CpG-ODN(Guangdong Zhaotai InVivo Biomedicine)

摘要：疫苗是人类抵御传染病和癌症的重要武器，而亚单位疫苗因其安全性高、稳定性好等优势成为研究热点。然而，亚单位疫苗的免疫原性较弱，需借助先进的递送技术克服免疫级联过程中的多重障碍。本文系统梳理了亚单位疫苗递送技术的最新进展，从淋巴结靶向、树突状细胞亚群靶向、B 细胞调节、抗原摄取、交叉呈递、T 细胞激活到抗原释放动力学等关键环节，解析了各环节的优化策略。通过改造递送载体的理化性质、结合方式及释放特性，可实现疫苗的精准、高效、稳定递送，为下一代亚单位疫苗的研发提供理论依据和设计思路。推荐阅读：鸡胚“亚单位”VS杆状病毒重组亚单位流感疫苗：一场“真假亚单位”的科学审视一、疫苗发展与亚单位疫苗的崛起1.1 疫苗的前世今生疫苗的历史可追溯至 18 世纪末，爱德华・詹纳用牛痘材料预防天花，开启了疫苗时代。早期疫苗多基于减毒或灭活的病原体，虽能模拟自然感染引发免疫反应，但减毒疫苗存在毒力返祖风险，灭活疫苗免疫原性较弱且需多次接种。20 世纪后半叶，随着蛋白质 conjugation 技术、重组 DNA 技术的发展，疫苗进入亚单位时代。亚单位疫苗通过设计重组纯化的蛋白或肽段抗原诱导保护性免疫，具有纯度高、安全性好、稳定性强、可规模化生产等优势，适用于免疫功能低下人群，能有效应对快速变异的病原体。1.2 亚单位疫苗的应用与挑战亚单位疫苗已广泛应用于乙肝、破伤风、白喉、带状疱疹、宫颈癌等疾病的预防。在新冠疫苗研发中，亚单位疫苗（如 NVX-COV2373）表现出色，诱导的 CD4+T 细胞记忆反应和中和抗体滴度可与 mRNA 疫苗媲美。在癌症领域，基于肿瘤新抗原的亚单位疫苗已进入临床试验。但亚单位疫苗存在免疫原性弱的问题，需佐剂增强免疫反应，而获批的佐剂和辅料较少，限制了其发展。此外，对人体免疫网络和疫苗设计关键原理的认知不足，也阻碍了研究成果向临床产品的转化。因此，深入理解亚单位疫苗在体内的行为和细胞内转运机制，对指导疫苗合理设计至关重要。1.3 疫苗的分类及特点不同类型疫苗的成分和特点各异，如下表所示：表 1 各类疫苗的特点疫苗平台疫苗成分疫苗特点灭活疫苗体外培养的病毒或细菌经灭活处理免疫原性低于减毒活疫苗，免疫维持时间短，需多次接种减毒活疫苗通过反向遗传学或适应培养获得的病毒或细菌减毒病原体致病性弱但保留免疫原性，稳定性差、安全性低，可能恢复毒力亚单位疫苗通过细胞表达系统表达的抗原特异性蛋白或肽段纯度高、安全性好、稳定性强、可规模化生产，适用于免疫功能低下人群DNA 疫苗编码抗原的重组质粒质粒 DNA 廉价、稳定、相对安全，但需递送至细胞核，存在递送障碍和插入突变风险mRNA 疫苗包裹在载体中的编码蛋白抗原的 mRNA无需进入细胞核整合基因组，具有内在免疫激活作用，但保存稳定性和安全性存在问题病毒载体疫苗携带病原体抗原编码基因的减毒复制能力的工程病毒（如腺病毒）具有内在免疫激活作用，多数人对腺病毒存在预存免疫，免疫效果和安全性需进一步提升VLP 疫苗 共表达形成非感染性颗粒的结构蛋白作为疫苗免疫原类似真实病毒颗粒但无病毒基因组，安全性好、稳定性强、结构有序、尺寸适宜、可进行表面修饰二、亚单位疫苗的免疫级联过程亚单位疫苗经皮下或肌内注射后，需经历七个关键的免疫级联步骤实现时空递送（图 1）。这一过程具有级联性，每个阶段都依赖于前一阶段的产物或作用。步骤 1：淋巴结蓄积：疫苗需先被递送至免疫特化器官 —— 次级淋巴组织（淋巴结），促进与免疫细胞的相互作用。步骤 2 和 3：特异性细胞靶向：在淋巴结中实现对特定免疫细胞的靶向。步骤 4：抗原内化：疫苗被靶细胞识别后高效内化。步骤 5：抗原处理与交叉呈递：内化的抗原被处理并交叉呈递。步骤 6：T 细胞激活：抗原 - 主要组织相容性复合体（MHC）被 T 细胞受体（TCR）识别，激活 T 细胞。步骤 7：抗原释放动力学调控：调节抗原释放的时间模式，影响上述六个空间递送步骤。疫苗必须以合适的形式递送至正确的位置，每个步骤的效率都会影响最终的免疫效果。当前研究常聚焦于单一步骤，忽略了整个免疫过程中多个步骤的关联和进展。实际上，诱导强效亚单位疫苗免疫的整体 efficacy 是每个步骤效率的乘积，因此改善多个级联步骤乃至整个过程是亚单位疫苗设计的潜在挑战。随着纳米技术的发展，各种纳米材料有助于亚单位抗原和佐剂的负载与共递送，合适的疫苗递送技术可改变疫苗在体内的命运和细胞内转运。理解并解决上述亚单位疫苗的免疫级联障碍和递送困境，可完善合理的设计原则，定制化的疫苗制剂有望实现高精度、高效、稳定的免疫保护。（注：该图展示了亚单位疫苗从接种到引发免疫反应的七个关键步骤，包括空间递送的六个步骤和时间递送的抗原释放动力学调控。）三、亚单位疫苗的递送策略3.1 淋巴结靶向淋巴结是适应性免疫反应发生的关键场所，富含抗原呈递细胞（APCs）、CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞。将抗原从外周组织通过淋巴系统转运至淋巴结是疫苗发挥作用的前提。与外周组织相比，淋巴结中的 CD8α+ 树突状细胞（DCs）和 CD169 巨噬细胞能交叉呈递抗原，而外周组织的朗格汉斯细胞和真皮 DCs 则不能，因此靶向淋巴结可使疫苗更快、更直接地与免疫细胞相互作用，增强免疫激活。淋巴结内注射：直接将抗原和佐剂注入淋巴结，可减少抗原和佐剂的剂量，提高免疫保护效果。例如，装载抗原和 TLR3 配体聚肌苷酸：胞苷酸的微粒经淋巴结注射后可持续释放，增加抗原和佐剂在淋巴结驻留 APCs 中的积累，激活免疫反应。但这种方法需用染料（如伊文思蓝、吲哚菁绿）可视化淋巴结，且可能损伤淋巴结结构，注射体积也受限。基于扩散的淋巴结靶向：皮下注射后通过淋巴引流至淋巴结，需合理设计疫苗制剂。10-100nm 的颗粒可有效进入淋巴系统实现靶向递送，小于 10nm 的颗粒易进入血管毛细血管，大于 100nm 的颗粒则无法通过间质中的水通道进入淋巴系统。例如，约 50nm 的氢氧化铝纳米颗粒可有效引流至淋巴结，被 DCs 和巨噬细胞摄取，诱导的 CD8+T 细胞抗肿瘤反应比传统氢氧化铝凝胶更强。间质主要由带负电的粘多糖组成，带正电的载体易被困在间质中，无法进入淋巴毛细血管；而用聚乙二醇（PEG）等亲水性材料修饰载体表面，可使其更高效地通过水通道到达淋巴结。注射部位的间质压力越高、间质流动越快，越有利于淋巴结靶向，因为疫苗沿淋巴系统移动的驱动力是外周间质与引流淋巴结之间的压力差，在注射部位创造较高的间质压力可加速疫苗向淋巴结的引流。主动靶向策略：内源性白蛋白 hitchhiking：内源性白蛋白从间质引流后通过淋巴管返回体循环，将亚单位抗原或佐剂与内源性白蛋白结合，可优先引流至淋巴结。白蛋白结合部分（ABMs）为脂质和亲脂性材料，如脂肪酸、二酰基甘油、磷脂、胆固醇、α- 生育酚等，具有不同的白蛋白结合亲和力和淋巴结积累性能。理想的 ABMs 需在白蛋白结合亲和力和解离之间保持平衡。研究表明，DSPE 的白蛋白 hitchhiking 效果最佳，能增加淋巴结积累。点击化学反应：先皮下注射前体 DSPE-PEG - 叠氮化物，其 DSPE 部分与内源性白蛋白高亲和力结合，通过淋巴循环将白蛋白带回静脉，因此 DSPE-PEG - 叠氮化物通过白蛋白 hitchhiking 迁移至淋巴结，然后从白蛋白转移到淋巴内皮细胞，暴露叠氮基团。随后在同一部位皮下注射 DBCO 偶联的脂质体（装载抗原和佐剂），DBCO 与 DSPE-PEG - 叠氮化物通过点击化学反应特异性结合，使疫苗在淋巴结积累。高内皮静脉（HEVs）靶向：HEVs 是主要存在于淋巴结中的高度特化血管，外周淋巴结地址素（PNAds）是特异性表达于 HEVs 的硫酸化和岩藻糖化糖蛋白，可被 MECA79 和 MHA112 单克隆抗体识别。因此，用这些抗体修饰颗粒可显著增加其在引流淋巴结中的积累。大颗粒的 “反向靶向”：以铝佐剂为例，大颗粒可招募免疫细胞至给药部位捕获抗原，随后细胞成熟并通过 DC 依赖的归巢途径迁移至淋巴结。这种注射部位的细胞浸润称为 “反向靶向”。尽管外周未成熟 DCs 的数量不如其他吞噬细胞多，但这种递送方式可通过调节局部免疫微环境，诱导强大而持久的免疫和抗肿瘤效果。这些颗粒可上调趋化因子（如单核细胞趋化蛋白、嗜酸性粒细胞趋化因子、巨噬细胞炎症蛋白）的分泌，持续招募 APCs。DCs 向淋巴结的迁移由 CC 趋化因子受体 7（CCR7）介导，该受体对淋巴管中 CCR7 配体（CCL19 或 CCL21）的趋化梯度作出反应。一种新型淋巴结靶向胶束可增加 CCR7 的表达，促进 DCs 向淋巴结迁移，将卵清蛋白（OVA）和编码 CCR7 的质粒 DNA 共递送至 DCs 的细胞质，最终在动物模型中增强了细胞免疫和肿瘤抑制作用。淋巴管具有不连续的基底膜且缺乏紧密连接，为大颗粒转运提供了通道。研究人员设计了一种约 330nm 且具有自适应变形能力的纳米疫苗，可调整尺寸通过内皮间隙进入淋巴结（细胞间途径）；同时，一些较大的颗粒可留在注射部位被 APCs 内化，然后迁移至淋巴结（细胞内途径）。这种双管齐下的方法实现了高效的淋巴结递送和免疫反应，但变形能力与尺寸之间的关系仍需进一步探索，以增强淋巴结引流。目前，常用荧光分子可视化疫苗抗原到达淋巴结，但荧光标记抗原的强度往往未知，难以有效量化到达淋巴结的抗原量，新的技术或商业化荧光标记抗原可能弥补这一缺陷。此外，多数研究仅评估疫苗在邻近淋巴结中的积累，忽略了远端淋巴结和其他器官中的分布，未来研究应关注远端淋巴结和其他器官的分布动力学，寻找更多主动淋巴结靶向的靶点，并与被动淋巴引流结合，以实现协同和更优的免疫效果。（注：该图总结了淋巴结靶向的多种策略，包括淋巴结内注射、基于扩散的靶向、基于大颗粒的细胞招募、主动靶向等。）3.2 树突状细胞（DC）亚群靶向APCs 是连接 innate 免疫和适应性免疫的关键细胞，而 DC 是唯一能激活初始 T 细胞的 APCs，是疫苗设计的主要靶标。不同 DC 亚群具有不同的免疫功能，未来的疫苗设计需激活特定 DC 亚群以获得期望的免疫反应，对疫苗进行配体修饰是靶向特定 DC 亚群的典型策略。人类血液 DC 亚群和皮肤 DC 亚群表达不同的 TLRs，诱导不同的适应性免疫反应。常规 DCs（cDCs）根据个体发育和功能分为 cDC1s 和 cDC2s 两个亚群。将抗原递送至 cDC1s 或 cDC2s 会导致抗原肽呈递给 MHC II 类分子，cDC1s 分泌白细胞介素（IL）-12，cDC2s 分泌 IL-10 和 IL-33，分别启动辅助性 T（Th）细胞从 Th0 向 Th1 或 Th2 方向极化。靶向 Xcr1、C 型凝集素 Clec9a 和 DEC205 表面受体可促进抗原向 cDC1s 递送；靶向 DCs 抑制因子 2 和 TLR5 表面受体可增强抗原向 cDC2s 递送；靶向 CD11c 可将抗原递送至两个 DC 亚群。靶受体的选择还会影响 IgG 抗体的极化（图 3）。CD8α+DCs 和浆细胞样 DCs（pDCs）是淋巴器官中疫苗设计的重要 DCs。CD8α+DCs 对外源抗原的交叉呈递至关重要，不同孔径的介孔二氧化硅纳米颗粒被淋巴结中的 CD8α+DCs 捕获，可有效实现抗原的交叉呈递。pDCs 是分泌 I 型干扰素（IFN）的主要细胞，可诱导初始 T 细胞分化为 Th1 细胞，触发抗原交叉呈递，促进细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）反应。皮肤中也含有多种免疫细胞，尤其是不同的 DC 亚群。驻留皮肤的朗格汉斯细胞作为表皮 DCs，可调节多种 T 细胞反应，诱导 Th2 和 Th17 细胞增殖。真皮 DCs 可呈递自身抗原以维持外周耐受，但当遇到病原体时，真皮 DCs 会上调共刺激分子，激活抗原特异性 T 细胞反应。小鼠真皮 DCs 的两个重要亚群是 CD103 + 和 CD11b+DCs，CD103+DCs 表达 Langerin、Clec9A、TLR3 和 Xcr1，增强抗原交叉呈递，驱动 Th1 和 Th17 细胞分化；CD11b+DCs 表达 DEC205 但不表达 Langerin，是真皮中最丰富的 DC 亚群，主要参与 MHC II 类限制的抗原呈递，引发调节性 T 细胞和 Th 细胞反应。颗粒的物理特性（如大小、形状）也可设计用于靶向不同的 DC 亚群。尽管尺寸对 DC 内化和激活的影响已被广泛研究，但这些参数对 DC 亚群的影响尚未明确。研究发现，阳离子颗粒可触发 TLR4 信号启动，诱导活性氧（ROS）的产生，而 ROS 是 TLR4 依赖性炎症反应的关键信号，因此高表达 TLR4 的 DCs 更易被阳离子载体刺激。另有研究表明，骨髓来源的 DCs 在体外更易内化纳米盘而非纳米棒，因为与纳米棒相比，纳米盘与细胞膜的表面接触面积更大，细胞膜弯曲包裹颗粒所需的应变能更小。这些影响 DC 亚群靶向的特征变化是否具有体内相关性，仍需进一步探索，还需要更多研究来开发靶向特定 DC 亚群的策略，并阐明特定 DC 亚群诱导不同免疫反应的机制。（注：A 图展示了不同 DC 亚群的靶向受体；B 图显示了 cDC1s 和 cDC2s 对 Th 细胞极化的影响；C 图说明了 Th 细胞对抗体分泌的作用。）3.3 B 细胞调节基于 B 细胞的体液免疫在免疫系统中不可或缺，预防微生物感染的疫苗需要激发高亲和力、持久的抗体反应，这涉及淋巴结生发中心的 B 细胞。B 细胞还可作为专业 APCs 参与适应性免疫反应，但这一功能常被忽视。B 细胞通过 B 细胞受体（BCRs）以高亲和力识别抗原，与其他 APCs 相比，B 细胞能在抗原含量低的情况下捕获和处理抗原。此外，B 细胞具有多功能免疫作用，如呈递抗原、分泌抗体和细胞因子，甚至直接诱导肿瘤细胞裂解。B 细胞被抗原激活后可分化为浆细胞，分泌抗原特异性抗体，肿瘤特异性抗体已被提议作为疾病诊断的生物标志物，与多种肿瘤的良好预后相关。B 细胞还可分泌多种细胞因子参与抗肿瘤免疫，如肿瘤坏死因子 -α、IL-2、IL-17、IFN-γ 等，同时表达颗粒酶 B 和第一凋亡信号（Fas）配体，直接裂解肿瘤细胞。近年来，B 细胞在 tertiary 淋巴结构（TLSs）的形成和功能中备受关注。TLSs 是在肿瘤组织和慢性炎症病变中形成的异位淋巴组织，可直接浸润到炎症病理环境中，充当肿瘤引流淋巴结，更方便快捷地启动抗肿瘤免疫。研究表明，B 细胞在维持与良好预后和免疫治疗反应相关的 TLS 功能中发挥作用。TLSs 类似于身体的次级淋巴组织，富含 B 细胞、T 细胞和 DCs，含有生发中心样结构，B 细胞在其中发生激活、增殖、抗体类别转换和体细胞突变，随后这些激活的 B 细胞分化为浆细胞，在原位分泌肿瘤相关抗原特异性 IgG 或 IgA 抗体。巨噬细胞和自然杀伤细胞可结合这些抗体，对肿瘤细胞执行抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用。因此，B 细胞是靶向 TLSs 的肿瘤疫苗的重要细胞，增加肿瘤中 TLSs 的形成、促进 B 细胞分化和抗肿瘤抗体分泌，是增强抗肿瘤 B 细胞免疫反应的关键步骤。然而，B 细胞在纳米 / 生物材料辅助的肿瘤免疫治疗中的作用尚未得到足够关注，鉴于 B 细胞免疫治疗的潜力，增强抗肿瘤 B 细胞免疫将与 T 细胞免疫互补和协同，重塑未来肿瘤疫苗的设计。疫苗的理化性质对 B 细胞调节体液免疫有重要影响。可溶性蛋白或小颗粒可直接引流至淋巴结的 B 细胞滤泡；较大的纳米颗粒需要 B 细胞滤泡中的被膜下窦巨噬细胞或滤泡 DCs（FDCs）捕获并转移抗原，以激活 B 细胞。研究表明，小于 15nm 的颗粒易被清除，大于 50nm 的颗粒可被 FDCs 保留，用于 B 细胞激活，诱导更强的体液免疫，但疫苗的尺寸范围并非通用标准，而是由疫苗的多种特性和其他因素决定。糖工程化多价蛋白纳米颗粒的研究表明，糖基化对增强在 B 细胞滤泡中的积累以产生体液免疫至关重要，这些纳米颗粒通过甘露糖结合凝集素介导的先天识别被转运至 FDC 区域，然后定位到生发中心。此外，适当的间距和高密度表位模拟病毒刺突蛋白的排列，也可产生 B 细胞反应，在表面展示重复的抗原结构可增强 BCRs 的交联，有效激活 B 细胞。病毒样颗粒（VLPs）最初采用多价抗原展示策略刺激 B 细胞，基于重组乙肝表面抗原的 VLP 疫苗已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准。VLPs 可展示刺突蛋白和其他病毒表面成分，呈现线性或构象重复表位，B 细胞识别后诱导 B 细胞刺激和 MHC-II 上调，促进高滴度特异性抗体的产生。最近的研究表明，自组装铁蛋白纳米颗粒是表面亚单位抗原展示的理想载体，展示严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 刺突蛋白的铁蛋白纳米颗粒亚单位疫苗，仅一次免疫就可产生中和抗体。研究还发现，铁蛋白纳米颗粒被淋巴窦相关的 SIGNR1 + 巨噬细胞捕获，激活 B 细胞。另有研究通过在亚单位抗原中设计重复的磷酸丝氨酸残基，使其与铝佐剂强烈结合，抗原修饰的明矾颗粒展示多价和定向抗原，上调抗原呈递，增强 B 细胞激活。病毒和许多疫苗递送系统含有病原体相关分子模式（PAMPs）（如 TLR 配体），可增强抗体反应。B 细胞也表达 TLRs（如 TLR4、TLR7、TLR9），介导相关 TLRs 的佐剂激活作用。研究表明，100nm 磷酸钙纳米颗粒表面修饰的蛋白抗原形成 VLP 样结构，可靶向并激活抗原特异性 B 细胞，进一步用 TLR 配体修饰可调节 IgG 亚型抗体的产生和 IgA 抗体的分泌。CD40 是关键的 B 细胞成熟分子，可用于疫苗设计。研究发现，体外从活化的 CD4+T 细胞中纯化的细胞外囊泡（EVs）显著激发 B 细胞激活、扩增和抗体产生，CD4+T 细胞 EVs 可在体外直接结合 B 细胞并促进其摄取，CD4+T 细胞 EVs 中表达的 CD40 配体可能在 EVs 诱导的 B 细胞免疫中起重要作用。因此，可通过优化颗粒大小、糖基化、在纳米颗粒表面展示多价抗原、PAMP 呈递和 CD40 连接等方式激活 B 细胞（图 4）。B 细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒插入位点 1（BMI-1）是一种调节细胞增殖和生发中心发育的多梳组蛋白，研究发现，在慢性病毒感染中，生发中心 B 细胞中的免疫调节剂 BMI-1 上调，表明其可作为改善针对病毒的体液反应的靶点，这为 B 细胞调节疫苗设计提供了新思路和方法，以增强 B 细胞反应。（注：该图展示了 B 细胞在抗原呈递、抗体分泌、细胞因子分泌、肿瘤细胞裂解和三级淋巴结构（TLS）形成中的作用，以及 B 细胞激活的多种方式。）3.4 APCs 的抗原摄取疫苗抗原需被 APCs 高效内化，才能启动后续的免疫级联反应。APCs 的摄取取决于递送载体的参数，如大小、表面电荷、形状、粗糙度、疏水性、亲水性以及受体与配体之间的相互作用。颗粒大小对 APCs 有效内化抗原至关重要，将抗原包封在纳米 / 微米颗粒中可形成病原体大小的颗粒或蛋白聚集体，APCs 对其的摄取效率高于可溶性抗原。细胞膜是带负电的磷脂双分子层结构，因此带正电的纳米颗粒或经阳性细胞穿透肽（CPPs）修饰的颗粒更易与细胞膜相互作用，诱导更高的内化效率。根据脂质成分的相似相容性原理，由脂质结构组成的疫苗或用脂质结构伪装的纳米颗粒（如脂质体、EVs、细菌膜囊泡）可改善抗原的摄取和呈递。EVs 含有与亲本细胞相同的成分（如蛋白质、脂质、核酸），具有相似的功能，在细胞间通讯和免疫功能调节中发挥重要作用。研究将 DCs 和癌细胞膜融合作为肿瘤疫苗，使纳米疫苗具备 APCs 的功能，实现高效的同源摄取和 T 细胞激活。一般来说，纳米载体多为球形颗粒，但研究表明，较长的颗粒能更有效地附着在细胞膜上引发内吞作用，棒状颗粒由于与细胞膜的结合增强，比球形颗粒具有更高的特异性摄取率。研究人员开发了各种具有不同纳米刺突长径比的花粉模拟金属有机框架（MOFs），发现长径比更高的 MOFs 更易附着在细胞膜上，导致巨噬细胞的吞噬效率更高，免疫反应更强。通过氢氟酸蚀刻制备的粗糙表面二氧化硅纳米颗粒，在 APCs 上的内化量是光滑表面二氧化硅纳米颗粒的 4.2 倍，这可能是因为纳米颗粒的粗糙表面特性提供了更大的表面积，更有利于细胞摄取。此外，特定的配体修饰可与 APCs 表面的受体结合，提高颗粒的内化效率。DCs 表达的模式识别受体（PRRs）是 DC 靶向的常用选择，通过 DEC-205、DC-SIGN（CD209）、清道夫受体、Clec9、CD40、CD11c 等受体修饰纳米疫苗，可增加 DCs 的快速内化和呈递，这些方法通常通过受体介导的内吞作用或吞噬作用增强摄取过程。DCs 还可通过巨胞饮途径捕获抗原，增强抗原呈递。巨胞饮是一种肌动蛋白依赖的过程，通过形成大的内吞囊泡（直径可达 5μm）介导内化，比其他内吞途径更高效。研究人员制备了一种仿生纳米疫苗，其核心为聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物（PLGA），表面包裹磷脂膜并掺入载脂蛋白 E3，载脂蛋白 E3 掺入的疫苗被 DCs 的摄取量是未修饰纳米颗粒的 2.37 倍，这种通过巨胞饮途径的显著内化促进了抗原呈递和免疫激活。最近，模拟天然病原体与免疫细胞相互作用的策略也为改善抗原摄取提供了平台。病原体由于其柔软性和灵活性，通常与细胞膜结合并通过细胞间隙挤压穿透组织，入侵宿主系统。因此，可调节纳米颗粒的弹性来调节细胞摄取，研究人员设计了具有流动性和柔韧性的颗粒稳定 Pickering 乳液，模拟病原体的构型和变形灵活性，这些新型乳液具有较大的变形能力，增加了与细胞的接触面积，从而被 APCs 高效内化。3.5 抗原交叉呈递APCs 摄取抗原后，将其加工成肽段，与 MHC 分子结合并转运至 APCs 表面，供 TCR 识别。MHC-II 分子参与外源性抗原的加工和呈递，激活 CD4+T 细胞；而 MHC-I 分子参与内源性抗原的加工和呈递，激活 CD8+T 细胞。亚单位抗原是外源性抗原，易被 MHC-II 分子呈递，而高效的交叉呈递可使外源性亚单位抗原被 MHC-I 分子呈递，产生 CD8+T 细胞反应，以对抗癌症和慢性病毒感染。DCs 的抗原交叉呈递主要分为胞质途径和空泡途径。在胞质途径中，抗原被递送至细胞质，被蛋白酶体降解为抗原肽，抗原肽被转运至内质网（ER），与 MHC-I 分子结合，供 T 细胞识别；在空泡途径中，抗原的加工和与 MHC-I 分子的组装在吞噬体中进行。可溶性蛋白抗原通常不能有效交叉呈递，而通过多种纳米 / 微米颗粒包封可实现 MHC-I 类呈递。内体成熟过程中，膜上的质子泵将大量质子从细胞质转移到内体，使内体环境呈酸性。研究人员开发了一种在 APCs 中具有快速细胞内抗原释放方式的 pH 响应疫苗，被 APCs 捕获后，pH 响应性促进纳米颗粒解体，包封的抗原可从内体逃逸，进行交叉呈递，增强细胞免疫。一些阳离子材料（如聚乙烯亚胺（PEI））具有质子海绵效应，可质子化，使氯离子和水进入内体，最终导致内体破裂，内容物释放到细胞质中。类似地，其他阳离子聚合物（如 CPPs、1,2 - 二油酰基 - 3 - 三甲基铵 - 丙烷、聚（L - 组氨酸）-PEG）也可实现内体逃逸，引发交叉呈递。但基于阳离子聚合物的纳米疫苗可能存在淋巴间质引流障碍和细胞毒性问题，合理的疫苗设计需在抗原交叉呈递和安全性之间保持平衡。在 APCs 中，DCs 的抗原交叉呈递能力优于其他 APCs，这归因于其内体蛋白酶活性不足和相对碱性的环境。氯喹和 NH4Cl 可通过碱化内体促进 DCs 的交叉呈递，抑制内体蛋白酶活性，延缓抗原降解。此外，CO2 产生的物理应力、光化学内化（PCI）以及形态转化机械穿刺内体，也可促进内体逃逸和抗原交叉呈递（图 5）。研究人员制备了一种基于 CaCO3 的疫苗递送载体，CaCO3 进入酸性内体后分解释放 CO2，使内体膨胀，显著增加抗原交叉呈递。装载光敏剂的纳米颗粒可响应特定波长的光，产生 ROS 导致内体破裂，这种策略称为 PCI 策略，用 AlPcS2a 作为光敏剂可引发光诱导的内体破裂，增强 MHC-I 向 CD8+T 细胞的呈递，经 1.5J/cm2 照射的载抗原疫苗的交叉呈递量是游离抗原的 5 倍。一种质子驱动的纳米转换器基纳米疫苗，在 pH7.4 时为约 100nm 的球形颗粒，在酸性内体（pH5.6）中，酸可切割基团被切割，球形颗粒重新组装成纳米片（直径几微米），纳米片机械破坏内体膜，将抗原递送至细胞质，诱导强大的基于 CD8+T 细胞的抗肿瘤免疫。许多现有促进抗原交叉呈递的策略会导致溶酶体功能障碍，但有报道称，生理性自噬过程可能改善抗原交叉呈递，自噬有助于形成保留抗原的区室，延长抗原储存时间，避免被溶酶体快速降解。重要的是，应考虑合理控制溶酶体功能障碍，以确保细胞的正常生理功能。在 DCs 中，ER 参与 MHC 分子的合成、抗原肽的加工以及肽 - MHC 复合物的组装。阳离子多肽 pardaxin 具有疏水性和成孔特性，可插入磷脂双分子层并快速定位于 ER，通过 pardaxin 修饰实现 ER 靶向递送，可促进 DCs 的交叉呈递，在癌症免疫治疗中显著激发细胞免疫，其机制是通过小窝蛋白介导的内吞作用进入 ER 相关降解机制，而非进入溶酶体降解。高尔基体也被认为是疫苗研究的潜在细胞内靶点，但关于 ER 和高尔基体靶向策略改善抗原交叉呈递的研究较少。（注：该图展示了 MHC-II 和 MHC-I 分子呈递抗原的过程，以及促进抗原交叉呈递的多种方式。）3.6 调节 APCs 激活 T 细胞调节 APCs 激活 T 细胞是适应性免疫的关键步骤，佐剂是亚单位疫苗产生或增强免疫激活不可或缺的成分，将抗原和佐剂共递送至同一 APC 也被认为是免疫激活的关键。佐剂的加入可能影响抗原的摄取和呈递过程，同时，免疫调节分子佐剂作为 PAMPs 调节 APCs 的激活，进一步诱导抗体和细胞因子的分泌，辅助不同类型的 T 细胞反应。单一佐剂的免疫效果通常不足，而多种佐剂联合使用可发挥各自优势，协同或放大免疫效果。一种双佐剂疫苗将新抗原与 TLR7/8 激动剂和 TLR9 激动剂共递送，用于高效癌症免疫治疗，双佐剂通过刺激 MyD88 及其级联信号通路，实现协同免疫增强。需要注意的是，具有不同亲水和疏水特性的抗原和佐剂可能需要精确调节载体，以确保有效共递送，两亲性乳液、胶束和脂质结构是共包封不同亲水和疏水抗原及佐剂的常用载体。要引发抗原特异性免疫，成熟的专业 APCs 提供的 T 细胞启动的第一和第二信号不可或缺。然而，APCs 成熟失败以及 APCs 与 T 细胞之间的时空限制会阻碍 T 细胞的刺激。因此，人们构建了模拟天然 APCs 功能的人工 APCs（aAPCs），直接激活 T 细胞。工程化 aAPCs 应修饰有肽 - MHC 复合物和共刺激分子，为 T 细胞激活提供第一和第二信号。aAPCs 的大小、形状、配体修饰和流动性也可优化以刺激 T 细胞。研究人员制备了负载咪喹莫特的 PLGA 纳米颗粒，其表面包覆 DC 膜并修饰有抗 CD3 抗体，DCs 经抗原、IFN-γ 和脂多糖预处理后，自然表达 CD28 共刺激分子和肽 - MHC 复合物，这种纳米级 aAPCs 在淋巴结中积累能力优异，可激活 T 细胞，增强癌症免疫治疗效果。另有研究通过脂质 - DNA 介导的活细胞表面工程，用肽 - MHC 和 CD28 抗体修饰外周血来源的淋巴细胞，构建天然 aAPCs，这种 aAPCs 迁移至淋巴结和脾脏，激活抗原特异性细胞反应，OT-I 小鼠过继转移实验证实，aAPC 诱导的 CD8+T 细胞扩增是游离肽 - MHC+CD28 抗体的 8 倍。总体而言，基于纳米颗粒或活细胞的 aAPCs 为增强 T 细胞激活提供了新平台。然而，aAPCs 上免疫信号分子的低表达和修饰效率仍无法完全模拟体内 APCs 的正常生理功能，特别是基于纳米颗粒的 aAPCs 可能被其他吞噬细胞捕获，从而降低 T 细胞启动效率。在与病原体的斗争中，免疫系统逐渐进化出识别和对抗病原体的能力，以抵御病原体的入侵和再感染。病原体的表面结构由高度重复的结构组成，称为 PAMPs。因此，人们探索了模拟病原体的疫苗，以促进强大的免疫保护。优化的模拟病原体载体需具备病原体特性：对机体而言是外来物质，维持纳米 / 微米颗粒的形态，负载丰富的抗原，最重要的是携带 PAMPs，与免疫细胞上的 PRRs 相互作用，提供危险信号，激活免疫系统。模拟病原体的疫苗递送载体主要包括生物源性自组装系统和合成颗粒。生物系统主要包括 VLPs、细菌外膜囊泡（OMVs）、双层膜囊泡（DMVs）以及细菌和真菌的骨架载体。VLPs 是由病毒衣壳蛋白自组装形成的纳米颗粒，可模拟原始病毒体结构的构象，在表面展示高密度抗原。研究人员制备了展示鞭毛蛋白的乙肝核心 VLPs，提高了鞭毛蛋白的免疫原性和系统安全性。OMVs 是革兰氏阴性菌分泌的 30-200nm 单层脂质囊泡，携带细菌脂多糖、甘油磷脂和一些蛋白质，具有内在的免疫刺激功能。大肠杆菌来源的 OMVs 伪装的金纳米颗粒保留了细菌的复杂成分，模拟了细菌向免疫系统呈递天然抗原的方式，为设计抗菌疫苗提供了新途径。此外，铜绿假单胞菌经机械破碎后自组装形成 DMVs，含有相关抗原和具有佐剂作用的免疫刺激成分。研究人员用二氧化硅纳米颗粒包封铜绿假单胞菌裂解物，并包覆细菌 DMVs，制备出模拟病原体的疫苗，成功保护小鼠免受不同菌株病原体的感染。研究人员通过水热处理乳酸菌，去除内部内容物并形成孔洞，制备出仿生疫苗载体，该载体保留了病原体的形态，表面保留了已鉴定的甘露糖受体配体 N - 乙酰葡糖胺，这种中空多孔结构可有效共包封抗原和佐剂，其细菌形态和 PAMP 呈递有助于强大的免疫激活。还有研究直接利用细菌细胞壁、鞭毛和类核的成分制备合成的模拟细菌载体，可触发 TLR4、TLR5、TLR9 以及核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体 2 信号通路。甘露聚糖和 β- 葡聚糖是常见的真菌多糖，可被巨噬细胞和 DCs 上的 C 型凝集素受体识别。经酸碱处理的酿酒酵母可获得中空多孔的酵母细胞壁骨架，称为 β- 葡聚糖颗粒（GPs），作为理想的模拟病原体载体激活 APCs。用肿瘤裂解物和 TLR9 激动剂 CpG 负载 GPs 制备模拟病原体疫苗，与游离抗原处理相比，工程化疫苗显著提高了共刺激分子的表达和细胞因子的分泌，这种激活通过 β- 葡聚糖识别 dectin-1 受体、补体受体 3 以及 NOD、LRR 和 pyrin 结构域包含蛋白 3 炎症小体介导，诱导的抗肿瘤免疫优于商业铝佐剂。研究人员还报道了甘露聚糖修饰的聚乳酸 - PEI 组装纳米颗粒，展示抗原和 CpG，这种类病原体疫苗增强了向淋巴结中 CD8+DCs 的递送，产生显著的肿瘤免疫治疗效果。对于模拟病原体的亚单位疫苗设计，黏膜给药可能更合适，因为病原体通常通过黏膜途径（如口腔、鼻腔、阴道）侵入机体，通过模拟病原体形态或入侵方式预先训练免疫系统，更符合自然感染过程。然而，黏膜免疫系统存在纤毛运动清除、黏液和上皮屏障等障碍，常阻碍黏膜疫苗诱导的免疫反应，基于模拟病原体设计策略的黏膜亚单位疫苗相对复杂，需要考虑多种障碍。3.7 调节抗原释放动力学急性感染通常需要数周时间才能引发免疫反应，在此期间，抗原信号持续刺激免疫系统。抗原动力学对诱导具有潜在保护作用的效应 T 细胞和记忆 T 细胞至关重要。抗原暴露不足（如人乳头瘤病毒感染）往往无法获得有效的 T 细胞保护反应；而抗原暴露过多（如高剂量淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒感染小鼠）会导致 T 细胞耗竭甚至丧失免疫功能。一般认为，病毒先快速复制，然后减少到极低水平，这对放大和维持保护性抗病毒免疫至关重要。因此，亚单位疫苗的抗原释放动力学需经过精心设计以实现保护性免疫。抗原释放速率可能影响最终的免疫反应，但两者之间尚未建立明确的关系。研究表明，与初始单剂量或等剂量多次注射相比，抗原刺激呈指数增加可增强肽疫苗的 T 细胞反应，通过刺激生发中心形成和 B 细胞产生抗体，促进抗体反应。对抗体产生的抗原释放时间控制研究显示，14 天释放诱导的抗体比 7 天释放更强，生发中心可活跃数周或数月，因此，持续的动力学模式可能在时间上与生发中心匹配，增强抗原的捕获和保留，从而刺激抗体反应。最近的研究表明，调节缓慢而持续的抗原暴露可显著增强免疫反应。研究人员设计了一种疫苗，其肽抗原和佐剂通过二硫键或硫醚键连接，以研究抗原释放动力学对免疫反应的影响。可切割的二硫键设计用于在细胞内环境中释放药物，而硫醚键在生理 pH 和温度下更稳定，硫醚键允许持续的抗原释放，具有更高的抗肿瘤 efficacy。另一项研究使用自修复微胶囊负载白血病相关抗原和免疫检查点抑制剂，货物的持续释放导致免疫细胞的募集和抗原特异性 T 细胞的扩增，这两项研究均表明，持续的抗原释放有助于抗原呈递和免疫反应。但有研究认为，这种从外周储库持续释放的疫苗可能导致活化的抗原特异性 CD8+T 细胞滞留在给药部位，而不是迁移到肿瘤组织。因此，合理的疫苗设计应考虑这一点，通过调节抗原释放速率或添加趋化因子和细胞因子驱动免疫效应细胞迁移，以优化免疫结果。疫苗设计中可选择不同的抗原包封策略或不同的递送载体来调节抗原释放速率。研究人员用阳离子脂质伪装的 PLGA 纳米颗粒作为载体，比较了模型抗原 OVA 的三种抗原包封模式诱导的免疫反应，制备了抗原吸附（外）、抗原包封（内）和抗原吸附 / 包封（内外）的颗粒。其中，“外” 纳米颗粒的抗原释放速率最快，抗原储库效应最弱；“内” 纳米颗粒的抗原释放速率最慢，储库效应最明显；“内外” 纳米颗粒处于中间水平，但显示出最佳的抗体反应、细胞因子分泌和记忆 T 细胞反应，因为 “内外” 纳米颗粒可提供最佳的初始抗原暴露，随后在给药部位持续释放。不同递送载体的抗原释放行为对其免疫结果的影响研究表明，脂质体比 PLGA 纳米颗粒释放抗原的速度相对更快，脂质体在早期快速分泌抗体，而 PLGA 纳米颗粒引发更多的记忆 T 细胞扩增和 IFN-γ 产生。此外，与抗原共负载的佐剂的释放行为对激活 APCs 和触发免疫也至关重要。研究聚焦于佐剂释放方式的时间控制，以指导癌症疫苗的设计，疫苗支架中包封的佐剂 CpG-ODN 通常具有早期爆发释放特性，因此开发了一种超声响应的疫苗平台，超声刺激触发 CpG-ODN 的持续释放，产生强大的抗原特异性 CTL 反应。诱导保护性免疫通常需要多次免疫，这会带来注射疼痛和依从性差等问题。因此，具有足够接种效力的单次注射疫苗将是提高疫苗覆盖率和应对全球传染病的理想选择。聚合物的持续降解特性和抗原活性是单次注射疫苗设计中的重大挑战，选择 FDA 批准的特定材料可促进临床转化。研究人员开发了一种通过控释 PLGA 微球实现的单次注射疫苗，该疫苗分三次释放抗原，并缓慢降解至 14 周。此外，脉冲释放疫苗可在预定时间点释放抗原，模拟多次推注注射，比多次注射具有更广阔的应用前景。研究人员开发了一种新型可注射的具有中空核 - 壳结构的微球，通过聚合物基质孔隙率的突然增加，显示出脉冲释放行为，导致连接核心与环境的多孔路径形成。还有研究制备了一种光可切割的前药递送系统，用于近红外光触发的药物释放，通过控制照射强度和时间间隔，可实现定量脉冲药物释放。微针是精确控制抗原释放速率的优秀载体，可负载具有不同释放行为的颗粒。研究人员开发了具有双重释放行为的双层微针，外层持续释放抗原，内层快速释放铝佐剂，利用具有不同释放方式的双层微针，可最大限度地发挥铝佐剂的作用，同时减少其用量。然而，微针的载药量低和药物的实际定量透皮递送仍是亟待解决的问题。四、总结与展望亚单位疫苗通过合理设计高重组和纯化的蛋白或肽抗原诱导保护性免疫，通常需要载体负载或与佐剂共递送以提高免疫效力。亚单位疫苗设计的独特特性和要求主要包括淋巴结靶向、DC 亚群靶向、B 细胞调节、抗原摄取、抗原交叉呈递、调节 APCs 刺激 T 细胞以及抗原释放动力学。不同类型的疫苗往往需要不同的递送策略，减毒或灭活病原体疫苗通常不需要额外的递送载体，且减毒疫苗因其免疫原性强而无需佐剂，其设计策略不涉及淋巴结靶向和抗原释放动力学调节。mRNA 等核酸疫苗通常关注 mRNA 的设计与合成、细胞摄取、溶酶体逃逸、翻译效率以及防止核酸降解，mRNA 疫苗递送载体无法调节翻译后抗原的释放动力学和呈递。针对亚单位疫苗递送中的具体问题，可设计不同的多功能递送载体（图 6），多种策略结合应能获得累加或协同的免疫增强效果，某些递送策略可能同时改善多个免疫级联步骤，如 PAMP 修饰有利于疫苗靶向 APCs，促进抗原摄取和 APCs 激活。但一些疫苗设计策略可能需要疫苗载体具备相反的特性，例如，小尺寸、带负电且 PEG 化程度高的颗粒有利于淋巴结靶向，而大尺寸、带正电且 PEG 化程度低的颗粒更易被 DCs 吞噬，因此，需结合实际情况优化疫苗递送载体的特性，以获得最大的免疫效率。（注：该图总结了免疫级联的七个关键步骤及对应的疫苗设计策略。）此外，需考虑目标疾病类型，以提供足够的免疫保护。抗体是抵御细菌和其他病原微生物感染的有效武器，对某些游离于细胞外的病毒也具有特定的中和作用。预防性疫苗通常需要长效的 IgG 抗体反应，而治疗慢性感染或癌症的治疗性疫苗则依赖于诱导强大的 CD4 + 和 CD8+T 细胞反应。因此，预防性和治疗性疫苗设计通常采用不同的策略以实现目标免疫反应。动物模型和人类的免疫结果往往存在差异，人类和小鼠在解剖结构、疾病模型和 PRR 表达等方面的差异可能产生重要影响。安全性也是需要考虑的关键指标，由于现有疫苗通常用于健康儿童或青少年，因此提高疫苗安全性并避免副作用至关重要。尽管亚单位疫苗递送载体的功能和组成不断扩展，但要转化为临床应用仍有很长的路要走，还需要解决许多其他重要问题，包括规模化生产能力、商品成本、冷链维护、抗原的体内稳定性以及载体对多种抗原的适用性。随着人工智能在癌症免疫治疗中的不断发展，这项先进技术逐渐渗透到医学领域，以提高医疗安全性和质量，有望通过人工智能技术进行体外虚拟筛选和体内验证，解决上述问题。机器学习已用于预测疫苗系统配方和辅助选择合适的辅料，分子动力学模拟可研究药物与其他成分之间的相互作用。在亚单位疫苗设计中，合适的抗原是首要因素。亚单位疫苗研究中通常使用模型抗原 OVA 来验证递送载体和佐剂的有效性，但模型抗原或疾病抗原在理化性质、免疫原性以及与佐剂的结合等方面存在诸多差异，可能导致体内免疫级联过程不同。设计、工程化和鉴定合适且具有高免疫原性的亚单位抗原仍是关键挑战。尽管重组蛋白和肽抗原具有高纯度和特异性，但无法提供足够的表位以产生全面的免疫反应。大多数疾病的抗原是体内高度同源的蛋白质，成分异质且突变率高。因此，新的策略不断涌现，如基于结构疫苗学的抗原设计、通过测序技术和计算分析发现个人新抗原、细胞裂解物作为多价抗原、将 MHC-I 和 MHC-II 表位组合成单一长肽抗原等。除疫苗递送载体和抗原外，佐剂的选择对协调亚单位疫苗诱导的免疫也至关重要。免疫原性低的亚单位抗原主要产生体液免疫反应，添加佐剂可减少抗原剂量，实现更快的免疫激活，优化抗体反应的质量和持久性，促进 CD4 + 和 CD8+T 细胞免疫反应的诱导。因此，合适的佐剂选择对亚单位疫苗诱导的免疫反应至关重要，可根据目标免疫反应的需求及其在靶细胞中作用的时空位置选择疫苗佐剂。同时，一些疫苗递送载体具有佐剂作用，如脂质体、乳液、磷酸钙纳米颗粒、二氧化硅颗粒等。最近，一些自组装和无载体疫苗受到更多关注，研究人员通过涡旋 - 超声法制备了用肿瘤或细菌细胞膜伪装的明矾佐剂蛋白抗原纳米颗粒，激活免疫级联，在肿瘤和细菌感染模型中表现出显著的免疫效果。另一项研究专注于通过丙烯酰基修饰的抗原、具有 DC 靶向能力的甘露糖单体和交联剂制备的自组装纳米疫苗。还有研究通过抗原与唑衍生物封端的 PEI 聚合物的静电相互作用，制备自组装纳米疫苗，这些策略减少了额外材料的使用，实现了抗原和佐剂向同一 APC 的共递送。除了抗原和佐剂整合的极简疫苗外，抗原和佐剂的包封通常通过静电相互作用、化学键、疏水相互作用、氢键、范德华力、金属离子螯合或多种方式的组合实现。例如，MOF 可通过金属离子与有机配体之间的配位以及主客体相互作用实现抗原和佐剂的包封。静电相互作用通常不稳定，可能导致包封效率低或抗原和佐剂在被 APC 摄取前解离，同时，需注意抗原和佐剂应充分释放以发挥作用， redox 化学键和 pH 敏感键等化学键可响应特定的生理条件，实现抗原和佐剂在特定部位的释放。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。