Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.

“ 点击蓝字 关注我们 基于网络药理学探讨构树治疗特异性皮炎的作用机制 PPS  徐颖 1，宋雨轩 1，聂文凯 1，武易星 2，刘冰 1，杨慧文 1* （1. 广东药科大学药学院，广东 广州 510006；2. 广东药科大学护理学院，广东 广州 510006） [摘要]目的 通过网络药理学、分子对接技术及实验验证，探讨构树 （Broussonetia papyrifera, BP） 治疗特异性皮炎 （atopic dermatitis，AD） 的作用靶点及机制。方法 建立 2，4-二硝基氯苯 （2，4-dichloronitrobenzene，DNCB） 诱导的小鼠 AD 模型，分为正常对照组 （Nor）、模型组 （Mod）、地塞米松组 （DEX）、构树提取物低剂量组 （L-BP） 和高剂量组 （H-BP），连续给药 12 天。对AD 小鼠进行皮损情况观察、皮炎评分及病理染色，确定 BP 治疗 AD 的药效。利用 HERB、TCMSP 和 SwissTargetPrediction 数据库预测 BP 的活性成分及其作用靶点，并结合 GeneCards、DisGeNET 和 OMIM 数据库筛选出与 AD 相关的靶点。通过 Venny 制作韦恩图，筛选出 BP 与 AD 的共同靶点。利用 STRING 和 Cytoscape 软件进行蛋白质相互作用 （protein-protein interaction，PPI） 网络分析，以degree 值排前 10 的靶点作为核心靶点。通过基因本体论 （Gene Ontology，GO） 功能和京都基因与基因组百科全书 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析 BP 治疗 AD 的可能作用机制，并使用 AutoDock 软件评估 AD 的活性成分和核心靶点之间的结合亲和力。最后，以 Western blot 实验等验证网络药理学预测的结果。结果 体内实验结果显示，与模型组相比，BP 能显著提高小鼠的表皮厚度，降低皮炎评分，改善 AD 症状。经网络药理学分析，从 BP 的 115 个靶点和 AD 的 1 815 个靶点中筛选出 47 个交集靶点。PPI 网络拓扑分析确定了 10 个核心靶点，包括 ESR1、AKT1、PTGS2、HIF1A、NF-κB1 等。分子对接结果显示，BP 活性成分与这些核心靶点结合能力较好。GO 功能富集结果显示，有 74 个分子功能、22 个细胞成分、167 个生物过程。KEGG 通路富集分析显示，PI3K-AKT、NF-κB 信号通路可能是 BP 治疗 AD 的重要途径。验证结果显示，BP 可通过降低 PI3K、IKB、p65、AKT 的磷酸化水平，抑制 PI3K/AKT 和 NF-κB 信号通路的激活。结论 BP 可通过调节 PI3K/AKT 和 NF-κB 信号通路发挥治疗 AD 的作用，为 BP 治疗 AD 的后续深入研究和潜在临床应用提供参考。 特异性皮炎 （atopic dermatitis，AD） 是一种常见的慢性炎症性皮肤病，主要表现为皮肤屏障功能障碍，反复发作的湿疹样皮疹、明显的皮肤干燥及瘙痒[1]。全球范围内，婴幼儿 AD 发病率为 10% ~30%，成年人发病率为 2% ~ 10%[2]。2010 年流行病学调查显示，全球 AD 患者数量已达约 2.3 亿，给社会带来沉重负担。随着环境污染加剧和生活压力增加，AD 发病率呈逐年上升的趋势[3]。 瘙痒作为AD 的关键症状之一，患者常因难以忍受的瘙痒感而频繁抓挠，进而造成皮肤损伤，这不仅影响患者身体健康，还可能引发焦虑、抑郁等心理问题[4]。现有医学研究表明，AD 的发病机制涉及免疫系统失调、皮肤屏障功能受损、皮肤微生物群失衡及遗传因素等多个方面。然而，AD 确切的发病机制迄今仍未明确。目前，西医治疗 AD 的主要方案依赖糖皮质激素、抗组胺药及润肤剂等，但这些治疗方法对中重度 AD 患者的疗效有限，且长期使用可能引发肾上腺功能抑制、皮肤变薄和色素减退等一系列副作用[5]。在此背景下，中草药因其疗效显著且副作用较少的优势，日益受到关注。研究显示，中药治疗不仅能明显缓解 AD 的瘙痒感和皮损情况，还能有效减少疾病复发次数[6]。 构树（Broussonetia papyrifera，BP）又名枳树、枳实子，为桑科植物，在我国华东、华北、陕西、甘肃等地均有广泛分布，尤其在南部地区更为常见。作为多年生植物，BP 的叶片、根茎及果实富含矿物质、蛋白质、氨基酸以及多糖等多种生物活性物质与营养成分，表现出显著的药用潜力[7]。据文献记载，BP 的活性成分主要包括黄酮类化合物、酚酸类物质和多糖，这些成分使其具备抗氧化、抗真菌、抗炎及免疫调节等多种药理作用[8]。在传统医学实践中，BP 常用于治疗皮肤病、消化不良和炎症性疾病，其提取物也广泛应用于食品和保健品领域。笔者课题组前期实验结果表明，BP 能有效减轻2, 4-二硝基氯苯（2, 4-dichloronitrobenzene，DNCB） 诱导的小鼠 AD 症状，但其具体作用机制尚待进一步探讨。 中药因其多成分特性、广泛的作用靶点、相对较低的选择性及成分间协同效应，给药理研究带来挑战。为应对这些挑战，网络药理学应运而生，该技术融合计算机技术、生物信息学、系统生物学等多领域研究手段，从系统层次和生物网络的整体角度出发，解析药物与治疗对象之间的分子关联，为揭示中药复杂作用机制提供了新途径[9]。本研究旨在运用网络药理学与分子对接技术，系统预测 BP在 AD 治疗中的潜在分子靶点及其作用机制，并通过体内动物实验进行验证，以期为 BP 在 AD 治疗领域的潜在临床应用提供参考。 1 材料与方法 1.1 试剂与仪器 构树 （产地：安徽省亳州中药材交易中心；批号：20240329）；地塞米松 （DEX，美国 MedChem Express 公司，产品编号：HY-14648/CS-1505，批号：45270，规格：500 mg）；DNCB （上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；橄榄油（陕西康禾制药有限公司）；丙酮 （广东广试试剂科技有限公司）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒 （贝博生物科技有限公司）； SDS-PAGE 蛋 白 上 样 缓 冲 液 （5X）（中 国Bioharp 公司）；RIPA 裂解液（上海碧云天生物技术有限公司）；PMSF 丝氨酸蛋白酶抑制剂（碧云天生物技术有限公司）；PEG-40 氢化蓖麻油 （陕西康利制药有限公司）；3% 卡波姆 （广东新如荣生物科技有限公司）；三乙醇胺（上海麦克林生化科技股份有限公司）；多聚甲醛 （上海碧云天生物技术有限公司）；磷脂酰肌醇-3-激酶 （phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K）、 p-PI3K、 蛋 白 激 酶 B （protein kinase B，PKB，又称 AKT）、p-AKT、p65、p-p65、核因子 κB 抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor κB，IKB)和 p-IKB（联科生物技术股份有限公司）。 ALX13M07 高速冷冻离心机 （贝克曼库尔特商贸有限公司）；3300 Mini 化学发光成像系统 （上海勤翔科学仪器有限公司）；1658033 小型垂直电泳转印系统 （美国 Bio-Rad 公司）；1510 全波长酶标仪（赛默飞世尔科技有限公司）；EVOS M5000 智能细胞成像系统 （赛默飞世尔科技有限公司）；RE-5299旋转蒸发仪 （广州市星烁仪器有限公司）；NMYC600 水平摇床（苏珀仪器有限公司）。 1.2 构树提取物的制备 首先，将 BP 根皮进行粉碎处理，随后按照 1∕4的料液比加入 95% 浓度的乙醇。在 75℃条件下进行加热回流提取，每次提取时长为 1 h，共计提取 3次。将 3 次提取所得的提取液进行合并，并利用旋蒸技术进行浓缩，直至形成浸膏状。随后，将浸膏用水溶解，再次使用旋转蒸发仪去除残留乙醇。最后，将溶液在-80℃下冷冻过夜，并进行冻干处理，保存于-20℃以备后续使用。 1.3 动物实验 1.3.1 动物 BALB/c 小鼠，雌性，6 ~ 8 周龄，购自广东医学实验动物中心，动物生产许可证号为SCXK（粤）2022-0002，并于标准的 12 h 光照/黑暗中饲养，环境温度维持在 （22 ± 2）℃，动物可自由摄食和饮水。所有动物实验通过广东药科大学实验动物中心伦理委员会审查和批准 （审批号：gdpulacspf2022035）。 1.3.2 动物模型和实验设计 将 40 只 BALB/c 小鼠随机分为 5 组 （每组 8 只）：正常对照组 （Nor，空白水凝胶）、模型组 （Mod，DNCB）、DEX 阳性对照组（DEX 为 0.01 mg‧mL-1，DEX）、低浓度 BP 组（BP 为 100 mg ‧ mL-1，L-BP） 以及高浓度 BP 组（BP 为 200 mg‧mL-1，H-BP）。于实验开始当天，去除小鼠背部的毛发，处理的区域为 2 cm × 2 cm。接下来的致敏阶段，在第 1、3、5 天分别施用不同浓度的 DNCB （3%、4%、5%，混合比例为橄榄油与丙酮 4∶1，施用量为 70 μL）进行皮肤实验。在随后的7 d 内继续饲养。在激发期的第 13、16、19、22 天，皮肤使用 1% DNCB。在第 13 ~ 24 天内，给药组每天在小鼠皮肤上涂抹 100 mg‧mL-1或 200 mg‧mL-1的BP 进行治疗。药物给药于第 24 天停止。 1.3.3 构树水凝胶制备 空白水凝胶基质的制作方法：首先将 0.3 mL 的 PEG-40 氢化蓖麻油 （10%）与 1.8 mL 的蒸馏水经过煮沸处理，再加入 3% 水凝胶基质，最终的总体积调整至 3 mL，以制成空白水凝胶基础。 100、200 mg‧mL-1 的 75% 醇提正丁醇萃取部位提取物凝胶：分别称取 200、400 mg 75% 醇提正丁醇 萃 取 部 位 提 取 物 ， 溶 于 PEG-40 氢 化 蓖 麻 油（10%）0.2 mL，煮沸后于 1.2 mL 蒸馏水（60%）中进行超声至溶解，加入 3% 卡波姆 （30%） 定容至2 mL，最后加入三乙醇胺调节 PH 值至 5.5，得100、200 mg‧mL-1 的 75% 醇提正丁醇萃取部位提取物凝胶 2 mL。 1.3.4 皮炎评分 自实验第 13 天始，每隔 3 d 根据以下标准为小鼠评估皮炎的严重程度。评分项目涵盖红斑或出血、皮肤肿胀、皮肤溃疡或表皮的剥落以及干燥或结痂等情况。每一项症状的评分从 0（无症状）到 3（症状严重）不等，每只小鼠的总得分是所有症状得分的累计[10]。 1.3.5 组织病理学检查 取小鼠背部受损的皮肤样本，采用 4% （v/v） 多聚甲醛固定 24 h，随后脱水处理，石蜡包埋，切片厚度设定为 4 μm。通过苏木精-伊红 （HE） 染色方案，光学显微镜观察皮肤的病理学变化，同时运用 ImageJ 软件对表皮厚度进行测量与统计分析。 1.3.6 Western blot 法检测蛋白表达量 选取适量小鼠皮肤组织样本，置于冰面上，添加 RIPA 裂解液 （RIPA 与 PMSF 丝氨酸蛋白酶抑制剂的比例为80∶1），使用组织匀浆器充分均质，离心后提取上清液。BCA 蛋白检测试剂盒评估组织中的蛋白浓度，经过 SDS-PAGE 电泳后，将分离出来的蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜 （PVDF） 膜。随后，使用5% 脱脂奶粉在室温下封闭 PVDF 膜 2 h，进行洗膜处理 ， 接着分别加入PI3K、p-PI3K、AKT、 pAKT、p65、p-p65、IKB 和 p-IKB 一抗，在 4 ℃下孵育过夜。洗去一抗后，加入二抗 （HRP 标记山羊抗鼠），在室温条件下孵育 1 h。洗涤后，用显影液处理 PVDF 膜 10 s 以完成显影，并拍摄影像。使用Image J 软件进一步分析目标蛋白条带的光密度值。 1.4 网络药理学预测 1.4.1 构树作用靶点的预测与筛选 以“构树”为关键词，检索系统药理学抗癌草药数据库 （Cancer HSP，https://old. tcmsp-e. com/CancerHSP. php） 和HERB 本草组鉴数据库 （HERB，http://herb.ac.cn/），筛选类药性 （DL ≥ 0.18） 或口服生物利用度 （OB ≥0.30）的有效化学成分，并通过 SwissTargetPrediction平台 （http://www.swisstargetprediction. ch/） 预测其靶点。将 2 个数据库筛选的靶点去掉重复值后，使用 UniProt 数据库（https://www.uniprot.org/）将靶点匹配至人类基因名。 1.4.2 AD 的靶基因预测与筛选 “atopic dermatitis”作为关键词，搜集GeneCards（https://www.genecards. org/）、 DisGeNET （http://www. disgenet.org/） 和 OMIM （https://www.omim.org/） 数据库中AD 的潜在靶点基因，并将 3 个数据库检索的结果导入 excel 表格进行整合，删除重复靶点。 1.4.3 蛋白相互作用网络构建与拓扑分析 将交集靶点上传至STRING11.5数据库 （https://cn.stringdb.org/），选择“Homo sapiens”物种构建蛋白质相互作用 （protein-protein interaction，PPI） 网络，并使用 Cytoscape 3.10.0 软件进行可视化。筛选 degree值排前 10 的靶点作为核心靶点，构建“构树-活性小分子-靶点-AD”网络。 1.4.4 GO 功能富集与 KEGG 通路富集分析 将交集靶点导入DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp），物种限定为“Homo sapiens”，进行基因本体论 （Gene Ontology，GO） 富集分析和京都基因与基因组百科全书 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，并按 P 值选取分子功能前 15 个显著条目和 KEGG 信息通路显著性较高的前 20 个通路数据导入“微生信可视化云平台”（http://bioinformatics.com.cn/login/）进行可视化分析。 1.4.5 药物-靶点-通路-疾病网络的构建 把药物、交集靶点、筛选的信息通路及 AD 上传到 Cytoscape软件，构建“药物-靶点-通路-疾病”网络。 1.4.6 药物和核心靶点的分子对接验证 选用 PPI网络图中 degree 值排前 5 的核心靶点作为受体，度值大于 10 的 5 个活性成分作为配体，两两对应进行分子对接的相关验证。将核心靶点蛋白名称输入到RSCB PDB 数据库中 （https://www.rcsb. org/） 中，限定条件为“Homo sapiens”，获取三维靶蛋白结构，并利用 PyMOL 软件去除原始受体蛋白中的水分子和原始配体分子。通过 PubChem 数据库获取构树活性成分的结构，在 AutoDock 软件上对活性成分和核心靶点进行分子对接，取受体与配体最低结合能的 10 项作为靶蛋白与配体的对接结果。受体和配体间结合能较低的构象较为稳定，结合能最低的构象为最优构象，因此研究选用结合能最低的最优构象，且利用 PyMol 软件处理其对接结果，进行可视化展示[11]。 1.5 统计学方法 所有实验数据均通过 GraphPad Prism 8.0.2 软件进行统计分析，结果以均值 ± 标准差（x̅ ± s）表示。对于多组数据比较采用单因素方差分析法。在满足正态分布及方差同质性的条件下，进行两两比较采用 LSD 检验；在数据不符合正态分布或方差同质性时，使用 Dunnett,s T3 方法进行比较。P < 0.05 为差异具有统计学意义。 2 结果 2.1 构树对 AD 小鼠皮损的影响 用 DNCB 刺激的 BALB/c 小鼠作为模型，实验结果显示，与模型组相比，经过 12 d 给药后，DEX组和各 BP 给药组的小鼠红斑、水肿、结痂等症状均得到有效缓解；特别是 H-BP 组的小鼠，其背部皮肤的结痂面积较 L-BP 组明显减小，且水肿症状有所减轻（见图 1）。 2.2 构树对 AD 小鼠皮炎评分 小鼠的皮炎评分结果和最后一次评分结果如图2 所示，模型组小鼠的皮炎评分明显高于其他组。与模型组相比，DEX 组、L-BP 组和 H-BP 组的小鼠皮炎评分均显著下降 （P < 0.05）。L-BP 组和 H-BP组小鼠的皮炎评分呈剂量依赖性，H-BP 组与 DEX组评分无显著差异。 2.3 构树对 AD 小鼠皮肤组织结构的影响 小鼠皮肤组织经苏木精-伊红 （HE） 染色结果显示，与正常组比较，模型组小鼠受损皮肤过度角化，并伴有大量炎症细胞浸润，表皮层也显著增厚（P < 0.01）；与模型组相比，DEX 组、L-BP 组和 H-BP 组小鼠皮肤过度角化症状得到改善，炎性细胞浸润显著减少（P < 0.01）；与模型组相比，BP 能显著降低 AD 小鼠表皮厚度，且呈剂量依赖性 （P <0.01），见图 3。 2.4 与构树治疗 AD 相关的靶点预测 通过 Cancer HSP 和 HERB 数据库的检索共发现 BP 含有 127 个活性成分。以 OB ≥ 0.30 和 DL ≥0.18 的条件筛选，并在 excel 表格中对获得的成分做去重复值处理，最终筛选到 17 个关键活性成分。将 17 个 成 分 的 SMILES 结 构 输 入 Swiss Target Prediction 数据库，设定物种为“Homo sapiens”且概率阈值 ≥ 0.7，筛选高置信度靶点并剔除重复靶点，最终获得 115 个靶基因。通过 OMIM、DisGeNET和 GeneCards 数据库进一步检索 AD 相关的靶点，最终得到 1 815 个靶基因。利用 Venny 软件绘制韦恩图，得到 BP 和 AD 的 47 个交集靶点（见图 4），包括 AKT1、 NFKB1、 PTGS2、 HIF1A、 ESR1 等（见表 1）。 2.5 PPI 网络构建与拓扑分析 将 47 个交集靶点导入 STRING 11.5 数据库，构建 PPI 网络；利用 Cytoscape 3.10.0 软件进行数据可视化分析（见图 5A）。构建的 PPI 网络包含 46 个节点和 234 条相互作用的边，其中圆圈代表 BP 在AD 治疗中的靶点，边代表靶点之间的相互作用。图中靶点的颜色深浅及形状大小均与其在网络中的中心性贡献有关，节点越大、颜色越深、面积越大，其生物学功能越明显。最终筛选出 10 个核心靶点，包 括 AKT1、 NFKB1、 PTGS2、 HIF1A、 ESR1、MMP2、 EGFR、 MPO、 NOS3 和 CYP3A4 （ 见图 5B）。 2.6 GO 富集和 KEGG 信号通路分析 对构树治疗 AD 进行 GO 功能分析，探究其可能的作用机制。GO 富集分析分为 3 类：生物过程（biological process， BP）、 细 胞 成 分 （cellular component，CC） 和 分子功能 （molecular function，MF）。GO 功能分析得到 167 个 BP，主要有 DNA模板转录 （DNA-templated transcription）、蛋白水解（proteolysis）、 炎 症 反 应 （inflammatory response）等；22 个 CC，主要有核质 （nucleoplasm）、质膜（plasma membrane）、 细 胞 质 （cytoplasm）、 胞 浆（cytosol） 等；74 个 MF，主要有酶结合 （enzyme binding）、蛋白质结合 （protein binding）、锌离子结合 （zinc ion binding）、内肽酶活性 （endopeptidase activity） 等分子功能与构树缓解 AD 症状有关。按 P 值筛选出前 15 个 GO 功能分析结果如图 6 所示。 KEGG 通路富集了 112 条相关信号通路，主要包括肿瘤坏死因子 （tumor necrosis factor，TNF）信 号 通 路 、 磷 脂 酰 肌 醇 3- 激 酶 - 蛋 白 激 酶 B（phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B，PI3K-AKT） 信号通路及脂质与动脉粥样硬化相关通路等，排名前 20 条 KEGG 通路富集结果如图 7所示。 将相关的有效成分、潜在靶点及其信号通路导入 Cytoscape 软件，绘制“药物-成分-靶点-信号通路-疾病”的网络图 （见图 8），其中，橙色圆形代表信号通路，蓝色正方形代表靶点基因，红色飞镖形代表疾病，红色三角形代表药物，粉色圆形代表药物的活性成分。 2.7 构树与核心靶点的分子对接验证 基于上述结果，从 BP 选取中度值大于 10 的 5个活性成分与 5 个核心靶点两两进行分子对接，验证化合物与核心靶点之间的分子对接活性，有效成分（配体）与交集靶点（受体）之间的结合能越低，表明其构象越稳定。当结合能 < -4.25 kcal∙mol-1（1 kcal· mol-1= 4.184 kJ· mol-1） 时，表明有一定结合能力；结合能 < -5 kcal∙mol-1 时，有较好结合能力；结合能 < -7 kcal∙mol-1时，有强力结合能力[12]，分子对接结果见表 2 。对各受体与配体结合能排名前 2 的对接结果进行可视化，结果如图 9 所示，AKT1 与 moracin N、 broussonol A， ESR1 与moracin I、moracin N，NFKB1 与 demethylmoracin I、moracin I，PTGS2 与 moracin I、moracin N，HIF1与 demethylmoracin I、moracin N 的结合能均小于-5 kcal ∙ mol-1， 具 有 较 好 的 结 合 性 能 ， 结 构 较稳定[13]。 2.8 构树对 AD 小鼠 PI3K、AKT1、p65 及 IKB 蛋白表达的影响 从各组小鼠的皮肤组织中提取总蛋白，检测与炎症通路相关的信号传导蛋白表达情况 （见图 10、图 11）。与正常对照组相比，模型组小鼠皮肤组织中 p-p65/p65、 p-IKB/IKB、 p-PI3K/PI3K、 p-AKT/AKT 的比值均显著升高 （P < 0.01）。与模型组相比，H-BP 组小鼠皮肤组织中 p-PI3K/PI3K 的比值显著降低 （P < 0.01），L-BP 组 p-PI3K/PI3K 的比值有下降趋势，但差异不显著 （P > 0.05）；与模型组相比，L-BP 组和 H-BP 组小鼠皮肤组织中 p-AKT/AKT、p-p65/p65、p-IKB/IKB 的比值均显著降低（P < 0.05），且呈剂量依赖性。 3 讨论 AD 是一种慢性炎症性疾病，通常由多种细胞、细胞因子、趋化因子和信号通路的相互作用引起[14]，AD 的病理特征主要表现为炎症细胞 （如 T 细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞） 在病灶部位的浸润[15]，这些细胞可释放更多的细胞因子和炎症介质，促进局部组织的变质、渗出和增生，从而进一步加重病情。 本研究建立 DNCB 诱导的小鼠 AD 模型，连续给药 12 天后发现，AD 小鼠皮损情况显著改善、皮炎评分呈下降趋势、表皮厚度明显变薄，初步证实BP 对 AD 的药理作用。基于体内动物实验的药效结果，对 BP 开展网络药理学预测分析，筛选得到AKT1、NFKB1、PTGS2 等多个核心靶点。AKT1 是PI3K 和 AKT 信号通路的核心节点，其磷酸化可激活下游促炎因子（如 NF-κB、mTOR），已有研究表明 AD 模型的抓挠行为与磷酸化 AKT1 介导的细胞因子、趋化因子密切相关[16]。在多种炎症性皮肤病中，NF-κB 活性的过度上调会促进炎症持续发展和组织损伤[17]，而抑制 NFKB1 可阻断 NF-κB 通路的核转位过程，抑制其过度上调[18]。抑制 PTGS2 可减少炎症介质的产生，促进炎症改善[19]，且在 AD 的瘙痒与皮损过程中起重要作用。HIF1A 可调控多条信号通路，参与细胞增殖、凋亡及炎症反应等多种生物学过程[20]。ESR1 的信号激活会加重由白细胞介素-4 （interleukin-4，IL-4） 诱导的炎性反应[21]，进而参与 AD 的发病过程。 交集靶点的 GO 功能分析表明，BP 可能通过调控蛋白水解、DNA 模板转录、先天免疫应答及炎症反应等多种生物过程，从而改善 AD 相关症状。在细胞组分方面，这些靶点主要富集于细胞质、质膜和胞浆等区域；在分子功能方面，主要涉及 ATP 结合、锌离子结合和酶结合等多种功能。KEGG 通路富集分析结果发现，PI3K/AKT、NF-κB 及 TNF 信号通路在 AD 的炎症反应及病理过程中发挥关键作用，该结果与核心靶点中 AKT1 和 NFKB 相关性较高，因此选择 PI3K/AKT 和 NF-κB 信号通路进行后续实验，通过测定这 2 条通路中的相关蛋白以验证BP 治疗 AD 与上述通路的关系。 NF- κB 超家族包含 p65 等 5 个转录因子[22]，IκB 蛋白家族阻滞剂通过与转录因子相互作用来调控 NF-κB 的激活过程[23]。NF-κB 激活后会诱导促炎介质与分子产生，引发炎症及免疫细胞的激活和分化；磷酸化的 NF-κB 从 IκB 复合物中解离并进入细胞核，作为转录因子进一步诱导促炎细胞因子的表达，进而促进炎症反应[24]。同时，抑制 NF-κB 通路可减少 TNF-α 的合成与释放，改善炎症损伤[25]，进一步影响 TNF 信号通路。已有研究表明，AD 患者皮肤中 NF-κB 通常处于高度活化状态，会增加炎症细胞的浸润程度[26]，从而引发皮肤炎症反应；NFκB 抑制剂可有效抑制过敏性炎症，降低炎症细胞浸润及 AD 相关细胞因子释放。实验结果显示，BP 可有效降低特应性皮炎小鼠皮肤的 p-p65/p65、p-IκB/IκB 比值，抑制蛋白磷酸化激活，进而下调促炎因子表达，调节炎症反应。PI3K/AKT 信号通路是一类研究广泛的典型信号通路，参与调控细胞凋亡、转录翻译及代谢等多种生物学过程[27]。在炎症性疾病中，PI3K/AKT 信号通路被异常激活，AKT 和PI3K 蛋白磷酸化水平显著升高[28]。本实验结果进一步证实，BP 处理后 PI3K 与 AKT 的磷酸化水平显著降低，表明其可抑制 PI3K/AKT 通路的异常激活。综上所述，BP 通过阻碍 PI3K/AKT 和 NF-κB 信号通路的激活发挥抗炎作用，从而缓解特应性皮炎症状。 参考文献： [1] Wang L, Xian Y F, Hu Z, et al. 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基于Rep蛋白定向进化与高通量筛选提高rAAV产量 宋紫川 任和 莫婉婷 聂简琪 白仲虎 DOI:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2026-0320 （点击此处下载全文） 目的  对Rep蛋白编码基因进行随机突变，构建突变体文库并建立高通量筛选平台，以获得可提高rAAV产量的Rep蛋白突变体，并解析其作用机制。 方法采用易错PCR构建Rep蛋白突变文库。利用带挡板24孔深孔板培养HEK293细胞并进行三质粒转染，以rAAV基因组滴度为指标，将产量接近或高于对照组80%的培养孔定义为候选突变组。对候选组中Rep蛋白突变体进行摇瓶复验，获得Rep蛋白有益突变体。通过分析rep基因和cap基因转录、Rep蛋白和Cap蛋白表达、rAAV转导效率，并基于AlphaFold3预测Rep78蛋白结构以及突变位点定位，解析突变体rAAV产量提高机制。 结果基于高通量筛选与摇瓶验证获得2个Rep蛋白有益突变体P39L与Q202H，其rAAV产量分别提高至对照组的2.0倍与1.8倍。对Rep蛋白的P39位点与Q202位点进行饱和突变未进一步提高rAAV产量。进一步分析表明，Rep蛋白突变体P39L和Q202H未显著影响Rep蛋白与Cap蛋白的表达量及rAAV的转导效率。结构定位结果表明，P39位于起源结构域（origin-binding domain，OBD）区域，Q202位于OBD与同源异型结构域（homeodomain，HD）的过渡区域且靠近OBD。 结论建立了Rep蛋白定向进化与高通量筛选技术，获得了可将rAAV产量分别提高至对照组的2.02倍和1.87倍的Rep蛋白有益突变体P39L和Q202H。OBD及其邻近区域是影响rAAV产量的重要敏感区域。 关键词 重组腺相关病毒；Rep蛋白；随机突变；高通量筛选；病毒产量 引用本文：宋紫川,任和,莫婉婷等.基于Rep蛋白定向进化与高通量筛选提高rAAV产量[J].生物技术通报,2026. DOI:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2026-0320. 重组腺相关病毒载体（recombinant adeno-associated virus，rAAV）具有免疫原性低、体内表达持续时间长及安全性较高等优点，已成为当前体内基因递送中应用最广、临床转化最成熟的载体体系之一［1-3］。近年来，rAAV相关基因治疗已在脊髓性肌萎缩症、遗传性视网膜疾病和血友病等疾病中取得重要进展［4-5］。截至2026年，全球已有9款AAV相关基因治疗产品获批上市，同时有超过200项临床试验持续推进，显示出巨大的临床应用潜力［4，6-7］。随着临床需求不断增长，rAAV高剂量给药、制备成本高和产能不足等问题日益突出，高效生产rAAV成为制约其进一步应用的重要瓶颈［8］。 目前，基于HEK293细胞的三质粒瞬时转染体系是rAAV实验室研究和产业化生产中最常用的技术路线［9-11］。近年来，围绕强化rAAV生成效率的研究逐渐由培养工艺优化转向生产质粒和包装元件的分子生物学设计［12-14］。已有研究表明，通过重组辅助元件、优化生产质粒组成或重新设计包装相关顺式/反式元件，可改善rAAV的产量。Ren等［15］进一步构建了对Rep蛋白和Cap蛋白进行双重诱导调控的表达系统，通过调节两者的表达时序与强度，将rAAV产量提高2.6倍，表明包装元件表达平衡与时序控制对生产效率具有显著影响。因此，包装相关元件的分子生物学设计是决定rAAV生产效率的重要因素之一［16-18］。 在三质粒转染系统中，Rep蛋白直接参与病毒基因组复制、包装及转录调控，是影响rAAV产量的核心因子之一［19-20］。相较于衣壳蛋白，Rep蛋白并非最终rAAV制剂的结构组成成分，因此对其进行工程改造理论上可在不改变组织特异性的前提下提高生产效率［21］。Jain等［22］通过对AAV2的rep基因全扫描突变文库系统评估单密码子替换和缺失对产量的影响，发现有益突变主要富集于起源结构域（origin-binding domain, OBD）区域，表明Rep蛋白具有可供工程改造的功能空间。此外，Rep蛋白的寡聚化在其多功能性中起关键作用。Musayev等［23］发现，连接Rep蛋白N端结构域与解旋酶结构域的连接子区域是寡聚化的重要组成，其中的保守芳香族残基Y224对Rep68的寡聚化和病毒活性至关重要。上述研究表明，Rep蛋白改造是提高rAAV产量的一种有效策略，但针对Rep蛋白关键位点的系统筛选、功能验证及结构-功能关系分析仍相对不足［24］。 本研究围绕Rep蛋白工程改造提高三质粒转染HEK293细胞生产rAAV产量这一目标，拟探究Rep蛋白序列变化对rAAV生产效率的影响，明确可提高rAAV产量的有益突变体及其位点特征；分析相关突变体在提高rAAV产量的同时是否影响病毒转导效率，并阐明其可能的作用基础，期望通过识别影响rAAV产量的Rep蛋白关键敏感位点，为Rep蛋白理性设计及rAAV高效生产策略优化提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验材料与主要试剂 DH5α大肠杆菌感受态购自上海生工生物工程股份有限公司。质粒pAAV-RC5（#104964）购自美国Addgene公司；质粒pHelper购自日本TaKaRa公司；质粒pAAV-CMV-EGFP购自美国Thermo Fisher Scientific公司。QuickMutation基因随机突变试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；PrimeSTAR Max DNA聚合酶购自宝生物工程（大连）有限公司；MultiF Seamless Assembly Mix购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；无内毒素质粒小提试剂盒和DNA回收试剂盒购自北京全式金生物技术股份有限公司；基因组DNA提取、逆转录及qPCR相关试剂购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；RNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技股份有限公司。硫酸卡那霉素购自麦克林生化科技股份有限公司；PEI Max购自美国Polysciences公司；三角摇瓶购自广州洁特生物过滤股份有限公司；带挡板24孔深孔板购自成都英德生物医药设备有限公司；BalanCD培养基购自美国FUJIFILM Irvine Scientific公司，使用前添加4 mmol/L L-谷氨酰胺。 1.1.2 主要仪器 实时荧光定量PCR：Applied Biosystems；WB化学发光成像系统：ThermoFisher Scientific；荧光显微镜：Olympus；流式细胞仪：BD Biosciences；二氧化碳培养箱：ThermoFisher Scientific；酶标仪：BioTek Synergy H1。 1.2 方法 1.2.1 Rep蛋白随机突变文库的构建与定点饱和突变 以质粒pAAV-RC5为模板，设计随机突变片段上下游引物（附表），并按照随机突变试剂盒说明书对反应体系进行优化，对rep基因编码区进行随机突变扩增。PCR扩增产物经DpnⅠ消化去除甲基化模板后进行纯化，并采用Gibson Assembly方法组装至线性化的pAAV-RC5质粒骨架中，构建Rep蛋白随机突变表达质粒文库。重组质粒转化至感受态大肠杆菌中扩增，挑取单菌落进行测序，对文库的突变频率及突变偏好性进行初步评估，以确保文库中突变体主要包含1-3个氨基酸突变。随后挑取单菌落培养并提取质粒，作为后续筛选文库。 针对筛选获得的Rep蛋白突变体，分析其突变位点后，进一步采用定点饱和突变构建Rep蛋白突变体。通过设计含目标突变位点的引物（附表），以包装质粒为模板进行扩增，PCR产物经纯化后通过Gibson Assembly方法组装回载体骨架中。重组质粒经测序确认正确后，用于后续功能验证实验。 1.2.2 摇瓶中HEK293细胞三质粒瞬时转染生产rAAV 将HEK293细胞按照1.3×106 cells/mL接种至含30 mL BalanCD培养基的125 mL带挡板摇瓶中，并进行三质粒瞬时转染生成rAAV。以PEI Max为转染试剂，DNA与PEI的质量比为1∶1.4，总DNA用量为0.70 μg/mL。三质粒体系包括辅助质粒pHelper、穿梭质粒pAAV-CMV-EGFP和包装质粒pAAV-RC5，三者质量比为1∶1∶1。将质粒与转染试剂分别使用BalanCD培养基稀释后混匀，室温孵育15 min后加入细胞培养液中，然后放入摇床中继续培养。转染后24 h取样，用于检测rep/cap基因转录水平；转染后72 h收获细胞悬液，用于rAAV基因组滴度（vector genome, vg）测定及Rep蛋白与Cap蛋白表达分析。 1.2.3 Rep蛋白突变体高通量筛选技术 为实现Rep蛋白突变体的高效筛选，本研究建立了基于带挡板24孔深孔板的高通量筛选体系。采用带挡板的24孔深孔板进行细胞培养与三质粒瞬时转染，每孔培养体积为2 mL，摇床转速为200 r/min，转染方法参照摇瓶中细胞转染并按体积等比例缩放。转染后将24孔深孔板置于37 ℃、5% CO₂培养箱中继续培养72 h，随后检测各培养孔rAAV产量。为提升筛选通量，在初筛阶段将两种含不同Rep突变体的包装质粒等质量混合后共转染HEK293细胞，以rAAV基因组滴度为指标，将产量接近或高于对照组80%的培养孔定义为候选突变组。随后，将候选突变组内的两个Rep蛋白突变体分别在摇瓶中单独转染复验，并将rAAV产量显著高于野生型Rep蛋白对照组的突变体定义为Rep蛋白有益突变体。 1.2.4 rAAV基因组滴度检测 使用qPCR方法对样品中rAAV基因组滴度进行检测，用于表征rAAV产量。具体操作方法为：转染后72 h收集细胞悬液，采用含1% Pluronic F-68的TE缓冲液进行适当稀释。随后加入1 U TURBO DNase（Merck，德国），并于37 ℃孵育30 min，随后于75 ℃孵育10 min灭活DNase。然后加入1% SDS并于95 ℃加热处理10 min，使AAV衣壳变性并释放基因组DNA。采用EGFP特异性引物（附表）对样品中rAAV基因组DNA进行扩增并进行定量。以pAAV-EGFP质粒为标准品建立标准曲线。根据探针法qPCR试剂说明书配置反应体系，并使用StepOnePlus实时荧光定量PCR系统进行检测，并根据标准曲线计算样品中rAAV基因组滴度，结果以vg/mL表示。 1.2.5 Rep蛋白与Cap蛋白转录水平与蛋白表达水平检测 为分析Rep蛋白突变体对rep基因和cap基因转录的影响，在转染后24 h和72 h取样，按照总RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA。随后使用反转录试剂盒去除基因组DNA并进行逆转录反应获得cDNA。以cDNA为模板，基于SYBR Green法使用StepOnePlus实时荧光定量PCR系统检测rep基因、Rep78/68基因和cap基因转录水平。以GAPDH作为内参基因，对样品的基因表达水平进行归一化处理。 为检测Rep蛋白与Cap蛋白表达水平，转染后72 h取样并提取细胞总蛋白。蛋白样品经SDS-PAGE分离后转膜，分别采用Rep蛋白与Cap蛋白特异性抗体进行孵育和显色。以β-actin为内参蛋白，比较不同样品间Rep蛋白和Cap蛋白的表达差异。 1.2.6 rAAV样品制备及转导效率检测 在转导前24 h将受体细胞HEK293细胞按照3.0×105 cells/well接种至6孔板中，培养基为DMEM培养基补加5%胎牛血清。转导前更换为无血清DMEM培养基，并将rAAV样品按照1×105 vg/cell加入6孔板中进行转导。转导24 h后更换为含血清DMEM培养基继续培养。转导48 h后，使用胰酶消化并收集细胞，使用荧光显微镜观察EGFP表达情况，并使用流式细胞术检测EGFP阳性细胞比例，进行rAAV样品转导效率分析。 1.2.7 Rep78蛋白结构预测与突变位点定位分析 使用AlphaFold3 Server对Rep78蛋白氨基酸序列进行结构预测，并使用PyMOL软件对Rep蛋白有益突变体的关键突变位点进行三维定位。通过可视化分析突变位点在Rep78蛋白中的空间分布特征及其与功能区域的相对位置关系，从结构层面对突变体的功能进行分析。 1.2.8 统计学分析 实验结果以平均值±标准差（Mean ± SD）表示。除特别说明外，各实验均至少进行3次独立重复。数据整理、作图及统计分析采用GraphPad Prism 9.0软件完成。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。 2 结果 2.1 高通量筛选获得Rep蛋白有益突变体 为获得能够提高rAAV产量的Rep蛋白突变体，本研究基于三质粒瞬时转染HEK293细胞生产rAAV体系，对Rep蛋白突变体文库进行24孔深孔板初筛和摇瓶复验，实验流程见图1。 图1   Rep蛋白突变体高通量筛选与功能分析流程图Fig. 1   Schematic workflow of high-throughput screening and functional analysis of Rep protein mutants 2.1.1 24孔深孔板高通量筛选获得候选突变组 基于HEK293细胞三质粒瞬时转染体系，以rAAV基因组滴度作为主要评价指标，对Rep蛋白突变文库进行24孔板高通量筛选。本研究共筛选了400个Rep蛋白突变体，展示其中具有代表性的两批次筛选（图2-A，B）。结果显示多数候选突变组rAAV产量低于对照组，仅约10%候选突变组的rAAV产量高于对照组。挑选rAAV产量接近或高于对照组80%的培养孔，野生型Rep蛋白对照组的rAAV产量为（1.99±0.56）×1011 vg/mL，最终获得R5、R8、R9、R15、R17、R19、R21、R26和R34共9个候选突变组，其rAAV产量范围为对照组的0.73-1.13倍，并对候选突变组所用的包装质粒进行基因测序。测序结果显示，各候选突变组中Rep蛋白突变体分别为R5：S25G与P39L，R8：T65S与M43L+L45P+V104A，R9：R119K与A56T+V148M+V189L，R15：A168V与C179T，R17：C151S与E6K+N46K+R61C，R19：M91V与Q202H，R21：I330M与M445L，R26：I502K与N532Y+P573H，R34：C604N与D615V+D616H。上述结果表明，该筛选体系可用于Rep蛋白突变体文库的初步筛选。 图2   Rep蛋白突变体高通量筛选及摇瓶验证Fig. 2   High-throughput screening and shake-flask validation of Rep protein mutants A，B：候选突变组的rAAV产量；C：候选突变组中单点突变体摇瓶复验结果；D：候选突变组中多点组合突变体摇瓶验证结果。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，ns表示差异无统计学意义，下同 A, B: rAAV yields of candidate mutant groups. C: Shake-flask validation results of single-point mutants from candidate mutant groups. D: Shake-flask validation results of multi-point combination mutants from candidate mutant groups. *, **, and *** indicate P<0.05, P<0.01, and P<0.001, respectively; ns indicates no significant difference. The same below 2.1.2 摇瓶复验获得Rep蛋白有益突变体 基于24孔深孔板筛选结果，将R5、R8、R9、R15、R17、R19、R21、R26和R34共9个候选突变组内的两个Rep蛋白突变体分别在摇瓶中进行三质粒转染生产rAAV验证。摇瓶复验结果显示，野生型Rep蛋白对照组的rAAV产量为（1.93±0.19）×1011 vg/mL，Rep蛋白突变体P39L和Q202H的rAAV产量分别为（3.91±0.15）×1011 vg/mL与（3.61±0.19）×1011 vg/mL，分别为对照组的2.02和1.87倍（图2-C，D）。相比之下，Rep蛋白突变体M445L与C604N的rAAV产量分别为对照组的1.10倍与1.20倍，但与对照组相比差异无统计学意义；Rep蛋白多位点突变体（M43L+L45P+V104A，A56T+V148M+V189L，E6K+N46K+R61C，N532Y+P573H，D615V+D616H）的rAAV产量为对照组的0.66-0.99倍，均未表现出显著性增产效果。综合24孔深孔板筛选和摇瓶验证结果，确定Rep蛋白突变体P39L和Q202H为Rep蛋白有益突变体。上述结果表明，带挡板24孔深孔板高通量筛选与摇瓶复验可高效获得Rep蛋白有益突变体。 2.1.3 Rep蛋白有益突变体突变位点饱和突变 为进一步提高rAAV产量，对Rep蛋白有益突变体突变位点P39和Q202进行饱和突变，并分析不同氨基酸替换对rAAV产量的影响（图3-A，B）。对于P39位点，在该批次转染中，野生型Rep蛋白对照组的rAAV产量为（2.22±0.31）×1011 vg/mL，P39L突变体的rAAV产量为（3.63±0.56）×1011 vg/mL，为对照组的1.65倍，提高效果最为明显；碱性氨基酸替换P39R和P39K的rAAV产量分别为对照组的1.54倍和1.29倍，但其产量低于P39L；疏水/非极性氨基酸替换对rAAV产量影响不具有规律性，其中P39L突变体对rAAV产量的提高表现最佳，而P39A与P39G突变体导致rAAV产量降低；而对于极性不带电氨基酸替换，P39S、P39T、P39N突变体的rAAV产量略微提高但未表现出显著性差异，而P39Q突变体导致rAAV产量降低；酸性氨基酸替换P39D、P39E的rAAV产量与对照组相比差异无统计学意义。 图3   P39和Q202位点饱和突变体rAAV产量分析Fig. 3   rAAV yields of saturation mutants at P39 and Q202 sites A：P39位点饱和突变体rAAV产量；B：Q202位点饱和突变体rAAV产量 A: rAAV yields of saturation mutants at the P39 site. B: rAAV yields of saturation mutants at the Q202 site 对于Q202位点，该批次野生型Rep蛋白对照组的rAAV产量为（1.63±0.13）×1011 vg/mL。Q202H和Q202R突变体的rAAV产量较高，分别为（3.29±0.44）×1011 vg/mL和（2.30±0.54）×1011 vg/mL，分别是对照组的2.02倍和1.41倍；极性不带电氨基酸替换有利于提高rAAV产量，其中Q202S和Q202T突变体优于Q202N和Q202C突变体；而对于疏水/非极性氨基酸，Q202A、Q202F、Q202W、Q202M、Q202I、Q202Y、Q202P突变体可提高rAAV产量，而Q202L、Q202G、Q202V突变体的rAAV产量无显著性差异或降低；酸性氨基酸替换有利于提高rAAV产量。综上所述，对P39和Q202位点进行饱和突变未获得进一步优于P39L或Q202H的突变体，说明P39L和Q202H仍是本研究筛选范围内较有利于提高rAAV产量的突变形式。 2.2 Rep蛋白有益突变体提高rAAV产量的机制分析 为探索Rep蛋白有益突变体P39L和Q202H提高rAAV产量的作用基础，进一步对Rep蛋白有益突变体P39L和Q202H的Rep蛋白与Cap蛋白转录和翻译水平、rAAV转导效率、三维结构进行分析。 2.2.1 Rep蛋白有益突变体Rep蛋白与Cap蛋白转录水平及表达水平分析 为探究Rep蛋白有益突变体P39L和Q202H提高rAAV产量的机制，本研究检测了转染后24 h和72 h的rep基因、Rep78/68基因与cap基因的转录水平，以及转染72 h后的Rep/Cap蛋白表达水平。结果显示，转染24 h后Rep蛋白有益突变体P39L和Q202H的rep基因转录水平（Rep蛋白总mRNA）分别为对照组的1.38倍和1.57倍，均高于对照组；P39L组Rep78/68基因转录水平为对照组的1.31倍，而Q202H组为对照组的0.75倍（图4-A、B）。转染72 h后，P39L组和Q202H组与对照组的rep基因转录水平与Rep78/68基因转录水平未表现出显著差异。转染24 h后，P39L和Q202H组cap基因转录水平分别为对照组的1.60倍和1.37倍，均高于对照组；转染72 h后，两组cap基因转录水平分别为对照组的0.56倍和0.53倍，低于对照组（图4-C）。Western blot结果显示，转染72 h后，P39L和Q202H组Rep78/68、Rep52/40及VP1/2/3蛋白条带强度与对照组接近，未观察到明显表达差异（图4-D）。上述结果表明，P39L和Q202H突变体可提高转染早期rep/cap转录水平，但在转染后期未持续提高Rep/Cap蛋白表达水平。 图4   P39L和Q202H突变体对rep/cap基因转录、蛋白表达及rAAV转导效率的影响Fig. 4   Effects of P39L and Q202H mutations on rep/cap gene transcription, protein expression and rAAV transduction efficiency A：转染后24 h和72 h的rep基因转录水平；B：转染后24 h和72 h的Rep78/68基因转录水平；C：转染后24 h和72 h的cap基因转录水平；D：Western blot检测转染72 h后Rep78/68、Rep52/40、VP1/2/3蛋白表达情况；E：转染后48 h流式细胞术检测EGFP阳性细胞比例；F：转染后48 h EGFP表达的代表性荧光显微照片，比例尺100 μm A: rep gene transcription levels at 24 h and 72 h post-transfection. B: Rep78/68 gene transcription levels at 24 h and 72 h post-transfection. C: cap gene transcription levels at 24 h and 72 h post-transfection. D: Western blot analysis of Rep78/68, Rep52/40, and VP1/2/3 protein expression at 72 h post-transfection. E: Percentage of EGFP-positive cells detected by flow cytometry at 48 h post‑infection. F: Representative fluorescence micrographs showing EGFP expression at 48 h post-transduction. Scale bars, 100 μm 2.2.2 rAAV转导效率分析 为评估Rep蛋白有益突变体P39L和Q202H对rAAV转导效率的影响，使用流式细胞术和荧光显微镜检测相同vg用量下rAAV样品转导HEK293细胞48 h后的EGFP阳性细胞比例。结果显示，对照组、P39L组和Q202H组EGFP阳性细胞比例分别为46.37%±0.84%、47.10%±2.63%和45.47%±1.83%，组间差异无统计学意义（图4-E，F）。该结果表明，P39L和Q202H突变体可显著提高rAAV产量，但未显著改变所获rAAV的体外转导效率。 2.3 Rep78蛋白结构预测及有益突变位点定位分析 为进一步分析P39L和Q202H突变位点的结构分布特征，本研究基于AlphaFold3预测Rep78蛋白三维结构模型，对Rep蛋白P39和Q202两个位点进行空间定位分析（图5）。结果显示，P39位于Rep78蛋白的OBD区域，并处于该结构域表面。Q202位于OBD与HD的过渡区域，且更靠近OBD一侧。局部结构放大图显示，P39周围分布有密集的氨基酸侧链，Q202同样位于侧链分布较密集的结构域衔接区域，在Rep78全长结构中位于结构域衔接部位的邻近区域。上述功能实验表明，P39L与Q202H突变体分别将rAAV产量提升至对照组的2.02倍和1.87倍，而P39与Q202位点的饱和突变均未获得产量更高的突变体。综合饱和突变与结构定位分析可知，P39与Q202在氨基酸替换偏好及空间分布特征上存在显著差异：P39位于OBD结构边缘，对残基侧链长度及局部空间填充能力较为敏感；Q202毗邻结构域连接区，更偏好能参与极性相互作用或介导构象调节的残基类型。上述结果提示，P39与Q202虽不能直接认定为DNA接触残基，但其所处的OBD区域及OBD-HD过渡区域可能是影响Rep蛋白功能与rAAV产量的重要敏感区域。 图5   基于AlphaFold3预测的Rep78蛋白结构及P39、Q202位点定位Fig. 5   AlphaFold3‑predicted structure of Rep78 protein and the localization of P39 and Q202 A：Rep78蛋白预测结构及主要功能区域标注；B：P39位点在OBD区域中的空间位置；C：Q202位点在OBD-HD过渡区域中的空间位置 A: Predicted structure of Rep78 protein with annotation of major functional regions. B: Spatial localization of P39 in the OBD region. C: Spatial localization of Q202 in the OBD-HD transition region 3 讨论 随着rAAV在基因治疗领域的应用持续扩展，生产效率不足已成为制约其规模化制备与成本控制的关键瓶颈［14］。除培养工艺优化外，包装相关元件的工程化改造亦是提升rAAV产量的重要策略。Rep蛋白作为病毒基因组复制与包装过程的核心调控因子，其序列优化对提高rAAV产量具有重要研究价值［15，25-26］。本研究基于Rep蛋白随机突变文库，建立了“24孔深孔板初筛+摇瓶复筛”的高通量筛选流程，成功获得可显著提高rAAV产量的Rep蛋白有益突变体P39L和Q202H，其rAAV产量分别提高至野生型Rep蛋白对照组的2.02倍和1.87倍。 高通量筛选方法的效率与可靠性是获得有益突变体的关键。本研究采用“双突变体等质量比混合转染”策略，在24孔深孔板中进行初筛，有效提升了筛选通量；随后通过摇瓶复验对候选孔内单个突变体进行独立验证，最终获得P39L和Q202H两个稳定增产突变体。该策略在兼顾筛选效率的同时，亦保证了结果的可靠性。值得注意的是，混合转染策略存在突变体效应相互抵消的可能性：若同一培养孔中同时包含增产与减产的两种突变体，可能导致该孔整体产量无显著提升，从而使增产突变体被漏筛。尽管如此，“24孔深孔板初筛+摇瓶复筛”的两步筛选策略仍为Rep蛋白突变体的高效挖掘提供了可行路径。 饱和突变分析显示，P39和Q202位点均具有明确的氨基酸替换偏好，但偏好模式存在差异。P39位点对具有适当侧链长度和局部填充能力的氨基酸（L、R、K）更为兼容；Q202位点则更偏好能够参与局部极性相互作用或构象调节的氨基酸（H、R、S、T、Y）。该结果表明，Rep蛋白的有益突变并非遵循统一的理化性质规律，而表现出强烈的位点依赖性，与大规模扫描研究结论相呼应［22，27-28］。 机制研究表明，P39L和Q202H虽在转染早期（24 h）对rep基因转录水平及Rep78/68基因水平产生一定影响，但在转染后期（72 h）其rep基因转录水平及蛋白表达水平均与野生型无显著差异，表明P39L和Q202H突变体并未通过改变Rep/Cap蛋白表达量来提高rAAV产量。结合其rAAV产量显著提升的结果，推测rAAV增产效应可能与病毒基因组复制或包装过程效率变化有关，而非通过持续提高Rep/Cap蛋白表达量实现。Rep78和Rep68作为复制起始的核心蛋白，其OBD负责识别复制起点，解旋酶结构域（helicase domain, HD）负责解旋DNA，二者协同决定病毒基因组复制效率［23，27-30］。因此，氨基酸替换可能在不改变蛋白表达水平的前提下，通过调控复制功能影响rAAV产量［31］。 结合结构定位分析，Rep蛋白的P39位于OBD区域的外围侧链堆积环境，Q202位于OBD与HD过渡区且更靠近OBD一侧。根据Jaiswal等［24］报道的AAV2 Rep68-AAVS1复合物结构，并结合本研究预测的Rep78蛋白结构发现两个位点虽均不直接位于DNA结合表面，但均能显著影响rAAV产量。这一发现揭示，除直接参与DNA结合或切割的残基外，位于功能结构域内部或结构域连接区的局部位点也可能对rAAV产量产生重要影响，与其他研究中将OBD及其邻近区域作为Rep蛋白工程改造的热点区域的结论相一致［24］。 综上，本研究建立的Rep蛋白突变体筛选流程为挖掘rAAV增产突变体提供了有效工具，筛选获得Rep蛋白突变体P39L和Q202H的位点特征分析进一步证实OBD及其邻近区域是Rep工程改造的重要靶区。结合近年来Rep蛋白工程化改造、包装质粒设计及表达调控研究进展，进一步证明Rep蛋白序列优化是提升rAAV生产效率的关键方向之一。 4 结论 本研究建立了Rep蛋白突变文库高通量筛选平台，通过“24孔深孔板初筛+摇瓶复验”策略，获得可将rAAV产量分别提高至对照组2.02倍和1.87倍的有益突变体P39L和Q202H，且未显著影响Rep/Cap蛋白表达水平及转导效率，提示其增产效应可能与基因组复制效率增强相关。结构定位显示P39位于OBD区域，Q202位于OBD-HD过渡区且靠近OBD，进一步证实OBD及其邻近区域是Rep工程改造的关键敏感区域。 文章所有附图附表请点击链接查看（https：//biotech.aiijournal.com/fileup/1002-5464/NEWS/20260819173459_NewsFile_62.pdf）。 推荐阅读 生物技术通报 | CRISPR高通量筛选技术及其在畜牧研究中的应用 生物技术通报 | 重组腺相关病毒瞬时表达系统的理性设计及其高效生产工艺的建立 生物技术通报 | 徐炜—基于R-loop靶向编辑技术的R-loop功能位点高通量筛选系统 《生物技术通报》是由中国农业科学院农业信息研究所主办、生物工程技术领域高水平综合性学术期刊，由知名科学家谢旗研究员担任期刊主编。主要报道与农业科学相关的国内外生物技术领域最新基础研究成果，致力于为学术共同体打造学术成果传播和交流的优秀平台。目前是EI、中文核心期刊、中国科技核心期刊，入选CSCD核心库、RCCSE核心，“百种中国杰出学术期刊” “中国精品科技期刊” “中国科技期刊卓越行动计划——中文领军期刊”“首都科技期刊卓越行动计划中文期刊”。 投稿网站：http://biotech.aiijournal.com 当 前 目 次 2026年 1期 2026年 2期 2026年 3期 2026年 4期 2026年 5期 2026年 6期 2026年 7期 2026年 8期 2025年 9期 2025年 10期 2025年 11期 2025年 12期 （点击图片阅读对应期次文章） 欢迎订阅： 1. 各地邮局订阅：邮发代号18-92 2. 科学出版社期刊发行部：电话 010-64017032；010-64017539 3. 网上购买：扫描下方二维码或在淘宝、微店搜店铺名称“中科期刊”可直接订阅 赞助单位 投稿、转载信息发布及合作等事宜请联系:010-82109925/82109903 官方唯一投稿系统：http://biotech.aiijournal.com 长按关注：生物技术通报

行业基础科普：多肽合成服务的基本认知 多肽是由氨基酸通过肽键连接而成的生物活性分子，分子量介于小分子化合物与蛋白质之间，在生命科学基础研究与药物开发中扮演着核心角色。从细胞信号转导机制探究、抗体筛选制备，到新型药物先导化合物优化、功能性生物材料开发，多肽定制合成服务已成为科研链条中不可或缺的一环。 多肽合成主要采用固相合成法，其基本原理是将目标肽链的C端氨基酸固定在树脂上，通过逐步偶联氨基酸、脱保护、洗涤等循环操作，最终从树脂上切割得到粗肽。这一技术路线自20世纪60年代发展至今，已相当成熟，但不同服务商在合成工艺、纯化策略、质控标准上的差异，直接决定了最终产品的纯度、活性与批次稳定性。 多肽的纯度等级通常分为粗肽、脱盐级、70%-99%以上不同梯度。对于细胞实验、动物实验等要求较高的应用场景，通常建议选择95%以上纯度；而用于结构生物学、核磁共振等精密研究时，可能需要98%甚至99%以上的高纯度产品。多肽的修饰类型则更为复杂，包括磷酸化、乙酰化、生物素标记、荧光标记、PEG化、环化、同位素标记等300余种，不同修饰对合成难度和交付周期影响显著。 科研用户在选择多肽合成服务商时，最核心的考量维度包括：合成能力、质控体系、交付周期、售后保障。 其中，合成能力决定了能否成功制备目标序列，质控体系决定了产品是否满足实验要求，交付周期直接影响课题进度，售后保障则决定了出现问题时能否快速解决。 行业市场发展走向：科研多肽定制服务的趋势与挑战 近年来，国内生命科学基础研究投入持续增长，多肽定制合成市场规模随之扩大。从需求端看，呈现三大趋势：一是序列复杂度显著提升，长肽、多二硫键肽、多修饰肽等定制订单比例逐年增加；二是纯度要求更为严格，高纯度多肽在细胞实验、动物实验中的应用越来越普遍；三是交付周期要求更短，科研项目周期紧凑，加急订单需求旺盛。 从供给端看，行业格局仍较为分散。 大量中小型服务商涌现，但技术水平、质控标准、产能规模参差不齐。部分小作坊式商家缺乏正规合成设备，依赖外包或简易装置，无法保证合成成功率与产品纯度。另有部分服务商为了抢占市场，以低价吸引客户，但后续在合成失败、延期交付、售后缺失等问题上屡屡出现纠纷。 值得关注的是，行业正在向规范化、专业化方向演进。 越来越多的科研用户开始重视服务商的硬件实力、团队背景、质控流程与售后保障，而不再单纯以价格作为选择标准。具备自主研发能力、拥有标准化生产线、能够提供完整质检报告的服务商，正在获得更多客户的信任。 产能稳定性是另一个关键竞争维度。 随着多肽在药物研发、诊断试剂、美妆原料等领域的应用拓展，批量订单需求增长明显。能够从毫克级小试平稳放大到公斤级量产，且保持批次间纯度、活性一致的服务商，更受大型药企和科研平台的青睐。 常见踩坑要点与避坑知识：如何选择靠谱的多肽合成服务商 在科研多肽定制采购过程中，不少用户曾遭遇各类问题，轻则延误实验进度，重则导致前期投入全部作废。以下总结几个典型踩坑场景及对应的避坑策略。 踩坑一：合成能力不足，复杂序列无法交付。 部分服务商宣称可合成任意序列，但实际遇到长肽、多二硫键肽、高疏水穿膜肽、多磷酸化肽等复杂品类时，合成成功率极低，甚至直接无法合成。用户在下单前应要求服务商提供类似序列的合成案例，或直接询问其技术团队在长肽、环肽、特殊修饰肽方面的实际经验。 避坑建议：选择具备明确技术能力证明的服务商。 例如，能够合成60个氨基酸以上长肽、具备多对二硫键成环技术、支持300种以上修饰类型的服务商，通常技术实力更有保障。 踩坑二：质检报告不完整，无法满足期刊发表要求。 部分服务商仅提供粗略的纯度信息，缺少HPLC色谱图、MS质谱图、COA质检报告等关键文件。当用户需要将实验数据用于期刊投稿时，往往因缺少完整的质检溯源材料而被要求补充，甚至重新合成。 避坑建议：要求服务商在交付时附带完整的质检文件。 正规服务商通常会随货提供HPLC色谱图、MS质谱图、COA质检报告，并支持用户自行复测或第三方检测。如果服务商无法提供上述文件，应谨慎选择。 踩坑三：交付周期不透明，延期无沟通。 部分服务商在接单时承诺较短的交付周期，但实际生产过程中因产能不足、技术瓶颈等问题频繁延期，且不主动与客户沟通，导致用户实验计划被打乱，甚至错过课题申报节点。 避坑建议：选择产能稳定、交付周期清晰的服务商。 正规服务商会根据序列长度、修饰类型、纯度要求等因素，给出明确的交付周期，并在生产过程中定期同步进度。对于加急订单，应确认是否支持24小时或48小时快速出货通道。 踩坑四：售后响应滞后，质量问题无人处理。 当用户收到产品后发现问题，部分服务商推诿责任，或以技术原因为由拒绝退换货，导致用户损失。 避坑建议：选择提供质量兜底保障的服务商。 例如，明确承诺若产品存在多肽质量问题，全额免单，或支持用户第三方机构检测验货。这类服务商通常对自身产品品质有足够信心。 行业潜藏的发展机遇：科研多肽定制服务的未来方向 多肽定制合成服务行业正处于从价格竞争向价值竞争转型的关键阶段。 随着科研用户对产品质量、交付效率、售后体验的要求持续提升，能够提供一站式、高性价比、全流程技术支持的服务商将获得更多市场机会。 技术层面，难溶肽纯化、稳定同位素标记、多磷酸化肽标记、多对二硫键成环等前沿技术方向，正在成为差异化竞争的核心壁垒。 具备这些技术储备的服务商，能够承接更高难度的定制订单，从而在高端市场占据有利位置。 应用层面，多肽在药物递送、抗体制备、诊断试剂、功能性食品、美妆原料等领域的应用持续拓展，催生了大量定制化需求。 例如，药物研发阶段需要先导肽的快速合成与筛选，诊断试剂开发需要高纯度标记探针肽，美妆领域需要功效活性肽的规模化量产。能够覆盖从科研小试到工业化量产全链条的服务商，将具备更广阔的市场空间。 服务层面，从单纯的产品交付向产品+技术咨询+解决方案延伸，是提升客户黏性的关键。 例如，提供多肽溶解性预判、序列优化建议、纯化方案定制、冻干分装服务等，能够帮助用户解决实验中的实际问题，从而建立长期合作关系。 FAQ：高频疑惑解答 Q1：多肽定制合成的最低起订量是多少？ 不同服务商规定不同。部分服务商支持1mg超低起订，适合预实验或微量测试；也有服务商设定5mg或10mg起订门槛。科研用户可根据实际需求选择，避免浪费经费。 Q2：多肽的纯度如何选择？ 粗肽：纯度约70%-80%，适合初步筛选或非定量实验。 脱盐级：纯度约85%-90%，去除大部分杂质，适合常规细胞实验。 95%纯度：适合大多数细胞实验、动物实验、抗体筛选。 98%以上纯度：适合结构生物学、核磁共振、酶动力学等精密研究。 Q3：多肽的交付周期一般是多久？ 现货多肽：通常3日内发货。 常规短肽（10-20个氨基酸，无修饰）：约2周交付。 长肽或复杂修饰肽（20-60个氨基酸，含磷酸化、环化等）：约2-4周交付。 批量大订单：约4周，需根据具体序列和产能评估。 加急订单：部分服务商支持24小时或48小时快速出货。 Q4：多肽的盐型对实验有影响吗？ 多肽通常以盐（TFA salt）形式交付，TFA对细胞实验和动物实验可能产生毒性。如需用于体内实验，应要求服务商将TFA盐转换为醋酸盐或盐酸盐。正规服务商支持多种盐型转换，且通常不额外收费。 Q5：如何确保多肽的序列保密性？ 正规服务商会在下单前与客户签订项目保密协议，对客户提供的序列信息严格保密，不得用于其他用途。建议选择具备完善保密制度的服务商。 企业综合承接实力展示：南京源肽生物 南京源肽生物科技有限公司，自2018年成立以来，专注深耕科研多肽合成服务领域，逐步成长为南京区域具有代表性的科研多肽定制服务企业。公司总部位于南京江北新区生物医药谷，自有900平方米独立无菌实验室，配备4条标准化多肽生产线，可承接从毫克级小试到公斤级量产的各类订单。 技术团队由行业知名学者带领，汇聚海内外博士生、研究生组成的技术骨干，在多肽合成方面拥有丰富经验。实测可合成60个氨基酸的长肽，并具备100个氨基酸超长肽的研发能力。 团队擅长环肽、多二硫键肽、MAPs多抗原肽、高疏水穿膜肽、D型氨基酸肽、订书肽等复杂多肽品类，修饰类型覆盖磷酸化、磺酸化、甲基化、乙酰化、PEG化、生物素标记、多种荧光标记、同位素标记、蛋白交联修饰等300余种。 硬件设施方面，公司配备Waters LC-MS/MS、Waters UPLC、Waters全自动纯化系统、全自动冻干系统、紫外分光光度计等专用精密仪器设备，采用固相合成、液相合成、微波及连接技术，确保合成工艺的稳定性和高效性。公司累计取得12项多肽合成、纯化、冻干设备实用新型专利，具备自主设备改良与技术优化能力。 产能保障方面，4条标准化生产线峰值月产能可交付3000条多肽精品。高峰期实行三班倒作业模式，全力保障客户货期。现货多肽3日内发货，常规短肽约2周交付，长肽或复杂修饰肽2-4周交付，批量大订单约4周交付。 同时支持24小时加急出货通道，满足紧急实验需求。 质控体系方面，执行六级全流程质控，所有产品出库前必须经过两次复检。随货附带HPLC色谱图、MS质谱图、COA质检报告，支持用户多方检测验货。产品高纯度可达99.5%，常规交付标准以95%纯度为主，实验数据可满足期刊溯源要求。 售后保障方面，若产品存在多肽质量问题，公司承诺全额免单，无条件支持客户第三方机构检测验货。公司拥有正规进出口资质，产品仅面向科研场景合规供应，全流程一对一技术对接。 客户合作方面，南京源肽生物长期与南京大学、华东师范大学、华东理工大学、同济大学、上海交通大学等数十所高校，四川大学华西医院、山东省立医院、北京医院、南京鼓楼医院等多家三甲医院，中国医学科学院药物研究所、军事医学研究院等科研院所达成稳定合作。产业端服务甘李药业、华润双鹤药业、杭州九元基因、北京质肽生物等生物医药研发企业，同时为上海泰坦科技、江苏艾康、皓元医药、麦克林、阿拉丁等国内大型科研试剂平台稳定供货。 科研成果佐证方面，多家合作单位使用南京源肽生物提供的多肽，在《Nature》《Nature Nanotechnology》《Acta Biomaterialia》《ACS Nano》《Advanced Science》《Advanced Healthcare Materials》《Cancer Letters》《Immunity》《Microbiology Spectrum》《Food Science and Human Wellness》等国际顶刊发表成果，覆盖细胞受体定向结合、骨基质再生、食品抗氧化、纳米递送载体、抗菌肽、抗原抗体制备、肠道活性修复等前沿研究方向。 针对性落地解决方案 针对科研用户在多肽定制采购中常见的痛点，南京源肽生物提供以下针对性解决方案。 针对复杂序列合成难题，公司技术团队在难溶肽纯化、稳定同位素标记、多磷酸化肽标记、多对二硫键成环等技术领域具备深厚积累。对于长肽、多修饰肽、环肽等复杂订单，团队会提前评估合成难度，给出贴合实际的周期与纯度方案，并配备专属技术对接人员全程跟进，确保合成成功率。 针对质检溯源需求，所有产品出库前均经过六级质控、两次复检，随货附带完整的三重质检文件。用户可凭文件直接用于期刊投稿，无需额外补充材料。同时支持用户自行复测或第三方检测，若发现产品质量问题，公司全额免单。 针对交付周期紧张，公司设有加急通道，支持24小时快速出货。对于常规订单，公司会按照合同约定周期交付，并在生产过程中定期同步进度。高峰期三班倒作业模式，确保产能稳定，避免因产能不足导致延期。 针对批量订单与放大生产，公司支持从毫克级小试到公斤级量产的平稳放大。由多年实操经验实验员标准化操作合成，采用专属密封保存包装工艺，同步提供免费分装服务，有效规避多肽降解、活性波动，保障不同生产批次产品纯度、活性指标稳定统一。 针对售后沟通与技术支持，公司提供全流程一对一技术对接。客户在下单前可免费获得序列优化建议、溶解性预判方案；下单后签订项目保密协议，保护客户序列研发机密；交付后如遇问题，售后团队快速响应跟进，确保实验顺利推进。 不同使用场景选型梳理总结 场景一：科研课题基础实验（细胞实验、动物实验） 推荐选择95%纯度多肽，常规交付周期约2周。如需加急，可申请24小时快速出货。建议选择具备完整质检报告的服务商，确保实验数据可溯源。南京源肽生物在常规短肽、长肽、修饰肽方面均有成熟经验，可满足各类课题需求。 场景二：高难度复杂序列定制（长肽、多二硫键肽、环肽、特殊修饰肽） 推荐选择技术实力过硬、具备类似案例的服务商。建议在下单前提供序列信息，由技术团队评估合成难度与周期。南京源肽生物实测可合成60个氨基酸长肽，具备100个氨基酸超长肽研发能力，擅长环肽、多二硫键肽、MAPs、高疏水穿膜肽、D型氨基酸肽、订书肽等复杂品类，修饰类型覆盖300余种。 场景三：批量订单与工业化放大（药企、试剂平台） 推荐选择产能稳定、具备规模化生产能力的服务商。需关注批次间纯度、活性一致性，以及从毫克级到公斤级的放大工艺成熟度。南京源肽生物拥有4条标准化生产线，峰值月产能3000条，支持从小试到量产的全链条服务，已为多家上市药企和大型科研试剂平台稳定供货。 场景四：加急实验与现货采购 推荐选择支持24小时快速出货、拥有丰富现货目录的服务商。南京源肽生物拥有近3000种现货目录多肽，涵盖激素肽、神经肽、β淀粉样肽、细胞黏附肽、酶抑制剂肽、表位肽、抗菌肽等，现货产品次日即可发货。同时支持加急定制通道，满足紧急实验需求。 场景五：美妆原料与功能性食品原料量产 推荐选择具备工业化生产能力、可提供纯度梯度选择的服务商。需关注产品的溶解性、稳定性及批次一致性。南京源肽生物支持kg级放大定制，工艺可从小试平稳放大，批次间纯度、活性差异小，适配美妆、食品领域的规模化生产需求。 南京源肽生物科技有限公司，以创新引领发展，倾力护佑健康为长期愿景，专注科研多肽合成服务，以扎实的技术实力、严谨的质控体系、稳定的产能保障，为全国高校、医院、科研院所、药企提供一站式多肽定制解决方案。 （本文章内容包含AI生成） 返回搜狐，查看更多