主要目的：评估GNP在中国健康成年受试者单次递增给药的安全性和耐受性，并与安慰剂比较。次要目的：（1）评估在健康受试者中GNP单次递增给药后药代动力学参数。（2）评估在健康受试者中GNP单次递增给药后的药效学特征。（3）评估在健康受试者中GNP单次递增给药后的免疫原性特征。探索性目的：利用模型引导，探索药物剂量暴露与药物效应之间的量效关系。

开始日期2022-10-12

申办/合作机构

雷恩康亚（深圳）生物医药科技有限公司初创企业

100 项与利钠肽相关的临床结果

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100 项与利钠肽相关的转化医学

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100 项与利钠肽相关的专利（医药）

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291

项与利钠肽相关的文献（医药）

2024-09-01·PANCREATOLOGY

Early tumor shrinkage as a prognostic predictor in chemotherapy-naïve patients with locally advanced pancreatic cancer treated with modified FOLFIRINOX or gemcitabine plus nab-paclitaxel combination therapy: An exploratory analysis of JCOG1407

Article

作者: Kojima, Yasushi ; Ueno, Makoto ; Yokoyama, Masayuki ; Shimizu, Satoshi ; Furuse, Junji ; Terashima, Takeshi ; Unno, Michiaki ; Uemura, Kohei ; Nakachi, Kohei ; Imaoka, Hiroshi ; Ikeda, Masafumi ; Tezuka, Shun ; Kato, Naoya ; Morizane, Chigusa ; Shirakawa, Hirofumi ; Sano, Yusuke ; Sano, Keiji ; Ozaka, Masato ; Kobayashi, Satoshi

BACKGROUND:

Early tumor shrinkage (ETS) is a prognostic predictor for patients treated with chemotherapy in colorectal cancer, although scarce studies evaluated its potential in locally advanced pancreatic cancer (LAPC). In this exploratory analysis of JCOG1407, a randomized phase II study comparing modified 5-fluorouracil, levofolinate, irinotecan, and oxaliplatin (mFOLFIRINOX) and gemcitabine plus nab-paclitaxel (GnP), we evaluated whether ETS can predict prognosis of patients with LAPC.

METHODS:

Of the 126 patients enrolled in JCOG1407, 112 with measurable lesions were included in this study. ETS was defined as a ≥20 % reduction in tumor diameter compared with baseline at the initial imaging assessment 6-10 weeks after initiating chemotherapy. Patients were divided into the ETS (achieved ETS) and non-ETS (failed to achieve ETS) groups based on their ETS status. The impact of ETS on overall survival (OS) was compared using multivariable Cox regression analysis.

RESULTS:

Fourteen of 55 (25.5 %) and 24 of 57 (42.1 %) patients in the mFOLFIRINOX and GnP arms, respectively, achieved ETS. In the overall population, mFOLFIRINOX arm, and GnP arm, the median OS in the ETS and non-ETS groups was 27.1 and 20.4, 29.8 and 20.6, and 24.1 and 20.4, months, respectively. The adjusted hazard ratios of OS for the ETS group in the overall population, mFOLFIRINOX arm, and GnP arm were 0.451 (95 % confidence interval [CI]: 0.270-0.754), 0.371 (95 % CI: 0.149-0.926), and 0.508 (95 % CI: 0.255-1.004), respectively.

CONCLUSIONS:

ETS may be a prognostic predictor in chemotherapy-naïve patients with LAPC treated with mFOLFIRINOX or GnP.

2024-09-01·MEDICAL PHYSICS

Nanoscale gold nanoparticle (GNP)‐laden tumor cell model and its use for estimation of intracellular dose from GNP‐induced secondary electrons

Article

作者: Jayarathna, Sandun ; Kaphle, Amrit ; Krishnan, Sunil ; Cho, Sang Hyun

Abstract:

Background:

Gold nanoparticles (GNPs) accumulated within tumor cells have been shown to sensitize tumors to radiotherapy. From a physics point of view, the observed GNP‐mediated radiosensitization is due to various downstream effects of the secondary electron (SE) production from internalized GNPs such as GNP‐mediated dose enhancement. Over the years, numerous computational investigations on GNP‐mediated dose enhancement/radiosensitization have been conducted. However, such investigations have relied mostly on simple cellular geometry models and/or artificial GNP distributions. Thus, it is at least desirable, if not necessary, to conduct further investigations using cellular geometry models that properly reflect realistic cell morphology as well as internalized GNP distributions at the nanoscale.

Purpose:

The primary aim of this study was to develop a nanometer‐resolution geometry model of a GNP‐laden tumor cell for computational investigations of GNP‐mediated dose enhancement/radiosensitization. The secondary aim was to demonstrate the utility of this model by quantifying GNP‐induced SE tracks/dose distribution at sub‐cellular levels for further validation of a nanoscopic dose point kernel (nDPK) method against full‐fledged Geant4 Monte Carlo (MC) simulation.

Methods:

A transmission electron microscopy (TEM) image of a single cell showing cytoplasm, cellular nucleus, and internalized GNPs in the cellular endosome was segmented into sub‐cellular levels based on pixel value thresholding. A corresponding material density was allocated to each pixel, and, by adding a thickness, each pixel was transformed to a geometric voxel and imported as a Geant4‐acceptable input geometry file. In Geant4‐Penelope MC simulation, a clinical 6 MV photon beam was applied, vertically or horizontally to the cell surface, and energy deposition to the cellular nucleus and cytoplasm, due to SEs emitted by internalized GNPs, was scored. Next, nDPK calculations were performed by generating virtual electron tracks from each GNP voxel to all nucleus and cytoplasm voxels. Subsequently, another set of Geant4 simulation was performed with both Penelope and DNA physics models under the geometry closely mimicking in vitro cell irradiation with a clinical 6 MV photon beam, allowing for derivation of nDPK specific to this geometry and further comparison between Gean4 simulation and nDPK method.

Results:

The Geant4‐calculated SE tracks and associated energy depositions showed significant dependence on photon incidence angle. For perpendicular incidence, nDPK results showed good agreement (average percentage pixel‐to‐pixel difference of 0.4% for cytoplasm and 0.5% for nucleus) with Geant4 results, while, for parallel incidence, the agreement became worse (–1.7%–0.7% for cytoplasm and –5.5%–0.8% for nucleus). Under the 6 MV cell irradiation geometry, nDPK results showed reasonable agreement (pixel‐to‐pixel Pearson's product moment correlation coefficient of 0.91 for cytoplasm and 0.98 for nucleus) with Geant4 results.

Conclusions:

The currently developed TEM‐based model of a GNP‐laden cell offers unprecedented details of realistic intracellular GNP distributions for nanoscopic computational investigations of GNP‐mediated dose enhancement/radiosensitization. A benchmarking study performed with this model showed reasonable agreement between Geant4‐ and nDPK‐calculated intracellular dose deposition by SEs emitted from internalized GNPs, especially under perpendicular incidence — a popular cell irradiation geometry and when the Geant4‐Penelope physics model was used.

2024-08-01·DENTAL MATERIALS

The impact of print orientation and graphene nanoplatelets on biaxial flexural strength and cytotoxicity of a 3D printable resin for occlusal splints

Article

作者: Krause, Arno ; Oberoi, Gunpreet ; Valentova, Angelika ; Tabrizi, Hassan Ali Shokoohi ; Schedle, Andreas ; Janjić, Klara ; Arellano, Sonia ; Unterhuber, Angelika ; Unger, Ewald

OBJECTIVES:

3D printing found its way into various medical applications and could be particularly beneficial for dentistry. Currently, materials for 3D printing of occlusal splints lack mechanical strength compared to polymethyl methacrylate (PMMA) used for standard milling of occlusal splints. It is known that print orientation and graphene nanoplatelets (GNP) can increase biaxial strength in a variety of materials. Thus, the aim of this study was to assess if adjustment of print orientation and addition of GNP improve biaxial strength and if they affect cytotoxicity of a 3D printable resin for occlusal splints.

METHODS:

Specimens were printed vertically and horizontally with a stereolithography (SLA) printer and multilayered GNP powder was added to the resin at different concentrations. Printed specimens were characterized by Raman spectroscopy, optical profilometer analysis and scanning electron microscopy. Biaxial strength was evaluated by biaxial flexural testing. Cytotoxicity of specimens on L929 and gingival stromal cells (GSC) was assessed by the toxdent test, the resazurin-based toxicity assay and live-dead staining.

RESULTS:

Horizontally printed specimens showed significantly higher biaxial strength and lower deformation. GNP did not improve biaxial strength and material deformation of 3D-printed resins. None of the specimens were cytotoxic to L929 cells or GSC.

SIGNIFICANCE:

Print orientation in SLA printing has a significant impact on biaxial strength and material deformation. 3D printable materials can reach comparable or even improved biaxial strength compared to PMMA when using the optimal print orientation while GNP has no beneficial effects on the biaxial strength of resins for 3D printing of occlusal splints.

项与利钠肽相关的新闻（医药）

2024-10-24

·CPHI制药在线

罕见病ACH“救命药”关键实验达主要终点，每年长高6厘米！

关注并星标CPHI制药在线近日，Ascendis Pharma 披露了其在研疗法 TransCon CNP（navepegritide）于 ApproaCH 试验中的积极顶线数据情况。研究分析表明，该试验达成了主要终点，与安慰剂相比，TransCon CNP 显著提高了软骨发育不全儿童（年龄处于2 至11岁）患者的年化生长速度（AGV）。那韦培肽（navepegritide）属于一款长效的C 型利钠肽前药，被用于软骨发育不全的治疗。并且，此药已同时被美国食品和药品监督管理局以及欧盟委员会认定为孤儿药。软骨发育不全属于人类最为常见的矮小症，是由编码成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)基因当中的一种常见致病突变所引发，这种突变会给骨骼生长的软骨内骨化过程带来影响。针对软骨发育不全发病机制的治疗手段始终是一项重大却尚未被满足的需求。针对 FGFR3基因变异的药物，当下仅有一款 CNP药物，即伏索利肽（Vosoritide)。C型利钠肽(CNP)在人体里自然存在，是骨骼生长的正向调控因子，是有效的软骨内骨化刺激物，能够和特定的受体相结合，启动能抑制过度活跃的 FGFR3通路的细胞内信号，进而阻止 FGFR3对软骨细胞造成干扰。一、软骨发育不全（ACH）-先天性遗传性罕见骨病骨发育不良属于先天性、遗传性的罕见病症，会对骨与软骨的组织结构及发育形成影响，为常染色体显性遗传病症。其在人群中的发病几率大概在 1/5000 至100,000之间，涵盖了与数以百计遗传缺陷相关的各种不同类型的骨和软骨发育不良，在临床上呈现的表型有差异，软骨发育不全（ACH）属于最为常见的类型，此外还包含假性软骨发育不良、多发骨骺发育不良（MED）、脊椎骨骺发育不良（SED）等等，其中的绝大多数已被全球范围内纳入罕见病的目录之中。软骨发育不全（ACH）大概每17,000 至28,000名的活产婴儿中会有1 名出现（其中约20%是由父母遗传），我国的儿童软骨发育不全患儿大概有10000 人上下。儿童软骨发育不全也被称作胎儿型软骨营养障碍、软骨营养障碍性侏儒等，属于由于软骨内骨化存在缺陷所致的先天性发育异常情况，是一种儿童罕见病。软骨发育不全由成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)基因的功能增益突变所引发，属于常染色体显性遗传。FGFR3及其抑制性下游信号通路的激活会致使软骨内骨化的速度减缓。几乎所有软骨发育不全患者的 FGFR3 跨膜编码区均存在1138G→A(Gly380Arg)或者1138G→C(Gly380Arg)的致病突变。在过去的 20 年当中，针对这些致病突变下游通路的界定和认知为靶向治疗提供了基础。该疾病的特征为头部明显较大（大头畸形）、上臂较短（根状侏儒症）以及身材矮矮小小（女性的最终成人身高通常处于124cm 之间，男性则在132cm之间）。软骨发育不全通常不会致使智力受到损伤，倘若连接头颈部的骨头未对脑干或者上脊髓形成压迫，那么预期寿命和正常人接近。软骨发育不全的最优治疗时机应当在生长板闭合之前进行用药，一旦错过这一生长发育的黄金时期，药物所能起到的帮助将会十分有限。二、ApproaCH试验鉴于CNP类似物在治疗软骨发育不全方面存在希望，Ascendis Pharma研发出了一种具有缓释且长效特性的 CNP（那韦培肽），期望能够为生长板提供更为平稳的CNP 水平。为此，他们把 CNP 和一种无活性的载体分子相联结，让 CNP避免被清除，并且有望延长其对于生长板发挥的作用。在完成动物机制验证研究之后，又在健康的成年男性中开展了 1期研究，结果表明这种长效的CNP 具备良好的耐受性，药代动力学特点契合每周给药一次的需求。此次所公布的ApproaCH试验属于一项关键的双盲安慰剂对照试验，总计有 84名罹患软骨发育不全的儿童（年龄处于2 - 11 岁）参与进来，按照2 ：1 的比例被随机分配为接受每周一次的TransCon CNP或者安慰剂治疗。分析表明，试验达成了主要终点。在第52周的时候，接受TransCon CNP治疗的儿童（n =57）的最小二乘（LS）平均 AGV 为5.89厘米/年，然而安慰剂组（n =27）患者的 LS 平均AGV 为4.41 厘米/年，两组之间的 LS 平均差异是 1.49厘米/年（p<0.0001）。进一步开展的亚组分析指出，接受TransCon CNP治疗的2 至5 岁儿童（n =21）在第 52周时的LS 平均 AGV 为6.07厘米/年，而安慰剂组（n =10）的LS 平均 AGV 为5.06厘米/年，LS 平均差异为 1.02厘米/年（p = 0.0084）。接受TransCon CNP治疗的5 - 11 岁儿童（n =36）在第 52周时的LS 平均 AGV 为5.79厘米/年，而安慰剂组（n =17）的LS 平均 AGV 为4.02厘米/年，LS 平均差异为 1.78厘米/年（p<0.0001）。 TransCon CNP一直保持着与安慰剂相似的安全性，并且总体耐受性优良，治疗过程中出现的不良事件（TEAE）大多数都是轻度的。 TransCon CNP属于一种处于研究阶段的 C型利钠肽（CNP）前体药物，每周给药一次，旨在给予患者活性CNP 的持续暴露。C型利钠肽能够通过阻挡 FGFR3 的活性，仿若松开抑制儿童生长的“刹车”。直接靶向软骨发育不全的潜在病理生理学，从而促进软骨内骨形成，让患儿的生长速率恢复正常。三、其他临床疗法伏索利肽（Vosoritide) 欧洲药品管理局（EMA）在2021 年准许伏索利肽对 2岁及以上的软骨发育不全患儿（直至生长板闭合）展开治疗。基于针对3 个月至5 岁软骨发育不全患儿临床试验所有数据集合的评价，美国FDA 在 2023年 10月许可伏索利肽用于治疗全部生长板开启的软骨发育不全患儿（也就是从出生起始）。伏索利肽已经在46 个国家被批准用以治疗软骨发育不全儿童，于日本和澳大利亚，从出生到生长板闭合的这段时期都能够加以运用。在II期临床探究中，经过 60个月的治疗，年化生长速度（AGV）提升了 1.35厘米/年，治疗 60个月时身高增加了 9.08厘米；在III期临床研究里，治疗 1年时年化生长速度（AGV）改良了1.57厘米/年，治疗 1年时身高增进了 0.28；最新的II期临床研究显示，观察到 3 -59个月年龄的患者接受 52周的治疗，除去身高的改变，身体比例、颅骨以及脑形态（涵盖枕骨大孔、脑室和脑实质的尺寸）的变动较为显著。伏索利肽（Vosoritide)具备良好的耐受性，副作用发生的几率不存在明显差异，5 岁以下和较大年龄的患者在安全性方面相近，III期临床研究未上报与治疗有关的严重不良情况。英菲格拉替尼(Infigratinib) 英菲格拉替尼属于一种口服型且具备生物可利用性的 FGFR1 -3 选择性的抑制剂，在针对由 FGFR2突变所驱使的曾经接受过治疗或者转移性的肝内胆管癌的治疗中呈现出良好前景。鉴于这些数据以及英菲格拉替尼对软骨发育不全小鼠模型的骨表型（涵盖枕骨大孔和骨性椎管的尺寸）所发挥的改善作用，针对软骨发育不全儿童（年龄处于2.5- 16岁）的观察性生长与干预的临床试验已然开启，以此对该种口服疗法的安全性与有效性展开评估（PROPEL[NCT04035811]以及 PROPEL - 2[NCT04265651]）。2 期的剂量探寻研究（PROPEL- 2）表明，处于最高剂量组的英菲格拉替尼（0.25mg/kg/d）的患儿未曾出现和治疗相关的不良事件，并且相较于之前的观察性研究中的基线生长速度，平均每年能够多长3cm。这些数据相当振奋人心，特别是鉴于这种药物为口服的小药片，能够撒在幼儿的食物之中。一项重要的 3期试验已于2023 年12 月启动（NCT06164951）。瑞夫明西普(Recifercept) 一种具备配体捕获作用的可溶性FGFR3分子（瑞夫明西普），能够优化软骨发育不全小鼠模型的骨表型。基于这一数据，Therachon Pharma 公司与辉瑞公司接连开发了此类潜在疗法，并针对0-10 岁的软骨发育不全儿童实施了观察性和干预性临床试验（NCT03794609以及 NCT04638153）。在 2022年，鉴于随机分配接受瑞夫明西普治疗的儿童相较安慰剂儿童来说，年生长速度没有上升，这些试验因疗效欠佳而被终止。 SAR-442501 2021 年，一种针对 FGFR3 的人单克隆抗体（SAR-442501）获取了欧洲医学管理局（EMA）所授予的孤儿药认定，目的是用于医治软骨发育不全的儿童。赛诺菲展开了一项观察研究，针对 0至 10岁软骨发育不全儿童实施纵向生长的测量数据收集工作，并对数字生物标志物（像是家庭睡眠监测仪器以及监控体力活动的可穿戴设备）的运用状况予以评估，以此当作该 FGFR3 抗体化合物 2期干预试验的序曲。到了2023 年10 月，SAR-442501 的开放标签2 期研究在 0至 12 岁的软骨发育不全儿童当中开启，每周进行两次皮下注射（NCT06067425）。美克洛嗪(Meclizine) 美克洛嗪是一种现成的非处方口服抗组胺药，常用于治疗晕车，被认为是治疗软骨发育不全症的潜在方法，可促进软骨发育不全小鼠模型的纵向骨生长。这一发现促成了一项1a期试验，在12名5-11岁软骨发育不全日本儿童中每天给予一次或两次美克洛嗪，从而获取药代动力学数据。美克洛嗪的耐受性良好，没有出现严重的不良反应。 RBM-007 RBM-007 属于一种 RNA 适配体，能够和FGF2实现特异性结合，进而阻挡其与FGFR3相互接触。相关研究指出，RBM-007 能够挽回野生型小鼠胫骨里的 FGFR3 信号，让软骨发育不全患者诱导多能干细胞中的软骨细胞分化得以恢复，也能够让软骨发育不全小鼠模型里的非正常生长回归正常化。基于此，提出了它或许能有效治疗软骨发育不全的这一假设。当前，RBM-007 在日本正处于早期临床研发的阶段。四、展望在过去的十年期间，首个用于软骨发育不全儿童的精准疗法（伏索利肽）已得到批准，同时其他具有潜力的疗法也在临床研发的进程之中。接下来的十年，不但要明确哪些药物对于改善软骨发育不全的并发症效果最为显著，而且还得进一步明确这些新疗法的利弊得失。能够促进软骨发育不全婴儿颅面部骨骼非正常发育改善以及颅底孔（特别是枕骨大孔）生长的药物将会具有关键的潜在临床价值。长期的临床研究将会查明这些改善有无降低婴儿猝死、睡眠呼吸障碍的出现概率，还有减压和颅颌面手术的必要程度。未来的试验还会评判这些疗法的最佳起始时刻和剂量，以及是否能够联合运用来增强治疗效果。既然这些疗法是由制药公司研制开发的，所以一定要保证软骨发育不全患儿在全球范围之内都能够平等地获取这些疗法。此项工作需要国际方面以及政府与制药公司相互合作，同时也离不开软骨发育不全患者及其家人和支持组织的倡议与主动参与。不管是当下还是未来，都会存在软骨发育不全患者以及他们的家人选择不去运用这些新药物，特别是倘若新药的主要作用是增多线性生长，就像临床试验的主要终点所体现的那样。针对这些人而言，身材娇小是其内在个人身份的一个重要构成部分，而并非是需要变更的特质——这类观点必须予以尊重。想要清楚这些新药是否还会改变软骨发育不全相关的基线发病概率和死亡概率，仍然需要长期的观察资料。这些新疗法永远没办法替代针对软骨发育不全患者及其家庭的全生命周期看护、宣扬、社区教育和政策扶持。参考资料： [1] Pivotal ApproaCH Trial of TransCon™ CNP (Navepegritide) Achieved Primary Objective, Demonstrated AGV Superior to Placebo. Retrieved September 17, 2024 from https://investors.ascendispharma.com/news-releases/news-release-details/pivotal-approach-trial-transcontm-cnp-navepegritide-achieved END 来源：CPHI制药在线声明：本文仅代表作者观点，并不代表制药在线立场。本网站内容仅出于传递更多信息之目的。如需转载，请务必注明文章来源和作者。投稿邮箱：Kelly.Xiao@imsinoexpo.com ▼更多制药资讯，请关注CPHI制药在线▼ 点击阅读原文，进入智药研习社~

孤儿药

2024-09-17

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每年长高6厘米！创新疗法关键试验达主要终点

▎药明康德内容团队编辑日前，Ascendis Pharma公布其在研疗法TransCon CNP（navepegritide）在ApproaCH试验的积极顶线数据。分析显示，试验达成主要终点，TransCon CNP相较于安慰剂显著增加软骨发育不全儿童（年龄2-11岁）患者的年化生长速度（AGV）。软骨发育不全主要表现为四肢、脊柱和头骨底部的骨骼生长缓慢。它的发病原因是由于编码成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）的基因出现突变，导致FGFR3蛋白过度活跃。FGFR3是骨骼发育的负向调节分子，可影响软骨细胞的增殖、活化和分化。这次所公布的ApproaCH试验是一项关键双盲安慰剂对照试验，共有84名患有软骨发育不全的儿童（年龄2-11岁）入组，以2：1的比例随机分配接受每周一次TransCon CNP或安慰剂治疗。分析显示，试验达成主要终点。在第52周时，接受TransCon CNP治疗儿童（n=57）的最小二乘（LS）平均AGV为5.89厘米/年，而安慰剂组（n=27）患者的LS平均AGV为4.41厘米/年，两组间的LS平均差异为1.49厘米/年（p<0.0001）。进一步的亚组分析显示，接受TransCon CNP治疗的2至5岁儿童（n=21）在第52周时的LS平均AGV为6.07厘米/年，而安慰剂组（n=10）的LS平均AGV为5.06厘米/年，LS平均差异为1.02厘米/年（p=0.0084）。接受TransCon CNP治疗的5-11岁儿童（n=36）在第52周时的LS平均AGV为5.79厘米/年，而安慰剂组（n=17）的LS平均AGV为4.02厘米/年，LS平均差异为1.78厘米/年（p<0.0001）。 TransCon CNP持续表现出与安慰剂相当的安全性，且总体耐受性良好，治疗中出现的不良事件（TEAE）大多为轻度。图片来源：123RF TransCon CNP是一种在研C型利钠肽（CNP）前体药物，每周给药一次，旨在提供患者活性CNP的持续暴露。C型利钠肽可通过阻断FGFR3的活性，就好像松开抑制儿童生长的“刹车”，直接靶向软骨发育不全的潜在病理生理学，从而促进软骨内骨形成，让患儿的生长速率恢复正常。 ▲欲了解更多前沿技术在生物医药产业中的应用，请长按扫描上方二维码，即可访问“药明直播间”，观看相关话题的直播讨论与精彩回放参考资料： [1] Pivotal ApproaCH Trial of TransCon™ CNP (Navepegritide) Achieved Primary Objective, Demonstrated AGV Superior to Placebo. Retrieved September 17, 2024 from https://investors.ascendispharma.com/news-releases/news-release-details/pivotal-approach-trial-transcontm-cnp-navepegritide-achieved 免责声明：药明康德内容团队专注介绍全球生物医药健康研究进展。本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表药明康德立场，亦不代表药明康德支持或反对文中观点。本文也不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。版权说明：本文来自药明康德内容团队，欢迎个人转发至朋友圈，谢绝媒体或机构未经授权以任何形式转载至其他平台。转载授权请在「药明康德」微信公众号回复“转载”，获取转载须知。分享，点赞，在看，聚焦全球生物医药健康创新

临床结果CSCO会议

2024-09-03

·生物制品圈

抗体糖工程和均相抗体-药物偶联物制剂

摘要：抗体-药物偶联物（ADCs）是一类生物制药，其中细胞毒性剂与单克隆抗体（mAbs）偶联，允许靶向药物传递。目前的异质性ADCs（在随机可变位置偶联）存在稳定性、可重复性、效力等问题。最近的进步已经导致了通过位点特异性偶联的均质ADC制剂的开发，允许控制药物-抗体比率。这些方法增加了ADC制剂的治疗窗口、效力和批次间一致性。抗体在Fc区域携带一对异质性N-糖链，这对抗体功能至关重要。通过糖基工程已经实现了药物偶联，包括使用内切β-N-乙酰葡萄糖胺酶（ENGases）和单糖基转移酶突变体。在本文中，我们总结了不同的糖基工程方法用于抗体-药物偶联，并讨论了它们对下一代均质ADCs开发的优势。 1.引言抗体-药物偶联物（ADCs）是通过将细胞毒性剂与单克隆抗体（mAbs）偶联而制备的一类靶向疗法。截至2021年1月，已有九种ADCs正在使用，超过80种ADCs处于临床试验中。目前商业化的ADCs是异质性的（在随机可变位置偶联），因为有效载荷是通过抗体的氨基或硫醇基团偶联的，导致药物-抗体比率和连接位点的变化。这种非选择性方法不是最优的。异质性ADCs存在可重复性、效力和稳定性问题，可能带来显著风险，阻碍了临床开发。因此，目前期待新一代改进的ADCs。为了最大化下一代ADCs的可重复性、耐受性、效力和治疗窗口，非常需要开发能够产生均质ADC制剂的方法。 IgG普遍在Fc区域的Asn297上携带一对N-糖链，由于其复杂的生物合成过程，这在很大程度上是异质性的。糖链结构在抗体功能中起着至关重要的作用。例如，Fc N-糖链上核心岩藻糖的缺失可导致抗体依赖性细胞毒性（ADCC）增强100倍。在非人细胞中生产的mAbs表达的糖链结构在人类血清IgGs中不常见，导致严重的免疫原性。此外，据报道，商业化的曲妥珠单抗的N-糖链结构在不同批次之间存在差异。因此，调节Fc N-糖链结构非常重要。最近，使用内切β-N-乙酰葡萄糖胺酶（ENGase）突变体的IgG糖基工程变得可能，这可以提供具有均质糖链结构的抗体制剂。这种方法的扩展将允许生产具有糖链连接的均质ADC制剂。在N-糖链位点偶联有效载荷是理想的，因为Fc N-糖链位于Asn297，远离抗原结合区域。因此，这种糖链的修饰不会影响抗原结合能力。最近，我们通过ENGase突变体介导的糖基工程实现了均质ADC制剂的制备。除了ENGases，还有其他方法可以将有效载荷偶联到抗体的糖基部分。在这里，我们总结了基于糖基工程的均质ADC制备方法，并特别关注我们的方法。 Shino Manabe教授于1996年在东京大学Kenji Koga教授的指导下获得了博士学位。在此期间，她加入了哥伦比亚大学Gilbert Stork教授的研究小组，担任研究员，并在天然产物合成领域工作。之后，她转到RIKEN工作，并在日本科学技术振兴机构的胚胎科学与技术（PRESTO）计划中任职。在那段时间里，她获得了日本药学会青年科学家奖。目前，她是星药科大学全职教授，同时在东北大学药学研究生院及药学部药物开发研究中心任职。她的主要研究兴趣涉及糖缀合物合成技术的开发展。山口义树教授于1998年在日本东京大学药学研究生院（导师为Isao Shimada教授和Yoji Arata教授）获得了博士学位。他继续在同一研究小组作为博士后研究员，然后作为研究员进行研究。从2001年到2007年，他在名古屋市立大学（Koichi Kato教授）担任讲师，之后他转到RIKEN，先是作为结构糖生物学团队的团队领导（2007-2017年），然后在合成细胞化学实验室继续研究（2017-2018年）。2018年，他转到东北医疗药科大学，担任他目前的教授职位。他目前正在研究糖缀合物和糖结合蛋白的三维结构和功能。 2.使用ENGase/ENGase突变体的抗体糖基工程 2.1.ENGase突变体的作用 ENGases是水解酶，能够切断N-糖链N,N'-二乙酰壳二糖核心中的β-1,4-糖苷键。从不同来源分离出多种ENGases。ENGases催化的水解机制涉及壳二糖核心中第二个GlcNAc残基的邻近基团参与（方案1）。在活性位点中氨基酸的位移产生了ENGase突变体，这些突变体抑制了糖链水解活性，但仍具有糖链转移活性（表1）。因此，ENGase突变体将糖链整体转移到糖链截短的抗体上，从而生产具有均质糖链结构的抗体。在ENGases中，EndoS和Endo S2突变体特别用于抗体糖链重塑，因为它们对IgG具有高亲和力（方案2）。方案 1. EndoS 和 Endo S2 内切酶的糖链水解机制。方案 2. 使用内切酶/内切酶突变体制备具有均质糖链结构的抗体的策略示意图。括号内显示的是异质性组分。首先，在水解过程中通过底物辅助催化生成一个恶唑啉中间体。高能态的糖链恶唑啉是ENGase突变体介导的糖链转移反应的良好糖链供体。因此，在水解原始异质糖链后，EndoS/Endo S2突变体和糖链恶唑啉可以结合，介导后者转移到IgG分子上，从而提供具有均质糖链结构的抗体。准备的具有均质糖链的抗体揭示了糖链的重要性以及糖链结构与抗体功能（包括稳定性、ADCC活性和与Fcγ受体的结合能力）之间的关系。 2.2.ENGase突变体介导的糖链转移反应条件 ENGase突变体介导的糖链转移反应的条件必须仔细优化。在没有ENGase突变体的情况下，糖链恶唑啉在碱性条件下与赖氨酸氨基基团反应（方案3）。我们通过亲水作用色谱（HILIC）的UPLC分析实现了这一副反应的实时监测。这种方法可以用来监测和优化反应。优化后，我们将反应介质的pH设定为6.5。在这些条件下，氨基被质子化以减少亲核性。由于糖链恶唑啉在pH 6.5下不稳定，因此在反应过程中分批添加以保持足够的浓度。方案 3. 糖链氧化哌啶酮与氨基之间的副反应。此外，选择合适的ENGase突变体是一个重要问题。虽然Endo M N175Q经常用于GlcNAc肽的糖链转移，但这种突变体对携带核心岩藻糖的抗体的糖链转移效果不佳。我们使用了Endo CC1，它具有与Endo M N175Q相似的特性，但热稳定性更高，用于添加到缺乏核心岩藻糖的抗CCR4抗体。 2.3.高效糖链转移的方法为了避免副反应，我们使用唾液酸糖肽（SGP）1作为供体，而不是高反应性的恶唑啉2。因为SGP 1不是过渡态模拟化合物，其反应性与恶唑啉2相比低。因此，糖链转移需要高浓度的SGP 1。另一种避免副反应的方法是结合两种ENGase突变体和SGP 1（方案4）。在这两种ENGase突变体中，Endo M N175Q用于生成活性糖链中间体，推测是恶唑啉，尽管确切结构未被鉴定。生成的活性糖链中间体使用ENGase突变体EndoS D233Q进行原位糖链转移。这一程序降低了恶唑啉浓度，从而抑制了副反应。这种方法的其他优点是避免了相对不稳定的恶唑啉的分离，并且恶唑啉的制备和糖链转移可以在一锅操作中进行。方案 4. 通过结合两种内切酶突变体，在一锅操作中原位生成氧化哌啶酮和糖链转移反应。尽管ENGase突变体的水解活性受到抑制，但由于剩余的水解活性，糖链转移产率有时仍然不足。使用固定化ENGase突变体的流动化学是提高产率的关键技术。虽然使用固定化Endo M N175Q的流动反应产率可以高于90%，但在静态条件下产率低于90%。固定化的ENGase可以回收利用，这也是一个优势。 2.4.均质ADC的制备基于上述协议，通过携带有效载荷偶联功能团的糖链恶唑啉，可以准备均质ADCs（方案5）。在唾液酸糖链3的唾液酸的羧基上，通过使用苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基磷酰六氟磷酸盐（PyBOP）形成酰胺键引入叠氮基团。然后，根据Shoda协议在水中通过脱水反应制备恶唑啉4（方案6）。最后，需要进行双正交反应以将有效载荷添加到连接位点，从而实现均质ADC的制备。方案 5. 糖链偶联均质ADCs制备策略的示意图。括号内显示的是异质性组分。方案 6. 制备携带叠氮基团的糖链氧化哌啶酮。曲妥珠单抗是一种与HER2抗原结合的mAb，广泛用于治疗乳腺癌和胃癌。曲妥珠单抗也常在ADC研究中使用。通过EndoS D233Q将携带叠氮的糖链转移到曲妥珠单抗后，每个抗体上安装了四个叠氮基团。通过与张力炔烃的双正交反应，将带有溶酶体酶cathepsin B可切割的Val-Cit（瓜氨酸）连接子和单甲基auristatin E（MMAE）5载荷偶联（图1）。MMAE是一种有效的抗有丝分裂药物，源自海洋生物中的肽类，已被固定在琼脂糖上，并且与糖结合域融合的EndoS D233和D233Q已被固定在纤维素上。如上所述，这些固定化的ENGase突变体有效地转移糖链。固定化野生型EndoS与上述ENGase突变体的结合允许进行抗体糖基工程，而无需纯化糖链截短的抗体。此外，在ADC brentuximab vedotin中，并且目前在几种使用的ADCs中使用。图 1. 用于糖链偶联ADC的载荷。我们通过UPLC、MS和肽图谱确认了所准备ADC的均质性。完整MS清楚地显示了4:1的药物-抗体比率。流式细胞仪表明，ADC的结合亲和力与天然曲妥珠单抗相同。此外，ADC对高HER2表达的乳腺癌SK-BR-3细胞或胃癌OE-19和N-87细胞系具有高度的细胞毒性。特别是，SK-BR-3细胞的IC50与MMAE本身相同（0.3 nM）。另一方面，ADC对低HER2表达的乳腺癌MCF-7和胃癌MKN-45细胞系没有细胞毒性。这些结果证明了糖链偶联ADC的有效性。已经报道了用于均质糖链偶联ADC制备的类似方法。在二醇基团氧化裂解后，使用腙键引入叠氮基团（图2）。糖链转移后，有效载荷6被偶联，ADC对SK-BR-3细胞系显示出强大的细胞毒性。图 2. 用于载荷偶联的糖链氧化哌啶酮水合物。心房利钠肽用于治疗充血性心力衰竭等心血管疾病。然而，心房利钠肽在体内的半衰期很短（2.4±0.7分钟）。通过EndoS D233Q/Q303 L突变体的糖基工程，将PEG 7与心房利钠肽偶联。ADC的半衰期延长至14.9天，并且降低血压的效果维持超过28天。 3.抗体糖基工程的其他方法 3.1.1,2-顺式二醇的氧化断裂由于岩藻糖和唾液酸含有邻位顺式二醇，通过NaIO4的选择性氧化断裂可以产生无甲壳类动物Dolabella auricularia的甲壳素，这些甲壳素被称为多拉定。可被组织蛋白酶裂解的连接子首次由研究小组开发。由于抗体没有甲酰基团，生成的甲酰基团可以作为在糖基部分专一性地固定载荷的官能团。唾液酸的无环二醇基团与其他单糖相比具有更大的灵活性和无阻碍性；因此，唾液酸可以在相对温和的条件下被氧化。然而，抗体通常含有低水平（<10-14%）的唾液酸。为了增加唾液酸含量，可以通过商业可获得的半乳糖基转移酶和α-2,6-唾液酸转移酶，使用尿苷二磷酸半乳糖（UDP-半乳糖）和胞苷酸唾液酸（CMP-唾液酸）作为糖基供体，来延长寡糖链。使用NaIO4处理HPCM2（一种抗磷脂IgM），用于糖链125I和111In的偶联。这些偶联抗体被证明保留了它们的结合亲和力。相比之下，通过赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸的偶联降低了它们的亲和力。体内生物分布和肿瘤定位数据表明，通过糖链放射性标记的抗体可能对免疫扫描成像有益。这些方法要求抗体长时间暴露于低pH值、剧烈的氧化条件，以及对氨基酸残基（如半胱氨酸、蛋氨酸和色氨酸）的修饰，这可能会引起潜在问题。3.2.唾液酸转移的修饰由于唾液酸转移酶对唾液酸C-5和C-9位置的修饰具有耐受性，可以将9-叠氮基团功能化的CMP-唾液酸转移至糖链（方案7）。利用唾液酸转移酶的耐受性，可以在糖链上引入叠氮基团以备ADC制备。为了增加唾液酸含量，使用半乳糖基转移酶和UDP-半乳糖添加半乳糖。然后，使用重组α-2,6-唾液酸转移酶I和9-叠氮-CMP-唾液酸，将带有叠氮基团的唾液酸并入。二苄基环辛基羰基（DIBO）基团中的炔烃与叠氮烃通过无铜Huisgen反应（炔烃-叠氮环加成）反应，并可用于生产生物缀合物。修饰抗体的唾液酸部分C-9的叠氮基团可以使用FITC、生物素或水合霉素等DIBO修饰的反应。制备的ADC在体内以剂量依赖性方式显示出细胞毒性。方案 7. 使用9-叠氮基唾液酸和唾液酸转移酶的均质糖链偶联ADC。括号内显示的是异质性组分。 3.3.改良的半乳糖转移由于半乳糖基转移酶能够容忍改良的半乳糖基供体结构，因此可以通过半乳糖基转移酶添加带有功能团的半乳糖。C2-酮半乳糖或叠氮-GalNAc已通过β(1,4)Gal-T1-Y289L半乳糖基转移酶突变体并入。半乳糖被半乳糖苷酶处理和β(1,4)Gal-T1-Y289L转变为带有叠氮基团的GalNAc（方案8）。然后，放射性同位素或细胞毒性化合物可以添加到叠氮基团上。还报道了另一种方法（方案9），在EndoS处理后，叠氮-GalNAc被转移到GlcNAc上，产生短糖链结构。这两种均质糖链偶联抗体在异种移植小鼠模型中显示出比异质赖氨酸偶联抗体更多的积累。方案 8. 使用半乳糖基转移酶突变体的ADC制备方法。括号内显示的是异质性组分。方案 9. 使用半乳糖基转移酶突变体的替代ADC制备方法。括号内显示的是异质性组分。 4.总结与展望在这里，我们总结了抗体糖基工程技术和开发均质ADC制剂的方法。由于对ADC和抗体药物的需求持续增加，了解糖链功能至关重要。尽管已经报道了不同的均质ADC制备方法，但本文报道的化学-酶法途径具有许多优势。由于N-糖链位于Fc区域，有效载荷的偶联不会干扰抗原结合。此外，糖链原本就存在于Fc区域，因此引入的突变或外来序列的免疫原性不是问题。目前，许多ADC和治疗性抗体生产的商业制造过程使用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞。然而，这种系统的生产力仍然很低。因此，正在研究CHO细胞的替代品，如微生物蛋白生产系统、蚕和酵母。这些系统产生的抗体带有高甘露糖糖链。正在探索通过糖基重构技术将高甘露糖型糖链转变为人类型复杂型糖链，以降低抗体生产成本的尝试。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

抗体药物偶联物

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