IBI3020

如果要在近两年的医药圈评选出最火的“明星分子”，抗体药物偶联物（ADC）绝对当仁不让。从井喷的临床试验管线到动辄数十亿美元的授权交易，ADC药物正以前所未有的速度重塑肿瘤治疗格局。这一崛起并非偶然：一方面，随着对肿瘤生物学理解的加深，传统化疗的毒性瓶颈与单抗药物的单药疗效天花板日益凸显；另一方面，以第一三共Enhertu为代表的第三代ADC药物在临床上取得的巨大成功，验证了该技术平台的巨大潜力，引发了资本的涌入与MNC（跨国药企）的巨额交易，推动了整个行业的技术迭代。       然而，耀眼的光芒背后是极高的技术壁垒。与传统的“小分子”或“大分子”药物不同，ADC本质上是一个“跨界混血儿”。它既有抗体的精准靶向性，又背负着小分子毒素的强杀伤力，而维系两者生命的则是至关重要的Linker（连接子）。这种“抗体+毒素+连接子”的三元结构，虽然赋予了它强大的抗肿瘤活性，却也给开发者带来了巨大的挑战。ADC的研发绝不能简单地套用抗体药物的开发模板，因为在偶联之后，分子的物理化学特性、稳定性乃至免疫原性都会发生剧变。因此，ADC的产品开发（尤其是CMC环节）拥有完全不同于传统抗体药物开发的考量维度，例如药物抗体比（DAR）的均一性控制、连接子的稳定性以及偶联工艺的放大等，都是决定其成败的关键。       为了揭开这层神秘面纱，本文将开启一场关于ADC药物研发的“深度游”。我们将按照药物研发的时间轴，从最初的靶点发现、抗体筛选，到核心的Linker与Payload（载荷）构建，再到决定产品能否落地的CMC（化学、制造和控制）工艺，以及不可或缺的临床前研究与临床研究。通过逐层递进的剖析，旨在让读者不仅看到ADC的辉煌现状，呈现一个立体、完整的ADC药物开发图谱，更能洞悉其从实验室到病床背后的科学逻辑与工程挑战。 第一章：ADC药物研发的“精准导航”——靶点与抗体发现       在ADC药物的全生命周期中，靶点发现与抗体发现是决定项目生死的第一道关口。与开发传统单抗药物只需关注“抗体能否结合”不同，ADC药物的“抗体-连接子-毒素”三元结构决定了其开发逻辑必须前置。抗体不仅要充当精准的“导航系统”，其结合后能否被细胞内吞、内吞速率快慢，直接决定了后续毒素能否在肿瘤细胞内有效释放。因此，ADC的靶点评估与抗体筛选，是一个从“虚拟计算”到“实体验证”、从“裸抗性能”到“偶联后功能”的递进式证据链。       通常，这一阶段需要耗时约12-15个月，可细分为靶点评估与验证、抗体产生与初步筛选、抗体工程化与优化三个核心步骤。 1.1 靶点评估与验证：从海量数据中锁定“可成药”靶点       靶点评估并非单一实验，而是一个层层递进的筛选漏斗。其核心在于确认靶点在肿瘤细胞中的特异性高表达、与肿瘤发生发展的密切关联性，以及最关键的内化能力（ADC必须被细胞内吞才能释放毒素）。具体要做三件事：（1）组学筛选与生物学验证：确认肿瘤依赖性和内化能力（ADC 必须被细胞内吞才能释放毒素）；（2）可成药性评估：表达丰度、抗原脱落特性、种属交叉；（3）FTO 检索与竞品格局：避开已拥挤的靶点赛道，做自由实施分析。 1.1.1 虚拟初筛与假设生成（In Silico）       在项目启动初期，研发团队首先利用生物信息学手段进行大人群假设生成。通过挖掘TCGA、GTEx、GEO等公共数据库，分析肿瘤组织与正常组织的RNA-seq数据，计算差异表达倍数（Fold Change）。同时，借助Human Protein Atlas (HPA) 查看蛋白水平的IHC表达图谱，并利用DepMap数据库评估靶点的基因必要性（敲除后肿瘤细胞是否死亡）。这一“虚”的步骤解决了群体水平的表达差异问题，极大压缩了后续实验的搜索空间。 1.1.2实体验证与蛋白水平确证以及可成药性分析       公共数据库的数据多为mRNA水平，而“mRNA不等于蛋白，总蛋白不等于细胞表面暴露的抗原”。因此，必须通过实体样本进行验证。       表达谱精确定量：利用商业FFPE肿瘤组织芯片（TMA）进行IHC染色，评估靶标在肿瘤组织的阳性率与染色强度；同时利用靶向质谱（MRM/PRM）和定量流式细胞术（QIFIKIT）对细胞表面抗原拷贝数进行绝对定量。国内头部企业如恒瑞、科伦博泰等，普遍采用“商业TMA初筛 + 质谱/流式确证”的策略。       内化能力评估（ADC特有核心）： 这是ADC靶点验证中最具决定性的一环。研发人员常采用pHrodo标记的抗体，通过流式细胞术或共聚焦显微镜实时监测荧光信号增强，以计算内化速率常数（ke）。此外，利用皂草素（saporin）偶联抗体进行功能性内化验证，若抗体能内化，皂草素进入细胞质会杀死细胞，这直接回答了“内化是否能有效释放payload并致死”这一核心问题。       在确认靶点的生物学特性后，需进行可成药性评估，包括跨膜区预测、表位作图、种属交叉反应（为NHP毒理铺垫）以及抗原脱落风险评估。 1.1.3 FTO分析       最后，通过智慧芽等专利数据库进行自由实施（FTO）检索，避开已拥挤的靶点赛道，确保项目的知识产权安全性。 1.1.4靶点评估与验证所需的样本       靶点评估与验证所需的样本主要包括：数据库样本 vs 实体瘤样本，下面介绍一下如何分工与获取。 1.1.4.1数据库样本（虚）        用于"大人群假设生成"，特点是样本量大、覆盖广、成本低，但只是 mRNA 或 curated 蛋白水平数据。 核心数据库与获取方式： •TCGA（https://portal.gdc.cancer.gov/）：33 个癌种 6000+ 肿瘤样本，通过 GDC API 程序化下载 RNA-seq 数据  •GTEx（https://gtexportal.org/）：5000+ 正常组织样本  •GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）：NRC 从中整理了 >26000 肿瘤 + >8800 正常样本的同平台微阵列数据  •Human Protein Atlas（https://www.proteinatlas.org/）：蛋白水平的 IHC 表达谱，可通过 XML 接口程序化抓取  •UniProt / ENSEMBL：蛋白序列、跨膜区、亚细胞定位，通过 REST API 抓取  •DepMap：CRISPR-Cas9 和 RNAi 基因必要性筛查数据  •ADCdb：已临床 ADC 的靶点-抗体对 应关系        获取方式：写 Python 脚本通过各数据库 REST API 批量抓取，或者用 GDC Data Transfer Tool 下载 TCGA 数据。NRC 的做法是建一个 MySQL 数据库，把各来源的 ADC 靶点特征数据 ETL 进去统一查询。 1.1.4.2实体瘤样本（实）        用于"蛋白水平验证 + 功能性确认"，特点是贴近临床真实状态，但样本量小、获取难、成本高。 样本类型与获取渠道： 样本类型 用途 国内获取渠道 FFPE 肿瘤组织芯片（TMA） IHC 评估靶标在肿瘤 vs 正常组织的蛋白表达 医院病理科合作、商业样本供应商（如上海芯超、paraffin-embedded tissue 库）、BioBank 新鲜/冷冻肿瘤活检 靶向质谱定量、原代细胞解离、流式定量 三甲医院肿瘤科合作、临床试验中心、PDX 模型库 正常组织微阵列 评估 on-target/off-tumor 风险 商业供应商、尸检组织库 PDX 模型 体内药效 + 回溯性靶标丰度 国内 PDX 平台（如中科院上海药物所、各大药企内部平台） 细胞系 2D/3D 模型表达、内化筛选、ADC 体外杀伤 ATCC、DSMZ、中科院细胞库 类器官 保留肿瘤异质性的功能验证 医院合作、 commercial organoid bank 食蟹猴抗原/细胞 物种交叉反应、NHP 毒理铺垫 药明康德、昭衍新药等 CRO 的 NHP 资源 1.1.5国内头部企业走的是哪条路线        综合公开资料，国内 ADC 头部企业（恒瑞、科伦博泰、百利天恒、荣昌、信达、映恩等）的阶段一路线呈现"混合路线"特征，但可以归纳出几种典型模式： 路线 A：靶点优先 + Fast-Follow / 差异化（恒瑞、科伦博泰、荣昌等主流）  逻辑：在已验证的 ADC 靶点（HER2、TROP2、CLDN18.2、B7-H3、Nectin-4、HER3 等）上做差异化布局。 •恒瑞：HER2 ADC（SHR-A1811）正面竞争 + HER3 ADC（SHR-A2009）卡位新靶点，已递交 NDA  •科伦博泰：TROP2 ADC（SKB264）联合免疫方案，拓展 PD-L1 阴性人群  •靶点选择依据：基于 TCGA/GTEx/HPA 等公共数据库做表达特异性初筛 + 文献调研临床需求 + IHC 在实体瘤 TMA 上验证  •抗体发现：内部杂交瘤/噬菌体展示平台 + 部分外部合作  路线 B：新靶点 First-in-Class 探索（少数头部 + Biotech）  逻辑：通过多组学挖掘全新靶点，承担更高风险换取 FIC 机会。 •利用 TCGA/GTEx/GEO 等公共数据做 in silico 靶点发现（参考 NRC 管线方法 ）  •结合糖蛋白质组学鉴定细胞表面糖蛋白   •代表：部分新兴 Biotech 如三优生物等建立了"靶点验证-抗体筛选-连接子载荷优化"的完整平台  路线 C：双抗 ADC / 新技术平台路线（百利天恒、康宁杰瑞）  逻辑：不只在靶点维度差异化，更在"抗体形式"上创新。 •百利天恒 BL-B01D1（EGFR×HER3 双抗 ADC）是全球首个获批的双抗 ADC  路线 D：合作开发 / License-in  •通过与海外 Biotech 合作获取已验证的抗体或靶点（如映恩生物与多家 MNC 的合作）  综上所述：从公开管线反推，国内头部企业的共性特征在靶点选择与确证方面呈现以下共性：以"公共数据库 + 文献"为主：TCGA/GTEx/HPA 做初筛，再用内部/合作医院的 FFPE 样本做 IHC 验证，样本获取：以"医院合作 + 商业 TMA + PDX/细胞系库"三位一体，极少依赖直接从临床大批量获取原代样本。 最务实的路线是：公共数据库（TCGA/GTEx/HPA）做 in silico 初筛 → 文献和专利调研锁定候选靶点 → 商业 FFPE TMA 做 IHC 验证 → 内部/合作抗体平台产生抗体 → AI 辅助抗体工程化 → 原型偶联验证。其中"实体瘤样本"主要用于 IHC 验证和功能性确认，而不是用于初筛——初筛的活儿交给数据库，效率和成本都更优。 这也是 NRC 等国际顶级研发机构和国内恒瑞、科伦等头部企业的实际做法 。区别在于：资源充足的大公司会同时跑多条靶点线（路线 A + B 并行），而 Biotech 更倾向于集中资源在 1-2 个差异化靶点上快速推进 PCC。 1.1.6靶点评估与验证的推进流程       在 ADC 开发中，靶点评估与验证是决定项目生死的第一道关口。它不是一个单一实验，而是一个从“虚拟筛选”到“实体验证”、从“群体统计”到“单细胞功能”的递进式证据链。下面把这件事拆成 6 个可执行的步骤，并明确每一步需要什么实验技术手段、用什么样本。 步骤一：靶点发现与初筛（In Silico 为主，文献为辅）        目标：从全基因组中快速锁定“肿瘤高表达、正常组织低表达”的候选靶点，缩小范围。 做什么 具体手段 样本/数据来源 性质 差异表达分析 用 R/Python 分析 TCGA 肿瘤 vs GTEx 正常组织的 RNA-seq 数据，计算 TPM 和 Fold Change TCGA + GTEx 公共数据库 计算 泛癌表达谱 查询 Human Protein Atlas (HPA) 的 IHC 表达图谱，确认蛋白水平趋势 HPA 数据库 计算 文献与专利调研 检索 PubMed、Google Scholar、ClinicalTrials.gov、ADCdb，评估靶点的已知生物学、临床进展、竞品格局 文献/专利库 文献 靶点必要性评估 查询 DepMap 的 CRISPR-Cas9 和 RNAi 筛查数据，确认靶基因敲除后肿瘤细胞是否死亡 DepMap 数据库 计算 需要具备的技术能力： •生物信息学分析能力：熟练使用 R/Python 进行 RNA-seq 数据处理（DESeq2、edgeR 等）、生存分析（Kaplan-Meier plotter）。  •文献检索与情报分析能力：熟练使用 PubMed、智慧芽等工具。  样本：此阶段全部是数据库样本，不涉及实体样本。 步骤二：靶点生物学与疾病关联性验证（湿实验 + 生信）        目标：确认靶点与肿瘤发生发展、预后、耐药等直接相关，而不仅仅是“伴随表达”。 做什么 具体手段 样本 性质 生存分析 用 KM plotter 或 TCGA 临床数据，分析靶点高/低表达患者的 OS/PFS 差异 数据库（带临床注释） 计算 基因必要性验证 在目标细胞系中进行 CRISPR-Cas9 敲除或 shRNA 敲降，观察表型（增殖、凋亡、迁移） 肿瘤细胞系 实验 功能回复实验 敲除后重新过表达靶点，观察表型是否恢复 肿瘤细胞系 实验 信号通路分析 Western Blot、磷酸化抗体芯片，确认靶点激活的通路 细胞系/组织裂解液 实验 临床相关性 分析靶点表达与临床病理特征（分期、分级、亚型、耐药）的关联 临床数据库/队列 混合 需要具备的实验技术： •分子克隆：构建敲除/敲降/过表达载体。  •CRISPR-Cas9 / RNAi：基因编辑技术。  •细胞表型分析：CellTiter-Glo（增殖）、Annexin V/PI（凋亡）、Transwell（迁移）、流式细胞术。  •Western Blot / 蛋白印迹：基础蛋白检测。  •ELISA / 多因子检测：细胞因子/蛋白分泌检测。  样本：主要是细胞系（2D/3D），部分数据来自数据库。 步骤三：靶点表达谱精确定量（核心实验环节）        目标：在蛋白水平确认肿瘤 vs 正常组织的表达差异，并定量细胞表面抗原拷贝数。这是 ADC 靶点评估中最关键也最容易出错的环节。 做什么 具体手段 样本 性质 肿瘤组织蛋白表达 IHC 染色，评估靶标在肿瘤组织的阳性率、染色强度（H-score） FFPE 肿瘤组织芯片（TMA） 实验 正常组织蛋白表达 IHC 染色，评估靶标在正常器官的暴露情况（on-target/off-tumor 风险） 正常组织微阵列 实验 靶点精确定量 靶向质谱（MRM/PRM），绝对定量靶标蛋白在组织和细胞中的拷贝数 新鲜/冷冻肿瘤组织、细胞系 实验 细胞表面抗原密度 定量流式细胞术（QIFIKIT），用已知荧光强度的标准微球换算抗原拷贝数 肿瘤细胞系、原代细胞 实验 肿瘤微环境共定位 多重免疫荧光（mIF/mIHC），同时标记靶标和免疫细胞标志物（CD8, CD68 等） FFPE 组织 实验 需要具备的实验技术： •免疫组化（IHC）：包括切片、染色、图像分析（Aperio 等扫描系统）。  •靶向质谱（MRM/PRM）：需要合成同位素标记的标准肽段，建立质谱检测方法。这是蛋白定量的金标准，但门槛较高。  •流式细胞术：需要配备激光的流式细胞仪，以及 QIFIKIT 等标准品。  •多重免疫荧光：需要多光谱成像系统（如 Vectra Polaris）。  样本获取： •FFPE TMA：商业供应商（如上海芯超、US Biomax）、医院病理科合作。  •新鲜/冷冻组织：三甲医院肿瘤科合作、临床试验中心。  •细胞系：ATCC、中科院细胞库。        关键点：IHC 只能半定量，且主观性强；靶向质谱和流式才能给出绝对拷贝数。国内头部企业通常IHC 做初筛，质谱/流式做确证。 步骤四：靶点内化能力评估（ADC 特有核心）        目标：确认抗体结合靶标后，能被肿瘤细胞内吞并转运到溶酶体。这是 ADC 释放毒素的前提——不内化的靶点，做 ADC 必死（不是死律，对于采用不可裂解连接子或膜不通透毒素（如 DM1、MMAF）的 ADC，靶标必须高效内化，否则毒素无法释放；但对于可裂解连接子 + 高膜通透性毒素（如 MMAE、DXd、SN-38）的 ADC，内化并非绝对前提，可通过胞外释放或旁观者效应实现疗效；另外靶点在肿瘤微环境中而不在肿瘤细胞内的ADC，也要视情况而定）。 做什么 具体手段 样本 性质 内化速率测定 用 pHrodo 标记的抗体（pH 敏感荧光染料）与细胞孵育，通过流式或共聚焦显微镜实时监测荧光信号增强 肿瘤细胞系 实验 内化途径分析 用化学抑制剂（如氯喹、巴菲霉素 A1、dynasore）处理细胞，确定内化是通过网格蛋白、小窝蛋白还是巨胞饮 细胞系 实验 溶酶体共定位 将抗体与荧光染料（如 Alexa Fluor 488/594）偶联，与细胞孵育不同时间，与溶酶体标志物（Lamp-1）做共聚焦显微镜共定位 细胞系 实验 功能性内化验证 将抗体与皂草素（saporin，一种核糖体失活蛋白）偶联，如果抗体能内化，皂草素进入细胞会杀死细胞；此实验可同时验证内化效率和毒性 细胞系 实验 原代细胞/类器官验证 在患者来源的原代细胞或类器官中重复内化实验，确认临床相关性 原代细胞/类器官 实验 需要具备的实验技术： •荧光显微镜 / 共聚焦显微镜：观察内化动态和亚细胞定位。  •流式细胞仪：高通量定量内化速率。  •抗体荧光标记技术：pHrodo 标记、传统荧光染料标记。  •类器官培养：Matrigel 3D 培养体系。  样本：主要是肿瘤细胞系，进阶验证用原代细胞/类器官（来自临床样本或 PDX 模型）。 步骤五：靶点可成药性与成药性评估        目标：确认靶点是“可成药”的——即能被抗体特异性结合，且结合后不会引起不可接受的毒性。 做什么 具体手段 样本 性质 跨膜区与胞外域预测 用 TopCons、Phobius 等工具预测靶点的跨膜螺旋和信号肽 蛋白序列（UniProt） 计算 表位作图 用氢氘交换质谱（HDX-MS）或丙氨酸扫描突变，确定抗体结合的关键残基 重组蛋白、细胞 实验 种属交叉反应 测试抗体与食蟹猴、小鼠、大鼠等种属的靶点同源性及结合能力 重组蛋白、细胞系、食蟹猴组织 实验 脱靶结合评估 用蛋白芯片（如 HuProt 人类蛋白组芯片）筛选抗体与数千种非靶蛋白的交叉反应 蛋白芯片 实验 抗原脱落评估 用 ELISA 检测细胞培养上清或患者血清中的可溶性靶标，评估抗原脱落风险 细胞上清、血清 实验 需要具备的实验技术： •蛋白表达与纯化：原核/真核表达系统，用于制备重组蛋白。  •表面等离子共振（SPR）/生物膜干涉（BLI）：实时监测抗原抗体结合动力学。  •氢氘交换质谱（HDX-MS）：表位作图，设备昂贵但信息量大。  •蛋白芯片：高通量交叉反应筛查。  样本：重组蛋白、细胞系、食蟹猴样本（用于 NHP 毒理铺垫）。 步骤六：FTO（自由实施）与竞品分析        目标：确保项目不侵犯他人专利，并评估市场竞争格局。 做什么 具体手段 样本 性质 专利检索 检索靶点、抗体序列、ADC 结构等相关专利 专利数据库（智慧芽、Incopat） 文献 序列比对 将候选抗体序列与已知专利序列比对，评估侵权风险 专利序列 计算 竞品管线分析 梳理全球同靶点 ADC 的临床阶段、技术路线、关键数据 临床试验库、会议摘要 文献 需要具备的技术能力： •专利分析能力：熟悉专利法律状态和权利要求解读。  •序列比对工具：BLAST、IgBLAST。  样本：无实体样本。 实验技术手段全景图（按类别汇总）        如果要从零搭建一个 ADC 靶点评估平台，需要以下核心技术模块： 模块 核心技术 关键设备/试剂 生物信息学 RNA-seq 分析、生存分析、跨膜预测、蛋白结构预测 高性能计算集群、R/Python 分子生物学 基因克隆、CRISPR-Cas9、RNAi、qPCR 超净台、PCR 仪、转染设备 细胞生物学 细胞培养（2D/3D）、流式细胞术、显微镜（共聚焦） CO₂ 培养箱、流式细胞仪、共聚焦显微镜 蛋白分析 IHC、Western Blot、ELISA、靶向质谱、HDX-MS 切片机、质谱仪、WB 电泳系统 免疫学 抗体标记（pHrodo 等）、多色流式、蛋白芯片 抗体标记试剂盒、多色流式细胞仪 药理学 原代细胞/类器官培养、PDX 模型 类器官培养系统、动物房 专利情报 专利检索、序列比对 智慧芽/Incopat 账号 国内头部企业的实际做法  国内头部企业（恒瑞、科伦博泰、百济神州、信达等）在靶点评估与验证环节，通常采用“内部核心能力 + 外部 CRO 合作”的模式： •内部团队：负责靶点初筛（生信）、文献/专利调研、IHC 验证（用内部 TMA 库）、细胞水平功能验证（内化、流式）。  •外部 CRO：将靶向质谱、HDX-MS、蛋白芯片、PDX 模型构建等需要重资产设备的任务外包给专业 CRO（如药明康德、康龙化成、昭衍新药、华大蛋白等）。  •医院合作：通过与三甲医院建立联合实验室，获取临床 FFPE 样本和新鲜肿瘤组织，用于 IHC 和原代细胞验证。  典型路线： •Fast-Follow 项目：直接跳过步骤一（靶点发现），从步骤三（表达验证）开始，用公共数据和内部 TMA 快速验证已验证靶点（如 HER2、TROP2）在特定癌种的表达，然后进入抗体发现。  •First-in-Class 项目：完整走完 6 个步骤，重度依赖生信分析和内部/合作医院的样本库，周期长、风险高，但一旦成功回报巨大。  1.2 ADC药物抗体筛选与工程化逻辑       完成了靶点筛选与验证之后，接下来便进入 ADC 药物开发的核心环节——抗体发现与工程化改造。需要明确的是，尽管同样涉及抗体的筛选与优化，但 ADC 药物对抗体的选择逻辑与传统单抗药物有着本质区别：单抗药物追求的是抗体本身的生物学功能（如阻断信号通路或介导免疫细胞杀伤），而 ADC 的抗体则更像是搭载了"细胞毒性弹头"的精准导航系统——它不仅要"认得准"，更要"进得去"，且其结构稳定性必须能够承受后续偶联工艺的改造。 1.2.1 ADC的裸抗选择标准       关于"适合做 ADC 的裸抗"究竟应该满足哪些标准，目前业界尚未形成全球统一的放行阈值。不过，经过 T-DM1、Enhertu 等十余年产品的迭代积累，行业在发现阶段已逐步沉淀出一套筛选优先区间。需要特别强调的是：这些数值只是候选抗体能否进入偶联验证环节的"入场券"，而绝非 ADC 终产品的放行标准——裸抗指标达标，仅仅意味着"偶联后失败的概率较低"；一个抗体最终能否成为合格的 ADC 弹头，仍必须以偶联产物的实际表征数据（如偶联后稳定性、细胞毒性、旁观者效应等）作为最终裁判。       下面按维度给出可操作的区间和建议。 一、靶点结合与内化能力（功能维度）        这是 ADC 抗体区别于普通治疗性抗体的第一道门槛——裸抗本身不一定需要 治疗活性，但必须"认得准、进得去"。 指标 推荐区间 说明 抗原结合 KD（SPR/BLI） 0.1–1 nM ADC 综述给出的可接受阈值；皮摩尔级亲和力有助于肿瘤摄取与 payload 递送 内化速率 kint 需大于解离速率 kd 内化必须快于解离，否则 ADC 在释放 payload 前就脱离抗原 内化效率（流式/显微镜） 30 min–2 h 内可见明显酸性内体定位 与细胞杀伤效力直接相关 靶点表达适应性 能覆盖目标适应症的抗原拷贝数范围 参考阈值：PSMA 10⁴–10⁵ copies/cell、CD33 5×10³–10⁴、HER2 ≥10⁶；但也有 1500 copies/cell 即可起效的案例 种属交叉 与 cyno 抗原结合 为 NHP 毒理研究铺垫 脱靶结合 FACS 阴性细胞信号背景水平 避免正常组织摄取导致毒性       亲和力不是越高越好：ka 或内化过快会造成"结合位点屏障"（binding site barrier），限制 ADC 在肿瘤内部的穿透深度。这也是近年"降亲和力优化肿瘤穿透"策略的理论基础。       值得注意的是，在传统 ADC 的设计逻辑中，"抗体-靶点复合物必须被肿瘤细胞内吞"几乎是金科玉律——因为只有进入细胞，连接子才能在溶酶体中被切割，释放出细胞毒性 payload。然而，随着新型 ADC 的不断开发，这一铁律正在被重新审视：抗体内化能力不再是 ADC 药物对抗体的绝对硬性要求，其重要性必须结合具体项目的靶点特性、连接子化学、payload 膜通透性以及旁观者效应进行综合评估，不可一概而论。       最直接的证据来自 Neri 团队 2017 年发表在 International Journal of Cancer 上的研究。他们用靶向 Tenascin-C 剪切异构体 A1 结构域的 F16 抗体（该靶点定位于肿瘤内皮下细胞外基质，抗体结合后根本不发生内化），通过 Val-Cit 二肽连接子偶联 MMAE，构建出完全非内化的 ADC。令人惊讶的是，这种 ADC 在 U87、A431、MDA-MB-231 三种小鼠肿瘤模型中实现了肿瘤完全消退，治愈剂量仅为 7 mg/kg。机制研究发现，Val-Cit 连接子能够在内皮下细胞外基质中被蛋白酶切割——这颠覆了"Val-Cit 只能在溶酶体内被组织蛋白酶 B 切割"的传统认知。       CD20 这个经典靶点也为"弱内化也能成 ADC"提供了有力佐证。CD20 本身内化速率极慢，曾被长期认为"not considered a desirable target for ADCs"。但 Law 等人早期的研究显示，利妥昔单抗通过可裂解的 Val-Cit 二肽连接子偶联 MMAE 后，在 CD20 阳性淋巴瘤异种移植模型中展现出强大的抗肿瘤疗效——其关键在于 MMAE 具有极强的膜通透性，即使在胞外或细胞表面释放，也能自由穿透细胞膜发挥杀伤作用。这一化学逻辑已被临床验证：国内进入临床的 CD20 ADC（MRG001、TRS005）均采用"I 型抗体 + vc 可裂解连接子 + MMAE"的组合策略，利用 MMAE 的膜通透性弥补 CD20 内化慢的缺陷，在复发/难治性 B 细胞非霍奇金淋巴瘤中获得了 38.2%–46.6% 的客观缓解率。       即便是高度成功的 TROP2 ADC Trodelvy（sacituzumab govitecan），其设计逻辑也在一定程度上"稀释"了对内化效率的绝对依赖。Trodelvy 确实仍通过 TROP2 介导的内吞进入细胞，并在酸性内体/溶酶体中水解连接子释放 SN-38；但由于 SN-38 具有膜通透性，释放后的毒素能够穿透细胞膜，杀死邻近的 TROP2 阴性细胞——即"旁观者效应"。Gilead 的官方机制说明指出，SN-38 在远离血管的肿瘤细胞中也被检测到，且呈现与 TROP2 表达无关的分布模式。这意味着，即使肿瘤群体中并非每个细胞都能高效内化 ADC，只要有一部分细胞能内化并释放 SN-38，毒素就能"扩散"到周围细胞。Enhertu 在 HER2-low 乳腺癌中的突破同样得益于此逻辑：DXd 的强膜通透性 + 高 DAR（~8）+ 旁观者效应，使得 ADC 不再需要"击中每一个肿瘤细胞"，从而降低了对单个细胞高效内化速率的绝对要求。       但需要特别澄清的是："内化不重要"是有严格边界条件的。上述案例的有效性，全部建立在"可裂解连接子 + 膜通透性 payload"的组合基础之上。若将 vcMMAE 中的 MMAE 替换为膜通透性极差的 MMAF，针对弱内化靶点的 ADC 活性会完全消失；而 T-DM1 使用的不可裂解连接子 + 膜不通透的 DM1，则必须高度依赖内化与溶酶体降解，因此只对 HER2 高表达且均一的肿瘤有效。       因此，在当代 ADC 开发中，抗体内化能力的考量必须具体项目具体分析：对于选择不可裂解连接子或膜不通透毒素（如 DM1、MMAF）的 ADC，内化效率依然是决定生死的关键变量；而对于选择可裂解连接子 + 高膜通透性毒素（如 MMAE、DXd、SN-38）的 ADC，即使靶点内化能力一般甚至不内化，也可通过胞外释放、旁观者效应或靶向肿瘤微环境（TME）成分等策略实现疗效。这也解释了为何当下 ADC 开发中选择"可裂解连接子 + 高膜通透性毒素"成为主流——它本质上是用化学手段"购买"了对抗体内化能力的容错空间，使得 ADC 的抗体选择逻辑从"必须高效内化"扩展到了更广阔的"连接子-毒素组合代偿"维度。 二、物理稳定性（热稳定性与聚集倾向）        这是裸抗"偶联耐受性"的核心预测指标。偶联后 CH2 域通常会被显著扰动、Tm 下降、聚集倾向升高，且这种变化与 DAR 正相关——所以裸抗必须留出足够余量。 指标 方法 推荐区间 警戒线 Fab Tm DSF/DSC >65°C <59°C 风险高 CH2 Tm1 DSF/DSC >65°C <55°C 高风险 CH3 Tm DSC >70°C — Tagg（聚集起始温度） DLS/SLS >55°C <55°C 风险高 Tm1 onset DSF 与 Tm1 差值 < 5°C 差值过大提示协同性差       为什么 CH2 的 Tm 如此关键？ 文献反复证实：偶联后 CH2 域是构象稳定性受冲击最严重的区域——T-DM1 研究中，仅连接子附着（T-MCC）就让 trastuzumab 的 CH2 Tm 下降，偶联 DM1 后进一步下降；半胱氨酸偶联 vc-MMAE/mc-MMAF 后，HDX-MS 也检测到 CH2 和 CH2-CH3 界面构象动力学增强。因此裸抗的 CH2 Tm 必须留出 5–10°C 的余量，否则偶联后极易跌入不稳定区。       Tm 本身对 ADC 长期储存稳定性的预测力有限——AbbVie 的研究显示 Tagg 和 B22 与 40°C 加速 8 周后 HMWS 形成的相关性（ρ>0.8）远强于Tm。但在裸抗筛选阶段，Tm 仍是最实用的高通量指标；进入 ADC 形态后，必须把 Tagg、B22、kD 作为核心预测指标补上。 三、胶体稳定性与疏水性（"疏水预算"维度）        这是 ADC 特有的考量——payload 几乎都是高度疏水的，偶联后抗体表面疏水性会显著跃升，导致胶体稳定性下降、聚集增加。 指标 方法 推荐区间 SEC 单体纯度 SEC-HPLC ≥95%，HMW ≤3%（早期评估通用门槛） HMW（裸抗） SEC-HPLC <2% 为佳，<3% 可接受 LMW（裸抗） CE-SDS 或 SEC <1% 电荷异质性（icIEF） icIEF 主峰占比 >70%，酸性/碱性变体各 <15% B22（低浓度胶体稳定性） SLS >0（净排斥） kD（动态光散射） DLS >0 表面疏水性 HIC 保留时间 / 疏水荧光探针 留出"疏水预算"——裸抗本底疏水性越低越好       "疏水预算"概念：偶联后表面疏水性会显著增加（auristatin 类尤其明显），这是聚集的主驱。因此裸抗本底的 HIC 保留时间应尽量短、疏水探针信号尽量低，为 payload 的疏水性"留空间"。裸抗阶段疏水性偏高的候选，偶联后几乎必然聚集。 四、表达与可生产性  指标 推荐区间 说明 瞬时转染表达量 >50 mg/L 低表达预示下游纯化损失大 稳定池表达量 >1 g/L 为商业化生产留余地 纯化收率 >60% 低收率常伴随聚集/降解 糖基化（尤其 Fc 岩藻糖） 依 ADC 类型而定 若不需 ADCC，岩藻糖化正常即可；若需增强 ADCC，可考虑 AFuc 五、化学稳定性与 PTM 热点  指标 推荐做法 脱酰胺热点（Asn/Gln） 处于 CDR 且关键则保留，否则工程化去除 异构化（Asp-Gly/Asp-Ser） 评估应力下降解风险 氧化（Met/Trp/Cys） 尤其关注铰链区 Cys 附近的 Met 应力测试 高温/强光/氧化条件下孵育，SEC + icIEF 监控降解       ADC 特有风险：偶联造成的局部构象扰动可能暴露裸抗阶段被埋藏的 PTM 热点，使其变为活性位点。因此裸抗的化学稳定性余量要比普通治疗性抗体更保守。 六、偶联兼容性（ADC 特有维度，最容易被忽视）        这是普通抗体成药性评估里没有、但 ADC 发现阶段必须加的"第六维"： 考察项 推荐标准 表面可及赖氨酸分布 若做定点偶联，需提前工程化；若随机赖氨酸偶联，需评估溶剂可及赖氨酸是否集中在 CH2（CH2 域赖氨酸偶联会显著 destabilize） 链间二硫键可还原性 半胱氨酸偶联需确保部分还原后结构完整性可控 工程化偶联位点（若定点） 溶剂可及性适中 + 局部正电荷微环境最优（参考 THIOMAB 研究：LC-V205C 优于 Fc-S396C） Fab 结合对局部构象扰动的鲁棒性 偶联后 SPR KD 变化 < 3 倍为佳 DAR 均一性潜力 定点偶联路线优先，目标 DAR 2 或 4       关键认知：文献明确指出，偶联会通过三种机制破坏裸抗性质——①疏水性增加降低胶体稳定性；②赖氨酸偶联丢失正电荷、减少静电排斥；③CH2 域构象扰动。这意味着即便裸抗在常规指标上完美，偶联后仍可能聚集——所以"偶联兼容性"这一维必须在发现阶段就通过原型偶联验证。 七、ADC 发现阶段的"淘汰门槛"建议  把上述维度整合为一个分级筛选漏斗： 优先推进（裸抗阶段） •Fab Tm > 65°C，CH2 Tm1 > 65°C  •SEC 单体 ≥ 95%，HMW ≤ 2%  •HIC 疏水性本底偏低  •KD 0.1–1 nM，内化快于解离  •瞬时转染表达 > 50 mg/L  •电荷异质性适中（主峰 > 70%）  可接受但需改造 •Tm1 在 55–65°C 之间：可通过序列工程化提升  •HMW 2–3%：优化纯化或制剂可救  •表达量 20–50 mg/L：评估稳定池潜力  直接淘汰 •CH2 Tm1 < 55°C（偶联后必然跌入不稳定区）  •HMW > 3%  •表面疏水性本底偏高（HIC 保留时间长）  •抗原结合 KD > 10 nM 或内化速率 ≤ 解离速率且计划采用不可裂解连接子/膜不通透毒素 •严重 PTM 热点且位于 CDR 关键位置  八、最重要的提醒：裸抗指标 ≠ ADC 指标        上述所有区间都是裸抗阶段的筛选标准。真正的"ADC 可开发性"必须在偶联后用以下指标重新评估： •SEC-HPLC：HMWS 变化（ΔHMWS%）作为物理稳定性主要衡量标准，加速稳定性 40°C 8 周后 ΔHMWS 越低越好  •HIC-HPLC：DAR 分布与异构体谱  •DLS / SLS：Tagg 与 B22（预测力最强）  •DSF / DSC：偶联前后 Tm 对比，CH2 域扰动幅度  •CD 光谱：二级结构变化  •SPR / 细胞结合：抗原结合保留率（目标 > 70%）  •细胞杀伤：EC50 与裸抗相比应有数量级提升        一个常被忽视的事实：Tm 在裸抗阶段是好的筛选指标，但对 ADC 终产品的储存稳定性预测力有限——AbbVie 研究显示 Tm 与 40°C 加速 8 周的 ΔHMWS 无显著相关性，而 Tagg（ρ>0.8）和 B22（ρ>0.7）才是强预测因子。这提示我们：裸抗阶段看 Tm 筛候选，ADC 阶段看 Tagg+B22 做制剂筛选。 1.2.2抗体产生与初步筛选：在“湿实验”中寻找最优解  1.2.2.1抗体产生的三条主流技术路线        不同阶段、不同资源禀赋的企业会选择不同路线，三条路线各有优劣： 路线 技术原理 亲和力范围 人源化程度 周期 适合场景 杂交瘤 免疫动物 B 细胞与骨髓瘤细胞融合 0.1–10 nM 需要后续人源化 数月 经典路线，许多上市 ADC 抗体来源 噬菌体/酵母展示 抗体片段展示在噬菌体/酵母表面，构建大型文库，"吸附-洗脱-扩增"循环筛选 1–100 nM 不需人源化（可直接全人源） 数周 高通量、无需免疫、可全人源 单 B 细胞 / 转基因小鼠 流式分选抗原特异性 B 细胞 + 单细胞 PCR；或转基因小鼠直接产生全人源抗体 0.1–10 nM 不需 数周–数月 周期与全人源兼顾 酵母展示平台流程很典型：抗原准备 → 定制化抗体文库构建 → FACS 筛选高亲和力克隆 → 亲和力/特异性/表位验证 → 亲和力成熟 → ADC 构建评估 。 国内头部企业实际选择： •恒瑞：单 B 细胞测序平台 + 高通量展示技术筛选，并配有高通量自动化抗体生产  •百济神州：基于多层组学数据整合分析和生物学实验室验证，发现并验证创新性 ADC 靶点  •荣昌生物：全面集成 ADC 平台，自研桥接偶联技术  •信达生物：自研 αTAA 平台 + 与 Synaffix 合作获取定点偶联技术        现代 ADC 发现的一个显著趋势：不再单一依赖某条路线，而是"杂交瘤/单B/展示"多路线并行，哪个出好克隆就用哪个。恒瑞、百济等头部企业均是这种"组合拳"打法。 1.2.2.2初步筛选的五层漏斗（核心实验手段）  第一层：抗原结合筛选（ELISA / FACS / BLI / SPR）  从文库/杂交瘤上清中筛出"能结合"的克隆： •ELISA：高通量初筛，适合从数百到数千克隆中快速分流  •FACS：基于抗原表达细胞的流式筛选，能同时评估结合与内化倾向  •BLI（Octet）：生物层干涉技术，并行测量蛋白-蛋白相互作用，无需检测试剂  •SPR（Biacore）：精确测定 KD、ka、kd，是亲和力"金标准"  关键参数： •目标 KD：0.1–1 nM（ADC 黄金区间）  •内化速率必须快于解离速率（kinternalization > koff）（需根据ADC产品释放payload的逻辑来确定）  第二层：内化能力筛选（最关键，ADC 特有）  抗体结合好不等于内化好。主流有两种筛选方法： ① 荧光标记 + 流式/高内涵 •抗体 NHS-SS-biotin 或直接荧光标记  •4°C 结合 → 37°C 启动内化 → 低 pH 缓冲液去除表面抗体 → 流式/高内涵定量  •可同时评估数百个抗体  ② Fab-ZAP 内化筛选系统 •Fab 片段偶联皂草素（saporin），内化后核糖体失活 → 细胞死亡  •敏感性高，可检测中等亲和力抗体的内化  •文献报道可适合数百至上千个抗体的中等规模筛选  注意：Fab-ZAP 等替代方法的数据与真实 ADC 可能不完全一致 ，所以只能用于"初筛分流"，不能替代后续的"小量 ADC 直接筛选"。 第三层：交叉反应与特异性  •种属交叉：测试与食蟹猴等 NHP 靶点的交叉反应（为毒理铺垫）  •脱靶筛选：蛋白芯片（HuProt 等）评估与非靶蛋白的交叉反应  •正常组织交叉：确认抗体不与关键正常组织抗原结合  第四层：初步可开发性  •表达量：瞬时转染 >50 mg/L 为佳  •纯度：SEC 单体 ≥95%，HMW ≤2–3%  •热稳定性：DSF 测 Tm，Fab >65°C，CH2 >65°C  •聚集倾向：DLS 测 B22、kD  •疏水性：HIC 保留时间，留出"疏水预算"  第五层：小量 ADC 直接筛选（最关键的一步，决定 ADC 排名）        这是 ADC 抗体筛选最具决定性的一环——抗体排名 ≠ ADC 排名。很多在抗体水平表现优异的克隆，做成 ADC 后细胞毒性反而差 。 药明 XDC 的高通量偶联平台是行业标杆做法 ： 1.Protein A/G 捕获抗体：从纯化抗体或杂交瘤上清中捕获  2.柱上偶联：在 Protein A/G 微球上进行偶联反应  3.统一 DAR：通过 NEM + vcMMAE 混合偶联，确保不同抗体获得一致的 DAR  4.96 孔板规模：高通量制备数十到数百个小量 ADC  5.质量控制：每个 ADC 测浓度、SEC 纯度、DAR  6.细胞毒性排序：在相同 DAR 下，用 OVCAR-3 等细胞系测 IC50 和最大杀伤  支持的偶联方式： •半胱氨酸偶联：MC-vcMMAE  •赖氨酸偶联：SMCC-DM1  •其他：MC-GGFG-DXd 等        这一步的本质是：把"偶联后功能"前移到抗体筛选阶段。一个裸抗完美但做成 ADC 后细胞毒性差的克隆，在这一步就被淘汰，避免推进到下游才发现。 1.2.2.3必备的实验技术平台清单        如果要从零搭建 ADC 抗体发现平台，需要以下核心技术模块： 1. 抗体产生平台  •杂交瘤技术：免疫动物、细胞融合、HAT 筛选  •噬菌体展示：文库构建、淘选、scFv/Fab 表达  •酵母展示：FACS 高通量筛选  •单 B 细胞平台：流式分选、单细胞 PCR、VDJ 测序  •转基因小鼠：RenMab/RenLite/RenNano 等全人源小鼠平台  2. 抗体表达与纯化  •瞬转表达：Expi293 / ExpiCHO 系统  •蛋白 A/G 纯化：AKTA 层析系统  •高通量表达：96 孔深孔板小规模表达 + 自动化纯化  3. 结合动力学分析  •SPR（Biacore 8K）：亲和力精确测定  •BLI（Octet）：高通量、无标记  •ELISA / FACS：初筛  4. 内化与功能筛选  •流式细胞仪（BD FACSCelesta 等）：内化定量  •高内涵成像：Incucyte 活细胞成像系统，实时监测内化、杀伤、旁观者效应  •Fab-ZAP 系统：中等通量内化筛选  •iQue 高通量流式：单孔内多重分析  5. 小量 ADC 偶联平台  •Protein A/G 柱上偶联：96 孔板规模  •DAR 控制：NEM 封端 + 位点特异性偶联  •ADC 纯化：尺寸排阻色谱（SEC）去除游离 payload  •ADC 分析：HPLC-SEC（纯度）、LC-MS（DAR）、HIC（异构体分布）  6. 可开发性初筛  •DSF/differential scanning fluorimetry：热稳定性  •SEC-HPLC：聚集体  •DLS：流体力学半径、B22  •HIC：疏水性  •icIEF：电荷异质性  7. 细胞水平功能验证  •CellTiter-Glo / CCK-8：细胞毒性  •共培养旁杀：流式或高内涵读数的旁杀系数  •PDX/类器官：临床相关性验证  1.2.2.4国内头部企业的实际做法        综合公开材料，国内头部 ADC 企业在"抗体产生与初步筛选"环节的打法呈现三大共性： 1. 恒瑞医药：全栈自研 + 单 B 细胞平台  •恒瑞构建了完整的内部能力 ： •单 B 细胞测序平台：高通量单 B 细胞测序 + 自动化抗体生产 + 生物信息学分析  •高通量展示技术：利用高通量展示技术进行抗体筛选，同时优化分子的亲和力和成药性  •ADC 创新平台（HRMAP）：包含不同 MOA 的有效载荷、最佳连接子/偶联方式，以及成熟的抗体发现和工程能力  •特点：全产业链闭环，从抗体发现到 ADC 构建全程内部完成  2. 百济神州：组学驱动 + 全球化标准  •多层组学数据整合：基于多层组学数据整合分析和生物学实验室验证，发现并验证创新性 ADC 靶点  •特点：强调"创新性靶点"的 First-in-Class 策略，抗体发现与靶点验证深度耦合  3. 科伦博泰：生物信息学辅助 + OptiDC 平台  •生物信息学辅助的抗体发现工作流程 •OptiDC 平台：已建立广泛的细胞毒性小分子库、亲水性连接子、可定制 DAR  •特点：强调"抗体-连接子-载荷"的整体优化  4. 信达生物：自研 + License-in 双轨  •自研 αTAA 平台：差异化抗体发现  •与 Synaffix 合作：引入临床阶段定点偶联技术，快速基于自有抗体开发 ADC  •特点：抗体自己发现，偶联技术合作引入，加速管线推进  5. 荣昌生物：全面集成 ADC 平台  •自研全面集成 ADC 平台：包含 ADC 连接子及载荷优化的筛选平台、专有 Thiel-bridge 偶联技术、载荷及偶联工艺开发、连接子/载荷 GMP 合成、ADC 的 DS/DP GMP 生产  •特点：维迪西妥单抗（RC48）已商业化，平台经过上市验证  6. 君实生物：自动化高效筛选  •抗体偶联药研发平台：结合已有的抗体筛选及功能测定的自动化高效筛选平台 + 自主开发的抗体偶联药高效平行合成技术  •特点：强调"自动化"和"快速筛选最优候选抗体"  1.2.2.5国内头部企业的共性模式        把上述企业的实践提炼出来，国内头部 ADC 企业在"抗体产生与初步筛选"环节普遍采用： 1. "内部核心能力 + 外部合作"的混合模式 •内部：单 B 细胞平台、噬菌体展示、杂交瘤、高通量筛选、小量 ADC 偶联  •外部合作：信达 + Synaffix（定点偶联技术）、多家企业与药明 XDC 等 CRO 合作  2. 早期引入"小量 ADC 直接筛选" •借鉴药明 XDC 的高通量偶联平台思路 ，在抗体筛选阶段就用统一 DAR 的小量 ADC 做细胞毒性排序  •这一步把传统的"先选抗体 → 再做 ADC"的串行流程，改为"抗体筛选与 ADC 功能验证"并行  3. 生物信息学辅助 •科伦博泰明确采用生物信息学辅助的抗体发现工作流程  •百济神州用多层组学数据整合指导靶点发现和抗体设计  4. 自动化与高通量 •君实生物的自动化高效筛选平台  •恒瑞的高通量展示技术 + 自动化抗体生产  •这是头部企业相对于中小 Biotech 的核心优势——能用机器人做大规模并行筛选  5. 全人源化路线为主 •单 B 细胞、转基因小鼠（RenMab 等）等全人源技术路线成为主流  •传统杂交瘤的人源化改造逐步减少  1.3 抗体工程化与优化：以“ADC终产品性能”为锚点        抗体工程化与优化是 ADC 发现阶段从“找到一个能结合的抗体”到“找到一个做成 ADC 后疗效、安全性、可生产性俱佳的 PCC”的关键一跃。它的核心逻辑是：所有改造都必须以"ADC 终产品性能"为锚点反向优化，而不是把裸抗优化到传统指标完美就结束——这正是前几轮我们反复强调的"裸抗调好了≠偶联后没问题"在工程化阶段的体现。 1.3.1工程化优化的六大目标维度        从初筛阶段拿到的 lead 抗体通常存在某些"短板"，工程化要针对性补强。六大优化方向： 维度 优化目标 典型手段 亲和力调优 KD 调到 0.1–1 nM 黄金区间；避免过度亲和导致肿瘤穿透差 定向进化、亲和力成熟、CDR 突变 表位优化 选择能促进内化、且内化后能有效释放 payload 的表位 表位作图、竞争结合筛选 Fc 工程 调控 ADCC/CDC（依 ADC 设计需求开/关）、延长半衰期、降低免疫原性 Fc 静默突变（LALA-PG）、FcRn 突变延长半衰期 人源化与去免疫原性 鼠源/兔源抗体转人源，消除 T 细胞表位 CDR 移植、框架区人源化、T 细胞表位删除 结构稳定性与可开发性 提升热稳定性（CH2 Tm 留出余量）、降低聚集倾向、优化"疏水预算" 保守区突变、去糖基化工程 定点偶联兼容性 引入确定的偶联位点，实现 DAR 均一 工程化半胱氨酸（Thiomab）、非天然氨基酸、酶促偶联位点、糖基化位点工程       这六个维度不是串行而是并行迭代——一个 CDR 突变可能同时影响亲和力、表位和内化；一个 Fc 突变可能影响半衰期和免疫原性。因此工程化阶段必须是"设计-构建-测试-学习"的闭环。 1.3.2项目开展的标准流程  第一步：基线全面表征（Benchmarking）        在动手改造前，先把 lead 抗体的"家底"摸清楚： •结合动力学：SPR/BLI 测 KD、ka、kd  •内化能力：pHrodo 流式或表面淬灭法测 ke 和 t1/2  •表位初步定位：竞争 ELISA 与已知表位的抗体竞争  •可开发性基线：DSF（Tm1/Tm2）、SEC（HMW%）、DLS（B22/kD）、HIC（疏水性）、icIEF（电荷异质性）  •原型偶联验证：用统一 DAR 的小量 ADC 测试细胞毒性 IC50 和旁杀效应        这一步是后续所有改造的"参照系"。没有基线数据，就无法判断某个突变是改善还是恶化了 ADC 性能。 第二步：计算机辅助设计（AI + 结构生物学）        这是近年变化最大的环节。现代抗体工程化已经不再是"盲突变+高通量筛选"的海选模式，而是计算预测指导下的精准突变： ① 结构建模 •AlphaFold2 / RoseTTAFold：预测抗体 Fv 区结构，特别是 CDR 环的构象  •分子对接：将抗体 Fv 与抗原结构对接，预测结合界面  •表位-构象关联分析：判断哪个表位更有利于内化  ② 突变效应预测 •蛋白语言模型（ESM-2、ProtT5）：从序列预测突变对折叠稳定性、表面暴露的影响  •ThermoNet / DDG 预测器：预测单个突变的 ΔΔG，筛选不会破坏结构的突变  •DeepAb 等专用模型：CDR 区突变对亲和力的影响预测  •免疫原性预测：用 AI 模型预测突变后是否引入新的 T 细胞表位  ③ 定点偶联位点设计 •用 Rosetta 或深度学习模型扫描抗体表面，识别溶剂可及性适中、局部带正电荷（稳定 Maleimide 连接）、且远离 CDR 和抗原结合面的位点  •Genentech THIOMAB 研究的经验：LC-V205C 这种"部分溶剂可及+正电荷微环境"的位点最优；Fc-S396C 这种高溶剂可及位点血浆中最不稳定  ④ 多目标优化 •用 Bayesian optimization 或遗传算法，在"亲和力↑、稳定性↑、聚集↓、疏水性↓、免疫原性↓"多个目标间找 Pareto 最优解集  •输出 10–50 个候选突变体（单点、双点、三点组合）  第三步：突变体构建与表达  实验手段： •定点诱变：重叠 PCR 或合成基因片段，构建突变体质粒  •瞬转表达：Expi293/ExpiCHO 系统，96 深孔板小规模表达  •自动化高通量纯化：AKTA 高通量层析系统，Protein A 捕获  •前沿技术：无细胞蛋白合成（CFPS）系统可在微孔板规模快速表达数百个突变体，Sutro Biopharma 用此法对 Trastuzumab 框架做了系统性位点扫描，快速识别最优非天然氨基酸插入位点  第四步：体外筛选与表征  第一层：结合与内化快速分流 •BLI（Octet）：高通量测 KD，每小时可测数十个突变体  •FACS：抗原表达细胞上的结合和解离  •pHrodo 内化流式：内化速率 ke 的快速评估  第二层：可开发性筛选 •DSF：Tm1/Tm2 热稳定性  •SEC-HPLC：HMW%  •DLS：B22、流体力学半径  •HIC：疏水性本底  第三层：原型偶联 + ADC 功能验证（最关键） 用统一 DAR（如 DAR4 的 vcMMAE）做小量柱上偶联  •SEC-HPLC：偶联后 HMW 变化（ΔHMW%）  •LC-MS：DAR 分布  •SPR：偶联前后 KD 保留率（目标 >70%）  •细胞毒性：Ag+ 细胞 IC50、Ag- 旁杀效应  •体外稳定性：40°C 加速 1–2 周，监测 ΔHMW%  这一层是工程化阶段的"终审"——一个裸抗状态完美的突变体，如果做成 ADC 后 HMW>10% 或 IC50 不降反升，必须淘汰。 第五步：Fc 工程与定点偶联位点整合  当 Fv 区优化到位后，进入 Fc 区和偶联位点工程： •Fc 静默（如需）：引入 LALA-PG 突变（Leu234Ala、Leu235Ala、Gly237Pro、Gly237Ala）消除 FcγR 结合  •半衰期延长（如需）：引入 FcRn 结合增强突变（如 M428L/N434S）  •定点偶联位点引入：  •Thiomab 路线：在 CH3 或轻链 CL 区引入工程化半胱氨酸（如 lcK149C），实现 DAR2 均一偶联  •非天然氨基酸路线：在 CH3 区引入琥珀密码子 + 正交 tRNA/aaRS 系统，在发酵时掺入叠氮苯丙氨酸等，再用点击化学偶联  •酶促偶联路线：引入转谷氨酰胺酶识别位点（如 Q295 附近）或 Sortase 识别序列  •糖基化偶联路线：利用 N297 糖基化位点，通过糖工程引入叠氮基团，SPAAC 点击化学反应  第六步：PCC 确认与可生产性评估  最终候选（PCC）必须通过的门槛： •亲和力：KD 0.1–1 nM  •内化：ke 足够高，t1/2 < 6 h  •偶联后稳定性：40°C 加速 2 周 ΔHMW < 5%  •DAR 均一性：定点偶联 DAR2 或 DAR4，单一主峰 >90%  •细胞毒性：IC50 达 pM–nM 级别  •旁杀效应：φ%Ag+_BE > 30%  •表达量：瞬转 >50 mg/L，稳定池 >1 g/L  •免疫原性：T 细胞表位预测阴性  •FTO：序列与现有专利不冲突  1.3.3必备的实验技术平台        如果要从零搭建 ADC 抗体工程化平台，核心模块包括： 1. 计算设计平台  •结构建模：AlphaFold2/3、RoseTTAFold、PyRosetta  •突变效应预测：ESM-2、ProtT5、ThermoNet、DDG 预测器  •表位-构象分析：分子对接（HADDOCK、ClusPro）  •多目标优化：Bayesian optimization 框架  2. 突变体构建与表达  •定点诱变：重叠 PCR、合成基因片段  •瞬转表达：Expi293/ExpiCHO，96 深孔板自动化  •无细胞蛋白合成（CFPS）：Sutro 模式，微孔板规模快速表达  •自动化高通量纯化：AKTA 高通量层析  3. 分析表征  •结合动力学：SPR（Biacore 8K）、BLI（Octet）  •可开发性：DSF、SEC-HPLC、DLS、HIC、icIEF  •结构验证：CD 光谱、HDX-MS（表位/构象）  •质谱：Intact mass、肽图 LC-MS（DAR 位点 occupancy）  4. 小量 ADC 偶联与功能验证  •柱上偶联：Protein A/G 微球上直接偶联  •ADC 纯化：SEC 去除游离 payload  •ADC 分析：HPLC-SEC（纯度）、LC-MS（DAR）、HIC（异构体）  •细胞功能：CellTiter-Glo、高内涵成像旁杀、PDX 类器官验证  5. Fc 工程与定点偶联  •CHOK1 或 ExpiCHO 稳定池构建：用于非天然氨基酸掺入的正交 tRNA/aaRS 系统  •糖工程：EndoS 等糖苷酶处理 + 糖转移酶重塑 N297 糖链  •酶促偶联：转谷氨酰胺酶、Sortase A  1.3.4国内头部企业的实际做法        综合公开资料，国内头部 ADC 企业在抗体工程化与优化环节的打法各有特色，但共性明显： 1. 恒瑞医药：HRMAP 平台 + 定点偶联布局  •HRMAP 平台：实现抗体分子的精准高效筛选，自研技术覆盖抗体优化全生命周期  •定点偶联技术：积极搭建新一代定点偶联技术，已有 8 个 ADC 产品进入临床，数量国内领先  •双抗 ADC 平台：开发 E-cM-Topi（EGFR/c-Met）、EM-TOPi（EGFR/MUC1）等双抗 ADC  •特点：全产业链闭环，从抗体发现、工程化到 ADC 构建全程内部完成  2. 科伦博泰：OptiDC 平台  •全链条能力：OptiDC 平台具备抗体优化、有效载荷筛选、连接子修改和专有偶联技术的全链条能力  •三次牵手默沙东：累计交易超 118 亿美元，平台价值获全球验证  •特点：抗体优化与连接子-载荷优化深度耦合，强调"为特定生物靶点量身定制 ADC"  3. 荣昌生物：ThioBridge 专有偶联技术  •ThioBridge 技术：专有的桥接偶联方法，用一个或多个自由巯基共价偶联  •成功孵化：维迪西妥单抗（RC48）已获批，是首个中国自主研发上市的 ADC  •Seagen 26 亿美元授权：平台价值获国际认可  •特点：工程化半胱氨酸路线实现 DAR 均一控制  4. 百济神州：抗体工程平台  •全球多中心临床试验 6 项：国内 ADC 企业中最多  •专利申请 185 项：国际合作伙伴 10 家，出海最深  •特点：基于多层组学数据整合分析和生物学实验室验证，强调创新性靶点的 First-in-Class 策略，抗体工程与靶点验证深度耦合  5. 信达生物：αTAA 平台 + Synaffix 合作  •自研 αTAA 平台：差异化抗体发现  •双 payload ADC 平台：IBI3020 双 payload ADC 进入临床  •与 Synaffix 合作：引入临床阶段定点偶联技术（GlycoConnect 等），快速基于自有抗体开发均一 ADC  •特点：抗体自己发现 + 偶联技术合作引入，加速管线推进  6. 百利天恒：双/多特异性抗体 ADC 平台  •四大创新平台：包括"多特异性抗体新型分子结构平台"、"全链条一体化 ADC 药物研发核心技术平台"  •BL-B01D1：全球独家 HER3/EGFR 双靶 ADC，已有 4 款 ADC 进入临床  •特点：在抗体工程化阶段重度依赖 AI 辅助设计，优化双抗链配对、结合几何、Fc 沉默  7. 君实生物：自动化高效筛选  •自动化高效筛选平台：抗体偶联药高效平行合成技术  •特点：强调"自动化"和"快速筛选最优候选抗体"，用机器人做大规模并行工程化突变体筛选  8. 三优生物等新兴力量  •模块化 ADC 平台：涵盖靶点验证、抗体筛选、连接子-载荷优化、体外药效评估  •强调高通量筛选和模块化设计：快速评估不同抗体、连接子、载荷组合的效果  1.3.5国内头部企业的共性规律        把上述企业的实践提炼出来，可以看到四条共性主线： 1. "内部核心能力 + 外部合作"的混合模式 •内部：单 B 细胞平台、噬菌体展示、杂交瘤、高通量筛选、小量 ADC 偶联、定点偶联技术自研  •外部合作：信达 + Synaffix、多家企业与药明 XDC 等 CRO 合作  2. 定点偶联技术成为核心竞争力 •恒瑞、荣昌、信达等头部企业均在积极布局定点偶联  •Thiomab 工程化半胱氨酸、糖基化位点偶联、酶促偶联是主流三条技术路线  •目的：实现 DAR 均一、提升 ADC 稳定性、改善 PK  3. 双抗 ADC 与双 payload ADC 是差异化突破口 •中国企业在双抗 ADC 和双 payload ADC 的研发投入占全球前列  •百利天恒 BL-B01D1 是全球首个获批临床的双抗 ADC  •信达 IBI3020 是双 payload ADC 代表  4. AI 辅助抗体工程化快速渗透 •百利天恒等企业在双抗 ADC 设计中重度依赖 AI  •AlphaFold2/3、蛋白语言模型、DDG 预测器等工具在国内头部企业中得到应用  •但 AI 预测仍需通过原型偶联和小量 ADC 功能验证来闭环  综上所述：把靶点评估、抗体发现、工程化改造三段串联起来，本质是构建一条递进式证据链：       靶点维度：肿瘤高表达 + 正常组织低暴露（特异性）→ 与肿瘤发生发展直接相关（必要性）→ 蛋白水平绝对定量（表达丰度）→ 内化能力确证（功能性）→ 可成药性 + FTO（可实施性）       抗体维度：能产生（杂交瘤/展示/单 B 细胞）→ 能结合（KD 0.1–1 nM）→ 能内化（ke 足够高）→ 能特异（种属交叉 + 脱靶评估）→ 可开发（表达、稳定性、疏水预算）→ 做成 ADC 后能杀伤（小量偶联直接筛选）       工程化维度：以 ADC 终产品性能为锚点 → 亲和力/表位/Fc/人源化/稳定性/定点偶联六大维度并行优化 → 原型偶联验证闭环 → PCC 确认       国内头部企业的共性模式可以归纳为"内部核心能力 + 外部 CRO 合作"的混合模式：内部负责靶点初筛、抗体发现、小量 ADC 偶联、定点偶联技术自研；外部与药明 XDC 等专业 CRO 合作重资产任务（靶向质谱、HDX-MS、PDX 构建等）；同时通过医院合作获取临床样本。恒瑞、科伦博泰、荣昌、百济、信达、百利天恒、君实等企业虽各有侧重，但都在"自动化高通量筛选 + 定点偶联技术 + AI 辅助设计"三个方向持续投入，这是 ADC 发现阶段相对中小 Biotech 的核心壁垒。       下一章节，连接子、毒素与偶联发现