Bioart Colombia

撰文 | 啾啾椰 测序技术是理解基因调控的基础工具。传统的RNA-seq技术虽然广泛应用，但它只能测量稳态RNA的丰度，主要反映成熟、稳定、存在于胞质中的RNA，而对许多重要但不稳定或低丰度的转录本（如增强子RNA（eRNA）、长链非编码RNA（lincRNA））几乎无法检测【1】。为此，研究者们发展了NRO-seq（nuclear run-on sequencing）类技术，如GRO-seq（global run-on sequencing）和PRO-seq（precision run-on sequencing）【2】。这些技术能够标记细胞中活跃的RNA聚合酶II（RNAPII），并以单碱基分辨率记录其位置，从而捕捉真实发生中的转录事件，揭示转录起始、暂停、延伸、终止等关键过程。 然而，PRO-seq等现有NRO-seq方法存在显著局限性。传统的PRO-seq实验要求至少1000万至2000万个细胞，步骤繁琐，包含多轮有机提取和凝胶分离，往往需要4到5天才能完成。在低起始量样本中建库效率极低，且容易生成接头二聚体（adapter dimer），严重影响数据质量【3】。因此，该方法难以应用于干细胞、神经元或临床样本等稀有材料中。虽然PRO-seq在分辨率和灵敏度上具有优势，但其高门槛和技术负担限制了广泛推广。 近日，迈阿密大学米勒医学院的Ramin Shiekhattar团队在Molecular Cell上发表了题为Enhancing transcriptome mapping with rapid PRO-seq profiling of nascent RNA的研究论文，提出并验证了一种全新的nascent RNA测序技术rPRO-seq（rapid PRO-seq）。该方法极大地简化了实验流程，提升了建库效率，尤其适用于起始细胞数量有限的样本，标志着转录动力学研究在技术层面取得了重要突破。 rPRO-seq在方法上引入了多项关键创新。首先，使用了预腺苷化的3’端DNA接头（App-DNA）进行连接，避免了ATP依赖性的非特异副产物，如RNA环化或多聚化。其次，在5’接头连接前加入了接头二聚体阻断寡核苷酸（DBO），可与游离3’接头配对，阻止其与5’接头形成二聚体。第三，整个建库过程使用磁珠和柱式纯化，取代了传统有机溶剂提取，显著降低RNA降解和样本损耗风险。得益于这些优化，rPRO-seq的整个流程可在12小时内完成，相比传统PRO-seq的4-5天大幅提速，且所需细胞数可低至5000个。 研究团队首先在HeLa细胞中对rPRO-seq与传统PRO-seq进行对比实验。使用10M细胞的传统PRO-seq结果作为参照，他们分别使用rPRO-seq在50万、10万、5万、2.5万个HeLa细胞上进行测序，发现即便在仅有2.5万个细胞的情况下，rPRO-seq也可获得与传统方法质量相当的转录图谱。无论是在转录起始区域、基因体区域，还是增强子区域，信号强度和分布高度一致，表明rPRO-seq在定量转录动力学上具有高度准确性和可重复性。 进一步，作者测试了rPRO-seq在仅5000个细胞中的表现。在HeLa细胞中构建INTS11的急性降解系统（dTAG），发现即使在极低起始细胞数下，rPRO-seq仍可敏锐检测到转录动态变化。特别是在INTS11被降解后，观察到RNAPII在启动子区域富集、基因体信号下降的现象，说明转录延伸受到抑制。这些结果说明，rPRO-seq具备在低样本量条件下进行机制研究的能力。 随后，研究者将rPRO-seq应用于生物医学相关模型，包括小鼠造血祖细胞（mHPC）和分化神经元，探索调控因子INTS11在不同背景下的功能。在mHPC中敲除INTS11后，发现有3525个基因表达显著改变，受影响的通路包括mRNA加工、IL-6信号、EGFR和胰岛素通路。RNAPII在启动子处停滞、基因体区信号减少，说明存在转录延伸障碍。同时，增强子区域的eRNA信号延伸，提示INTS11还参与转录终止。此外，在小鼠干细胞分化为神经元后急性降解INTS11，rPRO-seq揭示了长基因的转录延伸尤为受损。下调基因多为与神经发育和精神疾病相关的关键基因，进一步验证了INTS11在神经系统中的调控作用。 图1：rPRO-seq方法的建库流程与关键优势：在仅需5000个细胞的条件下，通过App-DNA和DBO提高连接效率、避免接头二聚体生成，实现对新生RNA的快速（12小时内）高精度测序。 综上所述，rPRO-seq是一项具有高度灵敏性、快速性和低样本量需求的新型转录组测序技术。它结合了快速建库（12小时）、低起始细胞（5000个）、高分辨率（单碱基）、适用于稀有或临床样本等优势，不仅大幅降低实验门槛，还拓展了nascent RNA研究的应用范围。rPRO-seq能够准确捕捉eRNA、lincRNA等低丰度新生转录本，并可广泛应用于发育、疾病、干细胞等领域的机制研究。相比传统PRO-seq，这项新方法具有更强的替代性和可扩展性，未来在基础研究和转化医学中具有广阔前景。 原文链接： https://www.cell.com/molecular-cell/abstract/S1097-2765(25)00579-9 制版人： 十一 参考文献 1. Gardini, A., and Shiekhattar, R. (2015). The many faces of long noncoding RNAs. FEBS Journal 282, 1647–1657. https://doi.org/10.1111/febs.13101. 2. Churchman, L.S., and Weissman, J.S. (2011). Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature 469, 368–373. https://doi.org/10.1038/nature09652. 3. Mahat, D.B., Kwak, H., Booth, G.T., Jonkers, I.H., Danko, C.G., Patel, R.K., Waters, C.T., Munson, K., Core, L.J., and Lis, J.T. (2016). Base-pair-resolution genome-wide mapping of active RNA polymerases using precision nuclear run-on (PRO-seq). Nat. Protoc. 11, 1455–1476. https://doi.org/10.1038/nprot.2016.086. 学术合作组织 （*排名不分先后） 战略合作伙伴 （*排名不分先后） · 转载须知 【原创文章】BioArt原创文章，欢迎个人转发分享，未经允许禁止转载，所刊登的所有作品的著作权均为BioArt所拥有。BioArt保留所有法定权利，违者必究。 BioArt Med Plants 人才招聘 近期直播推荐 点击主页推荐活动 关注更多最新活动！

撰文 | Qi X连锁重症联合免疫缺陷症（SCID-X1）是一种罕见的遗传性疾病，由于IL2RG基因突变导致免疫系统严重受损。患者因缺乏功能性T细胞和NK细胞极易发生感染，通常需要在婴儿期进行干预。传统的治疗方法如造血干细胞移植（HSCT）存在配型限制和并发症风险，而基因疗法的出现为这些患者带来了新希望。 近年来，基于慢病毒载体的基因疗法在SCID-X1治疗中取得了显著成效。通过将修正的IL2RG基因导入患者自身的造血干细胞（HSCs），能够重建免疫功能。然而，免疫系统如何在治疗后逐步恢复，尤其是T细胞如何重新发育，仍是未解之谜。此外，传统观点认为，记忆T细胞的生成依赖于抗原刺激。但近年研究发现某些T细胞表现出“先天记忆”特性，无需抗原接触即可具备快速响应能力。这类细胞在小鼠和人类脐带血中均有发现，但其在人体内的生成机制和功能尚不明确【1-4】。 2025年7月31日，美国圣裘德儿童研究医院的Ben Youngblood团队在Immunity杂志上发表了文章Innate-like memory T cells rapidly emerge in humans after gene therapy for SCID-X1 test，他们通过对SCID-X1基因治疗患者的纵向分析，发现了一种新型的“先天记忆T细胞”，这些细胞在免疫系统重建早期（12周内）即大量出现，表达NKG2A和CD49d等标志物，并具备抗原非依赖的效应功能。单细胞测序和表观遗传学分析显示，这些细胞具有独特的转录和甲基化特征，能够快速响应IL-12/IL-18刺激并分泌IFNγ，证实了人类免疫系统中“先天记忆T细胞”的存在及其在早期免疫保护中的潜在作用。 该团队对22名接受基因治疗的SCID-X1患儿进行了长达1.5年的随访，通过流式细胞术分析了CD8+ T细胞的表型变化。结果显示在治疗后12周，CD45RO+记忆T细胞（包括效应记忆TEM和中央记忆TCM）比例显著升高，与健康对照个体相比，SCID-X1患者的记忆T细胞高表达NKG2A和CD49d，提示其具有先天免疫特性。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq），他们从3名患者的血液样本中鉴定出9个T细胞亚群。其中，NKG2A+ CD8+ T细胞表现出以下特征：1）效应基因高表达，如GZMB（颗粒酶B）、TBX21（T-bet）和EOMES；2）先天免疫特征，NKG2A+ T细胞的得分显著高于其他亚群；3）非经典MAIT或NKT细胞，未检测到黏膜相关恒定 T 细胞（MAIT）或NKT细胞的标志基因（如TRAV1-2），表明这是一个独立的亚群。 接下来，该团队试图确定这些细胞是否经历了与效应细胞和记忆细胞分化相一致的表观遗传修饰，尤其关注与控制T细胞命运决定和体内持久性上具有因果作用的DNA甲基化程序【5, 6】。通过对来自健康供体和SCID-X1患者来源的幼稚、NKG2A−和NKG2A+样本的全基因组甲基化测序（WGBS）和差异甲基化区域（DMRs）分析，发现来自 SCID-X1 患者的NKG2A+细胞具有与记忆分化相一致的DNA甲基化程序，其在IFNγ、PRF1（穿孔素）等效应基因的启动子区域呈现广泛去甲基化。为了进一步评估早期和晚期时间点上 NKG2A+细胞亚群之间的关系，他们研究了这些先天记忆T细胞的克隆性和T细胞受体（TCR）多样性，发现克隆多样性随时间推移而增加，且对公共数据库的查询显示，在 NKG2A+ 14周样本中发现的所有CDR3序列均与任何已知抗原或感染无关。 已知先天记忆CD8+ T细胞在没有抗原刺激的情况下，会因IL-12和IL-18的刺激而产生效应性细胞因子如IFNγ【7】，因此，他们将从SCID-X1患者和健康对照个体身上分离出的CD8+ T细胞在有无IL-12和IL-18的条件下培养48小时并检测细胞内的IFNγ。结果显示在IL-12和IL-18存在的情况下培养的 NKG2A+T细胞表达了IFNγ，提示NKG2A+ T细胞具有在非抗原刺激下产生效应性细胞因子的能力。 综上，这项工作证明在SCID-X1基因治疗后，NKG2A+ CD8+ T细胞在免疫重建初期即大量出现，填补了适应性免疫尚未成熟的空白期，这些细胞通过去甲基化等修饰“预编程”为效应状态，无需抗原刺激即可快速响应。因此，可以开发基于此类细胞的免疫疗法，例如增强抗肿瘤或抗感染反应。 原文链接： https://doi.org/10.1016/j.immuni.2025.07.002 制版人： 十一 参考文献 1. White, J.T., Cross, E.W., Burchill, M.A., Danhorn, T., McCarter, M.D., Rosen, H.R., O’Connor, B., and Kedl, R.M. (2016). Virtual memory T cells develop and mediate bystander protective immunity in an IL-15- dependent manner. Nat. Commun. 7, 11291. https://doi.org/10.1038/ ncomms11291.  2. Smith, N.L., Patel, R.K., Reynaldi, A., Grenier, J.K., Wang, J., Watson, N. B., Nzingha, K., Yee Mon, K.J., Peng, S.A., Grimson, A., et al. (2018). Developmental Origin Governs CD8+ T Cell Fate Decisions during Infection. Cell 174, 117–130.e14. https://doi.org/10.1016/j.cell.2018. 05.029.  3. Jameson, S.C., Lee, Y.J., and Hogquist, K.A. (2015). Innate memory T cells. Adv. Immunol. 126, 173–213. https://doi.org/10.1016/bs.ai.2014. 12.001. 4. Zhang, X., Zhivaki, D., and Lo-Man, R. (2017). Unique aspects of the perinatal immune system. Nat. Rev. Immunol. 17, 495–507. https://doi.org/10. 1038/nri.2017.54. 5. Ghoneim, H.E., Fan, Y., Moustaki, A., Abdelsamed, H.A., Dash, P., Dogra, P., Carter, R., Awad, W., Neale, G., Thomas, P.G., and Youngblood, B. (2017). De Novo Epigenetic Programs Inhibit PD-1 Blockade-Mediated T Cell Rejuvenation. Cell 170, 142–157.e19. https://doi.org/10.1016/j.cell. 2017.06.007.  6. Kang, T.G., Lan, X., Mi, T., Chen, H., Alli, S., Lim, S.E., Bhatara, S., Vasandan, A.B., Ward, G., Bentivegna, S., et al. (2024). Epigenetic regulators of clonal hematopoiesis control CD8 T cell stemness during immunotherapy. Science 386, eadl4492. https://doi.org/10.1126/science.adl4492. 7. Haluszczak, C., Akue, A.D., Hamilton, S.E., Johnson, L.D.S., Pujanauski, L., Teodorovic, L., Jameson, S.C., and Kedl, R.M. (2009). The antigen-specific CD8+ T cell repertoire in unimmunized mice includes memory phenotype cells bearing markers of homeostatic expansion. J. Exp. Med. 206, 435–448. https://doi.org/10.1084/jem.20081829. 学术合作组织 （*排名不分先后） 战略合作伙伴 （*排名不分先后） · 转载须知 【原创文章】BioArt原创文章，欢迎个人转发分享，未经允许禁止转载，所刊登的所有作品的著作权均为BioArt所拥有。BioArt保留所有法定权利，违者必究。 BioArt Med Plants 人才招聘 近期直播推荐 点击主页推荐活动 关注更多最新活动！

撰文 | 阿童木 肿瘤微环境（TME）在癌症的发生、发展和免疫逃逸中发挥关键作用。其中，肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）是TME中最活跃的非肿瘤成分之一，具有高度的异质性和可塑性。它们通过重塑细胞外基质（ECM）、分泌细胞因子及诱导免疫抑制，协同推动肿瘤的生长、转移和治疗抵抗【1】。 在免疫调控方面，CAFs可直接抑制CD8⁺ T细胞功能，或通过招募髓源性抑制细胞（MDSCs）等免疫抑制细胞群，构建“冷免疫”微环境，从而降低免疫检查点阻断（ICB）疗法的疗效【2】。因此，深入解析CAFs的致病特征及其形成机制，对于提高免疫治疗的反应率具有重要意义。 已有研究发现，烟酰胺N-甲基转移酶（NNMT）在CAFs中异常高表达，可能是其获得致病表型的关键驱动因子。NNMT是一种胞质代谢酶，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移至烟酰胺（NAM），生成1-甲基烟酰胺（1-MNA）和S-腺苷同型半胱氨酸（SAH），显著消耗细胞的甲基供体资源，导致DNA、RNA及组蛋白甲基化水平下降，从而诱发表观遗传重编程【3】。 NNMT在多种实体瘤的间质组织中表达升高，并与患者不良预后显著相关【4】。然而，NNMT在CAFs中如何通过“代谢–表观”联动促成免疫抑制表型，以及其是否可作为肿瘤基质靶向干预的新靶标，尚缺乏深入机制研究。厘清NNMT调控CAFs致病性的分子基础，将为改善肿瘤免疫治疗开辟新路径。 近日，芝加哥大学Ernst Lengyel实验室等在Nature杂志发表了题为NNMT inhibition in cancer-associated fibroblasts restores antitumour immunity的研究文章，系统揭示了NNMT通过降低H3K27me3甲基化，促进CAFs分泌补体因子，招募MDSCs至肿瘤，从而增强免疫抑制。在多种小鼠肿瘤模型中敲除Nnmt可增强CD8⁺ T细胞活性、抑制肿瘤生长。本研究开发的高效NNMT小分子抑制剂（NNMTi）能够显著减轻肿瘤负荷、提升ICB疗效，表明NNMT为CAF调控与免疫抑制缓解的潜在靶点。 作者通过对未经化疗的高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）患者样本进行空间转录组学与单细胞RNA测序，发现CAFs中NNMT在肿瘤进展过程中表达上调。空间转录组数据显示，NNMT表达水平自癌邻基质、卵巢原发肿瘤基质，至大网膜转移灶逐步升高，伴随ECM组分和补体因子表达增强。NNMT高表达区域免疫相关通路活跃，但效应型/记忆型CD8⁺ T细胞显著减少。scRNA-seq确认NNMT在8个CAF亚群中均高表达，泛癌数据进一步印证其在多种癌症CAF中的广泛表达，提示其在免疫调控中的关键作用。 在多个小鼠肿瘤模型中，作者发现Nnmt⁻/⁻小鼠的卵巢癌、乳腺癌和结肠癌肿瘤负荷均显著下降，伴随CD8⁺ T细胞数量增加和功能增强。流式细胞术及细胞因子分析证实，肿瘤微环境中CD8⁺ T细胞的IFNγ与TNF表达增加，而未携带肿瘤的小鼠中T细胞功能无差异。骨髓嵌合实验明确，肿瘤生长抑制效应源于非免疫系统成分（即成纤维细胞）中NNMT的缺失。进一步实验证明，激活成纤维细胞NNMT表达即可恢复肿瘤生长，强调其在CAF致病性中的决定性作用。 在机制层面，作者构建了表达NNMT的NIH-3T3细胞株，发现NNMT能够上调与髓细胞迁移、活化及补体激活相关通路，并吸引Ly6Chigh单核细胞及CD206⁺肿瘤相关巨噬细胞。蛋白质组学分析显示NNMT能诱导补体因子的大量分泌，尤其是C3，CRISPR敲除C3或阻断C5a受体（C5aR）可显著抑制单核细胞迁移。此外，Ly6Chigh单核细胞在NNMThigh肿瘤中C5aR和PD-L1表达升高，呈现M-MDSC样表型，进而抑制CD8⁺ T细胞增殖。人源HGSOC样本中，NNMThigh区域CD14⁺单核细胞浸润明显，表明NNMT表达的CAFs通过补体介导单核细胞招募，诱导TME中免疫抑制性M-MDSC表型。 进一步研究发现，NNMT通过耗竭细胞SAM水平，降低H3K27me3组蛋白修饰，从而驱动表观遗传重编程。在3T3-NNMT细胞及小鼠原代成纤维细胞中，CAF标记基因和补体因子显著上调。ChIP-seq显示H3K27me3峰值缩小与CAF基因表达呈负相关，确认其表观调控功能。形态学上，NNMT表达使成纤维细胞变大、趋于星状。补充甲硫氨酸可提升SAM水平并抑制补体因子C3与Cfb的转录，防止组蛋白低甲基化。 针对现有NNMT抑制剂效能有限的问题，作者进行了小分子高通量筛选，从超过15万种小分子中筛选并优化出高效抑制剂NNMTi（IC₅₀<10 nM），具备高度选择性和良好生物利用度（口服吸收率47%）。NNMTi可有效降低1-MNA水平、恢复SAM供应、逆转H3K27me3低甲基化，抑制CAF收缩能力和CAF表型相关蛋白表达，而对癌细胞自身增殖与迁移无显著影响，表明NNMTi主要通过靶向CAFs发挥作用。 在小鼠模型中，NNMTi经腹腔注射、肿瘤内注射或口咽吸入均可有效减少卵巢癌、乳腺癌和结肠癌模型的原发肿瘤与转移灶负荷。CAF特异性实验进一步显示，NNMTi主要通过抑制表达NNMT的CAF发挥抗肿瘤作用，而非直接作用于癌细胞。NNMTi治疗可显著降低H3K27me3低甲基化的CAF比例、CAF亚群数量与大小、补体C3表达水平及免疫抑制性Ly6ChighPD-L1high单核细胞浸润，同时增强CD8⁺ T细胞激活功能。与抗PD-1或抗CD47联合治疗可进一步增强抗肿瘤效果，表明NNMTi通过调控TME，提高了ICB疗法的有效性。 综上所述，本研究系统揭示了NNMT在CAFs中通过“代谢–表观–免疫”轴协同调控免疫抑制微环境的机制，明确了NNMT作为泛CAF标志物和治疗靶点的潜力。所开发的抑制剂NNMTi不仅逆转CAFs免疫抑制功能，还增强免疫检查点疗法的疗效，或为未来肿瘤治疗中CAF靶向干预开辟新路径。 原文链接： https://doi.org/10.1038/s41586-025-09303-5 制版人： 十一 参考文献 1. Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer16, 582–598 (2016). 2. Sahai, E. et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nat. Rev. Cancer20, 174–186 (2020). 3. Ulanovskaya, O. A., Zuhl, A. M. & Cravatt, B. F. NNMT promotes epigenetic remodeling in cancer by creating a metabolic methylation sink. Nat. Chem. Biol.9, 300–306 (2013). 4. Song, M. et al. High stromal nicotinamide N-methyltransferase (NNMT) indicates poor prognosis in colorectal cancer. Cancer Med.9, 2030–2038 (2020). 学术合作组织 （*排名不分先后） 战略合作伙伴 （*排名不分先后） · 转载须知 【原创文章】BioArt原创文章，欢迎个人转发分享，未经允许禁止转载，所刊登的所有作品的著作权均为BioArt所拥有。BioArt保留所有法定权利，违者必究。 BioArt Med Plants 人才招聘 近期直播推荐 点击主页推荐活动 关注更多最新活动！