基因治疗生物生产的进展

2024-03-27

基因疗法

点击上方的行舟Drug ▲ 添加关注不同的rAAV生产平台带来不同的挑战，但无论使用哪种平台，rAAV的生产率与临床需求相比都相对较低。传统上，生物工艺改进是基于基因工程技术、克隆选择和生物工艺开发（例如培养基配方和工艺参数）。这些工作通常是劳动密集型且耗时的，因为它们遵循经验优化策略。尽管实验设计（DoE）方法确实对某些特定细胞系进行了工艺改进，但仍然缺乏关于为什么这些变化在分子或细胞生物学水平上发生的知识。此外，在生物工艺改进过程中对细胞施加的环境压力，例如选择压力、生长和生产条件的变化以及培养基适应，可能会导致细胞系发生各种不需要的修饰，例如染色体重排和其它表观遗传变化，从而导致表型变化。毫无疑问，考虑到在给定条件下可能发生多种修饰，评估和比较重组细胞系的基因组和表观遗传图谱的任务是复杂的。因此，为了提高rAAV生产率，同时减少杂质，应该考虑和应用更先进、更科学的技术，特别是在其它生物领域成功应用的技术。图 2 总结了改进 rAAV 生产的关键挑战和先进技术。为了解决1）瞬时转染过程中转染试剂引起的细胞毒性和2）将三种质粒引入细胞并进入细胞核进行基因表达而不保留在细胞质中的挑战，已经有文章对许多潜在的合成基因递送材料进行了全面的综述。针对质粒的核靶向，DNA 核靶向序列 (DTS) 和参与宿主细胞 DNA 核转运的辅因子也值得进一步研究。至于规模放大/生产生物工艺中复杂原材料的问题，多元数据分析将有助于解决这一挑战。多组学作为解决生产力和生物工艺可放大性问题的工具多组学技术作为一种先进技术，可以通过应用系统级方法来了解宿主细胞生理学的变化，并最终实现对细胞系和/或生物过程的完全控制，从而解决上述障碍。它是指基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学四个主要领域的收集和整合分析。通过定量和定性比较表现出不同生产特征的细胞系，可以鉴定相关基因和生物途径。新型生物标志物，例如差异表达的基因、蛋白质和代谢物，将提供对生产瓶颈的见解。获得这种见解将有助于解释细胞培养性能改善或退化背后的根本原因，并指导合理的修改，以实现所需的表型属性。利用组学技术成功解决其它治疗生物学领域的生产瓶颈，为我们的 rAAV 研究提供了有用的指导。图 3 总结了如何应用多组学研究来解决 rAAV 生产瓶颈。多组学数据集可用于表征宿主细胞生理学变化，了解宿主细胞在 rAAV 基因组复制、衣壳组装和衣壳化中的角色。合理的修改，无论是培养基配方还是细胞系工程策略，都可以用来改善 rAAV 生产生物过程。通过集成的多组学分析，生成的数据集可用于各种结果和应用，例如改进细胞 rAAV 生产、构建或改进现有 AAV 计算机模型、识别杂质并确定如何通过细胞培养减少杂质，以及发现在更高生产规模下提高细胞性能的方法。图3. 举例说明如何整合和分析多组学数据集以研究腺相关病毒 (AAV) 生产中宿主细胞的生理学变化，然后确定优化 AAV 生产生物工艺的合理修改（通过培养基配方或细胞系工程策略）。通过集成的多组学分析，生成的数据集可用于各种结果和应用，例如优化细胞 AAV 生产、构建或改进现有 AAV 计算机模型、识别杂质和如何通过细胞培养减少杂质，以及发现在更高生产规模下优化细胞性能的方法。基因组学研究通过将生物信息学应用于大量基因组数据来研究特定生物体的遗传特征。多项研究采用“组学分析”来表征细胞系（主要关注 HEK293）。迄今为止，HEK293 细胞和 HeLa 细胞的基因组信息，包括基因组序列，已发表。HEK293 细胞系及其衍生细胞的基因组信息可在线获取 (http://hek293genome.org/v2/)。结合 Frankish 等人发表的参考人类基因组注释。最近，这些资源将极大地促进人类相关细胞系未来的多组学开发。有关人类基因组注释的信息可以在网站（https://www.gencodegenes.org）上找到。转录组学利用基因表达分析来理解转录水平上的变化。先前的研究利用微阵列和 mRNA 测序 (RNA-seq) 分析来识别特定基因或基因簇表达，从而识别与不同过程相关的细胞通路的变化条件或克隆特征。先前已有文章综述了转录组学研究在提高重组蛋白生产力方面的应用。此外，Rodrigues等人进行的转录组学研究比较了两种生产重组逆转录病毒的人类细胞系的“亲本到生产细胞”，并揭示了生产细胞系中基因表达调控的全面概述。随后的靶向培养基添加实验基于重组逆转录病毒生产相关途径的识别和调节，使生产率提高了六倍。同样，为了解决 rAAV 生产力的限制，可以进行转录组学研究。最近，一项 RNA-seq 研究表明，瞬时转染介导的 rAAV 产生会引发强大的抗病毒和炎症反应。除了比较生产/非生产细胞状态之外，还可以使用转录组学进一步研究不同的细胞系、来自同一细胞系但具有不同生产力的克隆，以了解高生产力的细胞特征。根据转录组结果，可以提出培养基添加策略和细胞工程目标，然后进行验证，以实现所需的生产力或质量属性。根据 Scarrott 等人的研究，在生产过程中添加小分子化学添加剂作为培养基添加策略，可以将 HEK293 细胞中的 rAAV 生产力提高多达三倍。此外，一些已发表的资源将对转录组学研究非常有帮助，其中包括人类转录组数据库以及HEK293细胞和HeLa细胞的转录组数据。蛋白质组学揭示了整个蛋白质组中蛋白质表达所涉及的潜在细胞机制。蛋白质组已广泛用于研究产生单克隆抗体 (mAb) 的 CHO 细胞系，目前该细胞系已根据早期蛋白质组研究进行了工程设计和优化，以提高生产率。Lavado 等人的一项研究比较了生产病毒样颗粒（VLP）的转染和未转染 HEK293 细胞的蛋白质组图谱。结果表明，转染效率降低是由转染后细胞稳态的整体破坏和脂质生物合成的下调引起的。为了减少转染效应，他们过表达了运输 Nedd4L 和 CIT 等辅助蛋白所需的内体分选复合物，并将 VLP 产量提高了 3.3 倍和 2.9 倍。最近一项针对产生 AAV5 的 HEK293 细胞的宿主细胞蛋白质组的研究揭示了参与转染和病毒生产过程的重要调节蛋白，例如参与内吞作用和溶酶体降解的蛋白质，为理解潜在的细胞机制提供了宝贵的见解。此外，DNA 包装到衣壳中是 rAAV 生产过程中的另一个瓶颈，从细胞培养物中收获的少量病毒颗粒含有目的基因。除了 Rep52/40 蛋白和 ITR D 序列外，宿主细胞蛋白在基因组包装中也发挥着重要作用，因为在无细胞分析中重建基因组包装需要添加细胞裂解物。据报道，野生型 AAV 可以获得 95% 的完整衣壳，而粗收获中只有 5%–30% 的衣壳含有治疗成分。考虑到宿主细胞因子在衣壳化过程中的重要作用，蛋白质组学研究可通过比较野生型 AAV 和 rAAV 的产生来鉴定参与基因组包装的蛋白质。从蛋白质组学研究中获得的见解有助于提出新颖的控制策略，以克服 rAAV 生产过程中的生产力和包装效率挑战。有一些已发表的资源可以促进 rAAV 生产相关蛋白质组学研究。人类蛋白质组图谱是在过去十年中起草的，包括基于质谱数据的图谱。后来，还起草了人类蛋白质组的亚细胞图谱，极大地推进了蛋白质组网络的发展和理解。人类蛋白质组数据可以在这些网站上找到：http://www. humanproteomemap.org/ 和 https://www.uniprot.org。代谢组学使我们能够更直接地表征细胞内和细胞外代谢需求，并优化细胞代谢以获得所需的细胞表型。代谢优化主要可以通过两种方法实现：非靶向代谢组学和靶向代谢组学。非靶向方法旨在识别和半定量细胞培养特定时期的所有（可测量）代谢物。靶向方法更多地是假设驱动的，主要用于验证非靶向的结果。非靶向和靶向代谢组学，尤其是联合应用时，可为计算机代谢计算模型提供输入数据，例如代谢通量分析 (MFA) 和通量平衡分析 (FBA) 模型。这些生物信息学模型的解释以及途径富集和代谢网络分析指导生物过程的修改。HEK293 是用于重组蛋白生产和病毒载体生产的主要细胞系之一。这些治疗性生物制剂的生产引起细胞生理学和代谢状态的变化，因此对 HEK293 代谢的了解可以为工艺优化提供一般指导。关于 HEK293 代谢优化的全面综述可以在最近的综述论文中找到。然而，不同病毒/蛋白质类型的生产具有特定的代谢需求，并且需要特定的代谢优化。重组囊膜病毒生产中确定了几种代谢途径，包括氨基酸和碳水化合物分解代谢、脂质、核苷酸和谷胱甘肽代谢以及多胺生物合成。代谢组学研究后针对这些主要招募途径的培养基优化使 HEK293 细胞的生产力提高了六倍。对宿主细胞代谢和rAAV生物合成缺乏了解阻碍了产量的提高，因此可以通过进行全局非靶向代谢组学来鉴定与rAAV产量相关的代谢生物标志物。在比较多个细胞系时，多变量分析可用于识别与细胞系无关的代谢物。然后，通过通路富集分析和拓扑分析可以获得rAAV生产相关通路。其它生物领域也报道了类似的研究策略。此外，还有一些可用于代谢组学（以及其它综合“组学”）应用的有用数据库，例如京都基因和基因组百科全书（KEGG）（http://www.kegg.jp）、Reactome（http：//www.reactome.org）和人类代谢组数据库（HMDB）（http://www.hmdb.ca）。Pereira 等人描述了这些数据库的功能和解释。测序、核磁共振和质谱技术的进步使研究人员能够收集更准确、更具成本效益的高通量组学数据。大多数研究采用单一组学方法或最多两种组学方法。然而，单一的“组学”分析无法全面了解复杂生物系统中的细胞生理学。例如，转录物分析提供了组之间的基因表达变化，而代谢物分析则提供了表型变化的更直接表现。因此，对生物系统的全面理解需要将单一组学进一步扩展到基因治疗研究的多组学分析。其它生物制剂研究也进行了多组学研究。同样，多组学可用于了解 rAAV 生产的挑战和瓶颈，例如低生产率、规模放大以及建立稳定生产细胞等问题。Rep 和辅助病毒蛋白的细胞抑制性和细胞毒性是建立用于 rAAV 生产的无辅助/感染病毒稳定生产细胞系的关键障碍。然而，Rep和辅助病毒蛋白的细胞毒性机制仍不清楚。多组学可能是通过在宿主细胞中过表达Rep/辅助病毒基因来研究Rep/辅助病毒蛋白与宿主细胞蛋白之间相互作用的有用工具。宿主细胞基因表达或代谢重编程的变化将为细胞毒性的潜在细胞机制提供有价值的见解。多组学方法还可以解决 rAAV 生产规模扩大的挑战。许多论文通过多组学技术研究了 CHO 细胞生物治疗生产中的放大问题并确定了放大依赖性生物标志物。尚未对用于生产 rAAV 的细胞系进行类似的研究。多组学将成为一种实际应用，用于评估不同工艺规模的生产力和产品质量结果之间的显著差距。此外，多组学研究发现的新型生物标志物可用于监测 rAAV 生产的放大过程。原文：Q.Fu, A.Polanco, Y.S.Lee, et al., Critical challenges and advances in recombinant adeno-associated virus (rAAV) biomanufacturing. Biotechnology & Bioengineering, 2023.文章信息源于公众号Biologics CMC，登载该文章目的为更广泛的传递行业信息，不代表赞同其观点或对其真实性负责。文章版权归原作者及原出处所有，文章内容仅供参考。本网拥有对此声明的最终解释权，若无意侵犯版权，请联系小编删除。学如逆水行舟，不进则退；心似平原走马，易放难收。行舟Drug每日更新欢迎订阅+医药大数据|行业动态|政策解读