抗体偶联药物质量研究与评价技术

2024-06-29

点击上方的行舟Drug ▲ 添加关注抗体偶联药物(Antibody-Drug Conjugate，ADC)是由靶向特异性抗原的抗体或抗体片段与有效载荷(payload)通过连接子(linker)偶联而成的一类创新型抗体药物。与传统抗体药物相比，ADC产品兼具传统小分子药物强效作用及抗体药物的靶向性，以降低全身毒性并更有选择性地将有效载荷递送至肿瘤细胞、肿瘤微环境或其他靶细胞中，近年来，随着抗体、有效载荷、连接子、偶联技术和分析技术等的快速发展，使 ADC 产品具有更高的均一性、稳定性和治疗指数，极大地促进了 ADC产品的开发热潮。图1.上市ADC药物及未来设计发展方向1 考虑到 ADC 产品的复杂性和特殊性，为了规范和指导ADC 产品的研发，CDE制定了《抗体偶联药物药学研究与评价技术指导原则》。原则基于当前的科学认知，主要针对 ADC 产品申报上市阶段的药学研究提出建议性技术要求，旨在为研发单位提供技术指导。 1. ADC产品的质量研究质量研究需选择代表性批次(如非临床研究批次、临床研究批次和/或商业化工艺批次等)和/或适当生产阶段的样品作为研究对象，采用先进的分析方法进行研究，研究项目需全面、充分，尽可能涵盖所有可能与产品安全性、有效性相关的项目。分析方法还应关注样品的处理和分析过程，避免样品预处理等分析过程对检测结果产生影响，导致分析结果无法代表样品的实际质量。 ADC 产品质量研究包括小分子部分、裸抗部分和ADC原液/制剂部分，原液和制剂之间若存在质量特性的差异，应分别取样进行研究。图2. ADC药物典型结构2 1.1 小分子部分小分子的质量研究可参考化学药物相关指导原则开展如《化学药物原料药制备和结构确证研究技术指导原则》《化学药物杂质研究技术指导原则》、《化学药物残留溶剂研究技术指导原则》、《化学药物质量标准建立的规范化过程技术指导原则》、《手性药物质量控制研究技术指导原则》以及 ICH等相关指导原则。除常规的杂质分析外，还应结合杂质的结构等研究分析对后续工艺和终产品质量的影响。基于杂质的类型、结构等特点，结合去向(杂质是否参与偶联反应)研究和清除(杂质是否通过后续工艺被去除)研究等综合评估风险制定合理的杂质控制策略。由于在偶联反应完成后，可偶联杂质极难量化且难以去除，需重点关注可偶联杂质的风险，应制定严格的控制标准，并提供合理的依据。不可偶联杂质可根据后续工艺清除能力等建立合理的控制策略提供充足的研究数据。 1.2 裸抗部分裸抗质量研究可参考《中国药典》及相关指导原则:如《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》、ICH 等。原则上，裸抗的质量研究要求和抗体药物的要求基本一致，此外，还需对可能影响偶联工艺的质量属性，如抗体的氧化水平等，进行充分的研究和适当的控制。对于通过基因工程技术在抗体特定位点引入半胱氨酸或包含活性反应基团的非天然氨基酸进行抗体修饰的，需对修饰位点进行确证。虽然抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity，ADCC)、补体依赖的细胞毒性作用(Complement Dependent Cytotoxicity，CDC)或抗体依赖的细胞吞噬作用(Antibody Dependent Cellular Phagocytosis，ADCP)一般不是 ADC产品的主要作用机理但可能也有一定的作用效力，应基于抗体的类型、结构改造等开展Fc功能研究，若对终产品的安全性或有效性产生影响，则应进行适当的控制。 1.3 ADC原液/制剂 ADC 产品综合了抗体药物的靶向性和小分子药物的强效作用(如细胞毒性等)的优势，但二者的偶联也改变了彼此的物理化学特性，可能会引起药物分子结构、电荷等变化。因此，ADC 产品除了需要关注大分子蛋白的质量属性和小分子相关的质量属性外，还需要增加偶联引起的关键质量属性，如 DAR、载药分布、偶联位点(包括非目标偶联位点)、未偶联的裸抗、游离小分子及其衍生物(如降解产物和/或与淬灭剂的反应产物)、异质性等的研究和控制。应采用适宜的、先进的分析技术，从结构确证、理化性质、生物学活性和杂质研究等角度进行全面的表征，并结合对裸抗的特性分析充分了解偶联前后的相关特性变化(如高级结构、翻译后修饰、分子大小变异体、电荷变异体、抗原结合活性、Fc 功能活性等)，提供尽可能详尽的信息以反映终产品的质量属性。质量研究应至少包括以下范畴： (1) 结构确证与理化特性结构确证研究应结合 ADC产品的结构特点，采用适宜的分析方法对一级结构、二级结构、高级结构、偶联位点及各位点偶联比例等进行表征。此外，开展ADC结构确证时需结合偶联反应的机理，采用适宜的分析方法，如肽图谱法和质谱分析法等，评估偶联工艺对裸抗的结构(如氨基酸序列覆盖率完整性、二硫键连接、热稳定性等)、糖基化修饰和其他翻译后修饰等的影响，尤其需关注包括互补决定区在内的影响产品功能的关键位点。鉴于 ADC 分子结构的复杂性，基于产品特点可采用酶解、还原等方式结合液质联用或串联质谱法(LC-MS/MS)技术分步骤、分段降低 ADC 分子结构的复杂性，以提高分析方法的分辨率和结果的可靠性。对于修饰发生在半胱氨酸残基上或工艺过程中使用了还原剂的产品，还应考虑二硫键、三硫键、游离巯基和巯基氧化等情况。抗体通常具有复杂的异质性(如电荷变异体、分子大小变异体、糖基化和其他翻译后修饰等)，裸抗本身的异质性及偶联造成的异质性的看加会导致 ADC的复杂程度大幅增加。对于具有高度异质性的 ADC产品(即使是利用定点偶联技术的产品)，需采用具有足够分辨率的可靠分析方法进行全面表征，以阐明产品相关物质的多样性。研究中需根据有效载荷和连接子的化学性质、偶联方式以及产品的异质性等选择合适的特性分析方法。 ■ a.一级结构和药物偶联位点采用适当的分析方法，如肽图谱法和质谱分析法，评估偶联工艺对抗体一级结构、糖基化修饰和其他翻译后修饰等的影响。偶联位点可能影响 PK/PD 和分子稳定性，可通过酶解后采用 LC-MS\MS 法对偶联位点进行鉴定和分析。 ■ b.高级结构高级结构是抗体类药物结构稳定、发挥作用的基础高级结构表征方法一般包括圆二色谱(CD)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、荧光光谱、差示扫描量热法(DSC)分析型超速离心(AUC)等。相对于常规抗体，ADC的高级结构分析可能会因为偶联了化学药物而变得更加复杂。如偶联的有效载荷可能产生红外、紫外或荧光响应，则可能影响结果分析。偶联前后的高级结构若存在差异，在利用生物物理手段对比结构差异的同时，需重点关注差异对生物学活性的影响。 ■ c.DAR值 DAR 值表示每个抗体分子上偶联的有效载荷的平均数量，直接与产品的有效性和安全性相关，是 ADC产品的关键质量属性。根据连接子和有效载荷的化学性质、偶联方式以及 DAR 异质性高低选择适宜的分析手段，常用的方法包括紫外-可见分光光度法(UV)、疏水高效液相色谱法(HIC-HPLC)、反相高效液相色谱法(RP-HPLC)、LC-MS等。其中，小分子的疏水性和吸光度贡献可能会干扰 DAR值的测定，在结果分析时应考虑。对于双载荷 ADC产品，除了总的 DAR 值以外，还应对两种载荷的 DAR 值进行表征。 ■ d.药物载量分布 ADC产品，尤其是采用非定点偶联方式的 ADC产品，通常是包含了不同位点偶联和连接不同数量有效载荷的ADC 分子混合物。药物载药量分布表示偶联有不同数量的有效载荷的 ADC 分子分别占总的药物分子的比例。应采用适当方法，如 HIC-HPLC、RP-HPLC、毛细管电泳(CE)或 LC-MS等，鉴定不同载药量组分的分布。 ■ e.分子大小变异体分子大小变异体直接影响产品的有效性和安全性，与抗体药物相比，由于偶联了小分子可能引起 ADC 药物疏水性增加、表面电荷分布改变以及热稳定性降低，导致ADC产品有更强的聚集倾向。应采用适宜的方法，如分子排阻色谱法(SEC-HPLC)、十二烷基磺酸钠-毛细管电泳(CE-SDS)、分子排阻-多角度静态光散射(SEC-MALS) 、AUC、动态光散射(DLS)、粒子测量和 LC-MS 等多种方法对 ADC 的分子大小变异体进行研究。目前SEC-HPLC 和CE-SDS 是比较常用的放行检测方法。SEC对聚集体分辨率较好，而 CE-SDS 法对片段分辨率较好，两种方法有一定的互补性。可基于产品结构特点等采用多种分析方法对分子大小变异体进行充分表征。 ■ f.电荷变异体常规抗体药物通常采用毛细管区带电泳(CZE)、离子交换色谱(IEX-HPLC)、毛细管等电聚焦电泳(CIEF)或全柱成像毛细管等电聚焦电泳(iCIEF)等方法研究电荷变异体。对于 ADC 产品，电荷变异体分析方法的开发需要结合产品特性，如小分子的特性(尤其是电荷)以及偶联位点的选择(如赖氨酸、链间巯基、半胱氨酸等)等，考虑小分子可能与分离介质产生非特异性的相互作用等情况选择适宜的一种或多种方法进行分析。此外，偶联过程可能会消耗裸抗上的电荷(如赖氨酸偶联)或有效载荷-连接子引入电荷基团，部分小分子存在结构特殊性(如疏水性强、不同结构间动态转化等)，导致单一的分析方法可能无法全面地反映电荷异质性。应在充分理解分析方法深层原理的基础上，科学解读分析结果，必要时可采用其他分析方法进行补充分析，如采用肽图谱法分析样品不同的离子交换收集组分，间接评估偶联对抗体本身电荷异质性的影响等。对于双载荷的 ADC产品，电荷异质性的复杂程度和检测难度可能更高，可采用iCIEF或其他分析方法监测电荷异质性的批间一致性。 (2) 生物学活性生物学活性是反映产品质量和临床有效性的重要指标可基于产品特点和作用机制等，建立可反映体内药效机制的生物学活性分析方法，用于产品的功能活性研究。ADC产品的主要作用机制是通过裸抗与靶抗原结合，在靶细胞内或细胞外释放有效载荷并发挥其生物学活性功能。应采用适当的分析方法(如ELISA、表面等离子体共振法或生物层干涉法等)评估与目标抗原的结合活性。选择合适的表达目标抗原的细胞株开发基于细胞的生物学活性方法。生物学活性应能体现ADC的特异性杀伤活性。若Fc介导的效应子功能(ADCC,CDC,ADCP 等)可能影响药物的有效性，或表现出效应子结合功能相关的非特异性毒性，则应进行相应的生物学活性评估。 (3) 杂质分析 ■ a.产品相关杂质产品相关杂质是指生产或储存过程中产生的非预期产物。ADC 产品潜在的产品相关杂质一般包括聚集体、片段、二硫键错配变异体(如适用)、未偶联裸抗、杂质偶联ADC(如适用)、游离小分子及其衍生物(来源可能是工艺添加或降解产物)、副反应产物等。为控制产品质量，建议采用适宜的方法对各类产品相关杂质进行分离和/或鉴定，参考 ICH O6B 的理念评估其安全性风险，根据评估结果综合考虑杂质的控制策略。未偶联裸抗与 ADC 终产品竞争靶细胞结合并最终减少输送到靶细胞的药物量，可能直接影响产品的有效性，且未偶联裸抗含量的变化可能会导致疗效发生变化。在放行检测和稳定性研究中，应依据偶联的有效载荷的性质(如电荷、疏水性)选择合适的分析方法对未偶联裸抗的百分含量进行监测。 ■ b.工艺相关杂质工艺相关杂质是指生产过程中引入的杂质，应结合生产用原材料、生产工艺等鉴定潜在的工艺相关杂质并根据情况进行定性和/或定量研究，评估杂质残留的安全性风险必要时将具有潜在安全性风险的杂质残留纳入质量标准进行控制。可能包括有机溶剂、生物酶(如适用)、元素杂质、偶联试剂、亚硝胺(如适用)等。 ■ c.污染物污染物系指生产过程中引入的颗粒物、微生物或其相关组分(如细菌内毒素等)。生产过程中需采取措施避免引入污染物并对其进行相应的控制，同时在原液和制剂的放行检测和稳定性研究中对必要的指标进行相应的监测。 (4) 含量采用适宜的物理、化学或免疫学方法测定含量。如采用分光光度法在 280 nm 处测定，还应考察小分子、缓冲液组分等对 280 mm 处吸光度测量值的潜在贡献，如发现明显干扰，在供试品浓度计算中应纳入适当的校正因子或引入其他定量方法。 (5) 其他特性其他特性分析需结合产品类型及剂型进行控制，可能包括性状、可见异物、异常毒性(如适用)、不溶性微粒、pH 值、渗透压摩尔浓度、装量、复溶时间(如适用)、水分(如适用)、辅料含量等。参考文献： 1. Metrangolo V, Engelholm L H. Antibody–Drug Conjugates: The Dynamic Evolution from Conventional to Next-Generation Constructs[J]. Cancers, 2024, 16(2): 447. 2. Fu Z, Li S, Han S, et al. Antibody drug conjugate: the “biological missile” for targeted cancer therapy[J]. Signal transduction and targeted therapy, 2022, 7(1): 93. 3. 《抗体偶联药物药学研究与评价技术指导原则》文章信息源于公众号抗体圈，登载该文章目的为更广泛的传递行业信息，不代表赞同其观点或对其真实性负责。文章版权归原作者及原出处所有，文章内容仅供参考。本网拥有对此声明的最终解释权，若无意侵犯版权，请联系小编删除。学如逆水行舟，不进则退；心似平原走马，易放难收。行舟Drug 每日更新欢迎订阅+ 医药大数据|行业动态|政策解读