首个基于circRNA的TCR-T细胞疗法！优于线性mRNA，助力TCR筛选和T细胞工程，有效控制巨细胞病毒感染长达18天

2023-12-03

信使RNA细胞疗法

巨细胞病毒(CMV)感染是接受同种异体造血干细胞移植的患者发病和死亡的重要原因。据上海市第一人民医院对2018年至2021年期间接受同种异体造血干细胞移植患者的综合分析显示，有53.5%的患者在造血干细胞移植后56.1天的中位时间内经历了巨细胞病毒感染，其中CMV感染患者在48个月后的死亡率达到了25.7%，严重威胁移植后患者的生命健康。在临床实践中，大多数巨细胞病毒感染发生在造血干细胞移植后3个月内，一旦患者能建立自身的抗巨细胞病毒免疫力，将可以有效控制巨细胞病毒感染的可能性和严重性。然而50多年来，一直未能针对巨细胞病毒研制出有效疫苗。CMV利用五种蛋白质捆绑的方式进出人体细胞，这种多聚体结合的抗原结构在生物反应器中难以产生，使得基于蛋白质的疫苗难以模仿。临床治疗中，尝试采用供体来源的CMV特异性细胞毒性T淋巴细胞（CMV-CTL）用于治疗移植后的CMV感染。然而，对于供体为CMV阴性或接受脐带血或非亲缘供体移植的患者，获得供体来源的CMV-CTL并不是件容易的事情。2023年11月17日，来自上海交大医学院附属第一人民医院和苏州科锐迈德的研究团队在Cell子刊Molecular Therapy上发表了题为“Circular mRNA-based TCR-T offers a safe and effective therapeutic strategy for treatment of cytomegalovirus infection”的研究论文。研究发现，利用编码候选抗原pp65的环状RNA（cmRNA）转染的自体单核细胞来源的树突状细胞（moDC）可以有效在体外筛选和扩增抗原特异性T细胞，并表现出较线性mRNA转染的moDC更好的效力。采用编码抗原的环状RNA体外工程亦可高效获得可扩增的TCR-T细胞，并可在体内/外有效杀伤靶细胞。环状RNA可延长人moDC中的靶蛋白表达为比较环状RNA与线性mRNA的表达持续时间和表达强度，研究团队在相同转染条件下向健康供体的自体moDC中瞬时转染相同数量的线性或环状GFP-mRNA，并使用qPCR检测转染后不同时间点moDC中的GFP mRNA水平。检测发现，转染后4h内的mRNA水平相当，但在8-32h内，环状GFP mRNA的清除率明显慢于线性mRNA。免疫荧光显示，等量mRNA下，环状GFP mRNA的GFP表达持续时间更长（图1F,G），转染7天后环状组的表达水平仍达到了第1天的70%，而线性组则仅为20%（图1H）。通过流式细胞术检测表达强度和持续水平发现，转染24h后环状组有50% moDC仍有GFP表达，而线性组仅有30%。这些结果表明，cir cRNA相较于线性mRNA能够更持久地维持靶蛋白的高表达，转染编码抗原环状RNA的moDC可以作为稳定的抗原呈递细胞，在体外引发和扩增抗原特异性T细胞。图1. 环状RNA与线性mRNA的表达水平和持续时间对比环状RNA可用于体外筛选抗原特异性TCRCMV-pp65的表达与CMV病毒复制具有显著相关性，可作为TCR特异性识别的抗原靶标。研究团队开发了一种基于环状RNA转导moDC的体外抗原特异性TCR筛选方法。首先，研究人员将携带HLA-A*02:01、HLA-A*11:01或HLA-A*24:01等位基因的健康供体CD8 T细胞与转染线性或环状pp65 mRNA的moDC共培养。分别在第0，第7天共培养两轮后，在第14天收集T细胞并使用CMV-pp65-四聚体染色分析pp65抗原特异性CD8 T细胞。之后从三组不同等位基因的T细胞中扩增出pp65-CD8/四聚体T细胞，环状组较线性组多扩增了超3-6倍。这一结果表明，环状RNA转导的moDC能够有效诱导抗原特异性T细胞的持续扩增，并较线性mRNA的扩增效率更高。图2. 使用环状pp65-mRNA体外筛选CMV-pp65-TCR-T的流程pp65-TCR环状RNA的转导目前常用慢病毒和逆转录病毒载体用于CAR-T或TCR-T疗法的细胞转染，最近也有报道采用基于CRISPR的技术成功地以位点特异性方式将CAR整合到T细胞中。然而，无论是病毒载体还是CRISPR都有可能导致CAR或TCR整合到T细胞基因组中，长期安全性仍有待评估。鉴于之前的结果表明，环状RNA可以实现强大而持续的蛋白质表达，本研究中使用了基于环状RNA的方法生成非病毒、无整合的TCR-T细胞。首先，研究者生产了编码HLA-A*02:01限制性pp65特异性TCR的环状RNA，并且经过纯化后,纯度可以高达96.6%；在此基础上，将HLA-A*02:01阳性供体的原代CD8 T细胞在体外扩增12天，之后采用电转染的方式将编码pp65特异性TCR的环状RNA转入T细胞中。流式细胞术检测发现，电转染24h后有超过90%的CD8 T细胞表达有外源性TCR，并且这些转染后T细胞能够在体外继续扩增。图3. 电转染pp65-TCR环状RNA在此基础上，研究者再次对比了线性或环状pp65-TCR-mRNA转导的TCR-T细胞中mRNA和蛋白质表达的持续时间，qPCR结果显示，相同转导剂量下，环状pp65-TCR-mRNA的降解率低于线性mRNA，更为稳定。线性mRNA在电转后第7天阳性率降至几乎检测不到,而环状pp65-TCR-mRNA转导的TCR-T细胞在电转染第7天仍有80%外源性TCR阳性率。环状pp65-TCR-mRNA介导的TCR表达时长高达18天，是目前表达时长最高的mRNA改造T细胞产品。功能验证实验结果表明，环状RNA改造的TCR-T细胞具有优秀的安全性,，电转后T细胞阳性率高达90%以上，且可以对靶细胞进行高效杀伤，上调激活标志物(CD107a)并释放细胞因子（IFN-γ和TNF-α）。pp65-TCR-T细胞的体内杀伤功效体内CDX验证实验结果表明，通过环状RNA改造的TCR-T细胞比线性mRNA更有效控制pp65阳性细胞体内增殖, 显著提高小鼠生存率。此外，研究团队还对环状RNA改造的TCR-T细胞体内给药频率进行了探索。结果表明，当细胞回输量达到2E7后，在给药频率方面，每5天给一次药和每两周给一次药，药效并无显著差异。线性mRNA改造T细胞的痛点在于表达时长不够，不到7天的表达时长无法满足临床需求。而环状RNA表达长达2周以上，很好地弥补了其短板，并同时呈现了转染效率高、安全性好等优势。图4. 通过CDX模型验证cm-pp65-TCR-T细胞杀伤功效总结抗原特异性TCR的发现是TCR-T TCR-T细胞疗法必不可少但具有挑战性的一步。转染抗原编码cmRNA的moDC可有效引发和扩增抗原特异性T细胞，鉴定并验证了多个靶向CMV pp65抗原的HLA-A限制性TCR。此外，本研究在体外和体内水平上还了，用编码pp65特异性TCR的环状RNA转染的CD8 T细胞可以有效识别并杀伤靶细胞。这项研究是目前已发表的第一个利用基于环状RNA技术来筛选抗原特异性TCR并可生产具有治疗潜力的TCR-T细胞的研究。尽管本研究使用CMV pp65反应性TCR-T细胞作为模型，但本研究的鉴定方法可针对包括肿瘤新抗原或免疫原性自身抗原在内的TCR进行筛选扩增，同时也能帮助相应的TCR-T细胞的产生。凭借环状RNA的高安全性、卓越稳定性和易于制造的特点，环状RNA平台有望成为未来多种疾病的治疗选择。关于张岩/宋献民团队上海交通大学医学院附属第一人民医院/上海市第一人民医院血液科张岩/宋献民团队长期从事于血液恶性肿瘤发病机制与免疫细胞治疗的基础、转化与临床研究，近年来承担多项科技部、基金委、上海市科研项目。目前，研究团队已经建立了成熟的TCR-T细胞研发技术平台，成功开发了多种靶向CMV、EBV等病毒，以及TP53突变、KRAS突变等“肿瘤新生抗原”（Neoantigen）的TCR-T细胞，并申请了多项中国发明专利与PCT专利。关于科锐迈德科锐迈德专注于新一代环状RNA核酸药物研发，已申请30余项环状RNA领域核心平台技术发明专利，多项PCT国际专利，2项软件著作权。科锐迈德自主研发的新型成环框架Clean-PIE系统，无需引入外源序列，精准高效成环，更低的免疫原性，更高的蛋白表达量与持久度。已突破环状RNA工艺开发瓶颈，实现高纯度环状RNA并量产。开发了自主知识产权LNP核酸递送系统及生产工艺。科锐迈德旨在打造综合性的环状RNA核酸制药平台，积极布局感染性疾病、肿瘤免疫、蛋白替代、细胞疗法等产品管线，以满足临床巨大的治疗需要。2022年入选国家生物药技术创新中心（NCTIB）核酸药“揭榜挂帅”项目，为唯一入围的环状RNA公司。2023年与申联生物医药（上海）股份有限公司合资成立上海申锐联生物医药有限公司，进入兽用疫苗领域。参考资料[1]Shen L, Yang J, Zuo C, Xu J, Ma L, He Q, Zhou X, Ding X, Wei L, Jiang S, Ma L, Zhang B, Yang Y, Dong B, Wan L, Ding X, Zhu M, Sun Z, Wang P, Song X, Zhang Y. Circular mRNA-based TCR-T offers a safe and effective therapeutic strategy for treatment of cytomegalovirus infection. Mol Ther. 2023 Nov 17:S1525-0016(23)00618-4. doi: 10.1016/j.ymthe.2023.11.017.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。