降低PD-L1表达被认为是调节PD-1/PD-L1通路的一种有效的策略，引起了持续的研究兴趣。本文将重点分析能够降低PD-L1表达的分子，并根据是否直接与PD-L1结合将其分为降解剂和下调剂。此外，它还深入探讨了 PD-L1 降解剂以及基于 PD-L1 的联合疗法和多靶点药物开发的合理设计策略和挑战。1. 背景介绍近几十年来，免疫疗法的发展引发了癌症治疗的新革命，其中包括利用免疫系统识别和攻击癌细胞的免疫检查点抑制剂（ICIs）和过继细胞移植（ACT）。细胞死亡蛋白-1（PD-1）/程序性细胞死亡配体1（PD-L1）疗法作为最具代表性的ICIs之一脱颖而出，自1992年发现以来得到了迅速发展（图1）。PD-1、也称为 CD279，是一种 I 型跨膜蛋白，主要表达于各种免疫细胞，包括 B 细胞、T 细胞、自然杀伤细胞(NK)、树突状细胞 (DC) 和肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL)。（CD274或B7−H1）是另一种I型跨膜蛋白，作为PD-1的结合配体，主要表达于肿瘤细胞（如肺、肝、结肠、卵巢癌、乳腺癌、食管癌、黑色素瘤等）、B细胞、T细胞、DC、肥大细胞、巨噬细胞和非造血健康组织细胞。在肿瘤微环境中，PD-1与PD-L1相互作用导致PD-L1下调T 细胞功能和抗肿瘤免疫抑制；最终，肿瘤细胞实现免疫逃逸，避免被T细胞杀死。阻断 PD-1/PD-L1 的相互作用将诱导肿瘤中新鲜且未耗尽的替代 T 细胞的富集，从而改善抗肿瘤免疫反应（图 2），成为一种有前途的肿瘤治疗策略。图1. 靶向PD-1/PDL1研发关键进展时间表图2. 肿瘤免疫阻断疗法机制简图迄今为止，多种针对PD-1/PD-L1相互作用的单克隆抗体药物（例如pembrolizumab、dostarlimab、nivolumab、durvalumab、atezolizumab、avelumab等）已被批准用于治疗全谱系肿瘤，并表现出显著的临床疗效。然而，抗体药物的某些固有缺陷，如免疫相关不良事件、药代动力学（PK）特性差、肿瘤组织渗透性差、生产成本高等阻碍了其更广泛的临床应用。针对PD-1/PD-L1的小分子抑制剂自从百时美施贵宝（BMS）公司公开了联芳甲基芳基醚支架作为小分子PD-1/PD-L1抑制剂以来，这种相互作用有望克服抗体药物的上述缺点，并得到了广泛的探索（图3）。2015年共晶结构分析表明小分子PD-1/PD-L1抑制剂不与PD-1结合，而是与PD-L1胞外结构域结合，诱导PD-L1二聚化，形成PD-L1复合物二聚体/抑制剂来阻碍PD-1和PD-L1之间的相互作用。与抗体药物不同，迄今为止还没有小分子PD-1/PD-L1抑制剂上市。迫切需要更多的临床前和临床研究来推进小分子PD-1/PD-L1抑制剂的开发。此外，目前的小分子PD-1/PD-L1抑制剂基于联苯核心支架，普遍表现出较低的口服生物利用度，可能与这些分子的高疏水性有关。同时，PD-1/PD-L1蛋白-蛋白相互作用的平坦、疏水性和延伸的结合界面也增加了开发小分子抑制剂的难度。而且PD-L1的胞质区域参与促进肿瘤细胞增殖的细胞内信号传导，这表明仅通过抑制剂调节PD-1/PD-L1相互作用可能不足以达到预期的抗肿瘤功效。因此，许多研究小组已经试图寻找干扰 PD-1/PD-L1 轴的替代策略，其中减少 PD-L1 表达的降解剂和下调剂引起了持续的研究兴趣，因为它们是“事件驱动的”（例如降解剂），因此可以克服传统抑制剂“占据驱动”的缺点（高剂量、非催化作用、毒性、耐药性等）。在此，我们重点关注PD-L1降解剂和下调剂的药物化学视角，旨在为针对 PD-1/PDL1 轴的药物开发提供鼓舞人心的见解。图3. 代表性的PD-1/PDL1阻断小分子抑制剂2 与 PD-L1 结合的降解剂2.1.通过泛素-蛋白酶体系统降解PD-L1的药物。PD-L1 降解剂最初与 PD-L1 结合，随后通过泛素蛋白酶体系统或溶酶体途径诱导 PD-L1 降解。通过泛素-蛋白酶体系统降解 PD-L1的药物。蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC) 已成为药物发现中的一种新型治疗策略，它通过劫持活细胞中的泛素蛋白酶体系统来诱导致病性靶蛋白的降解。PROTAC 是由三个部分组成的异双功能分子：结合蛋白质的配体感兴趣的，另一个招募E3泛素连接酶的配体，以及连接两个配体的连接子。最近，开发了基于PROTAC的PD-L1降解剂配体和E3 连接酶配体（CRBN、VHL、cIAP 和 MDM2）的四个系列。其中，将 BMS-37 与沙利度胺（CRBN 配体）偶联的化合物 BMS-37-C3（14，图 4）被认为是最有效的 PROTAC 分子，对 PD-L1 表现出显著的降解活性在B16-F10和A375细胞中。此外，在T细胞和A375细胞共培养模型中，BMS-37-C3增强了T细胞对A375细胞的杀伤能力。一般认为，基于CRBN的PROTAC主要降解细胞内蛋白质，因为CRBN存在于细胞质中；因此，BMS-37-C3 诱导细胞表面 PD-L1 降解的确切机制仍有待阐明。图4. BMS-37-C3化学结构和设计策略另一方面，基于抗体的PROTACs（AbTACs）通过招募膜结合E3连接酶RNF43成功地通过溶酶体途径实现了细胞表面PD-L1的降解，表明利用膜结合E3连接酶设计PROTACs可能是一种有效的策略用于降解细胞表面的 PD-L1。在发现BMS-37-C3之前，有报道一种新的PROTAC分子（21a，15），也基于BMS-37和沙利度胺的结构（图5），有效地诱导PD-L1在多个肿瘤细胞中降解。此外，静脉注射化合物21a对皮下接种MC-38细胞的C57BL/6小鼠具有抗肿瘤作用。随后对肿瘤组织的免疫组化分析表明，21a诱导PD-L1降解，改善CD8+ T细胞对肿瘤组织的侵袭。图5. PROTAC化合物21a的化学结构和设计策略此外，还有基于碳点 (CD，carbon-dot，新型的零维荧光纳米材料，尺寸通常小于10 nm，其核含有sp2杂化的碳原子，表面可能有氨基、醚基、羰基、羟基和羧基等官能团。它具有生物相容性好、荧光量子产率高、化学稳定性高、极少光漂白和眨眼现象等特性) 的PROTAC (CDTAC（carbon-dot (CD)-based PROTACs），18)，可通过泛素蛋白酶体系统降解膜蛋白。与传统的基于小分子的PROTAC相比，CDTAC是基于纳米材料的降解剂，可以通过内吞作用被肿瘤细胞摄取。PD-L1 靶向 CDTAC 是通过将BMS-1166（一种 PD-L1 配体）和沙利度胺与 CD 上的氨基结合而获得的（图 6），在B16-F10 和 CT26 细胞内体外和体内有效诱导PDL1 降解。CDTAC通过内吞作用转运至溶酶体，然后释放至细胞质。在细胞质内，CDTAC 通过泛素-蛋白酶体系统有效诱导 PD-L1 降解。此外，CDTACs可以激活干扰素基因刺激剂（STING）通路，从而促进树突状细胞（DC）的生长成熟和 T 细胞启动。图6. 靶向PD-L1 降解CDTACs设计策略和合成路线BMS-1166（图 3）是一种直接与 PD-L1 结合的 PD-1/PD-L1 抑制剂。BMS-1166影响PD-L1糖基化并抑制PD-L1从内质网（ER）转运至高尔基体，导致泛素化和蛋白酶体降解PD-L1。这些结果表明，BMS-1166 与 PD-L1 的结合可能会破坏 PDL1 的翻译后加工，激发研究人员探索其他 PD-1/PDL1 抑制剂是否具有通过类似或不同机制降解 PD-L1 的能力。2.2.通过溶酶体途径降解PD-L1的药物。多种化合物对PD-1/PD-L1的相互作用表现出显著的抑制活性，其中只有化合物P22（21，图7）将BMS-1198与泊马来酰胺结合，弱诱导PD-L1降解，而BMS-1198和泊马来酰胺不影响PD-L1的水平。用MG132（蛋白酶体抑制剂）和Bafilomycin（溶酶体抑制剂）处理表明，P22通过溶酶体依赖途径诱导PD-L1的降解是通过溶酶体依赖的途径，这与依赖于泛素-蛋白酶体系统的典型CRBN-based PROTAC分子不同。此外，在Hep3B/OS-8/hPD-L1和CD3+ T细胞共培养模型中，P22剂量依赖性地促进了IFN-γ的分泌。图7. PD-L1 降解PROTAC化合物P22的设计策略和合成路线综上所述，需要进一步研究经典PROTACs诱导PD-L1降解的机制。此外，在上述研究中，除AbTACs和CDTACs外，还需要高剂量的化合物（>2.5 μM）来观察PD-L1的大量降解。因此，必须开发出更有效的能够诱导PD-L1降解的PROTACs。利用膜结合的E3连接酶设计PROTACs，如AbTACs，可能是通过溶酶体途径降解细胞表面PD-L1的有效策略。此外，代谢稳定性影响靶向PD-L1的小分子抑制剂和PROTACs的发展；因此，它也可能是这些杂交化合物（即PD-L1 PROTACs）的严重障碍。更重要的是，细胞外的PD-L1，如存在于外泌体中或作为自由溶性蛋白的PDL1，也在抑制抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用，而目前的PROTACs不能靶向细胞外蛋白。与典型的 PROTAC 不同，溶酶体靶向嵌合体 (LYTAC) 最初由 Bertozzi 及其同事开发，用于通过溶酶体途径降解细胞外和膜相关蛋白。LYTAC也是由三个部分组成的异双功能分子：结合感兴趣蛋白质的小分子或抗体，结合细胞表面溶酶体靶向的另一种配体受体（LTR）和连接两个配体的接头。为了响应 LYTAC，目标蛋白与 LYTAC 和LTR 形成三元复合物，随后经历内吞作用和溶酶体降解（图 8）。基于上述原理和机制，PD-L1抗体与阳离子非依赖性甘露糖6-磷酸受体（CI-M6PR；也称为胰岛素样生长因子2受体，IGF2R）的糖多肽配体偶联，该受体是一种典型的胰岛素样生长因子2受体（IGF2R）。细胞表面 LTR，导致MDA-MB-231 和 HDLM-2 细胞系中通过溶酶体途径的细胞表面 PD-L1 表达水平显着降低。除了PD-L1之外，载脂蛋白E4 CD71和表皮生长因子受体（EGFR）也被相应的LYTAC降解。为了开发更有效和可药物化的PD-L1 LYTAC，需要大量的研究工作。首先，可以设计靶蛋白和细胞表面LTR的小分子配体并将其应用于PD-L1 LYTAC，例如Spiegel及其同事诱导α二硝基苯酚（DNP）抗体和巨噬细胞迁移抑制因子降解的工作（ MIF）与小分子 LYTAC。其次，除了CI-M6PR之外，还应该探索更多类型的细胞表面LTR，例如肝脏特异性脱唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）、分拣蛋白和转铁蛋白受体。此外，Jiang和同事设计了信号介导的溶酶体靶向嵌合体（ SignalTAC）根据 CI-M6PR 的溶酶体分选信号降解 PD-L1这也可能为 LYTAC 的开发提供鼓舞人心的结果。第三，LYTACs的PK、药效学（PD）和安全性需要进一步研究。图8. 靶向PD-L1的LYTACs设计策略基于 LYTAC 技术，Liu 及其同事最近开发了基于 DNA 适配体的共价 LYTAC，其一侧靶向 CI-M6PR，另一侧允许生物正交共价缀合增强与 PD-L1 的特异性结合（图 9）。与非共价对应物相比，共价 LYTAC 表现出显着且更有效的 PD-L1 降解效力。除了阻断 PD-1/PD-L1 相互作用外，共价 LYTAC 还通过降解 PD-L1 引起肿瘤细胞的免疫原性凋亡。此外，体内研究表明，与PD-L1抗体相比，共价LYTAC具有更强的抗肿瘤功效和更少的炎症损伤。基于适配体的药物是一种新兴技术，具有非免疫原性、特异性高、生产成本低等优点，但较差的PK特性可能阻碍其进一步发展。图9. 靶向PD-L1的共价LYTACs设计策略与 LYTAC 类似，Fang 及其同事开发了一种整合素促进溶酶体降解 (IFLD) 策略，以整合素和溶酶体依赖性方式降解细胞外和膜相关蛋白。IFLD分子也是由靶蛋白配体、整联蛋白配体和接头组成的异双功能分子。响应 IFLD 分子，靶蛋白与 IFLD 分子和整合素形成三元复合物，然后经历内吞作用和溶酶体降解（图10）。通过将 BMS-8 作为PD-L1 配体和 cRGD（一种环肽）作为 αβ 整联蛋白配体与不同的连接体结合，获得了三个靶向 PD-L1 的 IFLD 分子 (23−25)。其中，BMS-L1-RGD (23) 在 MDAMB-231 细胞中以整合素和溶酶体依赖性方式显示出最有效的针对 PD-L1 的降解活性。使用 B16F10 肿瘤异种移植物 C57BL/6J 小鼠模型的体内研究表明，BMS-L1-RGD 显著抑制肿瘤生长并诱导 PD-L1 降解。此外，PK特性可能是基于肽的IFLD分子的绊脚石，开发和应用有效的整合素小分子配体将是提高IFLD分子成药性的替代且有前景的策略。图10. 靶向PD-L1的IFLD设计策略利用内源性细胞因子介导的同源受体内化来实现靶蛋白的溶酶体递送，开发了细胞因子受体靶向嵌合体 (KineTAC)，它可以通过溶酶体途径诱导细胞表面和细胞外蛋白的降解（图 11）。KineTAC 是双特异性抗体，由用于结合其同源细胞因子受体的细胞因子臂和用于靶蛋白的靶结合臂组成。基于结合诱饵受体 CXCR7 的趋化因子 CXCL12，融合 PD-L1 抗体的 KineTAC 可有效诱导 MDA-MB231 细胞中的 PD-L1 降解。此外，人表皮生长因子受体 2 (HER2)、表皮生长因子受体 (EGFR)、含 CUB 结构域的蛋白 1 (CDCP1)、肿瘤相关钙信号转导器 2 (TROP2)、PD1、肿瘤坏死因子-α (TNF) -α）和血管内皮生长因子（VEGF）也被各自的 KineTAC 成功降解。这意味着设计结合细胞因子受体（例如 CXCR7）和感兴趣的蛋白质的小分子嵌合体可能是诱导细胞降解的替代策略-表面和细胞外蛋白。图11. 靶向PD-L1的KineTAC设计策略为了取代 CI-M6PR 的糖多肽配体，最近设计了基于 IGF2 的肽作为 CI-M6PR 的配体，然后将其与 PD-L1 抗体融合以获得基于肽/蛋白质的 LYTAC（图 12）。这些LYTAC可以与PD-L1和CI-M6PR结合，从而诱导PD-L1降解并增强外周血单核细胞（PBMC）对肿瘤细胞的细胞毒性。图12. 靶向PD-L1的KineTAC基于IGF2肽段的LYTACs设计策略一般来说，上面提到的大多数分子（14、15、18、21和23−25）都是基于PD-1/ PD-L1小分子抑制剂的杂化化合物。典型的PD-1/PD-L1抑制剂（以BMS202为例）药效团可分为核心组、连接子、芳基和尾基（图13）。从这些杂化化合物的结构角度来看，它们通过各种连接物与PD-1/PD-L1抑制剂尾基团中的另一个分子偶联。实际上，PD-1/PD-L1抑制剂通过诱导PD-L1形成对称二聚体与PDL1结合；因此，根据我们对PD-1/PD-L1抑制剂57−61的研究经验，我们推测核心组可能是另一个与不同分子偶联的位点（图13），这可能产生值得进一步研究的新的杂化化合物。图13. BMS202与PD-L1结合模式和潜在的重要药效团基于小分子可能能够抑制PD-1/PD-L1相互作用并诱导PD-L1降解的假设，通过虚拟筛选和研究报道了一系列小分子PD-1/PD-L1抑制剂。广泛的结构-活性关系研究。其中，化合物Jiang-17（30，图14A）在PD-L1-GFP质粒转染的293 T细胞中诱导PD-L1内化到细胞质中，并通过溶酶体依赖性促进MDA-MB-231细胞中的PD-L1降解。此外，在PBMC和MDA-MB-231细胞共培养模型中，Jiang-17还有效抑制PD-1/PD-L1相互作用并激活PBMC的抗肿瘤免疫。晶体结构分析表明Jiang-17诱导PD-L1二聚化并形成PD-L1二聚体/Jiang-17复合物。体内研究表明，Jiang-17 抑制了接种 CT26 细胞和 B16−F10 细胞的 BALB/c 小鼠的肿瘤生长。图14. Jiang-17的设计策略和化学结构通过在体外使用均相时间分辨荧光 (HTRF) 测定筛选小分子文库，发现了一种有效的 PD-1/PD-L1 抑制剂，命名为 ARB-272572（31，图 14B）。进一步的研究表明，ARB-272572诱导 PD-L1 二聚化并随后内化到细胞质中，导致细胞表面PD-L1 水平降低。在接种MC38细胞的人源化PD-1/PD-L1小鼠中，ARB-272572表现出显著的抗肿瘤作用，并降低了细胞表面PD-L1的表达水平。此外，ARB-272572 改善了乙型肝炎病毒 (HBV) 特异性免疫反应。除了与 PD-L1 胞外区域结合的配体外，Xu 及其同事还发现 HIP1R 充当PD-L1 的内源性配体，它可以与 PD-L1 的胞内区域结合，并与 PD-L1 结合，然后以溶酶体依赖性方式促进 PD-L1 降解。此外，他们设计的嵌合肽（PD-LYSO，32）也成功实现了溶酶体依赖性PD-L1降解（图15）。这一发现意味着PD-L1的胞内区域也可以被靶向，为PD-L1的胞内区域提供了新的策略。有可能可以设计肽、肽模拟物和小分子来结合PD-L1的胞内区域，从而阻碍PD-L1的免疫抑制功能。图15. 嵌合肽PD-LYSO 降解PD-L1的作用机制3. 不与PD-L1结合的下调调节器作为一种膜蛋白，成熟的PD-L1需要经历复杂的过程，包括转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰（如磷酸化、泛素化、甲基化、糖基化和棕榈酰化）、运输等，受多种蛋白质和因子的调节。迄今为止，据报道，多种分子不是通过与PD-L1结合而是通过影响上述过程来下调PD-L1的表达水平，从而表现出抗肿瘤免疫作用。接下来，我们简要总结这些分子和它们下调 PD-L1 的机制（图 16）。图16. 间接调控PD-L1水平的小分子汇总3.1 影响PD-L1的转录信号转导和转录激活因子（STAT）信号通路在调控基因转录和生物学过程中起着重要作用，包括STAT1/2/3/4/5A/5B/6。2017年，Sun及其同事发现PD-L1的过表达与头颈部鳞状细胞癌患者中磷酸化的STAT3水平显著相关。用STAT3抑制剂S3I- 201处理CAL27和FaDu细胞，可抑制STAT3的磷酸化，导致PD-L1的表达降低。组蛋白脱乙酰酶（HDAC）是一种表观遗传蛋白，在调节组蛋白和非组蛋白底物乙酰化水平的动态平衡中发挥着关键作用。越来越多的证据表明 HDAC 参与调节免疫相关通路和 PD-L1 的表达水平。2016年，Villagra及其同事发现HDAC6通过调节STAT3的激活来调节PD-L1的表达。HDAC6 和磷酸化 STAT3 被招募到 PD-L1 的启动子上，从而激活 PD-L1 基因转录。通过选择性HDAC6抑制剂（Tubastatin A和Nexturastat A）抑制HDAC6或敲低HDAC6均能阻断STAT3的磷酸化，并进一步降低黑色素瘤细胞中PD-L1的表达。由 BRD2、BRD3、BRD4 和 BRDT 组成的溴结构域和额外末端结构域 (BET) 蛋白属于含溴结构域蛋白家族在识别和结合乙酰化组蛋白和其他非组蛋白底物以促进基因转录方面发挥着关键作用。近年来多项研究表明PD-L1基因（CD274）是BRD4介导的基因转录的直接靶点，BET抑制剂JQ1处理可降低PD-L1在转录和蛋白水平的表达，并降低PD-L1的表达。降低IFNγ诱导的PD-L1表达，从而提高抗肿瘤免疫效果。c-MYC是一种在多种肿瘤中过度表达的原癌基因，参与肿瘤的发生和发展。2019年，Ma及其同事发现非小细胞肺癌患者中PD-L1表达与c-MYC表达呈正相关，这些PD-L1和c-MYC双阳性表达的患者预后较差。随后在食管鳞状细胞癌患者中证明了类似的结果。此外，c-MYC抑制剂10058-F4降低了KY-S140细胞中PD-L1的表达。机制研究表明，c-MYC 直接与 PD-L1 启动子结合，导致 PD-L1 表达增加。3.2.影响PD-L1的翻译后修饰。二甲双胍是治疗2型糖尿病（T2D）的经典口服药物，近年来被发现具有抗肿瘤作用。2018年，Huang及其同事证明二甲双胍降低了多种肿瘤细胞中PD-L1的表达水平。进一步的机制研究表明，二甲双胍诱导激活的 AMP 激活蛋白激酶 (AMPK) 直接磷酸化 PD-L1 的 Ser195。PD-L1 Ser195 磷酸化诱导 PD-L1 异常糖基化，从而抑制内质化PD-L1 的微网 (ER) 易位至高尔基体，导致 PD-L1 内质网积聚，最终导致 PD-L1 泛素蛋白酶体依赖性 ER 相关蛋白降解 (ERAD)。3.3.影响PD-L1的运输。受到天然药物抗肿瘤功效的启发，Deng及其同事在2020年通过筛选发现小檗碱（BBR）下调非小细胞肺癌（NSCLC）细胞中PD-L1的表达水平系列中药化学单体。机制研究表明，BBR 通过在 Glu76 处直接结合组成型CSN5 并抑制其去泛素化活性，诱导泛素蛋白酶体依赖性 PD-L1 降解。此前，有报道称 CSN5 可以直接去泛素化 PD-L1，从而稳定 PD-L1。4. 联合抑制策略如上所述，PD-L1下调剂通过降低PD-L1表达来促进抗肿瘤免疫作用；将这些下调剂与其他免疫疗法结合起来，产生协同增强的抗肿瘤功效是可能的。多项研究表明，相应的联合疗法表现出协同抗肿瘤活性。然而，药物间相互作用、药代动力学特性和安全性是联合疗法开发的挑战。此外，同时针对多个肿瘤相关信号因子的多靶点药物将成为提高抗肿瘤效果的替代策略。研究人员可能会受到这些PD-L1下调剂的机制和结构的启发，开发出更有效的抗肿瘤药物。基于PD1/PD-L1抑制剂和HDAC抑制剂的经验，提供了双PD-L1/HDAC抑制剂的设计策略，作为开发多靶点抑制剂的模板。首先，分析两类抑制剂与相应蛋白质的结合模式。HDAC抑制剂（以Nexturastat A为例）药效团可分为锌结合基团（ZBG）、表面识别帽（SRC）和连接基团（图17），其中ZBG对于通过ZBG之间的螯合相互作用实现HDAC抑制活性是不可或缺的和HDAC的催化Zn离子；连接子将ZBG与SRC连接并占据HDAC结合口袋中的疏水隧道；SRC与HDAC表面的氨基酸残基相互作用，表现出多种结构；因此，将 PD-1/PD-L1 抑制剂药效团纳入该部分可能会导致 PD-1/PD-L1 和 HDAC 的双重抑制。结合图13中的分析，PD-1/PD-L1抑制剂中有两个位点可以尝试引入HDAC抑制剂药效团（图17）；最终，通过研究合适的连接体可以获得PD-L1/HDAC双重抑制剂。与单靶点药物相比，多靶点化合物可以同时靶向多个肿瘤相关信号因子，从而可能提高抗肿瘤效果。与联合疗法相比，多靶点化合物是单组分药物，可以克服联合疗法中不可预测的药物间相互作用、药代动力学特性和安全性的缺点。图17. PD-L1、HDAC双抑制剂的设计策略声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手觉得本文好看，请点这里↓

免疫疗法

2024-01-16

·药时代

靶向PD-1/PD-L1小分子药物的研究进展

前言利用免疫途径治疗癌症的免疫疗法正在迅速成为继手术、化疗和放疗之后的一种公认的癌症治疗方法。其中利用针对细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）、程序性死亡受体1（PD-1）或程序性死亡配体1（PD-L1）的单克隆抗体进行检查点阻断，在癌症免疫治疗方面取得了显著突破。然而，尽管免疫疗法有其优点，但它只在一小部分患者中获得成功，而广泛预测其疗效的生物标志物仍有待确定。此外，治疗期间还可能发生严重的治疗相关毒性，称为免疫相关不良事件（irAE），主要是由于免疫系统平衡失调。因此，小分子药物又回到人们的视野，因为这类药物相比单抗有许多优点。特别是，较短半衰期的小分子有利于急性和可逆的作用，并可能减少持久的全身副作用。与抗体不同的是，小分子通常以细胞内蛋白质为靶点，并具有不同的毒性特征，使其成为适用联合治疗的候选者。此外，与抗体相比，它们可以以更低的成本生产，并且通常可以口服给药。因此，需要基于免疫学和肿瘤学过程的分子洞察力的新策略来提高小分子在免疫治疗中的潜力，重点是小分子有望提高检查点阻断对癌症治疗的成功率。靶向PD-1/PD-L1小分子的设计PD-1/PD-L1受体-配体相互作用是蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的经典例子；因此，为这些相互作用设计抑制剂是极具挑战性的。这主要是因为（a）相互作用的大范围接触面积（1500–3000Å），（b）存在平坦的界面，没有深而明确的结合口袋，适合以高亲和力结合配体，（c）缺乏内源性小分子配体作为参考标准。在分析PD-1:PD-L1和PD-1:PD-L2复合物的晶体结构的进展方面，人们发现了几个潜在热点区域。基于PD-1:PD-L1晶体结构在PD-L1上鉴定的三个主要热区包括（1）由Tyr56、Glu58、Arg113、Met115和Tyr123的侧链组成的疏水口袋；（2）由Met115、Ala121和Tyr123组成的疏水位点附近的第二口袋；和（3）由Asp122、Tyr123、Lys124和Arg125的主链和侧链组成的延伸槽。这些区域被认为是使用常规小分子结合PD-L1的理想区域。目前，主要有两类不同的靶向PD-L1的小分子抑制剂，即（a）基于联苯支架的化合物；以及（b）在功能测定中鉴定的模仿受体-配体界面的氨基酸启发的小分子。1）联苯衍生物BMS的科学家基于PD-1:PD-L1相互作用的机制，开发了一系列联苯衍生物。此外，过去6年来，包括Incyte Corporation、Arising International Inc.、Chemocentryx Inc.、Polaris Pharmaceuticals和Guangzhou Maxinovel Pharmaceeticals Co.在内的多家公司已经发现了一系列基于联苯核心的小分子PD-L1抑制剂。在新的改性联苯支架中，具有C2对称性或含有极性基团的假对称性的化合物比不对称结构获得了很多关注。2）多肽检查点蛋白是膜蛋白，其中大多数来自B7家族。B7家族的大多数成员及其配体属于免疫球蛋白超家族（IgSF）。IgSF蛋白的受体-配体相互作用通过环、链或环和链介导。基于这些相互作用界面的多肽设计是PPI抑制剂设计的一种行之有效的策略。利用上述设计原理，已经开发出了了几种拟肽分子。靶向PD-1/PD-L1小分子的作用机制尽管多数分子设计来自于能够与PD-1:PD-L1复合物中的一个结合并阻止相互作用，但新出现的数据表明，一些化合物拮抗PD-1信号传导具有额外的复杂性。诱导PD-L1二聚并抑制PD-1:PD-L1相互作用通过晶体结构研究，一些化合物被证明通过诱导PD-L1二聚化来抑制PD-1:PD-L1相互作用。例如BMS的小分子抑制剂倾向于首先与一种PD-L1单体相互作用，然后形成二聚体，以获得稳定性优势。而Incyte和Arbutus还利用了PD-L1二聚体中固有的C2对称性，通过对称化其分子来获得更大的效力。阻断PD-L1从内质网向高尔基体输出PD-L1胞外结构域中存在的四个N-糖基化位点（Asn35、Asn192、Asn 200和Asn 219）对配体蛋白的稳定性是必需的，除Asn35外，所有其他糖基化位置对其与受体的相互作用都非常关键。BMS-1166特异性抑制部分PD-L1的糖基化，并通过阻断PD-L1从内质网向高尔基体的输出而使其功能失活。诱导PD-L1二聚和内化化合物ARB-272572通过顺式相互作用的同源二聚体诱导细胞表面PD-L1二聚来抑制PD-1/PD-L1轴，这种同源二聚物通过快速内化到胞质中触发细胞表面PD-L1的快速丢失，从而防止与表达PD-1的细胞发生进一步相互作用。与PD-L1结合而不干扰PD1:PD-L1复合物的形成与基于联苯的小分子抑制剂相比，CA-170是高度极性的，在细胞环境中观察到的PD-L1信号传导的功能拮抗作用，而其与PD-L1的直接结合却不破坏PD1:PD-L1复合物导致形成有缺陷的三元复合物。CA-170的这种作用模式类似于两种已报道的抗PD-1抗体的作用模式，它们在不干扰PD-1:PD-L1复合物形成的情况下拮抗PD-1信号传导。靶向PD-1/PD-L1小分子的临床研究进展CA-170是第一个于2016年进入临床试验的口服小分子PD-L1抑制剂，目前正在进行2b/3期试验（由Curis和Aurigene共同开发）。Incyte化合物INCB-086550的临床试验于2018年启动，第一阶段预计将于2022年完成。下表综合了临床上所有小分子抑制剂的最新发现。小结自首个PD-1——Opdivo单抗于2014年获FDA批准上市后，截止目前，中国也已有10款PD-1抑制剂、5款PD-L1抑制剂上市。PD-1/L1抗体可以说是目前癌症靶向药物研发中的“超热”赛道。然而，单抗存在诸多固有缺点，包括口服生物利用度差、延长的组织滞留时间和半衰期、较差的膜通透性、运输储存等方面的弊端，另外，抗体药物成本较高也是不可忽视的问题。因此，越来越多的研究人员在探索小分子药物作为PD-1/L1抑制剂以规避治疗性抗体的缺点。另外，与PD-1/L1抗体相比，口服小分子药物可以很容易地渗透到组织中，因此可以针对细胞外和细胞内的目标来促进抗肿瘤免疫，实现对肿瘤微环境的调节，甚至有望将“冷”肿瘤转为“热”肿瘤。而且它们的半衰期通常很短，降低了产生不良影响的机会。基于这些特点，在癌症免疫治疗领域开发基于小分子的策略引起了广泛的兴趣，其未来的前景仍然广阔而令人兴奋。参考文献：1.Immune-checkpoint inhibitors: long-termimplications of toxicity. Nat Rev Clin Oncol. 2022 Jan 26 : 1–14.封面图来源：123rf点击阅读原文，查看更多精彩内容

免疫疗法

2022-10-05

·BiG生物创新社

肿瘤免疫治疗小分子药物盘点

前言 PD1、PDL1、CTLA4等免疫检查点蛋白抑制剂（ICIs）的成功，使科学家们投入到肿瘤免疫治疗药物的开发热潮中。最近一些药物已进入临床试验，其中除了靶向表面蛋白的抗体外，不乏一些具有免疫刺激效应的小分子药物（见表1）。口服小分子药物克服了抗体药物不良反应多、半衰期长、输注给药不便等局限，为药物发现开辟了一个全新的领域。此外，肿瘤免疫小分子药物与免疫检查点抑制剂具有协同作用，两者联合用药的方案也得到了越来越多的批准。今年8月发表的Nature reviews盘点了肿瘤免疫治疗中的小分子药物及其应用发展 [1]。表1：肿瘤免疫治疗部分小分子药物作者 | 梨子君靶向细胞生长和肿瘤代谢的小分子抑制类药物01靶向促肿瘤通路癌症的两个固有的特征是失去细胞稳态周期控制和增加凋亡抵抗。另外，肿瘤持续的生长需要一个有利的微环境，并由促进血管生成、炎症和组织重塑的通路驱动。进展中的肿瘤能量需求不断增加，因此癌细胞重新调整其代谢途径，导致营养和代谢物浓度的显著变化，这些因素共同参与了肿瘤微环境（TME）的塑造 [2]。目前已经开发了各种靶向肿瘤细胞固有特征和TME途径的小分子药物。1. 细胞生长抑制剂细胞生长抑制类药物的疗效部分依赖抗肿瘤免疫反应的间接刺激，该类药物诱导的免疫原性细胞死亡（ICD）可以触发抗肿瘤T细胞应答的激活（图1）。在进入TME后，T细胞会遇到抑制信号而功能减弱，因此常常联合化疗和免疫检查点抗体。然而，化疗往往与淋巴减少症相关，会抵消诱导的适应性免疫反应。因此，联合具有选择性的靶向药物可能是更好的用药方案。在BRAF（V600E）转移性黑色素瘤中，BRAF抑制剂与MEK抑制剂联合应用是治疗的标准方法，之后进展的患者常用PD-1抗体进行二线治疗。这使得研究人员探索BRAF/MEK抑制剂与ICIs的三联治疗。两项I期研究表明，BRAF/MEK抑制可导致ICD，产生促炎信号，增加CD8+T细胞浸润，提高MHC I表达水平，使肿瘤细胞对T细胞介导的攻击更敏感。在这种情况下，同时给予ICI会以协同方式维持T细胞活化。此外，小分子抗肿瘤药物的影响可能不止于诱导ICD。MEK抑制可在多个水平上直接调节免疫浸润的性质，例如通过减少CD4+调节性T细胞（Treg细胞）、髓源性抑制细胞（MDSC）和M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAM），导致TME中CD8+/Treg淋巴细胞和M1/M2巨噬细胞比值增加。一项II期疗效试验显示，与治疗组合达布雷尼布（BRAF抑制剂）和曲美替尼（MEK抑制剂）相比，加上帕博利珠单抗（PD1 抗体）的三联疗法延长了患者的无进展生存期。IMspire150 III期研究也也观察到同样的效果，这项研究评估了阿替利珠单抗（PDL1抗体）、维莫非尼（BRAF抑制剂）和考比替尼（MEK抑制剂）的联合，并于2020年7月获FDA批准用于治疗BRAF（V600E）突变型黑色素瘤。图1：免疫原性细胞死亡调节T细胞活性2. VEGF–VEGFR 抑制剂血管内皮生长因子（VEGF）是一种刺激血管生成的信号蛋白，能抑制抗原提呈、招募免疫抑制细胞亚群、破坏抗肿瘤T细胞反应。高血管化肿瘤（如肾细胞癌）对VEGF–VEFGR通路抑制剂介导的血管生成阻断特别敏感。ICIs与这种药物的结合具有协同效益。2018年12月FDA首次批准贝伐单抗（VEGF 抗体）与阿替利珠单抗联合用于晚期非小细胞肺癌的一线治疗。2019年，阿西替尼成为首个FDA注册的小分子VEGFR酪氨酸激酶抑制剂，与帕博利珠单抗或阿维单抗（PDL1 抗体）联合用于晚期肾细胞癌的一线治疗。两种方案均优于迄今为止针对该适应症的标准方案——广谱激酶抑制剂舒尼替的单药治疗。目前，在其他实体肿瘤（包括黑素瘤、头颈癌、肝细胞癌、结直肠癌、胃癌和妇科癌）中，已有超过100项类似方案的试验启动，总体结果有望获得FDA批准 [3] 。3. 细胞因子、趋化因子通路阻断剂细胞因子超家族在细胞交流中起着至关重要的作用，特别是在免疫系统中。干扰素-α （IFNα）和白细胞介素-2 （IL-2）对T细胞增殖和效应功能有强烈刺激作用，成为第一批用于癌症免疫治疗的细胞因子。然而，在大多数情况下，这些细胞因子治疗无法重现临床前模型的抗肿瘤疗效。迄今为止，阻断促癌炎症过程中的细胞因子通路和/或抑制T细胞免疫的治疗方法，如IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TGFβ和CSF1，在临床研究中也没有表现出一致的疗效。尽管其中一些药物与ICIs和/或细胞抑制模式的组合可能被证明对癌症患者有效，但TME中细胞因子网络的复杂性使得单一通路抑制的抗癌效果削弱。从免疫治疗的角度来看，抑制CSF1-CSF1R通路可能是一种更有前途的策略。高水平的CSF1会促进微环境中TAMs和MDSCs的浸润和扩张，在临床前模型中抑制该通路能减少髓细胞浸润并增加CD8+ T细胞，从而与ICIs协同作用。因此，该途径的多种抗体和小分子抑制剂或作为单一药物，或与细胞抑制药物或ICIs联合使用（图2）。图2：CSF1R抑制剂结构2019年，FDA批准小分子CSF1R-TK抑制剂培西达替尼用于治疗腱鞘巨细胞瘤 (TGCT)。ARRY-382是一种选择性更强的CSF1R抑制剂，在一项II期临床试验中与pembrolizumab联合治疗晚期实体肿瘤，但辉瑞公司最近发布的研究报告显示该方案对患者没有任何有益的效果。相比其他人类激酶，Vimseltinib对3类RTKs具有超过100倍的选择性。2022年9月12日，生物制药公司Deciphera Pharmaceuticals Inc.在ESMO上公布了Vimseltinib治疗腱鞘巨细胞瘤I/II期试验的最新数据，显示31名患者都表现出临床获益，A组的客观反应率为53%，B组为46%。另一种选择性CSF1R抑制剂BLZ945是一种脑穿透剂，目前正在进行I/II期临床试验，作为单药或与斯帕巴他珠单抗（PD1 抗体）联合用于治疗晚期实体肿瘤及中枢神经系统癌症。初步数据显示对胶质母细胞瘤患者具有抗肿瘤活性和可接受的安全性。02 靶向代谢途径肿瘤生长过程中各种代谢物的积累促进TME的形成，驱动这一过程的几种酶促蛋白可以被靶向调节，目前研究与小分子开发较为深入的主要为以下三种途径。1. 谷氨酰胺和精氨酸代谢抑制剂癌细胞通过促进糖酵解和谷氨酰胺分解来满足对能量和生物合成前体的高需求。值得注意的是，TME中不止有肿瘤细胞，T细胞、髓细胞以及其他基质细胞之间对葡萄糖、谷氨酰胺和其他营养物质存在激烈的竞争。尽管临床前模型中，用小分子抑制这些代谢通路可导致肿瘤生长减少和免疫细胞浸润重编程，但在临床试验中仍缺乏具体证据。如著名的口服谷氨酰胺酶抑制剂CB839，基于临床前的成功数据进行了多项临床研究。尽管如此，由于在两项针对肾细胞癌和非小细胞肺癌的试验中没有临床效益，Calithera Biosciences最近停止了该化合物的开发。肿瘤、T细胞和MDSCs都依赖于精氨酸，从而进一步增加了这种氨基酸在TME中的需求。目前，一些小分子精氨酸酶抑制剂已经被开发出来，其中一种是硼酸基化合物INCB001158，已被Incyte纳入五项早期临床试验，在这些研究中，该药单独或与ICIs联合试验。初步试验报告表明，INCB001158的耐受性良好，临床疗效的信息有待全面评估发表。但截至最近，INCB001158已不再列在Incyte的投资组合中，这表明其临床开发已经停止。另外一种抑制剂是Calithera公司开发的CB-280，正在对囊性纤维化患者进行安全性评估。除上两者外，目前没有进一步的精氨酸酶抑制剂在临床试验中。2. 腺苷途径阻断剂腺苷是一种强大的免疫抑制剂，许多肿瘤产生高浓度的腺苷 [4]。其免疫抑制特性是由两个G蛋白偶联受体（GPCRs）介导的，即高亲和力的A2aR和低亲和力的A2bR（图3）。腺苷途径阻断剂imaradenant、ciforadenant和inupadenant特异性抑制A2aR，从2015年开始进行I/II期肿瘤试验，但迄今尚未报告临床疗效的明确证据。目前科研人员的注意力转向双A2aR/A2bR抑制剂。一个例子是etrumadenant，两种受体的拮抗剂，其可联合zimberelimab（PD1 抗体）和多西他赛（多烯紫杉醇）治疗转移性去势抵抗性前列腺癌患者。此外，在结直肠癌中，etrumadenant联合FOLFOX化疗作为三线治疗显示出有临床意义的疗效。另外，考虑到TME中的高腺苷浓度，高亲和力A2aR可能会被永久打开，其他研究人员正在开发低亲和度A2bR的阻断剂。Teon Therapeutics已开始开发TT-702，这是一种选择性A2bR拮抗剂，对免疫细胞和癌细胞都有活性。Taros Therapeutics也在开发A2bR选择性分子。在TME中，腺苷由外胚层酶CD73催化AMP生成，因此CD73成为该途径另一重要靶点。除了几种Ab类药物外，还有AB680和OP5244/ORIC-533两个小分子正在研究。此外，腺苷可以通过各种额外的外泌酶产生，如CD38、CD39、CD203a/外泌核苷酸磷酸磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员1、碱性磷酸酶和前列腺酸性肽酶（图3）。目前，针对CD38和CD39的临床抗体已经存在，未来可能会产生更多针对这组外胚层酶的小分子药物。该途径之后的方向可以聚焦在正确靶点组合的选择上。图3：腺苷途径相关通路3. 犬尿氨酸途径抑制剂肿瘤细胞和间质细胞可以在IDO1和TDO两种酶介导的反应中分解色氨酸，从而产生犬尿氨酸 [5]。由此导致的色氨酸缺乏和TME中犬尿氨酸的积累都会抑制免疫反应。在与芳香烃受体（AHR）结合后，犬尿氨酸可以抑制效应T细胞，促进 CD4+ Treg细胞和MDCSs的发展（图4）。临床实验表明，该途径的阻断在IDO1和犬尿氨酸水平高的患者中更具价值。林罗多司他是一种更有效的、不可逆的IDO1抑制剂，耐受性良好，目前正与纳武单抗联合用于黑色素瘤患者的III期临床试验中。但是，其他色氨酸降解酶TDO和IDO2的代偿性表达可能使肿瘤对IDO1抑制不敏感。此外，IL-4诱导-1（IL4i1）最近被确认为一种额外的色氨酸分解酶，由肿瘤和髓系细胞分泌到TME（图4）。因此，可能需要同时抑制上述几个靶点，从而提高临床试验中的疗效。最近已报道IDO1/TDO双抑制剂（如RG-70099和M4112）。另外，两种AHR阻断剂（BAY2416964和IK175）已进入实体肿瘤的临床试验。图4：犬尿氨酸途径介导的抗肿瘤免疫靶向固有免疫和免疫检查点的小分子药物03靶向固有免疫通路最早时曾在肿瘤内注射Coley疫苗和卡介苗（BCG）治疗癌症，尽管当时并不清楚作用机制，但现在我们知道，注射细菌提取物会触发多种固有免疫途径，从而介导肿瘤细胞的杀伤。1. TLR 激动剂Toll样受体（TLR）是一个1型跨膜蛋白家族，通过触发固有反应和介导适应性反应的激活，在协调病原体免疫方面起着关键作用 [2]。病原体相关分子模式（PAMPs）作为TLR配体，促进新表位的交叉呈递，在引流淋巴组织中激活树突状细胞。到目前为止，三种TLR激动剂已被批准用于肿瘤免疫治疗：用于膀胱癌局部免疫治疗的TLR2/TLR4刺激物卡介苗、用于局部治疗选定上皮病变的小分子TLR7/TLR8配体咪喹莫特，以及单磷酸脂A（MPL），一种TLR4配体，用作预防性人乳头瘤病毒（HPV）疫苗Cervarix95的佐剂。许多TLR激动剂已经在临床试验中进行了研究，其中大多数靶向内质体TLR。尽管在临床前肿瘤模型中使用各种TLR激动剂是有效的，但临床试验的结果一直令人失望，这主要有三个主要原因。一是TLR在许多不同的细胞类型上表达，包括不同程度上的肿瘤细胞，使得TLR激动剂的体内作用机制难以预测；二是TLR的表达模式和参与的生物学反应在小鼠和人类之间有很大差异；三是TLR激动剂全身给药有诱导全身免疫激活的高风险，与细胞因子释放综合征等严重不良事件相关。但TLR7激动剂LHC165克服了一些困难。它被吸附到氢氧化铝上，使其从注射部位缓慢释放，激活局部受限的免疫。据报道，在晚期实体瘤患者中首次出现临床抗肿瘤活性，包括作为单药或与sparvatigumab（PD1抗体）联合使用，尤其是对于基线时免疫微环境活跃的患者。为了降低全身给药时的毒性风险，目前正在探索通过抗体-药物结合物（ADC）靶向给予TLR激动剂。例如，SBT6050将强效TLR8激动剂与抗HER2抗体结合起来治疗HER2表达实体肿瘤。2. STING激动剂除TLR外，其他“危险”传感器主要响应细胞内源性分子信号（DAMPs），从而为激活先天免疫和适应性免疫提供额外途径。干扰素基因刺激物（STING）通路对非凋亡细胞死亡释放的DNA片段作出反应。这些DNA片段与细胞溶质酶cGMP–AMP合成酶（cGAS）的结合，导致环状二核苷酸cGAMP的产生，并激活内质网相关蛋白STING。随后，STING与TANK结合激酶1（TBK1）结合，然后该复合物转移到核周区域并激活下游介质，特别是转录因子干扰素调节因子3（IRF3）（图1）[3]。临床上第一代STING激动剂主要基于环状二核苷酸（CDN），如ADU-S100和MK-1454。但这两种化合物远远落后于预期，临床开发已被终止。与TLR激动剂类似，这些化合物的一个关键限制是需要肿瘤内注射。第一种全身给药的STING激动剂SB 11285和SNX281正在与PD1/PDL1抗体联合进行临床评估。此外，含有氨基苯并咪唑框架的非CDN基STING拮抗剂在小鼠中的药代动力学和全身活性得到改善。GSK3745417作为单一疗法以及与帕博利珠单抗联合治疗晚期实体瘤正在进行I期临床试验。当然，STING激活仍存在一些不确定性。过度刺激cGAS–STING途径有诱发细胞因子风暴的风险，最近的临床前数据表明，STING激活可通过触发应激和促凋亡途径诱导T细胞死亡。3. ENPP1、TREX1和PARP7抑制剂鉴于直接激活STING所面临的挑战，最近的策略侧重于以间接方式刺激该通路，如针对STING负调控因子ENPP1。ENPP1降解免疫刺激代谢物cGAMP和ATP，从而参与免疫抑制腺苷的生成（图1）。抑制ENPP1可通过增加cGAMP水平导致STING激活，同时减少对腺苷通路的刺激。一些口服ENPP1抑制剂已经进行了临床前研究，如MV626、SR-8314及其后续分子SR-8541。到目前为止还没有开始临床试验。进一步激活STING途径的方法是抑制3 ' 核酸修复外切酶1 （TREX1），它负责降解肿瘤来源的DNA。抑制TREX1会导致胞质DNA的积累和STING通路的激活。小分子TREX1抑制剂的首批实例最近由Constellation Pharmaceutical和Venenum Biodesign LLC公布。多聚ADP核糖聚合酶7（PARP7）在吸烟相关性强的癌症中过度表达，通过与TBK1相互作用负调节I型干扰素反应。因此，它也作为STING途径的抑制剂（图1）。RBN-2397是该酶的一种有效特异性阻断剂，最近已进入I期安全试验。图1：STING相关通路04小分子免疫检查点抑制剂（ICIs）尽管免疫检查点抗体已成为免疫治疗的金标准，但小分子药物相对于抗体药物的潜在优势引发了干扰PDL1–PD1轴的药物化学研究。另外，随着对T细胞内信号的不断深入研究，发现了T细胞受体（TCR）参与下游的几个负反馈回路，这些回路可能增强抗肿瘤T细胞免疫（图2）。主要的成药靶点包括造血祖激酶1（HPK1或MAP4K1）、二酰基甘油激酶（DGKα和DGKζ）、酪氨酸蛋白磷酸酶非受体型（PTPN6和 PTPN22）、E3泛素蛋白连接酶CBL-B等。图2：参与免疫受体信号传递的胞内靶点1. PDL1–PD1小分子抑制剂长期以来，PDL1-PD1的相互作用被认为不受小分子的抑制。尽管如此，第一批口服小分子药物CA-170（图3）和GS-4224已进入临床。CA-170来源于氨基酸丝氨酸-天冬酰胺-苏氨酸序列，该序列是由PD1初级序列的基序得到的。据报道，该化合物可靶向PDL1和VISTA。VISTA是一种检查点调节剂，在髓细胞上高度表达。核磁共振光谱显示CA-170在不阻止络合物形成的情况下产生缺陷的PD1-PDL1三元络合物，且在小鼠体内的口服生物利用度为50%。而GS-4224的安全性研究已被终止。另一种分子ARB-272572（图3）在亚纳摩尔浓度下可干扰PDL1功能，并在可移植的同源结直肠癌小鼠模型和肝炎病毒感染模型中显示出活性。一种相关的联苯分子INCB086550（图3）正在实体肿瘤患者中进行I/II期临床研究。口服这种化合物可抑制过表达PDL1的MC38肿瘤，其效力与阿替利珠单抗相当。这些化合物口服似乎增加了T细胞肿瘤浸润，不仅通过与PDL1结合，还通过诱导PD1的细胞内化。第一批小分子ICIs进入临床是十分重要的一步，但这些化合物在哪些方面可以达到临床上抗体的最佳状态，仍有待观察。图3：检查点小分子抑制剂2. MAP4K1抑制剂MAP4K1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，仅在造血细胞类型中表达 [4]。通过其富含脯氨酸的结构域，MAP4K1能够与造血细胞中的各种配体结合，MAP4K1的功能已经在TCR信号环境中得到了详细研究。TCR刺激后，MAP4K1在酪氨酸381上磷酸化，随后，MAP4K1被募集到TCR信号复合体中，通过其丝氨酸/苏氨酸激酶功能诱导该复合体解离，起到负调控作用。最近，一些论文揭示MAP4K1是小分子干预的合适靶点。最早发表的MAP4K1抑制剂之一是ZYF0033。据报道，该化合物可以抑制MAP4K1，影响近端生物标志物pSLP76，在4T1同基因小鼠模型中剂量依赖性的抑制肿瘤生长。BAY-405是另一个最近公布的MAP4K1抑制剂。该分子可以抑制SLP76的磷酸化，具有亚微摩尔的效力，并显示出良好的激酶选择性。体外功能分析显示BAY-405可增强人细胞毒性T细胞中细胞因子的活化和产生。BAY-405在同基因EMT6乳腺和B16-OVA黑色素瘤小鼠模型中显示了单药疗效，在B16-OVA模型中与抗PDL1 Ab联合使用时也有疗效。一些MAP4K1抑制剂已在实体肿瘤中进行了试验，例如NDI-101150/NMBS-2，具有很强的细胞效力，对所有MAP4K家族成员具有>100×的选择性。NDI-101150随后在一组同基因体内疗效模型中进行了评估，12个模型中有4个被观察到单药治疗肿瘤生长减少。重要的是，在EMT6同基因乳腺肿瘤模型中观察到肿瘤完全减少。联合抗PD1 Ab可以恢复衰竭T细胞的细胞因子分泌，并在CT26肿瘤模型中抑制肿瘤生长。此外，MAP4K1抑制剂CFI-402411的I/II期试验已开始评估单药和与帕博利珠单抗联合使用的耐受性。另外三种MAP4K1小分子抑制剂BGB-15025、PRJ1-3024和PF-07265028也已进入临床研究。3. DGKα和DGKζ抑制剂二酰基甘油（DAG）是磷脂酶Cγ1在TCR作用时产生的第二信使，触发信号级联，在T细胞发育和功能中起重要作用。DGKs家族催化DAG磷酸化为磷脂酸，从而调节DAG介导的信号。其中，DGKα和DGKζ在T细胞中显著表达。两种DGKs的表达和活性在TCR刺激下增强，而持续表达与肿瘤浸润T细胞的低反应性相关（图2）。DGKα小分子抑制剂R59022, R59949和利坦色林已经被发现几十年。这些第一代DGK抑制剂的体外实验已证明通过药理抑制DGKs增强T细胞活性的概念，以及DGK抑制与PD1 阻断的联合作用。在小鼠中，用利坦色林治疗可以克服对PD1阻断的耐药性。百时美施贵宝最近公布的一项专利申请声称双DGKα/DGKζ抑制剂是T细胞激活剂。其中一种抑制剂对DGKα的抑制作用低于1毫摩尔。目前开发临床DGKs抑制剂的一个关键顾虑是脱靶效应。4. CBL-B抑制剂泛素化，即泛素部分附着在蛋白质赖氨酸残基上，是蛋白质的翻译后修饰，参与调节多种信号通路和细胞过程。CBL-B是一个RING家族E3泛素连接酶，作为TCR激活的负调控下游发挥作用 [5] 。其活性被CD28共刺激抑制，并被PD1和CTLA4接合诱导。最初的CBL-B靶向研究集中在非小分子方法上，包括干扰CBL-B功能的细胞渗透性肽和通过小干扰RNA调控CBLB基因表达或靶向基因组编辑。2016年，Progenra提出了一系列已知的小分子CBL-B抑制剂，能够通过抑制TAM受体的泛素化激活T细胞和NK细胞活性，但缺乏后续研究。目前已知的唯一CBL-B抑制剂，由Nurix开发，可增强体外T细胞的反应性，以及可移植的同基因小鼠模型中T细胞依赖性肿瘤的消退。化合物NX-1607在晚期恶性肿瘤中的安全性试验最近已经启动。泛素系统的复杂性和对底物特异性的未知提高了选择性小分子CBL-B抑制剂的发现门槛。5. 磷酸酶几种磷酸酶（包括SHP1、SHP2和PTPN22等）介导T细胞信号转导的负调控。SHP099是一种选择性的、口服的SHP2抑制剂，在免疫缺陷小鼠中显示了对人类肿瘤异种移植的抗肿瘤效果。另一种SHP2抑制剂RMC-4550的试验显示，其在CT26和EMT6同基因肿瘤模型中具有中等的抗肿瘤效果，同时对PDL1和CTLA4抗体也具有补充作用。几种SHP2抑制剂正在与ICI Abs联合进行临床评估。TNO155与斯巴达珠单抗联合、RMC-4630与帕博利珠单抗联合都处于I期临床试验中。结语胞生长抑制剂、VEGF–VEGFR 抑制剂和细胞因子、趋化因子抑制剂等传统小分子药与ICIs联合应用具有更大的潜力。针对代谢途径的阻断剂可以改变肿瘤或TME中其他免疫细胞的行为，从而激活对肿瘤的杀伤反应。科研人员正在全力扩大肿瘤免疫治疗的方案，其中小分子药物发挥着越来越重要的作用（图4）。尽管一些靶向促肿瘤途径的小分子已被批准作为PD1-PDL1抗体的伴侣，但未来几年将探索小分子是否也可以应用于临床，直接刺激T细胞和/或先天抗肿瘤免疫。图4：TME造成的免疫调节障碍与解决者小分子[1] Offringa R, Kötzner L, Huck B, Urbahns K. The expanding role for small molecules in immuno-oncology [published online ahead of print, 2022 Aug 18]. Nat Rev Drug Discov. 2022;10.1038/s41573-022-00538-9. doi:10.1038/s41573-022-00538-9.[2] Hanahan D. Hallmarks of Cancer: New Dimensions. Cancer Discov. 2022;12(1):31-46. doi:10.1158/2159-8290.CD-21-1059.[3] Hack SP, Zhu AX, Wang Y. Augmenting Anticancer Immunity Through Combined Targeting of Angiogenic and PD-1/PD-L1 Pathways: Challenges and Opportunities. Front Immunol. 2020;11:598877. Published 2020 Nov 5. doi:10.3389/fimmu.2020.598877.[4] Allard B, Allard D, Buisseret L, Stagg J. The adenosine pathway in immuno-oncology [published correction appears in Nat Rev Clin Oncol. 2020 Jul 17;:]. Nat Rev Clin Oncol. 2020;17(10):611-629. doi:10.1038/s41571-020-0382-2.[5] Opitz CA, Somarribas Patterson LF, Mohapatra SR, et al. The therapeutic potential of targeting tryptophan catabolism in cancer. Br J Cancer. 2020;122(1):30-44. doi:10.1038/s41416-019-0664-6.扫码加入BiG生物创新社读者交流群，分享、交流纯粹的行业知识，非诚勿扰！BiGScientific Driven, Making Impact!创新生态丨医药论坛丨行业分析媒体公关丨BiG Webinar联系我们商务：Max 18662346610媒体：Kathy 17621909690

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