Ubiquitination, an essential post-translational regulatory mechanism, is primarily controlled by E3 ubiquitin ligases that dictate substrate specificity. Following microbial invasion, the innate immune defense mechanism is rapidly activated, wherein transforming growth factor-β-activated kinase 1 (MAP3K7/TAK1), a pivotal node in innate immune signaling, is tightly regulated by E3 ubiquitin ligases that dictate its stability and activity. Among these, Ring Finger Protein 34 (RNF34), a member of the E3 ligase family, has a role in regulating innate immunity in teleost fish that remains uncharacterized. In this study, we systematically investigate how RNF34 modulates this process using miiuy croaker (Miichthys miiuy). Siniperca chuatsi rhabdovirus (SCRV) infection significantly upregulates RNF34 expression, thereby promoting viral replication and suppressing transcription of key antiviral genes, including pro-inflammatory cytokines (IL-8, IL-1β) and interferon-stimulated genes (ISG15, MX1, Viperin). In luciferase reporter assays, this inhibitory effect was associated with RNF34-mediated suppression of the NF-κB/IRF3 signaling pathway. Western blot analysis revealed that RNF34 reduced TAK1 expression in a dose- and time-dependent manner. Ubiquitination assays confirmed that RNF34 can promote the ubiquitination of TAK1, and further experiments revealed that the proteasome inhibitor MG132 can block the degradation of TAK1. These findings indicate that RNF34 mediates the degradation of TAK1 through the ubiquitin-proteasome pathway, thereby acting as a negative regulator of innate immunity and inhibiting the NF-κB and IRF3 signaling pathways in miiuy croaker. This study identifies a crucial negative regulatory molecule in teleost fish.

2025-11-01·BIOCHEMICAL PHARMACOLOGY

Promoting ubiquitin-dependent Drp1 degradation contributes to the protective effect of Astragalin against diabetic renal fibrosis

Article

作者: Zhang, Peng ; Weng, Hongbo ; Wang, Yalin ; Yin, Ruotong ; Ma, Shihao ; Sun, Mengyao ; Huang, Qingyu ; Jin, Zijie

Diabetic kidney disease (DKD) is a severe complication of diabetes. Fibrosis is an irreversible pathological change closely associated with the development of disease. Disrupted mitochondrial dynamics involved in the progression of fibrosis. Astragalin (AG) exhibits therapeutic potential for DKD. However, the effects of AG on renal fibrosis, as well as precise target and underlying mechanisms, remain largely unexplored. Here, we report the alleviation of diabetes-induced renal fibrosis by AG and the mechanism of regulating dynamin-related protein1 (Drp1)-mediated mitochondrial dynamics. A diabetic mouse model was induced by streptozotocin and treated with AG for 8 weeks. In vitro, HK2 cells were treated with high glucose and lipids. Mitochondrial morphology and function were assessed to explore the mechanisms. The results demonstrated that AG significantly alleviated renal fibrosis, mitochondrial damage and inhibited renal tubular cell apoptosis in diabetic mice. In vitro, AG reduced Drp1 protein levels, inhibited excessive mitochondrial fission and restored mitochondrial function. Mechanistically, knockdown of Drp1 with siRNA and Drp1 overexpression further verified the effects of AG. Additionally, Cellular thermal shift assay (CETSA) and immunoprecipitation (IP) results confirmed the interaction between AG and Drp1. These findings suggested that Drp1 may serve as a key target for AG to exhibit the benefits. Furthermore, the proteasome inhibitor MG132 abolished the effects of AG, indicating that AG reduced Drp1 expression by enhancing its degradation via the ubiquitin-proteasome pathway. In conclusion, our data suggest that AG may be a potential therapeutic agent for diabetic renal fibrosis by inhibiting mitochondrial excessive fission through promoting ubiquitin-dependent Drp1 degradation.

2025-10-01·CELLULAR SIGNALLING

K33 only mutant ubiquitin augments cisplatin chemoresistance in A549 and NCI-H446 cells via Akt1 K33 ubiquitination

Article

作者: Gao, Feng Guang ; Liang, Yi Yun ; Wu, Jing Yi ; Chen, Xiao Jie ; Jia, Jun Jun ; Yang, Hong Ying ; Liao, Xiao Yan ; Yin, Yi Zhen ; Chen, Rui Ling

BACKGROUND:

To probe the function of Akt1 K33 ubiquitination in cisplatin-induced apoptosis in lung cancer.

METHODS:

Akt1 K33 ubiquitination modified by MG132/PYR-41, K33 only mutant ubiquitin (K33O), and Akt1 silence was investigated by co-immunoprecipitation in A549 and NCI-H446 cells. Akt phosphorylation was interrogated by western blot. The role of Akt1 K33 ubiquitination in cisplatin-induced apoptosis was assessed by cell viability using crystal violet staining, the changes of mitochondrial membrane potential with Rhodamine 123 (Rho123) and Calcein AM staining, and cell apoptosis with flow cytometric assay via annexin V-PI staining, respectively.

RESULTS:

Cisplatin induced apoptosis in A549 and NCI-H446 cells; K33O reversed the cisplatin resistance with elevated K33 ubiquitination; The intervention with Wortmannin induced a significant attenuation in the Akt phosphorylation; Inhibiting Akt1 K33 ubiquitination abolished cisplatin effects on cell viability, manifesting as heightened apoptosis and alterations in mitochondrial membrane potential.

CONCLUSIONS:

Akt1 K33 ubiquitination emerges as a promising therapeutic target for lung cancer chemotherapy.

项与 MG-132 相关的新闻（医药）

2025-08-02

·医药速览

Angew. Chem. Int. Ed. (IF 16.9) | 新型E3泛素连接酶--RBBP7

靶向蛋白质降解（Targeted Protein Degradation,TPD）作为一种创新的药物开发策略，近年来在生物医学研究中引起了广泛关注。与传统的药物不同，TPD利用细胞内的蛋白质降解机制，选择性地消除疾病相关的蛋白质，从而实现治疗效果。这一策略不仅具有更高的效力和更持久的活性，还能够破坏传统上“不可成药”的靶点，并有可能克服药物抗性。然而，现有的TPD策略大多依赖于有限的E3泛素连接酶，如CRBN和VHL，这限制了其应用范围。因此，发现新的E3泛素连接酶及其招募配体，对于扩展TPD的应用范围至关重要。近年来，化学蛋白质组学、基因筛选和共价降解剂的发展为发现新的E3泛素连接酶提供了新的途径。这些研究不仅揭示了新的E3泛素连接酶，还为开发新型的小分子降解剂提供了理论基础。例如，通过CRISPR筛选和TurboID蛋白质组学，研究人员发现了多种新的E3泛素连接酶及其招募配体，这些配体能够介导多种蛋白质的降解。这些研究结果表明，电philic探针在发现新的E3泛素连接酶方面具有巨大潜力。文章标题近日，Angewandte Chemie International Edition期刊上公布了一篇名为“Chemical Proteomics Identifies RBBP7 as a New E3 Ligase Supporting Targeted Protein Degradation”的文章，该文章描述了关于一种新型的小分子降解剂的开发，这些降解剂通过靶向蛋白质降解（Targeted Protein Degradation,TPD）策略，利用细胞内的蛋白质降解机制来选择性地消除疾病相关的蛋白质。研究团队通过化学蛋白质组学方法，发现了一种新的E3泛素连接酶RBBP7，并证明了它在TPD中的作用。此外，他们还开发了一系列基于炔酰胺（ynamide）的小分子降解剂，这些降解剂能够靶向多种蛋白质，包括CDK4、PDE5、PI3K、AKT、BCR-ABL、BRD4、EGFR L858R和EGFR L858R/T790M/C797S等，并展示了其在抗癌活性上的显著优势。研究方法与结果Ynamide化学基团实现BTK的高效降解研究团队通过在BTK抑制剂ibrutinib的溶剂暴露的哌啶环上引入不同的电philic基团（包括炔酰胺、丙二酰胺、氯乙酰胺等），开发了一系列新型的小分子降解剂。这些化合物被设计用于通过共价招募E3泛素连接酶来促进BTK的降解。其中，炔酰胺基团被整合到ibrutinib中，生成了化合物YT-57。为了评估这些化合物的降解能力，研究人员使用Western blot分析检测了它们在Toledo B细胞淋巴瘤细胞中对BTK蛋白水平的影响。实验结果显示，含有炔酰胺基团的化合物YT-57在1μM的低浓度下就能显著降解BTK，其半最大降解浓度（DC50）为0.96μM，最大降解分数（Dmax）为83.2%。相比之下，其他电philic基团（如丙二酰胺、氯乙酰胺等）未能有效诱导BTK降解。此外，研究还发现，YT-57的降解活性与连接链的长度有关，其中含有6碳连接链的YT-58表现出最佳的降解能力。进一步的浓度依赖性和时间依赖性实验表明，YT-58在0.2μM的浓度下就能显著降解BTK，并且在4小时内就能观察到明显的降解效果。YT-58通过蛋白酶体途径诱导BTK降解，并有效抑制BTK和PLCγ2的磷酸化为了探究YT-58诱导BTK降解的机制，研究人员使用了蛋白酶体抑制剂（如bortezomib和MG-132）预处理Toledo细胞，随后检测BTK的蛋白水平。此外，研究人员还通过Western blot分析检测了YT-58对BTK及其下游信号分子PLCγ2磷酸化水平的影响。实验结果表明，蛋白酶体抑制剂能够显著抑制YT-58诱导的BTK降解，这表明YT-58通过蛋白酶体途径介导BTK的降解。此外，YT-58能够以剂量依赖的方式降低BTK及其下游靶标PLCγ2的磷酸化水平，且这种抑制效果比传统的BTK抑制剂ibrutinib更为显著。这表明YT-58不仅能够降解BTK，还能更有效地抑制其下游信号通路。YT-58通过共价招募RBBP7介导BTK降解为了鉴定YT-58招募的E3泛素连接酶，研究人员采用了共免疫沉淀/质谱（CoIP/MS）和基于活性的蛋白质分析（ABPP）两种方法。通过这些方法，研究人员分析了YT-58处理的细胞中与BTK相互作用的蛋白质，并进一步验证了这些蛋白质在YT-58介导的BTK降解中的作用。实验结果表明，RBBP7（视网膜母细胞瘤结合蛋白7）是YT-58招募的关键E3泛素连接酶。通过CoIP/MS和ABPP分析，RBBP7被鉴定为与YT-58共价结合的蛋白质，并且在YT-58处理的细胞中与BTK的相互作用显著增强。此外，通过敲低RBBP7的表达，研究人员发现YT-58诱导的BTK降解被显著抑制，这进一步证实了RBBP7在YT-58介导的BTK降解中的关键作用。RBBP7的C97残基的共价修饰对YT-58介导的BTK降解至关重要为了确定YT-58与RBBP7相互作用的具体位点，研究人员通过质谱分析和基于活性的蛋白质分析（ABPP）技术，分析了YT-58处理的RBBP7蛋白的修饰位点。此外，研究人员还通过定点突变实验，验证了这些位点在YT-58介导的BTK降解中的作用。质谱分析和ABPP实验结果表明，RBBP7的C97残基是YT-58的主要共价修饰位点。通过定点突变实验，研究者发现将RBBP7的C97残基突变为丙氨酸（C97A）后，YT-58诱导的BTK降解被显著抑制，而其他残基（如C116、C166和C277）的突变则没有显著影响。这表明YT-58通过共价修饰RBBP7的C97残基来介导BTK的降解。Ynamide化学基团实现多种蛋白质靶标的降解研究人员进一步探索了炔酰胺基团在其他蛋白质靶标降解中的应用潜力。他们将炔酰胺基团整合到多种临床批准的蛋白质靶向配体中，包括CDK4/6抑制剂Palbociclib、PDE5抑制剂Sildenafil、BCR-ABL/c-ABL激酶抑制剂Dasatinib和BET家族抑制剂JQ1，生成了一系列新型的小分子降解剂。实验结果表明，这些新型降解剂能够有效诱导其靶蛋白的降解。例如，整合到JQ1中的炔酰胺基团生成的化合物YT-118能够显著降解BRD4；整合到Palbociclib中的炔酰胺基团生成的化合物YT-122能够降解CDK4；整合到Sildenafil中的炔酰胺基团生成的化合物YT-125能够降解PDE5；整合到Dasatinib中的炔酰胺基团生成的化合物YT-127能够降解BCR-ABL/c-ABL。这些结果表明，炔酰胺基团是一种多功能且可移植的化学基团，能够用于开发针对多种蛋白质靶标的降解剂。Ynamide化学基团实现EGFR L858R和EGFR L858R/T790M/C797S的降解研究人员将炔酰胺基团整合到EGFR抑制剂Erlotinib和Brigatinib中，生成了一系列新型的EGFR降解剂。这些降解剂被设计用于降解EGFR的突变体，包括EGFR L858R和EGFR L858R/T790M/C797S，这些突变体与非小细胞肺癌（NSCLC）的耐药性相关。实验结果表明，这些新型降解剂能够显著降解EGFR L858R和EGFR L858R/T790M/C797S。例如，整合到Erlotinib中的炔酰胺基团生成的化合物YE-8和YE-9能够以剂量依赖的方式降解EGFR L858R；整合到Brigatinib中的炔酰胺基团生成的化合物3002能够显著降解EGFR L858R/T790M/C797S。这些结果表明，炔酰胺基团能够有效诱导EGFR突变体的降解，为克服EGFR抑制剂的耐药性提供了新的策略。Ynamide化学基团通过共价招募RBBP7介导多种蛋白质靶标的降解为了进一步验证RBBP7在多种蛋白质靶标降解中的作用，研究人员将炔酰胺基团整合到泛激酶抑制剂和BET家族抑制剂JQ1中，生成了探针YT-134和YT-172。这些探针被用于通过共价招募RBBP7来介导多种蛋白质靶标的降解。实验结果表明，这些探针能够成功标记RBBP7，并且RBBP7的敲低显著抑制了YT-134介导的AKT和PI3K的降解。这进一步证实了RBBP7在多种蛋白质靶标降解中的关键作用。此外，研究人员还发现，这些探针能够标记多种E3泛素连接酶，这为扩展TPD策略的应用范围提供了新的线索。结论综上所述，总结该文章的关键结果如下：RBBP7的发现：通过化学蛋白质组学方法，研究团队发现RBBP7是一种新的E3泛素连接酶，能够被炔酰胺基团共价招募，从而介导BTK的降解。炔酰胺基团的作用：炔酰胺基团被证明是一种多功能且可移植的化学基团，能够促进多种蛋白质的降解，包括CDK4、PDE5、PI3K、AKT、BCR-ABL、BRD4、EGFR L858R和EGFR L858R/T790M/C797S等。降解剂的抗癌活性：与传统的抑制剂相比，含有炔酰胺的降解剂显示出显著增强的抗癌活性。降解机制：研究团队通过实验验证了RBBP7在YT-57介导的BTK降解中的关键作用，并通过结构分析和分子对接实验进一步确认了RBBP7的C97残基是YT-57的共价结合位点。这项研究不仅扩展了TPD策略的应用范围，还为开发新型抗癌药物提供了新的思路。通过将炔酰胺基团整合到不同的蛋白靶向配体中，可以开发出针对多种疾病相关蛋白的降解剂，这为克服现有药物抗性和开发新型治疗策略提供了有力的工具。但作者也指出，进一步的药物化学优化是必要的，以提高这些降解剂的选择性和效力。此外，未来的研究还需要探索这些降解剂在体内模型中的效果，以及它们在临床应用中的潜力。欢迎感兴趣的朋友进群讨论，群二维码如下：推文用于传递知识，如因版权等有疑问，请于本文刊发30日内联系医药速览。原创内容未经授权，禁止转载至其他平台。有问题可发邮件至yong_wang@pku.edu.cn获取更多信息。©2021 医药速览保留所有权利往期链接“小小疫苗”养成记 | 医药公司管线盘点人人学懂免疫学| 人人学懂免疫学（语音版）综述文章解读 | 文献略读 | 医学科普|医药前沿笔记PROTAC技术| 抗体药物| 抗体药物偶联-ADC核酸疫苗 | CAR技术| 化学生物学温馨提示医药速览公众号目前已经有近12个交流群（好学，有趣且奔波于医药圈人才聚集于此）。进群请扫描上方二维码，备注“姓名/昵称-企业/高校-具体研究领域/专业”，此群仅为科研交流群，非诚勿扰。简单操作即可星标⭐️医药速览，第一时间收到我们的推送①点击标题下方“医药速览” ②至右上角“...” ③点击“设为星标

蛋白降解靶向嵌合体

2025-07-23

·精准药物

【Angew】暨南大学李正球等：E3连接酶“亮相”，开辟蛋白降解新途径

当前靶向蛋白降解（TPD）技术（如PROTAC、分子胶）高度依赖CRBN、VHL等少数几种E3泛素连接酶。然而人类基因组编码超过600种E3连接酶，许多疾病（尤其是特定恶性肿瘤）因缺乏这些常用E3的表达，或靶蛋白难以与之形成有效的三元复合物，导致现有降解剂策略失效。为了突破这一限制，暨南大学李正球研究员团队在Angew上发表了突破性研究，他们创新性地将具有反应活性的炔酰胺（ynamide）共价弹头整合到靶向蛋白的配体分子上，成功开发出一个依赖新型E3连接酶RBBP7的降解剂平台。该研究从BTK降解剂的机制解析出发，系统验证了该策略在降解多类靶点蛋白以及克服临床耐药性方面的广泛适用性，为拓展TPD的应用边界奠定了重要基础。来源：Angew研究人员首先在伊布替尼（一种已上市的BTK共价抑制剂）溶剂暴露的哌啶环上引入炔酰胺弹头，得到化合物YT-57。为了优化设计，他们还系统合成了包含不同弹头（如烯酰胺、马来酸内酯、氯乙酰胺、丙烯酰胺等）及不同长度连接链的衍生物进行对比。在Toledo B细胞淋巴瘤细胞模型中，仅1μM浓度的YT-57处理16小时即可显著降解BTK蛋白（Dmax=83.2%），而其他弹头类型的化合物则基本无效。进一步优化连接链长度后发现，具有6碳链的化合物YT-58降解活性最优，其DC50值低至0.17μM，Dmax为83%。重要的是，YT-58展现出了比其母体抑制剂伊布替尼强约20倍的抗增殖活性。利用数据非依赖采集（DIA）技术的全细胞蛋白质组学分析进一步证实，YT-58能选择性且高效地降解BTK蛋白。图1. 将BTK抑制剂改造成降解剂（来源：Angew）研究人员深入探究YT-58的作用机制后发现，其介导的BTK降解严格依赖蛋白酶体途径。预处理蛋白酶体抑制剂硼替佐米或MG-132能完全阻断降解效应。同时，YT-58能剂量依赖性地抑制BTK及其下游关键信号分子磷脂酶Cγ2（PLCγ2）的磷酸化，其效果显著优于伊布替尼，这与观察到的强效抗增殖活性相符。为了揭示关键的E3连接酶，研究者采用了共免疫沉淀/质谱联用（Co-IP/MS）和基于活性的蛋白质组学（ABPP）两种互补策略。结果一致地将组蛋白伴侣蛋白RBBP7（也称为RbAp46）锁定为与降解过程密切相关的核心E3连接酶。在细胞中敲低（knockdown）RBBP7可有效逆转YT-58对BTK的降解作用。此外，YT-58处理能显著增强BTK的多聚泛素化水平，而这种增强效应在RBBP7被敲低后明显受损。免疫共沉淀实验还证实，YT-58能促进形成RBBP7-降解剂-BTK三元复合物。图2. 化合物YT-58的降解机制（来源：Angew）接下来的关键位点研究发现，YT-58通过其炔酰胺弹头共价修饰RBBP7蛋白第97位的半胱氨酸（C97），这是驱动BTK降解不可或缺的步骤。重组蛋白结合位点分析和基于活细胞的竞争性半胱氨酸定向ABPP均确认了C97是主要修饰位点。随后的点突变验证显示，将RBBP7的C97突变为丙氨酸（C97A）会显著削弱YT-58诱导的BTK降解，而其他半胱氨酸位点（C116, C166, C277）突变则无此影响。分子对接也显示C97位于蛋白表面，易于与YT-58发生共价结合。图3. RBBP7的C97位共价修饰对于YT-58介导的BTK降解至关重要（来源：Angew）此外，研究人员又对炔酰胺弹头的普适性进行了验证。结果发现，其可有效促进针对多种蛋白质（包括CDK4、PDE5、PI3K、AKT、BCR-ABL、BRD4、EGFRL858R、EGFRL858R/T790M/C797）的降解剂开发。此外，研究人员将炔酰胺连接至泛激酶抑制剂XO44，获得化合物YT-134，该分子可在AGS细胞中可同时降解PI3K、Syk、AKT、GSK-3β等多种激酶。图4. 炔酰胺共价结构能够降解多种蛋白靶标（来源：Angew）最后，研究人员设计带有炔烃标签的探针（如泛激酶探针YT-134、BRD4探针YT-172等）进行Pull-down/质谱分析，结合RBBP7敲低实验，证实了RBBP7是支撑该炔酰胺降解剂平台降解多种不同靶蛋白的核心E3连接酶。值得注意的是，普适性更强的泛激酶探针YT-134比选择性更强的BRD4探针YT-172捕获到了更多的E3连接酶，提示其降解活性涉及更广泛的E3网络。图5. RBBP7可用于多种降解剂的E3连接酶（来源：Angew）总结而言，这项工作填补了TPD领域新型E3连接酶资源的空白，并揭示了一种利用炔酰胺弹头共价招募E3连接酶的全新机制。他们所开发的“炔酰胺-RBBP7”降解剂平台展现出强大的模块化和普适性。此外，该平台中降解剂的分子量通常小于传统PROTAC，有望改善其药物代谢动力学性质。这一创新策略为快速开发针对“难成药”靶点和耐药靶点的下一代降解剂提供了强大工具，具有广阔的临床转化前景。参考资料：Yue Liu et al. Chemical Proteomics Identifies RBBP7 as a New E3 Ligase Supporting Targeted Protein Degradation. Angew（2025）https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202508538声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手觉得本文好看，请点这里↓

2025-07-06

·精准药物

【Angew.Chem.Int.Ed.】暨南大学李正球等报道新型靶向E3连接酶RBBP7用于蛋白降解策略

大家好，今天分享一篇发表在Angewandte Chemie International Edition上的文章，题目为“Chemical Proteomics Identifies RBBP7 as a New E3 Ligase Supporting Targeted Protein Degradation”。靶向蛋白降解（TPD）是一种通过利用细胞蛋白降解机制选择性消除目标蛋白的药物开发方法，具有治疗多种疾病的潜力。现有降解剂主要依赖于有限的E3泛素连接酶，如CRBN和VHL，这限制了降解剂的发展和应用。作者开发了一种新型亲电手柄炔酰胺，用于创建靶向EGFRL858R等多种蛋白质的共价抑制剂。作者通过在伊布替尼中引入包括炔酰胺在内的多种亲电弹头，结合化学蛋白质组学分析与功能验证，开发出新系列降解剂。研究结果表明，该方法为开发新型降解剂和拓展可用于靶向蛋白降解的E3连接酶范围提供了高效合理的策略。Bruton's酪氨酸激酶（BTK）在多种恶性血液疾病中广泛表达，如套细胞淋巴瘤（MCL）和慢性淋巴细胞白血病（CLL）。过去十年间，伊布替尼、泽布替尼和阿卡替尼等共价BTK抑制剂已获批用于治疗B细胞恶性肿瘤。这类首创共价抑制剂通过结合BTK的C481（半胱氨酸481）位点发挥抗癌作用。但因此，开发能同时靶向激酶依赖性和非激酶依赖性功能的BTK降解剂正受到越来越多的关注。为开发新型BTK降解剂，作者选择共价抑制剂依鲁替尼作为靶向配体。在其溶剂暴露的哌啶环上引入了包括炔酰胺在内的多种亲电弹头。采用6碳连接子的化合物YT-58展现出最优降解能力。进一步的浓度与时间依赖性研究表明，YT-58在低至0.2μM的浓度和短至4小时的孵育时间内即可诱导显著的BTK降解。在蛋白质组层面评估YT-58的BTK降解效果，作者对YT-58处理的Toledo细胞进行了全细胞蛋白质组分析。后续DIA分析显示，相较于对照组，YT-58处理样本中BTK蛋白表达显著降低。这些结果证实YT-58实现了BTK的选择性靶向降解（如图1）。图1为探究YT-58介导BTK降解的机制，作者使用蛋白酶体抑制剂硼替佐米（BTZ）或MG-132预处理Toledo细胞。两种抑制剂均显著减弱了YT-58的降解效应，表明YT-58通过蛋白酶体依赖途径介导BTK降解。信号通路分析显示，YT-58以剂量依赖方式下调BTK及其下游靶标磷脂酰肌醇特异性磷脂酶Cγ2（PLCγ2）的磷酸化水平，从而发挥强效抗增殖作用（如图2）。图2鉴于YT-58上的共价弹头对其降解活性至关重要，作者推测该分子片段可能作为共价识别元件来招募E3泛素连接酶。为鉴定负责YT-58诱导BTK降解的E3连接酶，作者采用互补策略，包括免疫共沉淀/质谱联用技术（Co-IP/MS）和基于活性的蛋白质分析（ABPP）。蛋白质印迹分析证实，YT-146和YT-148的降解效力与不含炔基标签的YT-58相当，表明可点击手柄的引入对化合物降解活性的影响极小。随后，用含炔探针YT-146和YT-148处理Toledo细胞，通过与生物素-N3的点击反应标记探针结合的蛋白质组。标记蛋白经链霉亲和素珠富集后，用胰蛋白酶消化并进行LC-MS/MS分析。在三次独立实验中，微管相关视网膜母细胞瘤结合蛋白7（RBBP7）始终是最突出的E3连接酶，表明其在共价降解剂存在下与BTK具有强特异性相互作用。为验证RBBP7参与YT-58介导的降解过程，作者使用含炔探针YT-146和148进行了pull-down/蛋白质印迹实验。这些实验证实两种探针均能有效原位标记RBBP7。为确定RBBP7是否介导YT-58诱导的BTK降解，作者开展了补充验证实验。在Toledo细胞中敲低RBBP7可逆转YT-58介导的BTK降解现象，实验证实了其在降解过程中的关键作用。随后作者检测了YT-58诱导的BTK多聚泛素化现象。YT-58处理显著增强了BTK的泛素化水平。为验证RBBP7-YT-58-BTK三元复合物的形成，作者对表达HA-BTK和Flag-RBBP7的细胞进行MG132与YT-58联合处理，随后进行免疫共沉淀实验。结果显示在YT-58存在时，HA-BTK与Flag-RBBP7的相互作用显著增强。这些结果共同证明，YT-58通过共价招募E3泛素连接酶RBBP7，促进BTK的泛素化及蛋白酶体介导的降解过程（如图3）。图3为确定RBBP7中被YT-58共价修饰的特定位点，作者分别采用重组蛋白和活细胞进行了蛋白质组学分析，发现RBBP7蛋白C97位点的共价修饰对YT-58介导的BTK降解至关重要。采用碘乙酰胺-炔烃（IAA-alkyne）作为竞争性探针进行半胱氨酸导向的活性位点蛋白质组分析。在5396个IA-炔烃修饰肽段中，作者鉴定出RBBP7中C97和C166两个被YT-58共价修饰的半胱氨酸残基，这些位点与重组RBBP7结合位点图谱结果一致。作者在HEK293T细胞中外源表达HA-BTK与Flag-RBBP7，并分别将RBBP7第97、116、166和277位的半胱氨酸突变为丙氨酸。值得注意的是，C97A突变显著削弱了YT-58诱导的BTK降解作用，而C116、C166和C277突变则未产生影响，表明YT-58通过共价修饰RBBP7的C97发挥降解活性。结构分析显示C97位于蛋白表面，分子对接证实了YT-58与该残基的共价相互作用（如图4）。图4作者进一步探索该策略是否可拓展至其他靶蛋白。将炔酰胺结构单元整合至临床批准的溴结构域和末端外结构域(BET)家族抑制剂JQ1中，构建了化合物YT-118。效果与基于CRBN的典型PROTACs50相当。为评估该靶向蛋白降解策略的普适性，作者尝试拓展配体与靶标类别的适用范围。重点研究了溶剂暴露区域含有哌嗪结构的配体——该结构便于直接进行化学修饰。通过简单偶联反应引入炔酰胺基团，作者成功制备出分别衍生自CDK4/6抑制剂瑞博西利和BCR-ABL/c-ABL激酶抑制剂达沙替尼的YT-122、YT-125与YT-127，均诱导了剂量依赖性的靶蛋白降解（如图5）。图5为探究炔酰胺结构单元对EGFR突变体降解的效果，作者将其引入厄洛替尼分子中，合成了化合物YE-8和YE-9。在H3255细胞中，这两个化合物均表现出明显的剂量依赖性EGFRL858R降解。作者将炔酰胺共价手柄整合至可逆性EGFR L858R/T790M/C797S抑制剂布加替尼中，由此开发出降解剂3002。随后评估了3002对EGFR L858R/T790M/C797S的降解活性及其抗增殖作用。数据显示，将炔酰胺共价手柄引入布加替尼可显著诱导EGFRL858R/T790M/C797S的降解并增强抗癌效果（如图6）。图6最后，为验证RBBP7是否作为参与多蛋白靶点降解的推定E3连接酶，作者将炔基手柄整合至广谱激酶抑制剂和BRD4抑制剂JQ-1中，构建了探针YT-134与YT-172。实验证实YT-172在降解BRD4靶点方面与不含炔基的探针YT-118效果相当。同步进行pull-down/LC-MS分析时，还使用了简易炔酰胺探针YE-1。将YE-1、YT-134和YT-172分别与Toledo、AGS及HEK293T细胞孵育——其中YT-134与YT-172已展现强效降解活性。细胞裂解后，通过点击化学将探针标记的蛋白质组与生物素-N3缀合。经链霉亲和素珠富集后，用胰蛋白酶消化标记蛋白并进行LC-MS/MS检测。三种探针分别成功标记了48、57和5种E3连接酶。广谱性探针YT-134比选择性靶向BRD4的YT-172富集了更多E3连接酶，表明其对多激酶的降解活性作用范围更广，这为拓展支持TPD的E3连接酶谱提供了重要线索。值得注意的是，三种探针在不同细胞系中均检测到RBBP7，提示其参与多种靶点的降解过程。为确证探针YE-1、YT-134和YT-172与RBBP7的共价结合，作者采用RBBP7抗体进行pull-down/免疫印迹。结果显示所有探针均能在活细胞中成功标记RBBP7。与前述验证结果一致，敲低RBBP7消除了YT-134对AKT和PI3K的降解活性，证实了RBBP7在这些靶点降解中的核心作用。这些发现确证了基于炔酰胺的降解剂对靶蛋白的降解作用，是由其共价靶向RING家族E3泛素连接酶RBBP7所驱动的（如图7）。图7本文作者：FSY责任编辑：TZM原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202508538DOI：10.1002/anie.202508538声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手觉得本文好看，请点这里↓

蛋白降解靶向嵌合体

100 项与 MG-132 相关的药物交易

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研发状态

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适应症	最高研发状态	国家/地区	公司	日期
缺血性卒中	临床前	中国	厦门大学附属中山医院（厦门中山医院、厦门市老年病康复研究所、厦门市消化疾病研究所、厦门市临床检验中心）	2025-06-07
黑色素瘤	临床前	中国	华侨大学	2025-04-27
炎症	药物发现	美国	LeukoSite, Inc.	-
类风湿关节炎	药物发现	美国	LeukoSite, Inc.	-