色谱质谱,物性表征测试(可合作),实验耗材,技术培训
从问题到答案-入血成分常见问题1. 什么是“入血成分”?它包含哪些类型?
入血成分指的是中药或复方在口服(或其他给药方式)后,被机体吸收进入血液循环的化学物质29。只有进入血液,成分才能分布到靶器官发挥药效。
入血成分主要分为三类:原型成分: 中药中原有的成分,直接被吸收进入血液,未发生化学结构变化2。例如:大青叶中的靛玉红、大黄素甲醚等16。代谢产物: 原型成分在体内(肠道菌群或肝脏)经过代谢转化后生成的新物质。这通常涉及甲基化、羟基化、硫酸酯化、葡萄糖醛酸化等反应12。例如:黄酮苷在肠道菌群作用下水解为苷元。内源性产物: 极少数情况下,中药成分与体内物质(如氨基酸)结合生成的物质2。2. 为什么有些中药成分“入血”了,却检测不出来?
这是中药研究中的一大挑战,主要原因包括:浓度极低(痕量): 入血成分往往处于纳克(ng)甚至皮克(pg)级别,被血液中高浓度的蛋白质、脂质等内源性物质掩盖24。基质效应干扰: 血液成分极其复杂,大量无关物质会干扰检测仪器对目标成分的信号识别。代谢过快: 某些成分在体内代谢速度极快,半衰期短,在采样时可能已经转化为代谢物或被排出。3. 科学家是如何检测和分析这些成分的?
目前主流采用高分辨质谱技术,具体流程如下:24
表格
步骤方法/技术作用样品前处理蛋白沉淀法、固相萃取(SPE)去除血液中的蛋白质,富集目标成分2。分离技术UPLC (超高效液相色谱)快速分离复杂混合物中的不同成分。检测技术MS/MS (串联质谱/Orbitrap)提供高灵敏度和结构信息,鉴定分子量和碎片离子23。常用组合UPLC-MS/MS目前最主流的手段,兼顾分离效率和结构鉴定能力29。4. 入血成分与药效之间有什么关系?
“入血”不完全等同于“有效”,但它是发挥药效的物质基础29。潜在活性成分: 研究发现,真正起效的往往是入血的原型成分或其代谢产物。例如,大青叶发挥药效的潜在活性成分就是其入血的生物碱类和黄酮类1。前药概念: 有些中药原型本身无活性,必须经过肠道菌群代谢(转化为入血成分)后才显效。例如,番泻苷必须经肠道菌代谢为苷元才具有泻下作用7。多成分协同: 中药复方(如六味地黄丸)的疗效往往是多种入血成分共同作用的结果,通过调控多靶点、多通路(如PI3K/AKT通路)来实现治疗效果24。5. 哪些因素会影响成分“入血”?药材质量: 原药材的品种、产地(道地药材)、采收时间直接影响有效成分的含量8。炮制工艺: “生熟异用”现象明显。例如,生首乌与制首乌的入血成分种类和含量存在显著差异5。个体差异:肠道菌群: 不同人的肠道菌群组成不同,导致对中药成分的代谢能力不同(如将苷类水解为苷元)7。代谢酶基因: 药物代谢酶(如CYP450)的基因多态性会影响药物的代谢速度,导致血药浓度在不同个体间差异巨大7。给药时间: 研究通常会采集多个时间点(如0.5h, 1h, 2h, 4h)的血样,以绘制药时曲线,确定达峰时间2。6. 研究入血成分有什么实际意义?阐明机制: 解决“中药为什么有效”的问题,从分子层面揭示药效物质基础2。质量控制: 确定哪些成分是真正起效的,从而制定更科学的质量标准(Q-Marker),确保药品批次间的一致性。新药研发: 从入血成分中发现新的药物先导化合物,推动中药现代化和国际化。
中药入血成分研究关键技术解析:从实验设计到Q-marker筛选
正文:
中药入血成分研究是连接药材化学物质与体内药效的关键环节,对阐明中药作用机理、制定质控标准具有重要意义。本文系统梳理入血成分分析的核心技术流程,为相关研究提供实践参考。一、研究价值与设计思路
入血成分分析的核心在于区分“药材成分”与“真正进入循环的药效成分”。理想的质量标志物(Q-marker)应满足制剂可控、体内可检测且与疗效相关三大条件。实验设计需根据研究目标选择模型:
正常动物:背景清晰,适合基础入血成分筛查;
疾病模型动物:可关联药效,适用于机制研究;
正常+疾病模型对比:可系统揭示病理状态对药物代谢的影响。
二、关键实验技术与质控要点
1. 样本前处理与质谱检测
采用标准化前处理流程,结合高分辨质谱(如UPLC-SYNAPT G2-S系统)进行正负离子模式双通道检测,以提高成分覆盖度与鉴定准确性。
2. 入血成分判定逻辑
通过“中药成分库—含药血清—空白血清”三组对比,结合信号强度与统计学差异(如P<0.05,含药/空白>1),科学判定入血成分。引入QC样本与主成分分析(PCA)进行质控,确保数据可靠性。
三、采血策略与数据分析
采血时间点设计应覆盖药物吸收主要阶段,常见方案包括:
基础版(0, 0.5, 1, 2, 4, 8 h):适用于多数成分筛查;
简化版(0, 1, 4 h):适于快速筛选;
扩展版(增加24 h点):用于观察长效成分。
每个时间点建议设置4–5个生物学重复,以保证结果稳健性。四、案例与展望
一项典型研究中,从677个中药成分中鉴定出13个稳定入血成分,为其后续网络药理学与机制研究提供候选分子基础。
入血成分研究通过整合现代分析技术与严谨实验设计,为中药复方物质基础研究、质量标志物筛选及成药性评价提供了关键方法学支持,有力推动中药标准化与国际化进程。
中药入血成分实验方案设计
实验背景 Experimental background
中药作为多组分复杂体系,其药效作用往往是多种有效成分协同作用,通过研究中药的体内入血移行成分,能够更加直观和深入的了解中药化学成分在体内的作用机制,对揭示其药效作用基础具有重要意义。本文介绍清华大学药学技术中心采用LC-MS技术在中药复杂体系药效物质基础研究中的实验方案,供各位老师和同学参考、交流。Traditional Chinese medicine, as a complex system with multiple components, its pharmacological effects are often the synergistic action of various active ingredients. By studying the components of traditional Chinese medicine that enter the blood in the body, it is possible to have a more intuitive and in-depth understanding of the mechanism of action of the chemical components of traditional Chinese medicine in the body, which is of great significance for revealing the basis of its pharmacological effects. This article introduces the experimental scheme of the Pharmaceutical Technology Center of Tsinghua University in the research of the pharmacological material basis of traditional Chinese medicine complex systems using LC-MS technology, for the reference and exchange of teachers and students.
02
实验方案 Experimental plan
2.1 实验仪器 2.1 Experimental equipment
仪器:Waters Synapt G2-Si Qtof质谱仪,配有ACQUITY UPLC I Class system液相色谱仪。Instrument: Waters Synapt G2-Si Qtof mass spectrometer, equipped with ACQUITY UPLC I Class liquid chromatography system.
2.2 中药复方供试品溶液配制 2.2 Preparation of traditional Chinese medicine compound sample solution
取样品20mg,置于15mL离心管内,加入10mL 50%甲醇水溶液(v:v,甲醇:水=50:50),混匀,取上清1mL置于离心管中,14000rpm离心5min,取上清过0.22um微孔滤膜后,置入进样瓶中,待LC-MS分析。Take 20mg of the sample, place it in a 15mL centrifuge tube, add 10mL of 50% methanol aqueous solution (v:v, methanol:water = 50:50), mix well, take 1mL of the supernatant and place it in the centrifuge tube, centrifuge at 14000rpm for 5 minutes, take the supernatant through a 0.22um microporous filter membrane, and place it in the injection bottle for LC-MS analysis.
2.3 动物实验方案 2.3 Animal experimental plan
SD大鼠4只,9周龄雄性,体重280-360g,其中3只作为给药组,每只大鼠给予中药复方药液灌胃,给药剂量按临床等效剂量5-10倍计算(根据复方实际情况计算),空白组按照相同方法灌胃蒸馏水,连续灌胃7d,第7d灌胃前禁食12h,腹主动脉或眼底静脉丛取血置于肝素钠抗凝管中,静置3min,4500rpm离心5min,取上清,置于-80℃冰箱冻存待用。Four SD rats, 9 weeks old, male, weighing 280-360g, among which 3 were used as the administration group, each rat was given a traditional Chinese medicine compound liquid by gavage, the administration dose was calculated as 5-10 times the clinical equivalent dose (calculated according to the actual situation of the compound), the blank group was given distilled water by the same method, gavage for 7 consecutive days, fasting for 12 hours before gavage on the 7th day, blood was collected from the abdominal aorta or retinal venous plexus and placed in heparin sodium anticoagulation tubes, allowed to stand for 3 minutes, centrifuged at 4500rpm for 5 minutes, the supernatant was taken, placed in a -80℃ refrigerator for freezing storage for later use.
2.4 生物样品前处理 2.4 Sample pretreatment
对于血浆样品,取血浆样品100μL或匀浆后脑样品200μL,至于1.5mL EP管内,加入500μL乙腈沉淀蛋白,涡旋2min,14000rpm离心5min,取上清液500μL,氮气吹干,用100μL 50%乙腈水溶液复溶,置入进样瓶中,待UHPLC-MS/MS分析。空白血浆样品采用相同条件处理。For plasma samples, take 100μL of plasma sample or 200μL of homogenized brain sample, add 500μL of acetonitrile to precipitate proteins in a 1.5mL EP tube, vortex for 2 minutes, centrifuge at 14,000 rpm for 5 minutes, take 500μL of the supernatant, dry with nitrogen, dissolve with 100μL of 50% acetonitrile water solution, place in the injection vial, and wait for UHPLC-MS/MS analysis. Blank plasma samples are processed under the same conditions.
对于组织样品,取匀浆后组织样品200μL,至于1.5mL EP管内,加入800μL乙腈沉淀蛋白,涡旋2min,14000rpm离心5min,取上清液500μL,氮气吹干,用100μL 50%乙腈水溶液复溶,置入进样瓶中,待UHPLC-MS/MS分析,空白组织样品采用相同条件处理。For tissue sample preparation, take 200μL of homogenized tissue sample, add 800μL of acetonitrile to precipitate proteins in a 1.5mL EP tube, vortex for 2 minutes, centrifuge at 14,000 rpm for 5 minutes, collect 500μL of supernatant, dry with nitrogen, dissolve with 100μL of 50% acetonitrile water solution, place in the injection vial, and wait for UHPLC-MS/MS analysis. The blank tissue sample is treated under the same conditions.
2.5 色谱条件 2.5 Chromatographic conditions
色谱柱:ACQUITY UPLC HSS T3 column(2.1×100mm,1.8μm),柱温:35℃,进样体积:5μL,流速:0.25mL/min,流动相:A(去离子水,含0.1%甲酸);B(乙腈,含0.1%甲酸),梯度洗脱。Chromatographic column: ACQUITY UPLC HSS T3 column (2.1×100mm, 1.8μm), column temperature: 35°C, injection volume: 5μL, flow rate: 0.25mL/min, mobile phase: A (deionized water, containing 0.1% formic acid); B (acetonitrile, containing 0.1% formic acid), gradient elution.
2.6 质谱条件 2.6 Mass Spectrometry Conditions
采用ESI离子源,正负离子模式分别扫描,MSE模式,扫描时间0.1s,质量范围50-1500Da,离子源温度150℃,脱溶剂温度500℃,锥孔气和脱溶剂气流速分别为50L/H和800L/H,毛细管电压在正离子和负离子模式下分别为3kV和2.5kV,锥孔电压为40V,采用亮氨酸脑啡肽做实时校正。Using ESI ion source, scanning in positive and negative ion modes, MSE mode, scanning time 0.1s, mass range 50-1500Da, ion source temperature 150°C, desolvation temperature 500°C, cone gas and desolvation gas flow rates are 50L/H and 800L/H respectively, capillary voltage is 3kV in positive ion mode and 2.5kV in negative ion mode, cone voltage is 40V, and leucine enkephalin is used for real-time calibration.
03
实验结果 Experimental results
3.1 TIC图 3.1 TIC diagram
中药复方供试品、空白血浆、给药后血浆样品的TIC图如图1-图6所示:The TIC (Total Ion Chromatogram) of the traditional Chinese medicine compound, blank plasma, and plasma samples after administration are shown in Figures 1-6
图1 中药复方的正离子模式TIC图 Figure 1 TIC diagram of the cationic mode of traditional Chinese medicine formula
图2 中药复方的负离子模式TIC图 Figure 2 Negative ion pattern TIC diagram of traditional Chinese medicine compound
图3 空白血浆样品的正离子模式TIC图 Figure 3 Total ion current (TIC) chromatogram of a blank plasma sample
图4 空白血浆样品的负离子模式TIC图 Figure 4 Negative ion mode TIC diagram of blank plasma sample
图5 给药血浆样品的正离子模式TIC图 Figure 5: TIC diagram of the positive ion mode of the drug plasma sample
图6 给药血浆样品的负离子模式TIC图 Figure 6 Negative ion mode TIC chromatogram of the drug plasma sample
3.2 中药复方物质基础分析 Analysis of the material basis of traditional Chinese medicine compound preparations
采用Unifi软件进行原始质谱数据特征峰提取,特征峰元素匹配、分子式预测及同位素分布,采用TCM天然产物数据库进行化合物鉴定,基于药材进行针对性建库,提高检索准确度。阳性结果筛选标准为质量偏差<5ppm、符合同位素分布且具有MS2碎片离子匹配信息。代表性结果如下表:Using Unifi software for the extraction of characteristic peaks from raw mass spectrometry data, element matching of characteristic peaks, molecular formula prediction, and isotope distribution. Compound identification is performed using the TCM natural product database, with targeted library construction based on medicinal materials to improve search accuracy. The positive result screening criteria are a mass deviation of less than 5ppm, conformance with isotope distribution, and matching information of MS2 fragment ions. Representative results are as shown in the table below:
3.3 中药入血成分分析 Traditional Chinese medicine ingredients in blood analysis
在对于中药物质基础研究分析结果基础上,进一步开展入血成分分析,首先将空白血浆样品中的特征峰在给药组血浆样品中扣除,并匹配同时在中药复方和给药血浆样品中寻存在的特征峰,并进行鉴定。代表性结果如下表:Based on the analysis results of the material basis of traditional Chinese medicine, further blood component analysis was conducted. First, the characteristic peaks in the blank plasma samples were subtracted from the plasma samples of the administration group, and characteristic peaks existing simultaneously in the traditional Chinese medicine compound and administration plasma samples were matched and identified. Representative results are shown in the table below:
3.4 网络药理学分析 3.4 Network Pharmacology Analysis
基于LC-MS分析结果,将入血成分作为候选化合物,通过Pubchem等数据库得到化合物SMILES结构式,通过Swiss Target Prediction数据库(http://swisstargetprediction.ch/)预测入血活性成分靶点。采用Gene Cards数据库(https://www.genecards.org/)获取关注疾病靶点并在Venny(http://swisstargetprediction.ch/)软件中取二者交集,在Cytoscape软件中构建“药物-入血成分-靶点-疾病”分子网络。Based on the LC-MS analysis results, the blood components are treated as candidate compounds. The SMILES structural formulas of the compounds are obtained through databases such as Pubchem. The blood active component targets are predicted through the Swiss Target Prediction database (http://swisstargetprediction.ch/). The target points of the diseases of concern are obtained through the Gene Cards database (https://www.genecards.org/), and the intersection of the two is taken in the Venny (http://swisstargetprediction.ch/) software. A molecular network of "drug-blood component-target-disease" is constructed in the Cytoscape software.
04
小结 Summary
高分辨质谱技术能够提供精确质量数信息,与液相色谱技术的联用实现对于复杂体系样品中化学物质基础和药效物质基础的准确鉴定,后续的网络药理学分析则能在整体上预测药物靶点,高分辨质谱提供的确切入血成分信息则能够与网络药理学的高通量筛选有机结合,是天然药物药效物质研究的有力技术手段。High-resolution mass spectrometry technology can provide precise mass information, and its combination with liquid chromatography technology can achieve accurate identification of the fundamental and pharmacodynamic substances in complex system samples. Subsequent network pharmacology analysis can predict drug targets as a whole, and the accurate blood component information provided by high-resolution mass spectrometry can be organically combined with high-throughput screening in network pharmacology, making it a powerful technical means for the study of natural drug efficacy substances.
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