DT-2216

导语 靶向蛋白降解技术，特别是蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC），作为一种新兴的抗癌策略，近年来发展迅速。本文发表于《Annual Review of Cancer Biology》，由Dundee大学靶向蛋白降解中心的Vesna Vetma、Suzanne O'Connor和Alessio Ciulli撰写，综述了PROTAC药物的研发进展及其在癌症治疗中的应用前景。文章详细介绍了目前已进入临床试验的30余种PROTAC药物，涵盖雄激素受体、雌激素受体、布鲁顿酪氨酸激酶等多个重要靶点，并深入探讨了PROTACs的设计思路、作用机制、临床前及临床研究数据，以及面临的挑战和未来发展方向。该文为深入了解PROTACs在抗癌领域的应用提供了全面而及时的参考。 当然由于综述时效性，因此个人也在此基础上做一些相应的增补。 一、背景介绍 尽管近年来癌症治疗取得了显著进展，但药物毒性、疗效不足和耐药性仍然是临床治疗的主要挑战。传统的药物研发主要集中于开发小分子抑制剂，这些抑制剂通过结合蛋白质的活性位点来阻断其功能。然而，许多致癌蛋白缺乏合适的结合位点，或者抑制剂无法完全阻断蛋白质的功能，导致治疗效果不佳。靶向蛋白降解技术，特别是PROTAC技术，为克服这些挑战提供了一种新的策略。 二、PROTAC作用机制 PROTAC 是双功能小分子，由三部分组成：E3 连接酶配体、连接体和靶蛋白 (POI) 配体。PROTAC 通过将 POI 与 E3 连接酶连接起来，形成三元复合物，从而促进泛素分子转移到 POI 上。泛素化的 POI 会被蛋白酶体识别并降解。由于 PROTAC 的催化作用机制，它可以在亚化学计量浓度下发挥作用，并且可以降解高丰度蛋白，从而在低剂量下达到显著的靶蛋白降解。 三、临床试验中的PROTAC 目前，超过30种PROTAC药物已进入临床试验，主要集中在癌症治疗领域，少数探索其他疾病的治疗。以下将对处于临床试验阶段、靶向不同癌症相关蛋白的PROTAC进行更详细的介绍，并对已公布的部分临床试验结果进行总结。 1. AR 作用机制： AR-PROTACs通过招募E3连接酶（例如CRBN）使AR泛素化，从而促进蛋白酶体降解AR，阻断AR信号通路，抑制前列腺癌细胞增殖。 代表药物： ARV-110 (Bavdegalutamide): 首个进入临床的PROTAC药物，靶向AR，用于治疗mCRPC。临床试验结果显示，ARV-110在携带AR T878X/H875Y突变的患者亚组中疗效最佳，凸显了患者分层的重要性。然而，在更广泛的mCRPC患者群体中，其疗效有限，可能与AR信号通路复杂的耐药机制有关。 ARV-766 (Luxdegalutamide): 第二代AR-PROTAC，具有更高的稳定性和更广的基因型覆盖范围，可降解野生型和突变型AR。早期临床数据显示，ARV-766在较低剂量下即可有效降低前列腺特异性抗原水平，展现出优于恩杂鲁胺的潜力。目前ARV-766正在进行激素治疗后mCRPC患者的临床试验，并计划开展一线治疗的临床试验。 CC-94676 (BMS-986365)：一种异双功能口服疗法，旨在通过 AR 降解和拮抗的一流双重机制来抑制 AR 活性，ESMO2024上展现的mCRPC一期临床数据出色，计划2025启动3期注册性临床【ESMO2024--BMS-986365数据出色，BMS计划2025启动3期注册性临床】。 其他AR-PROTAC: 包括HP518、AC-176和HRS-5041等，均处于早期临床试验阶段，靶向mCRPC。这些PROTAC大多基于CRBN或其他未公开的E3连接酶。其临床疗效和安全性数据还有待进一步公布。 未来展望： 开发更有效的AR-PROTACs，拓展适应症至激素敏感性前列腺癌，探索与其他疗法的联合应用。 2. ER 作用机制：ER-PROTACs通过介导ER降解，抑制ER信号通路，从而发挥抗肿瘤作用。 代表药物： ARV-471 (Vepdegestrant): 口服、高效的ER-PROTAC，用于治疗ER阳性/HER2阴性的局部晚期或转移性乳腺癌。临床前研究显示，ARV-471在多种乳腺癌细胞系中均能有效降解ER，并表现出优于氟维司群的肿瘤抑制活性。ARV-471已进入3期临床试验，并获得了FDA快速通道资格认定，有望成为治疗乳腺癌的新型有效疗法。 其他ER-PROTAC: 包括AC682 和HRS-1358等，处于早期临床试验阶段，主要用于治疗ER阳性的乳腺癌。 未来展望： 进一步评估ARV-471在不同乳腺癌亚型中的疗效和安全性，探索与其他疗法的联合应用，例如CDK4/6抑制剂或PI3K抑制剂。 3. BTK 作用机制：BTK-PROTACs通过诱导BTK降解，抑制BCR信号通路，从而治疗B细胞恶性肿瘤。 代表药物： NX-2127 (Zelebrudomide): 双重BTK和Ikaros降解剂，兼具分子胶和PROTAC的特性。它可以降解野生型和C481S突变型BTK，以及IKZF1和IKZF3。临床试验显示，NX-2127在CLL患者中取得了良好的疗效，与BTK突变状态无关。然而，由于生产工艺改进的需求，该药物的1期临床试验目前处于暂停状态。 NX-5948: 第二代BTK-PROTAC，具有更高的选择性和中枢神经系统渗透性。临床前研究显示，NX-5948比抑制剂和第一代降解剂更有效地抑制肿瘤生长。目前NX-5948正处于1期临床试验中，用于治疗B细胞恶性肿瘤，包括中枢神经系统肿瘤和原发性中枢神经系统淋巴瘤。 其他BTK-PROTAC: 包括BGB-16673、HSK-29116、ABBV-101、HZ-Q1070、UBX-303等，均处于早期临床试验阶段，主要用于治疗B细胞恶性肿瘤。 未来展望：进一步评估NX-5948的疗效和安全性，特别是其中枢神经系统活性；开发针对不同BTK突变的PROTACs，克服耐药性。 4. Bcl-xL 作用机制：DT-2216通过选择性降解Bcl-xL，诱导肿瘤细胞凋亡，而不会显著影响血小板存活，从而降低血小板减少症的风险。 代表药物： DT-2216: 1期临床试验正在进行中，用于治疗复发/难治性TCL和其他血液系统恶性肿瘤。初步数据显示，DT-2216在不引起严重血小板减少的情况下具有抗肿瘤活性。 未来展望：评估DT-2216的长期疗效和安全性，探索与其他疗法的联合应用。 5. BCL6 作用机制：BCL6-PROTACs通过降解BCL6，抑制其转录调控功能，从而抑制DLBCL细胞增殖。 代表药物： ARV-393, BMS-986458: 这两种BCL6-PROTACs均处于1期临床试验阶段，主要用于治疗DLBCL。 未来展望：评估ARV-393和BMS-986458的疗效和安全性，探索与其他疗法的联合应用，例如利妥昔单抗。 6. IRAK4 作用机制：IRAK4 是 TLR 和 IL-1R 信号通路的关键激酶，在多种炎症和癌症中发挥作用。IRAK4-PROTACs 通过降解 IRAK4 蛋白，阻断下游信号传导，从而发挥抗炎和抗肿瘤作用。 代表药物： KT-413: 由 Kymera Therapeutics 开发，是一种 CRBN E3 连接酶为基础的 IRAK4 降解剂。临床前研究显示，KT-413 能有效降解 IRAK4，并在多种疾病模型中显示出疗效。曾开展针对非霍奇金淋巴瘤、惰性淋巴瘤、B 细胞非霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大 B 细胞淋巴瘤和原发性皮肤大 B 细胞淋巴瘤的 I 期临床试验。尽管达到了预期的降解水平且没有剂量限制性毒性，但由于战略原因，该项目已终止开发。 未来展望：尽管 KT-413 的开发终止，但 IRAK4 仍然是一个有吸引力的靶点。未来研究可能集中在寻找新的 IRAK4 降解剂，优化其理化性质和药代动力学特性，并探索新的联合治疗策略。 7. BRD9 作用机制：BRD9 是非经典 SWI/SNF 染色质重塑复合物的一个组成部分，在滑膜肉瘤和 SMARCB1 缺陷型肿瘤中发挥关键作用。BRD9-PROTACs 通过降解 BRD9 蛋白，破坏癌细胞的转录调控，从而抑制肿瘤生长。 代表药物： FHD-609: 由 Foghorn Therapeutics 开发，是一种 CRBN E3 连接酶为基础的 BRD9 降解剂。I 期临床试验显示 FHD-609 可有效降解 BRD9，但在较高剂量下出现 QTc 间期延长，导致试验暂停。 CFT-8634: 由 C4 Therapeutics 开发，是一款口服 BRD9 降解剂。I 期临床试验显示，尽管 BRD9 降解水平很高，但在滑膜肉瘤和 SMARCB1 缺陷型实体瘤患者中疗效不足，导致试验终止。 未来展望：尽管面临挑战，BRD9 仍然是一个有潜力的靶点。未来的研究可能需要关注滑膜肉瘤的关键驱动因素 SSX-SS19 融合蛋白。此外，也需要进一步优化 BRD9-PROTACs 的理化性质和药代动力学特性，并探索新的联合治疗策略。 8. STAT3 作用机制：STAT3 是一种参与肿瘤发生、发展和转移的转录因子。STAT3-PROTACs 通过降解 STAT3 蛋白，阻断其下游信号通路，从而抑制肿瘤生长。 代表药物： KT-333: 由 Kymera Therapeutics 开发，是一款 VHL E3 连接酶为基础的 STAT3 降解剂。I 期临床试验显示 KT-333 能够有效降解 STAT3，并在特定患者群体中观察到临床意义的缓解。该药物已获得治疗皮肤 T 细胞淋巴瘤和外周 T 细胞淋巴瘤的孤儿药资格认定，以及 FDA 快速通道资格认定。 未来展望：KT-333 的临床试验结果令人鼓舞，有望成为治疗 STAT3 驱动型癌症的新型疗法。未来需要进一步评估其长期疗效和安全性，并探索新的联合治疗策略。 9. MDM2 作用机制：MDM2 是 p53 肿瘤抑制蛋白的负调节因子。MDM2-PROTACs 通过降解 MDM2 蛋白，稳定 p53 蛋白水平，从而激活 p53 介导的细胞周期阻滞和凋亡，抑制肿瘤生长。 代表药物： KT-253: 由 Kymera Therapeutics 开发。临床前研究表明，KT-253 可以克服 MDM2 的负反馈回路，并在体内外均显示出抗肿瘤活性。I 期临床试验正在进行中，用于治疗多种血液系统恶性肿瘤和实体瘤。初步数据显示，在耐受剂量下，KT-253 具有良好的疗效，且未观察到中性粒细胞减少症或血小板减少症等血液学毒性。 未来展望：KT-253 的早期临床数据令人鼓舞，有望成为治疗 p53 失活型癌症的新型疗法。未来需要进一步评估其长期疗效和安全性，并探索新的联合治疗策略。 10. EGFR 作用机制：EGFR 是一种参与细胞生长、增殖和分化的受体酪氨酸激酶。EGFR-PROTACs 通过降解 EGFR 蛋白，阻断 EGFR 信号通路，从而抑制肿瘤生长。 代表药物： HSK-40118: 由 Haisco Pharmaceutical Group 开发，靶向 EGFR L858R 突变体。I 期临床试验正在进行中，用于治疗 EGFR 突变的晚期或转移性 NSCLC。 CFT-8919: 由 C4 Therapeutics 和 Betta Pharmaceuticals 合作开发，是一款变构的、口服生物可利用的 EGFR L858R 突变体选择性降解剂。临床前研究显示，CFT-8919 能够降解 EGFR L858R 及其继发突变体，并在对第三代 EGFR 抑制剂耐药的小鼠模型中显示出抗肿瘤活性，包括 EGFR L858R T790M 脑转移模型。 HJ-002-03（和径医药）、BG-60366（百济神州）：EGFR C797S PROTAC，处于临床一期。 未来展望：EGFR-PROTACs 为治疗 EGFR 突变型 NSCLC 提供了新的治疗选择，特别是对于那些对现有抑制剂产生耐药性的患者。未来需要进一步评估 HSK-40118 和 CFT-8919 的临床疗效和安全性，并探索新的联合治疗策略。 11. SMARCA2   作用机制：SMARCA2 和 SMARCA4 是 SWI/SNF 染色质重塑复合物的 ATP 依赖性解旋酶。SMARCA4 功能缺失突变在多种恶性肿瘤中富集。SMARCA2-PROTACs 通过选择性降解 SMARCA2，利用 SMARCA2 和 SMARCA4 之间的合成致死关系，从而杀死肿瘤细胞。 代表药物： PRT3789: 由 Prelude Therapeutics 开发，是一款 VHL E3 连接酶为基础的 SMARCA2 降解剂。目前正在 I 期临床试验中，作为单一疗法和与多西紫杉醇联合使用，用于治疗 SMARCA4 突变的 NSCLC。但一期初步临床结果不佳【SMARCA2降解剂：靶向增强子重编程，治疗SMARCA4突变型肺癌的新策略】。 PRT7732：Prelude Therapeutics 开发，是一款口服SMARCA2 降解剂，可能是基于CRBN。目前正在 I 期临床试验中。 未来展望：SMARCA2-PROTACs 为治疗 SMARCA4 突变型癌症提供了一种新的治疗策略。未来需要进一步评估 PRT3789 的临床疗效和安全性，并探索新的联合治疗策略。 12. KRAS 作用机制：KRAS 是一种在多种癌症中 häufig 突变的癌基因。KRAS-PROTACs 通过降解 KRAS 蛋白，阻断 KRAS 信号通路，从而抑制肿瘤生长。 代表药物： ASP3082: 由 Astellas Pharma 开发，是一款靶向 KRAS G12D 突变体的 VHL E3 连接酶为基础的降解剂，目前处于 I 期临床试验阶段，但初步临床结果不佳【ESMO2024--安斯泰来的KRASG12D PROTAC令人失望】。FDA 已授予 ASP3082 快速通道资格认定，用于治疗胰腺导管腺癌。 ASP4396：Astellas Pharma另一个靶向 KRAS G12D 突变体的PROTAC，目前处于 I 期临床试验阶段，可能是基于CRBN。 未来展望：KRAS 长期以来被认为是“不可成药”的靶点，KRAS-PROTACs 的出现为 KRAS 突变型癌症的治疗带来了新的希望。未来需要进一步评估 ASP3082 和其他 KRAS 降解剂的临床疗效和安全性，并探索新的联合治疗策略。 13. BRAF 作用机制：BRAF 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是 RAS-RAF-MEK-ERK 信号通路的重要组成部分。BRAF V600E 突变在多种癌症中常见。BRAF-PROTACs 通过降解突变型 BRAF 蛋白，阻断下游信号通路，从而抑制肿瘤生长。 代表药物： CFT1946: 由 C4 Therapeutics 开发，是一款靶向 BRAF V600E 突变体的 CRBN E3 连接酶为基础的降解剂。目前正在 I/II 期临床试验中，用于治疗 BRAF V600 突变驱动的癌症，包括对抑制剂耐药的癌症。该试验将评估 CFT1946 单药治疗和与 MEK 抑制剂曲美替尼联用的疗效。 未来展望：BRAF-PROTACs 为治疗 BRAF 突变型癌症，特别是对 BRAF 抑制剂耐药的癌症，提供了新的治疗选择。未来需要进一步评估 CFT1946 的临床疗效和安全性，并探索新的联合治疗策略。 四、PROTAC 的优势和挑战 PROTAC的优势 完全消除蛋白功能: 传统的抑制剂通常只阻断蛋白质的特定功能或相互作用，而PROTACs则通过降解目标蛋白，从根本上消除其所有功能，包括催化功能、支架功能以及蛋白-蛋白相互作用等。这对于那些具有多种功能或难以通过抑制单个活性位点来有效控制的蛋白靶点尤为重要，例如转录因子、支架蛋白和致癌融合蛋白等。 靶向“不可成药”靶点: 许多疾病相关蛋白缺乏明确的结合口袋或活性位点，传统的小分子抑制剂难以靶向。而PROTACs不需要与蛋白的活性位点结合，可以靶向蛋白表面任何可及的位点，从而拓展了可成药靶点的范围，为开发靶向“不可成药”靶点的药物提供了新的途径。 催化作用机制: PROTACs以催化方式发挥作用，即一个PROTAC分子可以介导多个目标蛋白的降解，因此在亚化学计量浓度下即可有效发挥作用。这使得PROTACs药物在较低剂量下即可达到治疗效果， potentially 降低脱靶效应和毒副作用，并提高药物的治疗窗口。 更高的选择性: 即使使用对同源蛋白没有选择性的配体，PROTACs也可能实现选择性降解。这是因为PROTACs的作用依赖于三元复合物的形成，而不同蛋白与E3连接酶形成三元复合物的稳定性和空间构象可能存在差异，从而导致选择性降解。此外，可以通过合理设计PROTACs的结构，例如连接体的长度和组成，来进一步提高其选择性。 克服耐药性: 肿瘤细胞常常通过靶点蛋白突变的方式产生对抑制剂的耐药性。而PROTACs的降解机制使其对某些类型的突变不敏感，例如那些不影响PROTAC结合但影响抑制剂结合的突变。此外，PROTACs还可以降解那些导致耐药性的突变蛋白，从而克服耐药性。 作用持久: PROTAC介导的蛋白降解作用通常比抑制剂的抑制作用更持久。这是因为蛋白降解后需要一定时间才能重新合成，而抑制剂的抑制作用则会随着药物的清除而减弱。PROTACs的持久作用可以延长给药间隔，提高患者的依从性。 PROTACs面临的挑战 成药性挑战: PROTACs通常具有较高的分子量、较多的氢键供体和受体、较高的亲脂性和较多的可旋转键，这些特性使其难以满足Lipinski五规则等传统药物的理化性质要求，导致较差的细胞渗透性、溶解度和口服生物利用度，给药物的开发和临床应用带来挑战。 脱靶效应: PROTACs可能结合并降解非目标蛋白，导致脱靶效应和毒副作用。这需要在药物设计和开发过程中进行严格的筛选和优化，以提高PROTACs的特异性。 耐药性机制: 尽管PROTACs可以克服某些类型的耐药性，但肿瘤细胞也可能通过其他机制对PROTACs产生耐药性，例如E3连接酶的突变或表达下调、泛素-蛋白酶体系统的功能障碍等。需要进一步研究PROTACs的耐药机制，并开发相应的应对策略。 药物递送: 由于PROTACs的分子量较大，其在体内的递送和分布可能受到限制，特别是到达实体瘤内部。需要开发新的药物递送系统，以提高PROTACs在肿瘤组织中的浓度和疗效。 免疫原性: PROTACs作为一种新型的药物分子，其免疫原性尚不清楚。需要进行深入的研究，以评估PROTACs的免疫原性风险，并开发相应的解决方案。 生产成本: PROTACs的合成和纯化相对复杂，导致其生产成本较高。需要开发更有效、更经济的PROTACs合成方法，以降低药物的生产成本，提高其可及性。 尽管PROTACs技术面临一些挑战，但其巨大的潜力吸引了学术界和工业界的广泛关注。随着研究的不断深入和技术的进步，相信这些挑战将逐步得到解决，PROTACs技术将在未来为治疗癌症和其他疾病带来新的突破。 五、未来展望 PROTAC技术作为一种新兴的靶向蛋白降解策略，展现出巨大的潜力，但仍处于发展早期。为了充分发挥其治疗潜力，未来的研究需要关注以下几个方面： 1. 扩展E3连接酶库及优化配体: 目前，大多数PROTACs依赖于CRBN和VHL这两种E3连接酶。为了克服对这两种E3连接酶的耐药性，以及实现组织特异性降解，需要开发靶向其他E3连接酶的PROTACs，例如MDM2、cIAP1、KEAP1、RNF114等。这需要发现和鉴定新的E3连接酶配体，并深入研究其与靶蛋白相互作用的机制。 优化现有E3连接酶配体，提高其结合亲和力和选择性，降低脱靶效应。开发具有更好成药性的配体，例如口服生物利用度更高、组织分布更广的配体。 2. 优化连接体和靶蛋白配体: 连接体的长度、组成和柔性会影响PROTACs的成药性和降解效率。需要开发新的连接体设计策略，例如可裂解连接体、可控释放连接体等，以提高PROTACs的靶向性和疗效。 优化靶蛋白配体，提高其结合亲和力和选择性。开发共价结合的靶蛋白配体，提高PROTACs的降解效率和作用持久性。探索靶向蛋白-蛋白相互作用界面的配体，以更有效地干扰蛋白功能。 3. 提高PROTACs的成药性: PROTACs通常分子量较大，理化性质较差，导致其成药性较差。需要开发新的PROTACs设计策略，例如片段化的PROTACs、双PROTACs、杂合PROTACs等，以减小分子量，提高成药性。 利用计算辅助药物设计和人工智能技术，优化PROTACs的结构，提高其细胞渗透性、溶解度和口服生物利用度。 开发新的药物递送系统，例如纳米颗粒、抗体偶联药物等，以提高PROTACs在体内的递送效率和靶向性。 4. 深入研究PROTACs的作用机制和耐药机制: 深入研究PROTACs形成三元复合物的结构和动力学，揭示其降解靶蛋白的分子机制。 研究肿瘤细胞对PROTACs的耐药机制，例如E3连接酶的突变或表达下调、泛素-蛋白酶体系统的功能障碍等，并开发相应的应对策略，例如联合用药、开发新的PROTACs等。 5. 拓展PROTACs的应用领域: PROTACs技术不仅可以用于治疗癌症，还可以用于治疗其他疾病，例如神经退行性疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病等。 探索PROTACs在疾病诊断和生物标志物开发中的应用。 6. 开发新型靶向蛋白降解技术: 除了PROTACs技术外，还可以开发其他靶向蛋白降解技术，例如分子胶、自噬靶向嵌合体（AUTAC）、溶酶体靶向嵌合体（LYTAC）等，以拓展靶向蛋白降解的范围和应用。 7. 加强产学研合作: 加强学术界和工业界的合作，推动PROTACs技术的临床转化和应用。 建立PROTACs技术平台，共享资源和技术，加速PROTACs药物的研发进程。 总而言之，PROTAC技术具有广阔的应用前景，但仍面临诸多挑战。通过持续的创新和研究，不断优化PROTACs的设计和开发，克服其面临的挑战，PROTACs技术有望在未来为治疗多种疾病带来新的突破，造福人类健康。 六、结论 PROTAC 技术在癌症治疗领域展现出巨大的潜力。随着研究的不断深入，PROTAC 有望成为治疗癌症和其他疾病的新型有效疗法。然而，要充分发挥 PROTAC 的潜力，仍需要克服一些挑战，例如优化其理化性质、探索新的 E3 连接酶、开发组织特异性 PROTAC 以及研究其耐药性机制。相信随着技术的不断进步，PROTAC 将在未来为癌症患者带来更多希望。 END 免责声明：本文仅作知识交流与分享及科普目的，不涉及商业宣传，不作为相关医疗指导或用药建议。文章如有侵权请联系删除。 OTC2024类器官前沿应用与3D细胞培养论坛圆满落幕，点击图片可查看会后报告，咨询OTC2025类器官论坛请联系：王晨 180 1628 8769

学以致用   侃侃而言 RSC Med Chem 2024, Nov. 7th DOI: 10.1039/D4MD00769G 蛋白质水解靶向嵌合体（PRTOTACs）是一种靶向蛋白降解的新兴治疗策略，它们将靶标蛋白（POI）与E3连接酶紧密结合，并诱导参与泛素-蛋白酶体系统（UPS）以促进靶向蛋白质降解。 近日，RSC Med Chem上刊载了一篇总结性研究，通过分析处于临床中的PROTACs实体分子的物理化学性质，汇总了PROTACs各组成部分的优化，以及对于实现口服生物利用度所面临的困难和挑战，并根据作者在这一领域的经验提出了一些珍贵的指导性意见和建议。 主要内容 (1) 临床中的PROTACs (2) 口服生物利用度开发中的挑战 (3) 值得注意的陷阱提示 (4) 总结与展望，及往期相关精彩回顾 01 临床中的PROTACs PROTACs等靶向降解剂是一种“事件驱动”的治疗策略，其选择性地从细胞中去除靶标蛋白质。相比于传统的基于“占位驱动”的蛋白质功能抑制策略，PROTACs等靶向降解剂具有几个优势： (1)药理学上，PROTACs等靶向降解剂有可能提供更加完整的蛋白质功能封锁（如去除支架活性），因此，更有可能概括基因敲除实验的效果。简单地说，PROTACs等靶向降解剂不仅阻断了信号传导，而且通过分解细胞传播信号所需的机制，消除了细胞传播信号的能力； (2)细胞只能通过产生新的蛋白质来恢复功能，因此，药理学受到蛋白质的再合成率以及药物药效学的影响，从而提供了延长作用时间的可能性； (3) PROTAc机制中POI与E3组分之间必要的相互作用，为异构体之间（如，取决于三元复合物的形成和/或可用的表面赖氨酸残基）和组织内（如，取决于E3表达水平）的选择性提供了额外的机会； 因此，这种药物实体已经出现，便被证明对于患者具有良好的耐受性和有效性，并已有多个实体分子进入后期临床研究。 据统计，截至2024年7月，已有13种结构已公开的PROTACs进入临床试验阶段。这些PROTACs大多数用于肿瘤相关适应症，其中一种用于治疗炎症；两种因战略规划原因而停止（ARV-110、KT-413）。 就E3连接酶配体而言，其中有12种携带CRBN配体，口服给药。而仅有一种需要静脉注射（IV）的DT-2216，携带VHL配体。如下图。 图片源自RSC Med Chem 这些处于临床阶段的PROTACs实体的物化性质统计如下表。其中，携带CRBN配体的PROTACs分子量在711~958 Da；亲脂性（pH7.4时的LogD值）为1.4~4.8；色谱极性表面积（ePSA）为107~146 Å 2。 图片源自RSC Med Chem 而计算出的分子亲脂性LogP和极性表面积tPSA的预测结果分散更为广阔：其中LogP为-0.6~6.8；tPSA范围为96~238 Å 2。此外氢键受体HBA为9~20；氢键供体HBD均≤5。 如下图A，通过雷达图更形象地展示了临床口服PROTACs的物化性质空间（蓝色区域）在所有特性方面都超出了Lipinski五规则（Ro5）和Veber关于可旋转键（RotB）和极性表面积（PSA）（绿色区域）的经验指南，仅HBD除外。 图片源自RSC Med Chem 上图B绿色条形图显示了小分子的可接受的性质范围，同时与临床PROTACs分子做了对比。 在亲脂性方面，一些PROTACs突破了小分子LogP（≤5）和LogD（1~3）的极限。值得注意的是，ePSA的值（107~141 Å2）比tPSA （96~238 Å2）的范围窄得多，这表明这可能是口服PROTACs设计的更有价值的指南。尽管超出了先前确定的物理化学空间限制，口服给药仍然是首选的给药途径，专门为血液病癌症开发的DT2216和KT-413除外。 以上每一种PROTACs都是经历了广泛的优化后，以实现药理学和物化性质的最佳平衡的结果。而PROTACs模块化、三组件的特性（POI配体、E3配体、连接子），其设计的技巧在于平衡单个部件组分的特征，从而使最终PROTACs的整体特性处于可接受的空间内。 就POI配体而言：强效，较少的暴露HBD 许多PROTACs针对靶标POI改良的抑制剂/拮抗剂进行设计。这些抑制剂或拮抗剂通常是高效的配体片段基序，在其溶剂区安装输出载体，用以连接到E3结合基序片段。此外，这些配体大多数是中性的，而非酸性或碱性，并且氢键供体HBD≤1。以上几个PROTACs中也有几个例外，如ARV-393、NX-2127、KT-413、NX-5948，整体分子分别包含3、4、4、5个HBD，但分子内氢键可能屏蔽了其中的几个HBD。 就E3连接酶配体而言：CRBN配体最流行 在已经揭示了分子结构的临床PROTACs中，上面已提到，除了DT-2216以外，均是携带了CRBN配体。如下图，使用最广泛的CRBN配体包括来自免疫调剂亚胺类药物（IMiDs）沙利度胺、和来那度胺。这两者均具有高级性、高效、低分子量、并且在基本结合药效团中只有一个HBD。此外，它们对外排转运体缺乏敏感性，使其成为PROTACs的理想选择，特别是在实现口服生物利用度上。 图片源自RSC Med Chem 而与IMiD类配体相关的安全性问题（如致畸性、血液毒性等），也可以解释为什么PROTACs最初的治疗适应症主要是肿瘤领域。也许正是因为这一点，当前正在出现不同于IMiD类的由新型CRBN配体组成的PROTACs。 就连接体而言：胺基碱及富含环型基序片段占主导 除了极个别例外，如CFT-1946，这些临床阶段的PROTACs的连接体的共同特征是存在一个叔胺碱，以及哌啶、哌嗪、或氮杂啶都行。在一些特定的情况下，哌啶的碱度似乎随着氟取代（CFT-8634）或氧取代（ARV-393、KT-474）的加入而有所缓和，使其碱度不超过所有口服PROTACs的预测值pKa=9.1。 而静脉给药的PROTACs，如DT-2216，具有非常高的预测亲脂性（LogP=15.0）；然而，这降低到低得多的LogD=3.9，可能是由于其两性离子电荷所致；其高试验极性为193 Å2，比其他口服PROTACs的ePSA值高出52 Å2，比相关bRo5口服药物venetoclax的ePSA值高出31 Å2，似乎反映了这种两性离子。 口服PROTACs的另一个共同之处是使用环状基序作为构象约束，所有实例在连接体中至少包含两个环，有些甚至三个环。 在灵活性方面，10个实例在环之间包含亚甲基作为间隔剂，只有BMS986365具有乙氧基3-原子间隔剂。此外，CFT-1946具有最刚性的连接体，以酰胺键连接哌啶和螺环。而KT-474具有最大的非环组分，具有4-原子丙炔醚间隔，但即使这样也相对刚性，这表明构象约束是PROTACs的重要设计考虑因素。 一些研究也表明富环的、刚性连接体可以产生更高的细胞靶标降解能力和更高的代谢稳定性。也因此，可旋转键仅略高于Ro5依从性口服药物经验指导的上限。而其中一个明显的例外则是DT-2216，具有29个可旋转键，高度灵活的连接体仍然可以产生强效的降解物，并且适用于静脉给药的PROTACs。 02 口服生物利用度的挑战 PROTACs分子由三个组分构成的结构特征使其在物化特性和口服生物利用度等方面面临着诸多挑战。 EARLY R&D 2.1、最严格的HBD，口服PROTACs设计的关键 首先，构建分子量MW低于~700Da的PROTACs具有挑战性。 这种对Lipinski的MW经验规则的违反，通常也会伴随着维持其它Ro5标准（如HBA、HBD、LogP）和其它物化特性的限制（如，PSA、可旋转键等）。 尽管如此，如上一单元所示，也有不少临床中的PROTACs分子是可以生物利用的，尤其是在人类中达到有效的暴露水平。随着越来越多的试验数据的积累，以及对关键理化性质的分析总结，一些新的bRo5经验指导出现，并必将越来越成熟和精准。 例如，Arvinas和AstraZeneca都强调了限制口服吸收的或溶剂暴露的HBDs（eHBDs）数量的重要性。两个团队都得出这样的结论：虽然物化性质，如分子量、亲脂性、分子极性和HBA等可以超过口服药物的Ro5限制，但eHBD≤2这个标准是一个严格有效的设计标准。 对于bRo5化学空间里的大环类药物，相关研究发现，酰胺类HBD的上限为2个，而总体正式的HBD上限为7个，这相对宽松了许多，大概也是因为分子内氢键屏蔽约束的结果。 回到PROTACs来说，也或许也解释了为什么CRBN配体在临床PROTACs组成中更受青睐，因为这些基序片段小、有效且只有一个eHBD。 因此，尽管挑战重重，通过合理使用分子属性可支配限制，是设计PROTACs的关键，特别是最严格的方面，即HBD。 EARLY R&D 2.2、三元复合物本身的问题带来的挑战 尽管PROTACs能够有效地形成促进表面赖氨酸泛素化的三元复合物，然则其也仅能针对靶向蛋白质发挥降解功能。 这种三聚体复合物的建模是非常具有挑战性的。 这是因为，可能存在多种三元复合物构象，并且并非所有这些构象都能导致有效的靶标降解，这无疑阻碍了基于结构的PROTACs设计。 相比于传统小分子设计程序，PROTACs的设计要考虑分子大小、“POI-连接体-E3”组分之间的构象和物理化学性质相互作用，这意味着有更多的“化学等式”需要优化。 考虑到构成可及的三元配合物的不确定性，以及它位于正确的物化空间，因此，生产“活性”PROTACs的复杂性将会导致一系列设计和合成方面的挑战。 针对这么多不确定性，一种解决办法是通过生产“库”，用来探索广阔的化学空间，从而实际地解决以经验方式存在的巨大的组合优化。 EARLY R&D 2.3、变形嵌合体的挑战 PROTAC的三元组成和分子大小，使理解其构象比传统小分子更具挑战性。 一般，预先组织分子使其具有生物活性构象，以减少结合时的熵损补偿是一种行之有效的策略。然而，对于PROTACs分子，配体可以获得更大程度的构象自由度，再加上三元复合物的构象可塑性和不确定性，使得准确确定要模仿的“生物活性”构象具有挑战性。 利用核磁共振技术，结合分子动力学模拟来了解PROTACs的构象行为及其对渗透率的影响是目前的一种方法。 在极性溶剂和非极性溶剂中观察到的差异性，为构象集成、端到端反折叠和潜在的分子内氢键（IMHB）提供了证据。研究发现，与未折叠的配对对比，CRBN和VHL安装的PROTACs的溶剂依赖性（即“变色龙”效应）分子内折叠，增加了它们的被动细胞通透性。 EARLY R&D 2.4、PROTACs体外试验生产数据的分析 对于PROTACs领域的工作人员来说，另一个挑战是使用基于传统小分子优化程序配置的体外分析生成对PROTACs有意义的数据的能力。 如前面所提，PROTACs分子大，通常是亲脂性的碱，有粘附在实验仪器/蛋白质/膜上的倾向，导致渗透性和蛋白质结合试验回收率很低。传统的摇瓶法亲脂性分析通常难以达到LogD＞4，而且溶解度通常低于检测极限，这使得在缺乏数据的情况下筛选候选药物极具挑战性。 而且，作者还根据经验提到，代谢稳定性测定（肝细胞和微粒体孵育）产生可靠的值，在淘汰不稳定的PROTACs方面是没有价值的。 色谱法（ChromologD、ePSA）扩大了亲脂性和暴露极性的可测范围，并允许在一系列化合物中对化合物进行排序。此外，已有报道将色谱方法与计算机方法相结合来生成更多相关的3D描述符，以提高设计口服可用PROTACs的成功率。 03 陷阱提示 在整个PROTACs中整合CRBN结合实体，特别是IMiDs，会带来需要监测的相关安全风险。这些风险可能与以下有关： 与IMiDs非常相似，相应的PROTACs可以作为分子胶降解剂，并导致许多蛋白质降解，从而诱发毒理学效应；例如，值得注意的一个新的底物，GSPT1，一个平移终止因子。其的无意降解降低了蛋白质合成的速率，导致细胞毒性，同时伴有POI的明显和误导性降解。 总的来说，这些发现强调需要细致的对照实验来询问PROTACs的作用机制（MoA），从而促进其优化为有效和安全的药物。从发现阶段到体内PROTACs的评估，一个关键教训是了解它们的代谢命运的重要性。 即使对于代谢相对稳定的PROTACs，也可能产生极性更强、亲脂性更低和未结合清除率更低的片段。然后，它们可以竞争与POI或E3结合，并降低三元复合物形成的有效性，从而降低体内疗效。 此外，即使精心设计的利用CRBN的PROTAC的代谢物，没有分子胶降解剂（MGD）活性，理论上也可以作为MGD，从而引入MGD相关的安全责任。因此，在当前临床试验执行过程中对此类风险进行评估，无疑将使科学界了解利用CRBN的PROTACs用于非肿瘤适应症的适用性。 04 总结与展望 PROTACs目前已经从初始的肿瘤适应症领域向其它领域扩展，但主要还是在肿瘤领域，并且当前临床中的PROTACs还是以利用CRBN作为首选的E3连接酶。 初步数据也证实，人类的生物功效和口服生物利用度也是可以实现的。通过已公开的数据，得到的结论是它们在一些结构上（如碱性、富环连接体）和关键物化特性上（如eHBD≤2）等方面表现出了统一性的特征，并具有一定的指导意义。 往期相关精彩回顾 A Rebiew of the Past 站在靶向蛋白降解临床获批的风口，耶鲁大学Craig M. 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