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干货 | 翌圣镁孚泰突破性成果:低
dsRNA
T7 RNA聚合酶突变体,助力mRNA疗法研究!
2024-03-13
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生物制品圈
信使RNA
疫苗
基因疗法
核酸药物
随着生物技术的飞速发展,mRNA疗法作为一种新兴的治疗手段,因其可编程性强、响应速度快等优势备受关注。在mRNA疫苗和基因治疗等领域中,高效合成高质量的mRNA是实现疗法目标的关键步骤。而在这一过程中,T7 RNA聚合酶扮演着至关重要的角色,它能够高效地催化体外合成mRNA的过程。尽管T7 RNA聚合酶在mRNA合成中发挥着重要作用,但实际操作中经常会产生双链RNA(
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)这一副产物。
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的存在不仅降低了mRNA的产量和纯度,还可能激发非特异性免疫反应,影响疗效和安全性。因此,减少
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的产生成为了行业的一个迫切需求。目前,降低
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的方法主要包括优化反应条件和使用辅助酶等。这些方法虽然可以在一定程度上减少
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的产生,但往往伴随着操作复杂、成本提高等问题。与之相比,通过直接改造T7 RNA聚合酶来降低
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的产生则是一种更为根本的解决方案。酶定向改造技术可以通过精确改变酶的氨基酸序列或结构,从而改善其催化特性,提高产物的纯度和产率。对于T7 RNA聚合酶而言,针对性的改造不仅可以减少
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的产生,还能提升合成mRNA的整体效率和质量。翌圣镁孚泰生物突破性成果镁孚泰生物,作为mRNA体外合成原料供应商
翌圣生物
(点击了解更多)的子公司,利用其ZymeEditor定向进化平台的能力,持续在进化mRNA体外合成的核心酶原料——T7 RNA聚合酶。为了尽可能消除体外转录过程产生的
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等副产物,镁孚泰生物进化团队通过理性设计与定向筛选结合的方式对T7 RNA聚合酶进行改造。根据文献报导,副产物
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的产生主要包括两种来源(图1):第一种是转录早期T7 RNA聚合酶由起始构象转变为延伸构象时,转录三元复合物极易解离[1],伴随着大量长度在20 nt左右的短RNA链(即Abortive RNA)释放至体系中,这部分RNA即扮演“引物“的角色与长RNA链互补配对,并在T7 RNA聚合酶的RNA依赖的RNA聚合活性(RDRP活性)作用下延伸产生
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[2,3];第二种则由T7 RNA聚合酶具备的末端核糖核苷转移活性而引发,当转录反应进行到线性模板末端时,T7 RNA聚合酶会在不依赖模板的情况下随机增加若干个核糖核苷酸,这些核苷酸组成的“随机引物”即有可能反向折叠与目标mRNA区域发生互补配对进而延伸产生
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,通过回环产生的
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称为loopback
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[3,4]。因此,为了减少
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副产物,T7 RNA聚合酶改造的重点在于稳定早期转录三元复合物,或减弱T7 RNA聚合酶的末端转移活性和RDRP活性。图1. 能垒示意图及
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形成原理在进行T7 RNA 聚合酶改造过程中,镁孚泰生物一方面通过结构及自由能分析,发现在T7 RNA聚合酶构象变化的同时也伴随着能量的变化,且延伸构象的自由能显著高于起始构象,意味着转录过程需要越过较高的能垒才能产生完整的mRNA链。高能垒不利于构象平稳转变,为此,团队借助虚拟筛选手段锁定了20余个热点氨基酸,并构建了相应的定点饱和文库。另一方面,考虑到关于T7 RNA聚合酶的末端转移及
RDRP
活性相关的功能、位点及结构域的报导较少,且由于功能相近这两种活性极可能与T7 RNA聚合酶主反应的转录活性(即DNA依赖的RNA聚合活性,DDRP)共享关键位点,难以找到热点氨基酸进行定点改造。因此,镁孚泰生物同时构建了基于易错PCR的数个随机突变文库,结合ZymeEditor平台的进化通量,单个文库的多样性超过106。为了兼顾T7 RNA聚合酶的产量并监测体外转录反应中
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的含量,镁孚泰生物参照优化后的转录模板,精心设计了多个分子信标(FRET RNA探针),分别靶向目标mRNA产物的不同区域,将反应物产量、完整度以及体系内
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含量等信息与荧光信号关联,体系的荧光强度越强,突变体的性能越有优势。理论上,该筛选方法可按不同探针的荧光强度排序,分别获得高产或Abortive RNA减少的T7 RNA聚合酶突变体,以及完整度提升或loopback
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降低的T7 RNA聚合酶突变体。将反应模板更换为RNA时还可负向筛选突变体的RDRP活性,提升T7 RNA聚合酶的模板选择能力。此外,在液滴反应体系中添加修饰核苷酸、帽类似物,以及提高反应温度还可以进一步筛选耐受非天然底物、热稳定性提升的T7 RNA聚合酶突变体。根据文库大小,镁孚泰生物分别开发了基于荧光激活液滴分选(FADS)的超高通量筛选流程(图2),以及基于传统孔板法(MTPS)的高通量筛选流程(图3)。经过多轮实验,合计筛选超过107个突变体,获得多个
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显著降低的突变体,其中RP051、RP059突变体反应中由Abortive RNA引起的
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降低,提示这些聚合酶突变体的延伸构象更稳定;RP057、RP078突变体反应中loopback
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含量降低,提示这些突变体的末端转移活性或RDRP活性被减弱。图2. FADS筛选流程【5】图3. MTPS筛选流程鉴于上述突变体的性能优势来源于不同机制,镁孚泰生物针对它们构建了DNA shuffling文库,筛选后最终获得了性能更优的组合突变体RP080-RP082(图4)。图4. 酶进化历程及突变体性能表征经过定量分析,如图5所示,在9 kb转录模板、共转录加帽条件下,使用天然核苷酸时,野生型T7 RNA聚合酶产物中
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约为2.9 ng/μg,A公司竞品约0.18 ng/μg。而镁孚泰生物改造的各T7 RNA 聚合酶突变体
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产量均<0.10 ng/μg,尤其突变体RP082的
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产量仅为0.015 ng/μg,相比于野生型提升近200倍,比竞品提升12倍。经过反复测试,突变体的降低
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的性能优势在不同反应条件下均能稳定复现,表明上述突变体具有较好的体系兼容性,也为后续反应体系优化以进一步降低
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产量奠定了基础。此外,FADS的筛选还获得了多个产物完整度、热稳定性提升的突变体,可满足更多的体外转录应用场景。图5. T7 RNA聚合酶突变体产物
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检测图客户试用满意度高 目前,已有多家合作伙伴对镁孚泰生物改造的T7 RNA聚合酶突变体进行了试用,得到客户的高度认可。他们表示,新酶的使用简化了mRNA的纯化过程,提高了工作效率,并在多个应用场景中展现出卓越的性能。目前我们还有少量试用名额,如您需要试用或者改造酶的其他性能,点击阅读原文在线填写需求表,或扫描下方二维码联系我们哦!参考文献:[1] Sousa R, Mukherjee S. T7 RNA polymerase[J]. Progress in nucleic acid research and molecular biology, 2003: 1-41.[2] Steitz T A. The structural changes of T7 RNA polymerase from transcription initiation to elongation[J]. Current opinion in structural biology, 2009, 19(6): 683-690.[3] Vallejo D, Nikoomanzar A, Paegel B M, et al. Fluorescence-activated droplet sorting for single-cell directed evolution[J]. ACS synthetic biology, 2019, 8(6): 1430-1440.[4] Gholamalipour Y, Karunanayake Mudiyanselage A, Martin C T. 3′ end additions by T7 RNA polymerase are RNA self-templated, distributive and diverse in character—RNA-Seq analyses[J]. Nucleic acids research, 2018, 46(18): 9253-9263.[5] Vallejo D, Nikoomanzar A, Paegel BM, Chaput JC. Fluorescence-Activated Droplet Sorting for Single-Cell Directed Evolution. ACS Synth Biol. 2019 Jun 21;8(6):1430-1440. ●干货 | 酶定向进化之基因型与表型的关联●干货 | 酶定向进化之突变体文库筛选技术大全●干货 | 蛋白生物传感器高通量筛选方法助力代谢酶的挖掘与进化!●干货 | 酶定向进化之突变体文库构建技术大全——— ✦ 镁孚泰生物 ✦ ———镁孚泰生物科技(上海)有限公司(镁孚泰生物,Molefuture)是
翌圣生物科技(上海)股份有限公司
旗下的全资子公司,是一家以酶进化技术为驱动、专注于提供酶改造定制化解决方案的创新型企业。依托于
翌圣生物
,镁孚泰生物现有六大技术平台:ZymeEditor创新酶进化平台、多宿主高效表达平台、发酵工艺开发平台、纯化工艺开发平台、超洁净酶生产平台以及酶分析与质控平台。基于这六大技术平台,镁孚泰生物可提供酶定向改造、新酶开发、酶工艺开发以及GMP级别规模化生产的全套定制解决方案,以满足酶在体外诊断、生物医药、合成生物、医疗美容、医药中间体等领域的应用需求。
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机构
翌圣生物科技(上海)股份有限公司
适应症
-
靶点
RdRp
药物
错位双链聚核苷酸(北京百林康源生物技术有限责任公司)
标准版
¥
16800
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