Lauric acid

摘要：生物转化的发展必须整合上游和下游过程。上游生物加工将影响下游生物加工。考虑这一点至关重要，因为下游过程可能构成生物加工中最高的成本。这篇综述全面概述了酶促生物催化中上游和下游生物加工最关键的方面。讨论的主要上游过程包括酶的生产、酶的固定方法、溶剂选择和统计优化方法。本文回顾的主要下游过程是生物催化剂的回收以及产品的分离和纯化。正确选择和结合上游和下游方法将允许开发一个可持续且高效的系统。 1.引言 一个健全的生物过程的开发必须包括适当整合上游和下游过程。上游生物加工包括生物转化初始阶段的任务，但这些也会影响下游过程。这些阶段包括生物催化剂的准备、作为反应介质一部分的溶剂的使用，以及优化方法（见图1）。在开始酶促过程之前，一个关键方面是酶在工业规模上的可用性。全球酶市场正在以6.8%的速度增长。最常用的酶类包括碳水化合物酶、水解酶、聚合酶和核酸酶。它们被用于食品、营养保健品、洗涤剂、动物饲料和生物燃料等行业。大多数酶是由微生物产生的，其次是动物来源的酶，最后是植物来源的酶。这些信息表明了这些工业领域中酶的极佳可用性。来自天然来源的酶由于其生物学起源，通常表现出有限的活性和稳定性。生物催化剂工程包括使用蛋白质工程通过固定化技术或这些的结合来修改酶。蛋白质工程涉及战略性地修改蛋白质结构内的特定氨基酸，主要目标是提高酶的催化性能。另一种稳定和重复使用酶的策略是固定化，它包括将酶固定在材料上（与支持物结合）或在相同分子之间形成交联酶聚集体（CLEAs）。物理和共价键是支持物结合方法之一。物理结合在疏水材料上进行，弱范德华结合，或使用聚合物、生物聚合物或两者结合进行封装。酶与支持物的共价结合是使用双官能团化学物质进行的，该物质与支持物的化学基团和酶表面的氨基酸（如赖氨酸基团）结合。混合方法还结合了物理和共价结合，如异双官能团支持物，酶首先通过疏水作用结合，然后共价结合。统计优化是寻找影响反应转化或产率的变量的最佳条件的有价值工具。为了获得适当的调整和近似，进行先前的实验测试和多个实验设计是必要的。在酶促生物催化中，上游过程有时是必要的，因为它们取决于新技术的要求。例如，一些公司购买已经固定的生物催化剂，而其他公司则为特定应用量身定制它们，以降低成本。必须强调的是，在不回收酶的工业过程中，这些方法将不包括在上游过程中。下游加工确保了商业可行产品的高效回收。在酶系统中，这些过程包括生物催化剂的回收（如果是固定的）和反应产物的分离和纯化（见图1）。正如图1所示，下游过程通常比上游过程更多，这就是为什么它们更昂贵。在需要高纯度最终产品的某些情况下，成本可以达到生产过程总成本的80%。同样，下游过程中对感兴趣产品的纯化需求将取决于它们的应用。例如，如果最终产品是药物化合物，它必须具有高纯度，就像食品工业产品一样。相比之下，一些大宗化合物不需要太多的纯化。关于生物催化剂的回收，这篇综述包括了离心和过滤过程，并将分析包括蒸馏过程、液-液萃取、结晶和色谱在内的分离和纯化示例。通过这种方式，了解感兴趣的产品应用，可以设计生物转化中的上游和下游策略。鉴于此背景，本综述旨在仔细审查结合到生物转化中的上游和下游过程的最新进展。 图1. 酶技术中的上游和下游过程。 2.上游生物加工  在酶促反应中，上游过程包括在细胞中表达感兴趣的酶、用于生物催化剂回收和稳定的固定化方法，以及作为反应介质一部分的溶剂的选择。 2.1.酶的生产 确定一个健壮的生物催化剂作为过程催化剂是一个挑战，因为它的固有不稳定性以及对大规模酶生产的需要。为了确保某些酶的适当可用性，必须遵循一系列步骤来优化酶的生产。最初，需要从天然来源中分离出负责酶生产的微生物。一旦分离出来，了解其基因组变得至关重要，因为这允许进行遗传修饰，从而产生更活跃和更稳定的酶（图2）。这些遗传修饰随后可以通过在通常被认为是安全的（GRAS）微生物中克隆来表达。在文献中，可以发现许多例子展示了遗传修饰和表达如何增强酶的特性和能力。其中之一是在枯草杆菌（Bacillus subtilis）中表达土壤微生物枯草杆菌（Bacillus licheniformis TIB320）的溶菌酶。这种酶在pH值3到9和温度20℃到60℃的范围内显示出高活性和稳定性。根据现有文献，生物催化中最重要的酶包括脂肪酶、漆酶、纤维素酶、葡萄糖苷酶和淀粉酶。 图2. 酶的生产。 对脂肪酶生产的研究集中在优化培养条件以产生来自Yarrowia lipolytica NNRL Y-1095的胞外脂肪酶，特别强调使用磁场（MF）。成功的条件包括使用10 g/L的葡萄糖、15 g/L的橄榄油和2 g/L的Triton X-100作为表面活性剂。在培养期的第72至144小时应用30 mT MF后，记录到的最高脂肪酶活性达到34.8 U/mL。这些发现证明了MF作为高效生产Yarrowia lipolytica NNRL Y-1095脂肪酶的替代方法的可行性；在随后涉及相同酶生产的调查中，建立了一个双相系统，使用四丁基溴化铵（[N4444]Br）进行脂肪酶分离。该系统实现了100%的提取效率。 漆酶的多样化应用推动了对其生产的研究，同时减少生产成本。漆酶生产有两种主要策略：液体深层发酵（SF）和固态发酵（SSF）。SSF因其高产量和不产生液态废物而优于SF。在固态发酵（SSF）中，一层薄膜紧密粘附在固体基质上；主要的流动相是气体，从而阻碍了质量和热量的有效传递。此外，SSF通常涉及高度异质的成分，进一步复杂化了发酵过程。解决这些挑战对于推进工业发酵技术至关重要。王等人2023年提出的一个替代方案是使用氢氧化钠预处理作为固定支持、营养和诱导剂的木质纤维素废物，以生产漆酶。结果表明，使用氢氧化钠预处理有效地产生了一个底物，显著提高了酶的可消化性，并优化了水分保持能力，从而创造了一个促进Funalia trogii IFP0027菌丝生长的理想环境。此外，记录到的漆酶活性达到了令人印象深刻的2912.34 U/g，与对照组相比增加了7.72倍。另一项研究指出，应用Triton X-100从Shiraia sp. S9中获得漆酶。发现Triton X-100诱导产生大量活性氧（ROS），增加膜通透性，调节乳糖酶的基因表达，并最终导致更高的乳糖酶产量，达到约9.2 ×104 U/L，比对照组大约增加了108倍。 纤维素酶是将复杂的植物细胞壁多糖转化为具有经济重要性的有价值、易于获取的糖的关键酶。提高生产性能的基础原则是：仔细检查发酵过程中的操作变量至关重要。在这种情况下，Triphati等人，2023年，研究了温度和pH对SSF产生纤维素酶的影响。在最佳底物浓度（木质纤维素废物）10 g下，获得了22 IU/gds滤纸（FP）。发现最佳纤维素酶生产条件为40℃和pH 5.5。这些发现强调了利用木质纤维素废物作为成本效益高和可持续底物扩大工业纤维素酶生产的可行性。另一个例子是，使用由羧甲基纤维素钠（CMC-Na）和小麦麸（WB）组成的底物组合，从Penicillium oxalicum P-07中产生纤维素酶，显示出显著的滤纸（FPase）活性水平。通过精心优化降解条件，观察到在pH 5.0和37℃的温度下，FPase活性增加了1.5倍，从最初的0.30 U/mL增加到提高的水平0.45 U/mL。这些精细调整的操作条件促进了Penicillium oxalicum P-07高效生产纤维素酶。 β-葡萄糖苷酶是一种多才多艺的酶，具有许多应用，包括选择性水解纤维二糖以产生可发酵糖，以及生产用于食品工业的芳香化合物。在这种情况下，Oliveira等人，2021年，优化了碳源，使用中心组合实验设计从Malbranchea pulchella中获得β-葡萄糖苷酶。模型拟合系数为n (R2) 0.9960，F值高。纤维二糖成为最佳碳源，产生了具有显著性能的酶，相对活性为100%，酶活性水平为1.55 U/mg。另一项研究集中在利用从大西洋森林生物群系中分离出的微生物Aspergillus fumigatus菌株生产β-葡萄糖苷酶。这种酶可以有效地使用经济的培养基，如菜籽粉作为底物进行合成。值得注意的是，当在40℃下，pH为4.2，用2.9%的菜籽粉培养101小时时，该酶表现出显著的活性水平，达到24.53 U/mL。 α-淀粉酶是人体消化碳水化合物的关键酶。它在包括唾液腺和胰腺在内的多个器官中产生。α-淀粉酶将复杂的碳水化合物，如淀粉和糖原，分解成更简单的糖，如麦芽糖和葡萄糖。由于其重要性，各种研究旨在增加其产量，如Abo-Kamer等人，2023年的研究。研究人员从土壤样本中分离出来自微生物Bacillus cereus的α-淀粉酶。分离过程涉及系列稀释和平板技术，淀粉酶活性通过淀粉琼脂平板法进行评估。随后，通过使用Plackett-Burman单因素逐一统计设计，优化了酶的生产。在检查的独立变量中，葡萄糖、蛋白胨、(NH4)2SO4和MgSO4显示出最高的重要性，产生了令人印象深刻的250 U/mL的α-淀粉酶。最适酶生产物理条件为35℃和pH 5.5，维持48小时。 另一项研究深入研究了从Pontibacillus sp. ZY中生产α-淀粉酶。在这项研究中，重点是使用枯草杆菌作为宿主生物体表达酶，然后精心优化碳和氮源。值得注意的结果揭示了，在微调基因表达调节器、信号肽启动子序列和amyZ1基因上游的核糖体结合位点（RBS）后，酶活性达到了比天然酶高2.6倍的惊人水平，总计达到令人印象深刻的4824.2 U/mL。此外，通过严格的碳和氮源优化过程，在3 L发酵罐中达到了显著的α-淀粉酶活性49,082.1 U/mL。 2.2.酶的固定化 当需要回收并获得具有高稳定性的生物催化剂时，酶的固定化策略非常重要。固定化包括将酶固定在材料上（与支持物结合）或在相同分子之间形成交联酶聚集体（CLEAs）（图3）。 图3. 酶固定化的类型。 物理和共价键是支持物结合方法之一。物理结合在疏水材料上进行，弱范德华力结合，或使用聚合物、生物聚合物或两者结合进行封装。关于通过吸附进行的固定化，最常用的支持材料包括甲基丙烯酸酯、二氧化硅、磁性纳米粒子、碳和各种聚合物。这种固定化的一个例子是将来自Piriformospora indica的多聚半乳糖醛酸酶（Exo-PG）吸附在κ-卡拉胶-壳聚糖磁性纳米粒子（CCMNs）和壳聚糖-果胶磁性纳米粒子（CPMNs）这种新型支持物上。当Exo-PG固定在CPMNs和CCMNs上时，分别展现出了令人印象深刻的比活性479 U/mg和204 U/mg。Exo-PG在CPMNs上的固定化导致了其酶活性的显著恢复率71.11%，伴随着令人印象深刻的固定化产率89.15%。另一方面，将Exo-PG固定在CCMNs上导致酶活性的恢复率略有下降，为65.96%，固定化产率为63.85%。 一个说明性的例子涉及将磷脂酶Lecitase Ultra（LU）固定在大孔树脂上，特别是LXTE-1000，以催化二酰基甘油（DAG）的生产。吸附过程持续了2小时，产生了令人印象深刻的90%的固定化率。值得注意的是，即使在4℃下储存60天后，使用LXTE-1000-LU进行的甘油解反应仍然产生了显著的41.31%的DAG产率。 酶通过共价键固定在载体上的过程，是利用一种双官能团化合物，该化合物能够与载体上的化学基团（如赖氨酸基团）以及酶表面的氨基酸结合。一个共价固定的例子是将纤维素酶固定在功能化的核壳磁性金纳米粒子上。蛋白质的固定效率为84%，滤纸(FPase)的活性为0.78 mmol·mL-1。此外，新的生物催化剂比游离酶更稳定。Candida rugosa 脂肪酶也通过共价键固定在磁性Fe3O4@SiO2上。这种生物催化剂被用来催化酸化大豆油的水解，以产生脂肪酸。研究了诸如生物催化剂的用量、反应时间和水/油比等反应条件。优化结果表明，在10 wt%生物催化剂、3:1(v/v)水/油比和313 K下，经过12小时，水解率达到了98%。在五个反应周期后，生物催化剂的水解活性仍然保持在55%，这对工业应用来说是有希望的。 通过包埋法固定酶也已应用于工业酶促反应中，例如将Aspergillus oryzae 脂肪酶(AOL)和Rizomucor miehei (RML) 脂肪酶固定在磁性壳聚糖微胶囊上。包埋过程是通过自组装负电荷磁性纳米粒子(citrate-modified Fe3O4)在交联的壳聚糖柠檬酸脂肪酶聚集体上进行的。结合Tween 80生物印迹的AOL@RML共固定脂肪酶，实现了98%的生物柴油产率，这比单独固定的AOL和RML酶分别高出1.3倍和1.6倍。生物催化剂展现出显著的稳定性，在连续三个反应周期后，保持了其初始活性的96%。 使用CLEAs固定酶有多种例子；一种固定方法涉及使用糖类辅助的Trametes versicolor 漆酶的交联聚集体。优化过程关注了诸如沉淀剂的选择、交联时间、交联剂类型和糖浓度等关键变量。然后将这些优化条件与富含牛血清白蛋白(BSA)的漆酶-CLEAs进行了比较。结果揭示了果糖-CLEAs固定方法实现了大约45%的酶活性恢复。此外，动力学参数，特别是Kcat和Km，显示出的值是使用BSA-CLEAs获得的两倍。 另一个例子涉及通过形成交联聚集体（称为TL-CLEAs）来固定化Pseudomonas stutzeri脂肪酶。这种生物催化剂在深共熔溶剂（DESs）中表现出了显著的韧性和高活性。此外，它显示出在用甘油酯化苯甲酸时可重复使用多达三个周期的潜力，效率仅下降50%。混合方法也结合了物理和共价结合，如异双官能团支持物，其中酶首先通过疏水作用结合，然后共价结合。还有使用CLEAs的结合，然后通过使用Lentikats®（LentiKat’s a.s., Stráž pod Ralskem, Czech Republic）（聚乙烯醇）进行第二次包埋固定化，以增加稳定性和机械阻力，用于连续填充床反应器的应用。固定化方法的选择取决于酶的类型、支持物的简单性、成本以及在需要放大过程时所选反应器的类型。例如，在具有工业应用的脂肪酶固定化中，吸附或异双官能团方法（吸附和共价结合）在甲基丙烯酸酯树脂上是一个不错的选择，因为支持物具有高机械和化学稳定性，适用于批量和连续填充床生物反应器。包埋或固定化技术产生的生物催化剂具有较弱的机械阻力，它们在具有机械搅拌器的批量生物反应器中的操作构成了一个适当的放大替代方案。 2.3.反应介质制备中溶剂的选择 在处理不同极性的底物时，应用溶剂或共溶剂对酶促反应至关重要。然而，其选择并不简单，因为它不能影响酶的活性；它必须是环境友好的（见图4）。除了图4中指出的要点外，溶剂还可以改善酶的活性，以增加反应的转化率和产率。根据底物的极性，可以设计能够溶解底物的绿色溶剂。绿色溶剂包括离子液体（ILs）、深共熔溶剂（DESs）和基于生物的溶剂。ILs由阳离子和阴离子组成，制备复杂且昂贵。相比之下，DESs是由氢键受体（如胆碱氯化物）和氢键供体（可以是醇、酸或尿素）形成的。它们易于制备且比ILs便宜。ILs在生物催化中提供了几个优势，主要是它们显著的底物溶解性。然而，必须注意，在这些溶剂环境中操作时，酶的活性和稳定性可能会受到影响。Cui等人，2022年，确定酶的水合作用对于酶保持其活性和稳定性至关重要。例如，Zhao等人，2021年合成了模仿水的ILs，具有如乙二醇醚和叔醇这样的基团。这些新的ILs允许使用Candida antarctica的脂肪酶B（Novozym 435®, Novozymes, Bagsværd, Denmark）和固定化的Bacillus licheniformis蛋白酶获得高转酯化活性。不同ILs含有2%和3% v/v水分增加了Novozym 435®生物催化剂的活性，比叔丁醇高出1.8倍，比二异丙醚高出1.6倍。DES已被用于多种酶促催化应用中作为反应介质，允许与不同极性的底物进行反应。DES在生物催化中既作为溶剂又作为底物。添加少量水分，通常为2-5% v/v，可以有效降低DES的粘度，减轻质量传递挑战。此外，已证明其在连续填充床生物反应器和微反应器中的应用达到了高产率。如CyreneTM这样的基于生物的溶剂也已在生物催化中使用，主要作为酶促水解反应中的共溶剂，作为甘油与苯甲酸酯化反应中的溶剂，以及作为α-酮酯还原反应中的共溶剂。 图4.溶剂在酶促反应中必须具备的主要特征。2.4.统计优化 统计优化工具对于获取进行反应的最佳操作条件非常有价值。在文献中，有许多应用这种技术来确定最佳反应条件的研究。例如，酶促水解从酸性米糠油（RBAO）中去除甘油酯。RBAO包含脂肪酸（FFAs）、甘油酯和抗氧化剂，如γ-谷维素。通过中心组合旋转设计优化酶促水解，研究了三个独立变量——时间、温度和水：RBAO比例及其相互作用对响应（甘油酯去除、γ-谷维素损失和FFA产生）的影响，并确定描述它们关系的统计模型。使用最佳反应条件22小时、48.5°C和水：RBAO比例为1:1，在95%的预测区间内实现了甘油酯去除率99%、γ-谷维素损失32%和FFA产生73-75%。这项工作证明了在提取抗氧化剂γ-谷维素之前，酶促水解是去除甘油酯的有价值工具。 另一个应用统计优化的例子是通过Alcalase对小球藻微藻蛋白进行酶促水解（见图5）。为此，使用了响应面优化（RSM）方法。研究的独立变量包括pH值、反应温度、反应时间和酶电荷：底物比例。在Alcalase酶的最佳反应条件下，达到了3%的酶负载：底物比例、60°C、pH 6.5反应3小时和蛋白浓度为0.58 mg/mL。 关于酶促合成反应，已经根据Box-Behnken的实验设计，使用两种固定化脂肪酶（Novozym 435®和Thermomyces lanuginosus（TL））在Immobead 150上进行了5-羟甲基糠醛（HMF）与月桂酸的酯化反应的优化。使用Novozym 435®，在40°C、65 mM的HMF和16 U Novozym 435®的条件下，实现了75%的最佳转化率。使用TL生物催化剂，在50°C、30 mM的HMF和16 U的条件下，达到了78%的转化率。 图5. 优化小球藻微藻的酶促水解以获得蛋白质水解产物。 3.下游生物加工  先进的回收、分离和纯化技术在开发生物催化过程中至关重要。下游操作对于保持产品特性至关重要，旨在实现高产量和高纯度。本节仅考虑酶促反应产品的分离和纯化。 3.1.过滤 过滤是一种在实验室和工业规模上广泛使用的固液分离技术。过滤具有多功能性，因为它可以连续和不连续地进行。压力过滤器使用大于大气压的压力，通过介质产生的压力差使流体流过介质。在真空过滤器中，施加轻微的压力差；因此，必须注意压力损失。流动流体中的低压可能导致“空化”现象，即溶解的气体或蒸汽气泡释放到液体中。这些过滤器在工业中广泛使用，因为它们评估悬浮液的过滤性以及过滤介质的适用性。 半乳糖寡糖（GOSs）是含有多个半乳糖和一个末端葡萄糖的短寡糖链——由来自乳糖的β-半乳糖苷酶催化的GOS的酶促合成。原始GOSs是含有寡糖、未反应乳糖和单糖的混合物；因此，纳米过滤是产品纯化的替代方法。在从GOSs中分离乳糖方面，膜选择性差是它们的主要缺点。因此，通过在之前加入乳糖水解步骤，采用纳米过滤进行了酶促产生的GOSs的纯化。使用两种纳米过滤聚合物膜（Synder NFG和TriSep XN45）在搅拌死端单元中以不同的跨膜压力（8-30 bar）评估了原始和水解GOSs的纯化。水解原始GOS纳米过滤的最佳操作条件是在20 bar、45℃和1500 rpm下使用TriSep XN45膜获得的。加入之前的乳糖水解增加了GOS保留率、单糖和乳糖去除率，改善了GOS纯化。 膜生物反应器具有改善生物催化反应的功能，并且同时分离产生的反应产物。然而，尽管它们具有激动人心的应用，但由于系统的催化和质量传递特性，它们的商业使用受到限制。这方面的一个例子是设计由聚烯丙胺盐酸盐/多巴胺（PAH/PDA）共沉积形成的新膜，以获得酶活性、水渗透性和酶负载之间的最佳平衡（见图6）。由纤维制成的柔性固定化基质具有大表面积、轻重量和可控孔隙度等物理属性，赋予它们创建过滤器、传感器、支架和其他功能界面所需的机械属性。涂层还可以促进生物催化膜的寿命，这也是它们在膜生物反应器中引起兴趣和应用的原因。 图6. 用于制造膜生物反应器的膜实现了生物催化剂及其产品的同步分离. 3.2.液-液萃取 液-液萃取主要用于生物转化中的反应产物分离。液-液萃取，或分配，是一种涉及将溶质从一个溶剂转移到另一个溶剂的分离过程。溶剂必须不混溶或部分不混溶，该过程通常通过混合相然后分离它们来完成。转移的驱动力是目标化合物在双相系统的每个相中的溶解度差异。 萃取可以批量和连续模式进行。当样品体积大、分配常数不利或萃取速率慢时，使用连续模式。选择用于萃取的溶剂并不简单。溶剂必须具备特定特性：它必须与其他溶剂不混溶，感兴趣的产品必须在其中一个相中溶解，并且它必须对环境友好。最后一个方面至关重要，并且有很多研究使用ILs和DES作为提取溶剂。 液-液萃取中也已将ILs集成到生物催化系统中。ILs由有机阳离子和无机阴离子组成，根据其组分，它们可溶于水性和有机介质，并且具有低蒸气压。然而，它们高昂的价格、毒性风险和复杂的制备限制了它们在工业过程中的应用。通常的方法是将它们用作反应介质，并将它们与生物催化剂和底物混合进行反应过程。然后，使用与ILs不混溶的有机溶剂提取反应产物，而生物催化剂和ILs则回收用于下一个反应周期（见图7）。这一过程的可持续性取决于ILs的价格、ILs回收和用于萃取的溶剂类型。最推荐的是那些来自可再生资源的，包括胆碱乙酸酯和胆碱丙酸酯等。 图7.采用ILs和DESs的下游过程。(1) 反应系统，(2) 过滤，(3) 液-液萃取，(4) 蒸馏。 具有与ILs类似特性的DESs易于制备；许多是可生物降解的，由氢键受体如胆碱氯化物和氢键供体如醇、酸等组成。这些特性使它们非常适用于工业应用。文献中有多种DESs应用于液-液萃取操作的例子。其中一个例子是乙酸乙酯与HMF的酯化。在这项工作中，通过使用由胆碱氯化物和甘油形成的DES（摩尔比1:2）进行液-液萃取，实现了81%的分离效率，仅需要一个分离阶段。González和Guajardo进行的另一项工作证明，可以将连续的酶促酯化过程与使用由胆碱氯化物/甘油1/2（摩尔比）形成的DES进行的半连续液-液萃取过程集成，实现了8%的转化率和70%的萃取效率。Pánic等人，2021年，还研究了使用DES（ChCl:甘油）作为反应介质和萃取剂的同时进行的(R, S)-1-苯乙酸酯的动力学分辨率。在最后的分离阶段，使用了与DES形成两个相的乙酸乙酯，获得了95%的效率。 3.3.蒸馏 蒸馏是一种几个世纪前开发的工艺，它利用化合物沸点的差异来选择性地分离化合物。相对挥发性的差异越大，非线性越高，混合物的分离就越容易。实现分离的一个关键方面是了解液相(x)-汽相(Y)的平衡图。在处理恒沸混合物时必须特别小心，这种混合物在特定组成和恒定沸点下表现为仿佛由单一组分构成；即在沸点时，汽相的组成与液相相同。这样，混合物就不能被分离。 在工业上，使用两种类型的蒸馏：间歇和连续。间歇蒸馏是最古老的方法，已经使用了数个世纪。该系统由一个底部锅炉组成，锅炉中装载有待分离的馏出物，以及一个置于锅炉上的精馏塔（板式或填充式）；两者都连接到一个冷凝器。在连续蒸馏中，要分离的料液在塔的一点或多点输入到塔中。蒸汽向上移动，而在底部，富含重组分的液体从塔中抽出。从塔顶离开的蒸汽被冷凝。部分冷凝液回流到塔中，其余的作为馏出物提取。 在生物转化中，蒸馏被应用于各种过程，例如，在甘油和大豆油使用叔丁醇作为溶剂的酶促合成二酰基甘油（DAG）中。DAG被用作食品添加剂，用于低脂食品的配方。为了回收感兴趣的DAG产品，研究人员使用真空蒸馏从混合物中去除叔丁醇（见图8）。成功实现了98.7%的转化率，这是通过采用大豆油与甘油6.23:1的摩尔比，并利用40% w/v底物溶解在叔丁醇中实现的。反应结束后，二酰基甘油（DAG）的浓度达到了48.5%。通过分子蒸馏的进一步精炼，最终获得了96.1%的高纯度水平。 图8.由Novozym 435® 生物催化剂催化的大豆油和甘油的甘油解反应生产的二酰基甘油的纯化。 在由羟四氢呋喃脂肪酸酯形成的生物润滑剂的化学酶合成中，蒸馏过程对于获得精炼产品至关重要。首先，发生亚油酸的水合反应，然后是环氧化反应。环氧化后，使用真空蒸馏来获得环氧化物，该环氧化物将与醇一起酯化，并由Novozym 435® 生物催化剂催化。然后进行短程蒸馏，其冷凝液对应于最终获得的生物润滑剂的前体酯。这一过程在图9中有详细说明。 图9. 基于亚油酸的羟四氢呋喃（HTHF）酯作为生物润滑剂。(A) 亚油酸，(B) 10-羟基-顺式-12-十八碳烯酸，(C) 12,13-环氧-10-羟基-十八碳烯酸，(D) 12,13-环氧-10-羟基-十八碳烯酸酯，(E) 12,13-环氧-12-羟基-十八碳烯酸酯，以及 (F) HTHF脂肪酸酯。 3.4.结晶 从溶液中结晶是化学过程工业中最常用的单元操作之一。晶体颗粒的形成和从溶液中的分离涉及悬浮和沉淀期。在这些时期，流体颗粒移动，物质可以从液态变为固态。 相平衡和结晶模式是开发结晶过程的原理和技术。相平衡的发展考虑了组分在溶剂中的溶解度，这取决于其浓度和温度。此外，使用的一种策略是应用抗溶剂，这允许溶解其他溶剂无法溶解的组分，从而改善结晶。结晶方法利用过饱和，通过冷却或蒸发实现。“沉淀”过饱和结晶是通过添加诱导化学反应以产生溶质或降低其溶解度的第三组分产生的。 存在各种类型的结晶器，包括非搅拌和搅拌容器（见图10）。非搅拌容器是最简单的设备，在其中热液体以批量模式倒入并冷却至室温。在这种操作模式下，会发生局部和瞬时的过饱和变化，导致形成大的、相互锁定的、聚集的和细小的晶体，这些晶体难以分离（图10A）。在搅拌结晶器的情况下，系统中的传质得到改善，规模形成减少，过饱和度曲线平滑，晶体悬浮，产生更均匀的产品，并缩短结晶时间（图10B）。图10C详细说明了大规模连续晶体生产的几种选择。 图10.结晶设备。(A) 非搅拌容器，(B) 搅拌容器，(C) 搅拌结晶器 DTB(带有导流管和挡板)。 D-Allulose是一种低热量糖，用于加工食品中增强风味和外观。然而，由固定化葡萄糖异构酶催化从D-葡萄糖生产D-Allulose将产生额外的副产品，这会降低产量并妨碍分离过程。幸运的是，模拟移动床色谱(SMBC)随后通过结晶纯化是分离D-Allulose的有效方法。这种方法具有低溶剂消耗和高生产力及纯度的优点。D-Allulose溶液通过色谱柱后，使用纳米过滤膜浓缩至3%，然后在65°C的真空下用旋转蒸发器进一步浓缩，直到糖的浓度达到70%。以1:4(v/v)的比例添加无水乙醇（无水乙醇与D-Allulose的比例）；随后，加入D-Allulose晶种以在4°C下开始结晶过程，持续96小时，从而实现98%的纯度。 一个有趣的将结晶集成到生物转化中的方法是使用膜生物反应器。一个例子是合成(S)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，这是对抗阿尔茨海默病的药物前体。使用带有两室的膜生物反应器进行合成，在第一室中首先进行反应。在第二室中，反应产物被浓缩并进入结晶阶段，以获得99.5%纯度的产品。 3.5.色谱法 色谱法可以完成两个基本功能。第一个是作为合成反应下游纯化过程的一部分，用于分离混合物组分。在生物转化中，色谱法用于下游过程以纯化产品。色谱法有多种类型，包括纸色谱法、薄层层析法、液相色谱法、气相色谱法、超临界流体色谱法等。在液相色谱法的情况下，样品通过固定相（填充柱）进行洗脱以进行分离。根据分离化合物的特性，使用溶剂和水的混合物或仅使用溶剂进行洗脱。色谱法最关键的方面是柱子的制造——其填充可以由各种材料、粒径和孔径制成——以及可以使用不同比例的溶剂和水作为流动相。 色谱法是生产手性化合物的基本工具。这是Sun等人在2020年对D-泛酸及其在食品、制药和其他工业中使用的添加剂成分生产进行研究的情况。D-泛酸的酶促动力学解决方案在生产成本、毒性和污染方面具有明显优势。这项工作的目的是克隆催化D/L-泛酸内酯(DL-PL)水解为D-泛酸(D-PA)或L-泛酸(L-PA)的Lactonohydrolases (Lacs)酶。最终反应产物通过配备手性柱的HPLC进行监测，流动相由甲醇和0.1%甲酸组成。反应4小时后，对映体过量达到了99%。 3.6.分离方法的选择和比较 适当的分离技术的选择取决于需要分离的产品类型、其物理特性及其纯度。资本支出（CAPEX）和运营成本（OPEX）也至关重要，如图11详述。例如，如果需要高纯度的产品并且有大量的副产品，色谱法是一个很好的选择。然而，CAPEX和OPEX将会很高，所需的能源将会相当可观。 图11. 选择分离方法时的考虑因素。 如果产品具有不同的极性，液-液萃取可能是一个好的选择，如果溶剂可以重复使用且对环境友好的话。蒸馏是经典的分离过程之一；尽管能源成本高，但它应该是最少使用的替代方案之一。然而，如果必须使用，它应该被选择用于沸点差异很大的产品，以及存在副产品回收和再利用可能性的情况。 过滤是一种从能源角度来看昂贵的分离方法，需要高额的投资和维护，以在膜使用后更换它们。然而，在特定过程中，感兴趣的产品对高温条件和溶剂不稳定时，它是其他分离策略的适当替代方案。 4.结论  上游和下游过程的正确组合促进了可持续和高产出生物过程的开发。上游操作对下游过程有显著影响。因此，酶的生产、固定化、溶剂选择和优化技术有助于在工业规模上增强酶技术的发展。各种下游过程构成了工业过程总成本的约80%。因此，它们必须根据产品类型、简单性、放大、CAPEX、OPEX和环境考虑进行战略选择。最后，上游和下游过程必须结合简单性、可持续性、经济性等多种特性。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。