Terfenadine

水溶性是药物发现阶段的关键理化性质之一。在肠液中较高的溶解度能够形成浓度梯度，从而促进口服药物的吸收，并使其分布至作用部位，最终引发药理反应。对于静脉给药的药物，在血浆中具有足够高的溶解度至关重要，可以最大限度地减少在体循环中发生不必要的沉淀。通常，水溶性差会导致药物制剂研发过程中的诸多挑战，增加研发成本。水溶性数据有助于解读生物学检测结果。尤其是在高通量筛选（HTS）过程中，难溶性化合物可能会从溶液中析出，从而导致假阴性和/或假阳性结果，后者可能是由于靶标与聚集体结合所致。在高通量筛选阶段缺乏溶解度信息的情况下，此类假阳性结果可能被忽略，并妨碍构效关系（SAR）的解读。水溶性差会导致体内问题，例如口服给药后吸收不完全、生物利用度不稳定、进食/空腹效应以及剂量递增研究后难以建立足够的安全边界。此外，在药物发现项目的后期阶段，当先导化合物系列的核心结构基本确定后，溶解度差的问题也相对难以解决。纳米颗粒技术或聚合物分散等制剂可以通过减小粒径来提供解决方案，从而提高溶出速率。这些方法在配制 BCS II 类化合物时可能显示出优势，这类化合物的溶解度低（可能存在剂量限制）且渗透性高，吸收的限制因素是溶出速率，而不是通过肠道屏障的速率。 在药物研发中寻找高效化合物系列意味着，对于某些生物靶点类型，为了最大程度地增强与活性位点的相互作用，通常会倾向于选择亲脂性和/或平面结构的化合物。然而，这些化合物的溶解度通常较低。在少数情况下，高活性可以弥补溶解度低的问题，因为低剂量即可产生临床疗效。例如，孟鲁司特（白三烯D受体拮抗剂，Clog P=8.47）就是一种非常有效的化合物（0.1 nM），由于其剂量低，溶解度不再是问题。为了使目标化合物系列能够快速推进研发进程，重要的是在提高活性的同时，努力实现各项参数的良好平衡，例如溶解度、暴露量和可接受的毒性。这就需要更高通量的理化性质测定方法或更可靠的性质预测方法。1. 水溶性的定义 溶解度通常用logS表示，其中S是在特定条件下（例如，在室温下，生理pH值，持续一段时间，通常为24-48小时）化合物与当前条件的最稳定晶型达到平衡时的饱和浓度（mol/L）。这也被称为热力学溶解度。化合物的典型logS值范围为3（1 mM）至7（0.1 mM）。相比之下，动力学溶解度是指在特定时间段内测定的溶解度值，该时间段通常远小于24小时。由于在此时间范围内通常无法达到平衡状态，因此化合物通常并非处于当前条件下的最稳定晶型状态。因此，动力学溶解度值通常高于通过热力学方法获得的值。尽管存在这些限制，但动力学溶解度测量可以采用高通量检测形式，并且已被一些制药公司用于在药物发现的早期阶段，来识别难溶性化合物。 世界药物索引的一项研究显示，62.5%的上市药物是可电离的，这意味着这些物质可以根据介质的pH值以不同的带电状态存在。对于可电离药物，其溶解度取决于pH值，因此了解pH值对溶解度的影响至关重要。化合物的电离程度可以用酸解离常数pKa来定义。对于一元化合物，在给定pH值下的溶解度可以用以下公式描述： 其中，S0 表示化合物以中性形式存在时的溶解度，也称为固有溶解度。图1 显示了使用以上公式生成的 pH-溶解度曲线。可以看出，可电离化合物的溶解度受其以中性形式存在的溶解度限制。根据电荷类型的不同，溶解度随 pH 值降低（碱性）或升高（酸性）而增加，直至达到临界 pH 值，此时盐形式和溶度积 Ksp 成为溶解度的限制因素。 图1 pKa 为 8 的碱和 pKa 为 4 的酸的理论pH-溶解度曲线。2.药物发现不同阶段的水溶性 图2展示了药物发现流程的示意图。靶点识别阶段旨在确定生物靶点，标志着药物发现项目的开始。溶解度评估通常始于苗头化合物鉴定 (HI) 阶段，用于对苗头化合物进行理化性质表征，并解读生物学和药物代谢动力学 (DMPK) 分析数据。在先导化合物鉴定 (LI) 阶段，溶解度数据有助于筛选类具有类药性的先导化合物系列，从而快速确定候选药物 (CD)。在先导化合物优化 (LO) 阶段，溶解度数据可用于评估进入研发阶段的候选药物的制剂风险。此外，在 HI/LI/LO 阶段，溶解度数据也被广泛用于分子设计。 图2 药物发现的不同阶段。3.水溶性在苗头化合物鉴定中的应用 在药物发现项目的苗头化合物筛选（HI）阶段，会采用多种策略来识别潜在的苗头化合物系列。高通量筛选（HTS）、聚焦子集库筛选和片段库筛选是寻找优质苗头化合物系列的几种常用方法。除了评估效力之外，同时了解这些潜在苗头化合物的理化性质也变得越来越重要，以便快速识别最有可能快速进入药物递送阶段的高质量化合物系列。这种提前进行理化性质评估的做法，需要引入溶解度筛选方法，以处理该阶段生物测试产生的大量化合物。为此，药物发现领域已经建立了多种溶解度筛选方法，但所有方法都具有一个共同的特点，即要求化合物以DMSO为初始溶解状态，因为这样便于从公司化合物库中快速分装，并可使用基于微孔板的自动化设备。3.1 DMSO溶液中的水溶性 在制药公司中，化合物通常以固体和DMSO溶液两种形式储存，这是一种普遍接受的做法。例如，阿斯利康（AZ）通常使用10 mM或类似的浓度。从这些溶液中提取储备样品，用于各种测试，包括水溶性筛选。使用DMSO溶液作为溶解度测定的起始点具有诸多优势。溶液自动分装便于研究大量化合物：样品消耗量通常显著低于传统的热力学测定法（后者通过固体物质测定溶解度），且水样中DMSO溶液的浓度通常保持在1%或更低，助溶剂效应也极小（图3）。然而，使用DMSO储备液意味着溶解度测定的动态范围上限取决于储备液中DMSO浓度的选择以及水样中最终DMSO的百分比。对于AZ而言，在高通量溶解度（HTSol）测定中，10mM DMSO储备液与1%的最终助溶剂浓度相结合，意味着测定的上限固定为100μM。这通常低于固相测定所能达到的上限。 图3 采用经典摇瓶法，在 pH 7.4 的磷酸盐缓冲液中，分别在有或无 1% DMSO 的情况下，测定了一组 43 种内部化合物的溶解度比值。化合物的溶解度范围为 0.2mM 至 5mM。 文献中报道的许多使用DMSO溶液的高通量溶解度检测属于动力学HTSol检测。此类检测仅经过短时间振荡后即对水性样品进行分析，时间尺度范围从沉淀后立即进行至数分钟不等。相比之下，热力学HTSol检测通常需要至少24小时甚至更长的振荡时间。因此，动力学溶解度测定操作更简便，常被用作前沿检测方法，用于对先导化合物系列进行初步排序。此外，动力学溶解度数据已被应用于生物测定数据的解释，因为其测量时间尺度以及DMSO储备液稀释到水性介质中的沉淀过程与生物测定过程更为接近。 动力学溶解度顾名思义与时间密切相关，因此其结果的重现性可能不如热力学溶解度值。较短的时间尺度也意味着它们更依赖于初始沉淀物的物理形态。因此，动力学溶解度和热力学溶解度之间的相关性通常较差，动力学测量值通常更高。然而，这也带来了一个优势：在此阶段，被排除在外的化合物（即假阴性结果）会很少。 使用DMSO储备液的高通量溶解度（HTSol）测定方法在分析水溶液样品方面各有不同。常见的方法有两种：（1）浊度法，通过监测沉淀的生成或消失与浓度的关系；（2）过滤去除沉淀后，直接用紫外吸收光谱法定量溶液中的化合物。3.1.1 浊度测定法 浊度法依赖于测量溶液中沉淀物对光的散射来测定溶解度。Lipinski 最初描述的方法是将 DMSO 储备液以 1 分钟的间隔分批加入到紫外比色皿中的水性缓冲液中，直至达到动力学溶解度极限并出现沉淀。使用二极管阵列紫外分光光度计，通过检测 600–800 nm 波长范围内颗粒对光的阻挡引起的吸光度增加来识别沉淀。利用这种方法，Lipinski 能够测定 5–65 mg/mL 范围内的动力学溶解度，DMSO 助溶剂的上限为 0.67%。其他浊度法则使用固定的 DMSO 组成（0.3% 至 5% 的助溶剂），以避免助溶剂对溶解度的潜在影响，并通过连续稀释来观察沉淀的出现。其他光散射检测方法也已被使用，包括浊度法和流式细胞术。这两种方法都利用了穿过样品的激光束的扰动。在96孔板中进行浊度检测更易于自动化，并且比流式细胞术等线性流动检测方法或在紫外比色皿中逐步添加DMSO的方法具有更高的通量。然而，浊度计读数对孔板质量非常敏感，划痕或灰尘的存在会导致溶解度值偏低。3.1.2 紫外吸收法 在早期药物发现阶段，测定溶解度的另一种方法是使用紫外吸收光谱法直接定量测定水相上清液。通常，将DMSO储备液加入水性缓冲液中，使最终DMSO的浓度保持在最低水平（5%或更低），然后通过过滤去除生成的沉淀。之后，使用紫外酶标仪，通过比较滤液的吸光度和用相同溶剂配制的校准溶液的吸光度来确定水相溶解度。样品溶液和校准溶液的匹配至关重要，以避免溶剂变色效应。此外，还必须谨慎选择滤板，因为化合物可能会与某些滤膜发生非特异性结合，导致溶解度值偏低。与浊度法类似，基于酶标仪的紫外检测方法也易于自动化操作。 与浊度测定法类似，许多直接紫外吸收测定法旨在测定动力学溶解度。然而，通过将过滤前样品的搅拌时间延长至24小时或更久，紫外吸收法也适用于测定热力学溶解度。这带来了诸多优势。所获得的溶解度数据较少依赖于从DMSO中沉淀的初始物质的物理形态，并且更接近于在药物发现和早期开发阶段测定的热力学溶解度值。因此，该方法能够提供更一致的药物发现阶段溶解度数据，并有助于对先导化合物系列进入开发阶段可能遇到的困难或成功进行更高质量的早期评估。 该检测方法是基于后一种方法开发的，目前已成为药物发现阶段苗头化合物筛选的前沿溶解度测定方法。该方法使用10 mM DMSO储备液，并将其稀释到pH 7.4的水性缓冲液中，最终DMSO浓度为1%。样品在磁力搅拌下振荡24小时，然后进行过滤以去除沉淀。将样品进一步稀释，并与已知浓度的校准溶液进行比较，该校准溶液也取自10 mM DMSO储备液，并稀释到相同的溶剂组成。该检测方法基于96孔板，并使用紫外二极管阵列酶标仪。这使得检测过程能够完全自动化，每次运行可测量超过600种化合物。 直接紫外吸收法的一个问题是，如果没有高效液相色谱（HPLC）分离，杂质的存在可能会导致溶解度值出现误差。浊度法也存在同样的问题。然而，由于公司对化合物注册到化合物库中有着严格的纯度标准，因此这种担忧有所减轻。此外，该分析方法还编写了一个算法，用于将样品的紫外光谱与校准光谱进行比对。在24小时的搅拌期间，任何显著的杂质或分解产物都会被识别为光谱不匹配。 为了确定基于高通量DMSO的热力学分析方法测得的溶解度值与从固体中测得的经典热力学溶解度值的相似程度，比较了包含200种化合物（主要为内部化合物）的多样化测试集。对于后者，除了从固体材料开始测定外，该方法还包括高效液相色谱（HPLC）分析，并通过双重离心将未溶解的固体与上清液分离。图4表明，两种方法之间具有良好的相关性，大多数化合物的溶解度值相差在3倍以内。考虑到两种分析方法中生成的化合物可能具有不同的物理形态，这似乎是合理的。值得注意的是，不同晶型对溶解度的影响通常在此范围内。图中存在一些异常值，这些异常值主要集中在基于DMSO的分析方法测得的溶解度更高这一侧。文献和此研究表明，这种溶解度增强效应不太可能是由1% DMSO的增溶作用引起的。图3显示了采用经典热力学方法在含1%和不含1% DMSO的缓冲液中测得的43种化合物的溶解度比值。这些化合物的溶解度范围为0.2 mM至5 mM。1% DMSO的存在对溶解度的影响很小，观察到的最大增强倍数为3.6。对于异常值观察到的溶解度增强更可能是由于这些化合物以无定形物质的形式从DMSO溶液中析出，并且在24小时的搅拌期间尚未与它们的晶体形式达到真正的平衡。文献表明，化合物的无定形形式和晶体形式之间的溶解度差异可能很大。类似的解释也曾被用于解释在采用高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV）进行的长时间搅拌溶解度研究中观察到的正异常值。图4中存在一个显著的负异常值。进一步的研究排除了滤膜截留的可能性。对该化合物在放大实验中溶解后样品的粉末X射线衍射分析表明，DMSO法在24小时内生成了结晶样品，而从固体原料开始的实验样品在此之后主要呈无定形状态。这一有趣的观察结果表明，对于某些化合物，DMSO沉淀条件可以促进结晶物质的形成。 图4 固体溶解度测定（x 轴）和高通量溶解度测定（y 轴；四次实验的平均值）所得测试集溶解度的相关性。黑线为 1:1 线。符号□代表实验室自研化合物。符号◇代表市售化合物：1-双硫仑，2-己烯雌酚，3-灰黄霉素，5-氟哌啶醇，6-甲苯咪唑，7-格列本脲，8-硝苯地平，9-阿苯达唑，10-布美他尼类似物，11-洛哌丁胺，12-阿司咪唑，13-尼莫地平，14-氯雷他定。圆圈内的符号代表文中讨论的负异常值。3.1.3 其他检测方法 为了提高DMSO和固体中动力学和热力学水溶性测量的通量，近期采用了一种新的方法，即将检测方法从紫外检测改为无需化合物特异性校准的化学发光氮检测（CLND）。CLND检测器能够利用通用氮校准曲线定量水溶液样品中的氮含量，并根据分子中氮原子的数量确定水溶液浓度，进而计算溶解度。与紫外检测方法相比，CLND无需化合物特异性校准溶液，从而降低了样品消耗量，该技术与检测器直接流动注射联用时速度快捷。然而，CLND检测器对氮的敏感性要求严格的实验室维护，以避免非样品氮源对仪器的污染。CLND检测器需要定期重新校准以保持精度，并且并非所有氮环境都呈现线性响应；例如，分子中相邻的氮原子属于特殊类别。如果未使用 HPLC 检测器，则必须注意确保样品中不存在含氮杂质。 其他通用检测器已被建议作为 UV 溶解度测定的潜在替代品，包括 ELSD 和 CAD。3.1.4 DMSO溶解度测定法的应用 全自动DMSO溶解度测定法的出现意味着现在可以在进行生物学测试的同时，对高通量筛选（HTS）结果进行水溶性测定，从而能够从理化角度快速识别高质量的苗头化合物系列。图5展示了AZ的一个项目案例，其中同时进行的溶解度和效力测定发现，19个苗头化合物系列中有1个理化性质较差。溶解度数据与效力数据的比较还可以识别潜在的假阳性化合物，将其剔除有助于构效关系（SAR）的理解。全自动DMSO溶解度测定法在化合物库筛选中也展现出优势。例如，上文所述的热力学HTSol测定法已成功应用于AZ内部通用片段库化合物的筛选。片段通常与分子靶标的结合力较弱，因此通常需要在高浓度下进行筛选。因此，良好的水溶性是构建片段库的关键标准之一。研究表明，使用包含3234个中性化合物的训练集，可以建立测得的溶解度与预测的logP值（ClogP）之间的清晰关系（图6）。图6中采用分箱和百分位数的方法，可以从动态范围有限的数据中提取最大信息。特别是，多个百分位数（10%、20%、30%、40%和50%）能够捕捉logS的变化，并揭示其与ClogP的趋势强度。该分析应用于所有潜在的片段库化合物。ClogP小于2.19的中性片段被认为具有可接受的溶解度，而ClogP值较高的片段则需要进行溶解度测量。只有溶解度达到或超过溶解度测定定量上限的化合物才能被纳入片段库。 图5 某个发现项目的高通量筛选结果中，苗头化合物的高通量溶解度数据按结构系列（1-19）聚类显示。 图6 训练集片段溶解度百分位数与每个区间平均 ClogP 的关系。数据按 ClogP 分为 10 个区间，每个区间包含 356 个溶解度测量值。4. 水溶性在先导化合物鉴定和优化中的应用 在药物发现的先导化合物筛选和优化阶段，人们更加关注热力学溶解度测定。热力学溶解度旨在测定化合物稳定晶型的溶解度，因为这是口服药物开发阶段需要的物理形态。因此，热力学溶解度能够帮助药物发现项目更好地评估开发过程中可能出现的制剂问题。与动力学溶解度不同，热力学溶解度对化合物初始物理形态的依赖性较小，且对时间要求不高，因此通常具有更高的可重复性。这对于分子设计尤为重要，因为化学家们正致力于通过改变分子结构来提高溶解度。 传统上，热力学溶解度的测定采用摇瓶法。该方法是将过量的固体加入到固定pH值的水性缓冲液中。溶液搅拌至少24小时后，通过离心或过滤将上清液与未溶解的物质分离，然后进行HPLC-UV分析。由于需要称量固体并进行HPLC分析，该方法的通量通常较低。然而，药物发现领域对热力学溶解度的需求日益增长，促使人们开发出基于摇瓶法的自动化方法。许多此类方法使用DMSO储备溶液作为测定的起始溶液，从而充分利用了制药公司内部的自动化化合物分装设备。这些测定方法保留了摇瓶法至少24小时的搅拌时间，并通过HPLC-UV或直接紫外分光光度法分析上清液。4.1 干燥溶液法 另一种提高热力学溶解度测定通量的方法是在测定开始时将DMSO储备溶液蒸发至干。向干燥的固体中加入水性缓冲液，搅拌24小时，然后对上清液进行HPLC-UV或UV分析。去除所有DMSO溶剂可确保溶解度值不受任何助溶剂效应的影响。该方法的另一个优点是，与经典的摇瓶法一样，与直接基于DMSO的方法相比，可以获得更大的溶解度动态范围。适当选择待蒸发的DMSO体积以及缓冲液的体积，可以将测定上限提高一个数量级（1 mM）。需要注意的是，必须谨慎设置蒸发条件，以避免挥发性或热敏性化合物的损失。据报道，采用这种方法获得的溶解度数据与经典摇瓶法测定的热力学溶解度值具有良好的相关性。观察到差异的情况被认为反映了在24小时的时间尺度内，干燥固体法未能达到与稳定晶型的平衡。4.2 固体溶解度 许多药物研发中测定热力学溶解度的方法都致力于将经典的摇瓶法小型化，该方法需要人工称量固体样品并将其分装到96孔板或96瓶阵列中。96孔板的形式使得使用液体处理机器人能够提高实验通量。与标准摇瓶法一样，加入水性缓冲液后，溶液需振荡至少24小时，然后进行板过滤或离心以去除上清液，最后通过高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV）或直接紫外检测法进行分析。 鉴于化合物发现过程中评估溶解度的化合物数量庞大，而可用的固体原料量却很少，因此很少对起始固体和搅拌结束时的固体的物理形态进行表征。起始固体原料通常呈无定形。 在所有热力学溶解度测定方法中，都假设化合物在24小时的搅拌过程中能够转化为稳定的晶型。有证据表明，化合物可以在这段时间内从无定形转化为晶体，也可以发生多晶型转变。然而，并非所有化合物都能在这段时间内达到最稳定晶型的平衡。由此产生的问题是：初始固态对所报道的热力学溶解度结果有何影响？化合物在溶解度测定中转化为最稳定晶型的频率如何？Pudipeddi等人利用81种化合物的数据集表明，不同晶型的溶解度差异很小，溶解度比通常不大于2。Hancock等人也观察到了类似的现象。研究表明，溶解度差异最显著的是无定形和晶体。为了了解在热力学溶解度测定中，无定形样品转化为晶体的频率，选取了一系列不同的商业化合物，分别从晶态和无定形态固体开始测定其溶解度，并通过粉末X射线衍射（PXRD）比较了两种固体形态（表1）。从图7 可以看出，大多数无定形态化合物在测定过程中重结晶（图8）。PXRD 分析显示，少数在实验结束时仍为无定形态（图9）。Sugano 也观察到了类似的现象，他研究了一系列化合物在 DMSO 溶液中搅拌 20 小时后的溶解度，并通过偏光显微镜 (PLM) 对最终固态进行了表征。间接证据也表明，大多数化合物能够在 24 小时内生成稳定的热力学溶解度值。例如，AZ 发现项目中同一化合物的后续批次显示出较小的溶解度差异（0.44 个对数单位，见图10）。此外，通常观察到，从固体、干燥DMSO溶液及DMSO溶液起始的热力学溶解度测定所获数据间具有良好的相关性（图4）。 图7 在 pH 7.4 条件下，搅拌 24 小时后，无定形物质与结晶物质的水溶性曲线。(1) 双硫仑，(2) 阿司咪唑，(3) 比卡鲁胺，(4) 酮康唑，(5) 洛哌丁胺，(6) 格列本脲，(7) 灰黄霉素，(8) 特非那定，(9) 硝苯地平，(10) 氟哌啶醇，(11) 睾酮，(12) 氟他胺，(13) 比托特罗，(14) 地西泮，(15) 卡马西平，(16) 氯唑沙宗。 图8 比卡鲁胺的 PXRD 曲线：（a）初始晶体样品；（b）初始无定形样品；（c）无定形样品在磷酸盐缓冲液中搅拌 24 小时后。 图9 硝苯地平的 PXRD 曲线：（a）初始晶体样品；（b）初始无定形样品；（c）无定形样品在磷酸盐缓冲液中搅拌 24 小时后。 图10 各化合物不同批次测得的最大和最小对数溶解度之差 (n=360)。大于或小于检测限（超出范围值）的值已从分析中排除。平均 logSmax-logSmin=0.44。4.3 利用固态表征进行热力学溶解度测定 近年来，在化合物发现领域出现了一种趋势，即开发高通量热力学溶解度测定方法，该方法在搅拌结束后进行固态评估。这种评估有助于解释溶解度数据，并且在将溶解度数据与分子结构关联起来时是一个重要的考虑因素。固态表征方法包括使用偏光显微镜（PLM）、显微分析、粉末X射线衍射（PXRD）和拉曼显微镜。所有这些方法的关键在于获得足够的固体样品。研究表明，PLM 可以应用于仅需0.6毫克样本量的DMSO溶解度检测，并能对残留固体进行无定形/晶形表征。将样品溶液置于96孔玻璃底板中离心后，直接分析所得固体。另有研究报道，使用0.5-4mg样品的溶解度检测系统通过显微镜分析也可实现类似表征。在这种情况下，离心后去除上清液，并将剩余固体重悬于硅油中，然后再进行分析。近期该检测方法还引入了拉曼光谱分析，用以识别固体形态的转变。相比之下，采用金标准方法——粉末X射线衍射对残留固体进行表征的热力学溶解度检测，通常需要比显微镜技术更多的样品量。已有研究报道了一种包含PXRD评估的高通量热力学溶解度检测方法，仅需3毫克固体样品。该方法使用定制镍过滤板对振荡17小时后的样品溶液进行过滤，这种镍过滤器因其在分析窗口不产生背景衍射，成为向PXRD仪器呈现残留固体的理想载体。4.4 电位滴定法测定溶解度 电位滴定法是另一种用于测量化合物发现阶段水溶性的技术，但由于通量限制，该技术通常在LO阶段后期使用。电位滴定法专门测量固有溶解度，即分子中性形式的溶解度。 利用电位滴定法测定固有溶解度，其原理是通过测量可电离化合物在酸碱滴定过程中因化合物沉淀引起的pH值变化。在Avdeef开发的pSol方法中，至少需要进行三次沿溶解方向的滴定。通常的pH值与滴定体积曲线被重新表示为Bjerrum图，即平均结合质子数与pH值的关系图。Bjerrum图可以更清晰地观察化合物pKa值的变化，并用于通过以下公式计算固有溶解度(S0)。 其中，S0 为固有溶解度，C 为化合物的总浓度，pKaapp 为在有沉淀的情况下测得的 pKa，pKa 为在无沉淀的情况下测得的水溶液 pKa。 pSol法测定的固有溶解度与摇瓶法测得的值吻合良好，且由于该技术无需样品校准，因此所需化合物量更少。每次pSol溶解度测定所需时间因化合物而异，通常为3-10小时。难溶性化合物的测定时间可能更长，且容易发生重沉淀，导致滴定点偏离正常范围。在这种情况下，制造商建议在助溶剂存在下重复滴定，并采用不同百分比的助溶剂，然后外推至纯水溶液的溶解度值。虽然这可以提高滴定的速度和准确性，但额外的滴定次数通常会增加总实验时间。进行滴定时，还应考虑化合物的物理形态，而这通常未被表征。所提供化合物的初始物理形态可能与每次滴定后重新沉淀的形态不同，这会影响首次滴定和后续滴定之间报告的溶解度。还应注意的是，由于固体在每个pH值下与水溶液达到平衡的时间非常短，因此与经典的摇瓶溶解度法（24小时）相比，在pSol法中生成化合物热力学稳定形式的机会更少。 Cheqsol 方法采用与 pSol 方法类似的实验装置。然而，与 pSol 方法不同的是，Cheqsol 方法首先将化合物溶解于溶液中，然后进行滴定，直至通过紫外光谱探针检测到光散射产生的沉淀。此时，通过反复添加少量酸和碱，使溶液在欠饱和和过饱和状态之间切换，从而快速达到平衡点，并由此计算出化合物的固有溶解度。与 pSol 技术一样，测定固有溶解度需要精确测量化合物的水溶液 pKa 值。对于难溶性化合物，则采用在助溶剂中进行滴定，然后外推至水溶液状态的方法。Cheqsol 技术的优势在于能够相对快速地达到平衡状态，对于无需助溶剂外推的化合物，实验时间约为 1 小时。已对两种化合物双氯芬酸和舒林酸进行了研究，结果表明，在 Cheqsol 中进行电位循环会导致晶型变化。通过 Cheqsol 生成的固体的物理形态与经典摇瓶研究中观察到的固体的物理形态有何不同，还有待确定。4.5 热力学溶解度数据在LI和LO中的应用 在LI和LO阶段，热力学溶解度数据用于辅助理解药物代谢动力学（DMPK）数据并指导制剂设计。当溶解度较低时，会出现一些DMPK问题，例如生物利用度差且变异性大、空腹/进食效应以及剂量线性关系不佳。难溶性分子在药物研发过程中也可能带来显著且耗时的制剂开发挑战。为了解决这些问题和挑战，溶解度数据经常被用作药物发现过程中分子设计的一部分。在这方面，热力学溶解度数据已成功应用于局部和通用定量构效关系（QSPR）模型，例如使用贝叶斯神经网络（BNN）、多元线性回归（MLR）和偏最小二乘法（PLS）等技术，以及用于匹配分子对分析以确定取代基效应。后一种方法已被证明在识别影响溶解度的新型结构效应方面尤为有效。例如，图11展示了一个项目，该项目通过引入单个甲基提高了一系列化合物的溶解度。仅从logP值来看，这种提高并不明显，但它暗示了晶体堆积方式的变化。对这类观察结果的解释需要使用高质量的溶解度数据，并结合对固态性质的了解，以消除物理形态效应的影响。在化合物发现早期阶段加强对固态性质的表征这一趋势，能够促使人们在分子设计中更有效地利用溶解度数据。 图11 晶体溶解度匹配对，显示邻位甲基取代基的影响。5.结论 水溶性是药物发现过程中一项重要的性质，它对化学、药物代谢动力学（DMPK）和制剂以及生物活性测定结果的解读都具有重要影响。由于准确预测溶解度存在诸多困难，因此从早期药物诱导试验（HI）开始，水溶性的测定就至关重要。为了应对HI阶段需要表征的大量化合物，以及为了更好地理解生物活性测定数据，人们开发了基于动力学溶解度和浊度读数的自动化方法。然而，近年来，人们的需求已转向高质量的热力学溶解度测定，以便早期评估制剂开发中的风险，并识别高质量的先导化合物系列。这种对热力学溶解度的早期测定要求对传统的摇瓶法进行改进，使其更易于自动化操作，从而提高测定通量，并充分利用DMSO溶液易于分装的优势。此外，在药物发现的LO阶段，溶解度实验中对样品进行固态表征的趋势也日益增强。这种表征意味着对发现阶段的溶解度数据有更深入的理解，从而更有信心利用这些数据评估药物制剂的风险，并在分子设计中更好地应用溶解度数据。