AI已经越来越会“设计蛋白”了。给定一个靶点结构,RFdiffusion、ProteinMPNN等生成式模型可以快速设计出全新的蛋白结合剂。相比传统抗体,这类de novo minibinder只有几十个氨基酸,却有机会获得很高的靶点亲和力。但一个问题开始变得越来越现实:AI设计出来的蛋白,真的能直接拿来做药吗?
8月20日,Nature Communications发表一项研究。研究人员针对PD-L1、B7-H3和B7-H4等肿瘤表面靶点设计了数千种AI minibinder,并进一步把它们装进CAR-T细胞。结果却发现:一个蛋白即使能够很好地结合靶点,也不意味着它放进CAR后依然好用。而解决问题的关键,甚至不在结合界面。
70–88个氨基酸,AI开始制造“迷你结合剂”
传统CAR-T通常利用scFv等抗体衍生结构作为抗原识别模块,但研究人员正在尝试另一条路线:直接从头设计一种更小的蛋白,让它识别肿瘤抗原。
这项研究首先利用RFdiffusion生成70–88个氨基酸的蛋白骨架,再通过ProteinMPNN设计序列,并利用AlphaFold2等工具对候选结构进行计算筛选。最终目标很直接:让AI从零设计能够识别癌细胞表面蛋白的minibinder。
研究人员选择了B7家族的三个肿瘤相关靶点——PD-L1、CD276(B7-H3)和VTCN1(B7-H4),随后利用哺乳动物细胞表面展示、FACS和NGS对大量设计进行实验筛选。结果很快暴露出AI蛋白设计的第一个现实问题:不是所有靶点都一样容易设计。
针对PD-L1,筛选中约有2.4%的细胞进入阳性结合群体;而到了B7-H3和B7-H4,这一比例都降到了1%以下。NGS进一步发现了多个富集的PD-L1 binder、较少的B7-H3 binder,而B7-H4则没有得到明显富集候选。即使使用同一套AI设计流程,最终成功率仍然高度依赖靶点本身。这已经给“AI自动造药”泼了第一盆冷水。但真正有意思的还在后面。
能结合靶点,为什么装进CAR后却不好用?
研究人员随后把筛选出的minibinder进一步做成CAR的抗原识别结构。PD-L1方向的结果相当不错:minibinder CAR-T能够识别癌细胞天然表达的PD-L1,而在PD-L1被CRISPR敲除后,相应识别明显消失。
这说明AI从头设计的小蛋白,确实有能力承担CAR的抗原识别功能。但到了B7-H3,事情开始变得复杂。研究人员除了自己的minibinder,还引入了此前报道的高亲和力B7-H3 minibinder HM9等作为对照。令人意外的是,一些binder虽然对B7-H3具有很强的结合能力,做成CAR以后,其细胞表面表达却明显下降。问题来了:如果一个binder连CAR-T细胞表面都不能高效到达,那么它在溶液里的亲和力再漂亮,也很难转化成真正有效的细胞治疗工具。作者因此提出了一个非常重要的判断:高亲和力minibinder,不一定就是最好的lead。
问题不在“正面”,而可能藏在蛋白的“背面”
为什么同样能结合B7-H3,有些minibinder能够很好地呈现在CAR-T表面,有些却不行?研究人员比较了这些蛋白的理化性质,很快发现了一个明显差异——等电点pI。表面表达较差的HM9和mb,pI分别达到约9.4和9.8;而研究团队自己设计、表面呈递更好的几种B7-H3 minibinder,pI大约只有4.7–5.2。
于是作者没有继续改HM9与B7-H3直接接触的结合界面。相反,他们把结合界面的氨基酸全部固定下来,只允许远离结合界面的残基发生改变。随后利用基于遗传算法的策略结合Chai-1等模型,对HM9进行重新设计,一口气生成了接近6000种变体,让这些蛋白覆盖不同的pI范围,结果却发生了明显变化。
改了“背面”,CAR-T重新工作了
经过细胞展示筛选后,研究人员挑选17种HM9变体进一步做CAR-T功能验证。结果显示,minibinder的pI与CAR在T细胞表面的可及性存在明显关系;尤其是高度碱性的minibinder,更容易出现较差、且不均一的细胞表面呈递。
更重要的是,这种优化最终不只是让CAR“表达得更漂亮”。在A375黑色素瘤细胞模型中,经过理化性质优化的B7-H3 minibinder CAR-T表现出更好的靶点选择性激活,并在细胞杀伤实验中改善了针对B7-H3阳性肿瘤细胞的功能。这就把整个故事从“AI设计蛋白”推进了一步:AI不仅要设计一个能结合靶点的界面,还必须设计一个能够在真实生物系统中正确表达、运输和工作的完整蛋白。而后者,很可能比前者更难。
总结
AI蛋白设计,正在跨过“亲和力崇拜”!
过去评价一个新binder,我们很容易首先问:KD是多少?亲和力越高,似乎候选分子就越优秀。但这项研究展示了一个很典型的反例。一个高亲和力binder进入CAR这样的复杂体系后,还要经历蛋白折叠、细胞内运输、膜表面呈递以及抗原识别等多个环节。
任何一个理化性质出现问题,都可能让一个计算上非常漂亮的设计失效。甚至最高亲和力也未必意味着最好的治疗窗口:CAR如果对低水平抗原过于敏感,还可能增加正常组织中的on-target/off-tumor风险。作者因此明确强调,binder的最终评价不能只围绕target recognition展开。
这也是这篇论文真正值得关注的地方。它没有再证明一次“AI能够设计蛋白”。而是在回答AI蛋白设计进入药物开发后更现实的问题:设计出来之后,怎么把它变成真正能用的分子?比纳米抗体还小,但离真正成为药还有多远?
minibinder的优势非常诱人。这项研究中的设计只有70–88个氨基酸;作者进一步比较发现,其平均结合界面面积约为871 Ų,甚至高于论文比较的一组VHH平均约735 Ų的结合界面。也就是说,一个非常小的de novo蛋白,仍然可以构建相当大的靶点接触界面。
但作者同样给出了非常明确的边界。这项研究没有进行minibinder CAR-T的体内疗效验证;更重要的是,这些完全人工设计的蛋白是否具有免疫原性、长期表达后是否影响CAR-T持续性,以及在正常组织表达靶抗原时是否出现on-target/off-tumor毒性,都还需要进一步研究。
因此,现在谈“AI minibinder替代抗体”显然还太早。但这项研究揭示的趋势可能更加重要:AI蛋白设计的竞争,正在从“谁能生成一个高亲和力binder”,转向“谁能把计算设计真正工程化成一个可开发的药物分子”。
结合界面,只是第一关。蛋白的稳定性、电荷、表达、运输、膜呈递、免疫原性以及最终功能,正在重新回到设计中心。
Ref:Broske, B., McEnroe, B.A., Frechen, S.C. et al. AI-enabled discovery and biochemical optimization of minibinders targeting cancer cell-surface proteins. Nat Commun 17, 8736 (2026). https://doi.org/10.1038/s41467-026-76760-5
编辑:幕斜知风骤
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