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*仅供医学专业人士阅读参考作为继PD-1/L1抑制剂和CTLA-4抑制剂后的免疫治疗“第二梯队”成员，TIGIT抑制剂在过去一年里似乎走进了发展路上的低谷，多项关键临床研究相继失利。但有没有一种可能，这背后的原因是TIGIT靶点的价值还没被充分阐明，TIGIT抑制剂还有其它应用场景呢？近日，以色列特拉维夫大学研究团队在Cancer Discovery期刊发表的最新研究成果，就提示TIGIT抑制剂或在阻断乳腺癌骨转移中有用武之地：同时抑制TIGIT通路及白介素-1β（IL-1β），可有效击破乳腺癌微环境中粒细胞与T细胞协力构建的免疫抑制状态，重新激活免疫应答，减少乳腺癌骨转移[1]。论文首页截图骨转移是晚期乳腺癌最常见的远处转移之一，对患者预后和生活质量都有非常大的负面影响，而且目前只有地舒单抗等寥寥几种药物可减少骨转移导致的骨破坏及症状，“预防和抑制骨转移”仍然是个遥不可及的目标，所以还得深入分析乳腺癌骨转移的形成机制和内部状态。从免疫微环境角度入手，确实是个不错的选择。研究者们使用了此前专门构建的自发性乳腺癌骨转移小鼠模型（4T-Bone）[2]，来分析乳腺癌骨转移过程中不同时间节点的免疫微环境组分和动态变化：从免疫细胞组成来说，骨转移灶中增多较为明显的是粒细胞等髓系细胞，这个结果不出所料，毕竟髓系来源的免疫抑制细胞（MDSCs）也是惯犯了。但意外的是，研究者们在骨转移灶核心部位发现了大量不同亚群的T细胞浸润，其中既有细胞毒性T细胞也有辅助性、调节性T细胞。有T细胞浸润却消灭不了转移灶，说明它们整体处于被抑制的状态：T细胞激活标志物CD44、细胞毒性脱颗粒标志物CD107a表达下调，以及粒细胞中普遍富集表达的IL-1β、PD-L1等免疫抑制性分子，都可以证实这一点。骨转移灶核心部位浸润了大量功能异常的T细胞转录组学分析还显示，MDSCs（特征为CD11b+Ly6CintLy6G+）会发生转录组学重编程，特征包括免疫抑制性基因上调和细胞成熟标志物下调；与此同时，与粒细胞发生相互作用的细胞毒性T细胞（特征为CD3+CD8+），则出现了明显提示功能异常的标志物表达水平改变（如Cd44、Cxcr5等表达下调），而调节性T细胞也同时呈现免疫抑制相关的转录组学重编程。研究者们又专门评估了MDSCs与细胞毒性T细胞间的受体-配体相互作用，发现免疫检查点是两类细胞间最主要的沟通桥梁：绝大多数细胞毒性T细胞，以及CD4+T细胞和调节性T细胞的PD-1、TIGIT表达水平都显著上调，而MDSCs则相应上调了PD-L1和TIGIT配体CD155的表达，意味着MDSCs可能通过这两条免疫检查点通路，抑制了骨转移灶中的全部T细胞。MDSCs发挥抑制免疫应答、促进骨转移的关键在于PD-1/L1和TIGIT通路接下来，研究者们开始寻找破解这种局面的策略，抑制PD-1/L1和TIGIT通路的理由不用多说，但最好还能直接干预MDSCs，使它们不要呈现过强的免疫抑制表型，为此研究者们结合目前已获批的靶向治疗药物，对粒细胞表达较高的标志物进行筛选，圈定了表达水平显著上升的IL-1β，并通过实验证实IL-1β处理可显著上调PD-L1、CD155等免疫抑制功能标志物水平。那么从理论上说，联合治疗就该同时针对PD-1/L1、TIGIT两条通路和IL-1β靶点，不过小鼠实验显示，将PD-1抑制剂与后面两类靶向药物联合使用，会大幅增加小鼠发生细胞因子风暴这一严重免疫不良事件的风险，导致小鼠生存率大降，而IL-1β单抗与TIGIT抑制剂联用，综合来看是疗效和安全性相对较好的选择，能够有效激活免疫应答、预防骨转移发生。IL-1β单抗与TIGIT抑制剂联合治疗是较好的方案参考文献：[1]Monteran L, Ershaid N, Scharff Y, et al. Combining TIGIT blockage with MDSC inhibition hinders breast cancer bone metastasis by activating anti-tumor immunity[J]. Cancer Discovery, 2024.[2]Monteran L, Ershaid N, Sabah I, et al. Bone metastasis is associated with acquisition of mesenchymal phenotype and immune suppression in a model of spontaneous breast cancer metastasis[J]. Scientific Reports, 2020, 10: 13838.本文作者丨谭硕

本文为转化医学网原创，转载请注明出处 作者：Sophia 导读： 免疫疗法正在获得发展势头，但目前的治疗方法在受益者方面存在局限性。透明细胞肾细胞癌 （ccRCC） 在所有实体瘤中含有最高表达的人白细胞抗原 E （HLA-E），即 NKG2A 的配体。在这项研究中，我们旨在研究NKG2ACD8 T细胞在肿瘤微环境中的作用及其作为ccRCC新靶点的潜力。 近日，复旦大学基础医学院徐洁杰教授联合复旦大学附属中山医院郭剑明教授共同通讯在期刊《Journal for Immuno Therapy of Cancer》上发表文章“NKG2ACD8 T cells infiltration determines immunosuppressive contexture and inferior response to immunotherapy in clear cell renal cell carcinoma”， 研究发现ccRCC 中 NKG2ACD8 T 细胞浸润较高的患者表现出较短的总生存期和对免疫治疗的耐药性。NKG2ACD8 T 细胞表达上调的检查点分子，并显示出受损的效应功能，以及组织驻留特征。程序性细胞死亡蛋白-1 （PD-1） 阻断和 NKG2A 阻断的组合证明了重新激活 CD8 T 细胞效应器功能的增强能力。 https://jitc.bmj.com/content/12/1/e008368 研究背景 01 肾细胞癌（RCC）是泌尿系统三大恶性肿瘤之一。2020年，全球新发肾细胞癌病例超过40万例，其中透明细胞肾细胞癌（ccRCC）约占75%，是最常见的病理类型。与非转移性局限性 ccRCC 患者的 5 年生存概率较高（超过 80%）相比，其他 20%-50% 的转移性肾细胞癌 （mRCC） 患者的生存率会大大降低，大多数仅在手术后 3 年内发生。 在过去十年中，免疫疗法彻底改变了mRCC的治疗。与单独使用酪氨酸激酶抑制剂（TKI）相比，III期试验的最新结果表明，基于免疫检查点阻断（ICB）加TKI的联合治疗显着改善了mRCC患者的预后。因此， 亟需探索mRCC患者新的治疗方法。 有趣的是，与其他肿瘤不同，CD8 T 细胞的强烈浸润与 ccRCC 的较差预后相关，这可能是由于不同 CD8 T 细胞亚型的功能细分。我们小组之前还发现， 在ccRCC中，TNFRSF9CD8 T细胞同时具有耗竭和效应表型，CXCL13CD8 T细胞具有抗肿瘤功能受损的耗竭表型。 NKG2A 是 C 型凝集素家族成员，可在细胞表面与 CD94 形成二聚体。与程序性细胞死亡蛋白-1/程序性细胞死亡配体 1 （PD-1/PD-L1） 通路不同，NKG2A 独立于 T 细胞受体 （TCR） 起作用。非经典的主要组织相容性复合物-I 分子人白细胞抗原-E （HLA-E） 是 NKG2A-CD94 的主要配体。在实体瘤中，ccRCC代表了HLA-E表达的最高水平。据报道，NKG2A 主要在 CD8αβ T 细胞、CD56hi 自然杀伤 （NK） 细胞和自然杀伤 T （NKT） 细胞中表达。NKG2A-CD94与HLA-E结合可抑制T细胞和NK细胞的活化。先前的研究表明，NKG2A拮抗作用主要通过NKG2ACD8 T细胞而不是NKG2A NK细胞在肿瘤疫苗治疗耐药个体中发挥作用。然而， NKG2ACD8 T细胞在肿瘤微环境（TME）中的作用以及靶向NKG2A在ccRCC中的治疗效果仍然未知。 研究进展 02 由于 NKG2A CD8 T 细胞的较高浸润与对免疫治疗的反应较差有关，因此我们通过使用新鲜 ccRCC 组织的体外干预模型进一步探索了这些患者的潜在治疗方法。干预分为4组，即对照组、PD-1单克隆抗体（nivolumab）治疗组、NKG2A单克隆抗体（mAb）治疗组和联合治疗组（图 5A）。在纳武利尤单抗体外干预后，CD8 T细胞上NKG2A表达较低的患者在CD8 T细胞中表现出IFN-γ和GZMB的显著上调（图5B-D），证实了NKG2A CD8 T细胞浸润较高的患者对免疫治疗的反应较差。此外，在纳武利尤单抗干预后，CD8 T细胞显示NKG2A的表达增加（图5E;p=0.047）， 这表明基于抗NKG2A和抗PD-1的联合治疗可能增加PD-1阻断单药治疗的潜在价值。 NKG2A 阻断与抗 PD-1 疗法协同作用，重振 CD8 T 细胞的细胞毒性 随后，我们对不同干预方案下CD8 T细胞内的动态功能改变进行了全面评估。值得注意的是，接受抗NKG2A治疗以及NKG2A和PD-1联合抑制组均表现出CD8 T细胞脱颗粒功能（CD107a）的显著增强（图5F;p=0.047和p=0.013），而接受纳武利尤单抗治疗的组未能表现出这种改善（图5F;p=0.241）。抗NKG2A和抗PD-1治疗的组合增强了CD8 T细胞的细胞毒性，仅在组合治疗组中观察到IFN-γ分泌显著增加（图5G;p=0.017），并且优于抗NKG2A单药治疗组（图5G;p=0.011）。此外，值得注意的是，组合疗法可以显著提高CD8 T细胞内GZMB的表达（图5H;p = 0.007）。但TCF-7的表达没有差异（图 5I）。总体而言，这些发现表明， 抗 PD-1 和抗 NKG2A 的联合治疗可增强 CD8 T 细胞效应功能，这可能使抗 PD-1/PD-L1 免疫治疗耐药的患者受益。 研究结论 03 本研究表明， 在ccRCC中，NKG2ACD8 T细胞与不良预后和对免疫治疗的反应有关。NKG2ACD8 T 细胞表现出耗竭的表型，并且与炎症但免疫抑制的微环境有关，并伴有富集的调节性 CD4 T 细胞 （Tregs） 浸润。NKG2A 阻断和当前免疫疗法的协同相互作用表现出重新激活 ccRCC 中 CD8 T 细胞效应功能的强大能力。 总之，抗程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）和抗NKG2A的联合治疗可增强CD8 T细胞效应功能，这可能成为克服ccRCC当前免疫治疗耐药性的有效方法。 参考资料： https://jitc.bmj.com/content/12/1/e008368 注：本文旨在介绍医学研究进展，不能作为治疗方案参考。如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门·直播/活动 🕓 上海｜3月01日-02日 ▶第三届长三角单细胞组学技术应用论坛暨空间组学前沿论坛将在上海召开，诚邀您的参与！ 点击对应文字 查看详情

点击图片查看OTC2023类器官前沿应用与3D培养论坛会后报告，OTC2024论坛征集投稿做报告，详询：王晨 180 1628 8769关键词3D类器官，类器官血管化，肿瘤和免疫环境的相互作用，类器官系统构建，疾病模型，新药筛选，药物毒理，干细胞与再生医学提到类器官，许多研究人员脑海中浮现的关键词便是：前沿、高级、好发文章等。作为当下最为火热的研究方向之一，类器官为广大研究人员在体外真实模拟体内器官发育、疾病机制研究、靶点药物开发提供了便利。其具有的诸多优点已经被各类文章相继报道。尽管近10年来类器官研究如火如荼，各种类器官相继被开发出来。但是，缺乏血管化结构、缺乏免疫细胞、器官系统化程度低等问题限制了类器官研究的进一步发展。今天，我们就从最新的研究文献入手，逐步破局类器官研究的“三大挑战”。血管化在所有的类器官研究中，脑类器官应该是最为特殊的，不仅因为其临床样本的珍贵性，还得益于其重要的临床价值。然而，长久以来，脑类器官的发展并不顺利，这其中最主要的障碍在于脑类器官系统缺乏体内脑组织的微环境、神经元回路、血管和免疫系统。尤其是血管，其对于脑组织的营养供应和神经细胞分化都发挥着促进作用。血管的缺乏导致脑类器官中心坏死，进一步干扰其正常发育和神经元迁移路线。尽管与血管干细胞的共培养为上述问题提供了一定解决方案，但营养供应和真实血液微环境的问题仍然存在。2019年，来自耶鲁大学的研究团队在国际顶刊Nature Methods在线发表了题为《Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system》的研究性论文。文中使用表达人类 ETS 变体 2 ( ETV2 )的人类胚胎干细胞 (hESCs)成功构建了具有血管样结构的脑皮质类器官(hCOs)，该类器官具有类血脑屏障结构，包括紧密连接、营养转运蛋白和跨内皮电阻的表达增加，填补了脑类器官缺失血管的问题，丰富了脑类器官的研究应用。ETV2转录因子是机体发育时期内皮细胞分化的关键基因。在这项研究中， 研究人员使用含有赛默飞Gibco B-27添加剂的培养基中，添加ETV2诱导产生了脑皮质类器官 (hCOs)，并通过改变了ETV2的比例（5%、10% 和 20%）和诱导时间，确定了在 hCOs 中形成血管样结构的最佳条件：20% ETV2，18天诱导。通过免疫荧光，研究人员在该条件下可以显著观察到hCOs高表达的EC 标记CDH5、CD31、KDR、TEK、vWF和CD34。同时研究人员将具有血管样结构的 hCOs 命名为 vhCO。    Fig.1 Characterization of vasculature-like structures in vhCOs.为了评估vhCO的血管样结构是否具有相应的功能，研究人员又分别在30、70 和 120 天评估了心室 (VZ) 样区、心室下 (SVZ) 样区和皮质层的分化情况。免疫荧光结果显示hCOs 和 vhCOs 在管腔周围都表现出高表达 SOX2的VZ 和 TBR1的SVZ。这些结果表明 hCOs 和 vhCOs 分化程度相似，都具有大脑皮层结构的区域和形态特征。同时，使用CD31分子的整体免疫荧光染色，研究人员对内皮和血管样网络的组织也进行了评估。结果发现在30天时，vhCOs具有血管样结构，而hCOs则没有。在70天时， vhCOs中形成更加复杂的血管样结构网络。这些结果表明了ETV2可以成功诱导的血管样结构类器官的产生。Fig.2 vhCOs demonstrate BBB characteristics.结构和功能是相辅相成的两个有机组成。在分析了vhCOs中血管样结构的形成后，研究人员又对其功能进行了评估。首先通过灌注FITC-葡聚糖，研究人员确定了vhCOs中血管具有可灌注的功能。其次，通过对hCOs 和 vhCOs生长情况的对比，研究人员发现vhCOs中血管具有运送氧气的功能。最后，通过对分化神经元的分析，研究人员确定了表明 vhCOs中的血管样结构对于神经元成熟起着关键作用。Fig.3 Single-cell analysis of vhCOs.进一步地，通过单细胞测序，研究人证明了ETV2对 vhCO 中的血管 EC成熟和血管形态发生至关重要。同时，与发育中的人类大脑 (GW08-23) 的单细胞转录组谱进行比较后，研究人员证明了vhCOs 衍生的神经元类对应妊娠期16-19 周的神经元发育，进一步证明其向内皮谱系分化的潜力。总的来说，这项研究通过结合转录因子ETV2与脑类器官，首次构建了具有血管样网络结构及类血脑屏障结构的脑类器官，为解决脑类器官乃至其他类器官培养过程中缺失血管这一关键问题提供了对策，推动了类器官研究的发展。免疫化免疫治疗的兴起极大推动了肿瘤研究的发展，然而由于种属特异性、人源化体系的复杂性、免疫系统的部分或无效重组建等问题，致使免疫肿瘤模型面临着巨大的挑战，临床上迫切需要能够用于个体化验证疗效的体外模型。类器官的出现给肿瘤免疫治疗提供了新的契机，然而，现有的类器官中缺乏免疫细胞限制了其发展。一项发表于顶刊Cell题为《Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids》的研究性论文为这个问题的解决提供了新的策略。Fig.4 Co-culture of epithelial tumor organoids and peripheral blood lymphocytes在这项研究中，研究人员通过来自患者的自体肿瘤类器官和外周血淋巴细胞共培养建立一个能够特异性诱导分析肿瘤免疫反应的平台，为分离评估肿瘤免疫中T细胞提供了新的方法。Fig.5 Characterization of a Panel of dMMR CRC Organoids首先，研究人员从13 名错配修复基因缺陷型(dMMR)结直肠癌患者（dMMR CRC）体内分离15 个肿瘤类器官，成功率为60%，并使用含有赛默飞Gibco B-27添加剂的培养基按照1:2 至 1:5进行传代培养。随后，研究人员对着15个肿瘤类器官的特点进行了分析。通过全外显子组测序 (WES)、免疫组织化学染色分析发现MHC-1类分子的缺失不是类器官的一般特征。Fig.6 Induction of Tumor Reactivity in Circulating T Cells by Co-culture with Autologous Tumor Organoids进一步地，为了评估该肿瘤类器官是否可用于获得肿瘤特异性 T 细胞。研究人员构建了“肿瘤类器官-外周血淋巴细胞”共培养模型。其中，外周血单个核细胞(PBMC) 从 dMMR CRC 患者中分离出来，并每周使用自体肿瘤类器官刺激。通过对CD8+ T 细胞效应分子 IFNγ 和CD107a进行染色分析，在共培养 2 周后评估CD8 + T 细胞对肿瘤的识别情况。结果表明在 8个MHC-1 阳性肿瘤类器官中，有 4 个（50%）在共培养 2 周后，IFNγ 和CD107a发生了上调。而在MHC I 类缺陷类器官中没有发生上调，并且与类器官刺激前相比，CD8+ T 细胞群增加了10倍。这些结果表明了该系统可以用于产生评估肿瘤特异性 T细胞亚群。Fig.7 Induction of Tumor Reactivity in Circulating T Cells from Patients with NSCLC进一步地，研究人员又使用非小细胞肺癌对该系统的广谱性进行了分析。通过前述类似的方法，研究人员在培养两周后也观察到了CD8+ T 细胞群进行了扩大。综上，这些结果表明：通过肿瘤类器官与免疫细胞共培养可以有效诱导肿瘤特异性T细胞的产生。这一研究也极大拓展了类器官在肿瘤免疫中的应用，为解决类器官免疫细胞缺失问题提供了新的策略。系统化许多疾病的发生都是多器官系统共同作用完成的，而传统的单个类器官虽然能够较为真实的模拟体内单个器官的环境，但是对于多系统发生的疾病，仍然存在一定的缺陷。因此，构建多系统协同作用的类器官就成为解决这个问题的一个研究方向。2021年11月，一项发表于著名期刊ADVANCED SCIENCE的研究《Microengineered Multi-Organoid System from hiPSCs to Recapitulate Human Liver-Islet Axis in Normal and Type 2 Diabetes》中，就通过构建肝脏和胰岛类器官共培养构建了2型糖尿病（T2DM）疾病模型，这种多类器官系统可以在生理和病理条件下体外模拟肝胰岛轴，为今后 T2DM 发病机制研究和药物开发提供了独特的研究平台。Fig.8 Schematic of hiPSCs derived multi-organoid-on-chip system to model human liver-pancreatic islet axis in vitro.2型糖尿病（T2DM）的发病率逐年攀升，并且治疗费用昂贵，极大加重了社会的疾病负担。T2DM 的特点是高血糖和胰岛素抵抗，通常伴有胰腺β细胞功能障碍和肝脏中的胰岛素抵抗。肝脏和胰岛在维持血糖正常方面表现出双重功能，两者的功能紊乱导致了T2DM的发生。目前研究葡萄糖代谢和 T2DM依赖于动物模型，或使用原代动物肝细胞和胰岛β细胞或其细胞系的混合物。但是，这些模型不能准确模拟人类生理功能和代谢反应，尤其各个不同器官间的相互作用。类器官的出现给解决上述问题带来了转机。在这项研究中，研究人员开发了一种微流控多类器官系统，用于研究人类肝胰岛轴在正常和疾病环境中的胰岛素和葡萄糖调节。为了模拟体内肝脏和胰岛之间的葡萄糖调节，研究人员构建了一套微流控控制的多类器官系统，包括类器官共培养芯片、蠕动泵和灌注装置。微流控芯片由平行微通道网络连接的两个隔室组成。每个隔室都包含一系列微孔，以维持肝脏和胰岛类器官的 3D 培养。相互连接的微通道促进了两种类器官之间的介质交换和分泌代谢产物，由此实现了肝脏和胰岛类器官的共培养。其中，肝脏和胰岛类器官是通过微孔阵列中 hiPSCs 的产生的，并使用含有赛默飞Gibco B-27添加剂的培养基进行培养，最终在微孔中形成了具有均匀尺寸和形态（直径 200 µm）的拟胚体 (EB)。此外，通过向培养基中添加特定的生长因子和小分子，EB 分化为内胚层细胞，并分别在第 20 天和第 23 天分化为肝脏或胰腺谱系。随后，将肝脏和胰岛类器官转移到芯片装置中进行长期共培养。Fig.9 Identification of organ-specific protein and gene expressions in liver and islet organoids prior to co-culture assay.在共培养系统构建完成后，研究人员在第 0、5、11、20 和 23 天分别观察肝脏和胰岛类器官的形态和大小分布。结果表明在培养诱导分化过程中，肝脏和胰岛类器官的平均大小逐渐增加，形态保持良好。此外，通过活流式细胞术检测细胞活力后发现99.03%的肝脏类器官和96.11%的胰岛类器官细胞保持了良好的细胞活力。为了进一步验证该共培养类器官的功能，研究人员在第 20 天使用免疫荧光和实时聚合酶链反应 (RT-PCR) 鉴定了肝脏特异性细胞类型和蛋白质分泌。结果表明，hiPSC 诱导分化的肝类器官具有代谢药物的能力并含有天然肝脏的关键细胞成分。同样，通过免疫组织化学分析和 RT-PCR 证实了 hiPSC 诱导分化的胰岛类器官是含有四种类型 ECs 的典型多细胞组织。Fig.10 Comparison of cell viability and functionality of liver and islet organoids under mono- and co-culture conditions.同时，研究人员又对该共培养类器官系统进行了长达30天的功能研究。与单独的类器官培养相比，共培养系统中类器官在长期培养过程中表现出了更高的细胞活力，并显著提高了胰岛类器官的存活率和胰岛素分泌功能。综上，这项研究构建的多类器官芯片系统为研究多器官疾病发生提供了新的研究策略，并填补了单个类器官无法模拟多系统相互作用的空白。同时，这项研究也让我们看到了结合不同的技术手段丰富类器官培养的可能发展方向。总结总的来说，对于火热了10年的类器官研究来说，其存在的“血管化、免疫化、系统化”三大问题近年来已有不同研究团队提出了不同的解决方案。虽然这些研究方案尚不圆满，但是让我们看到类器官研究上的更多可能。尽管类器官研究仍有诸多问题需要解决，但是全球范围内不断的学术突破也让我们看到这些问题终将被一步步解决。而无论采用什么样的解决方案，研究人员都需要高质量的试剂支持。道阻且长，行则将至！文章来源：生物谷点击图片查看OTC2023类器官前沿应用与3D培养论坛会后报告，OTC2024论坛征集投稿做报告，详询：王晨 180 1628 8769