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ABSTRACT
摘要：目的：研究乳复方（RFF）对乳腺癌细胞MDA-MB-231铁死亡的影响机制。方法：利用网络药理学获取乳复方干预乳腺癌铁死亡靶点并分析其在乳腺癌患者中的表达。构建乳复方干预靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并对乳复方干预靶点进行富集分析，聚焦其诱导铁死亡潜在通路机制。分子对接技术评估乳复方药物有效成分与通路靶点蛋白质的结合能力。采用CCK-8法、EdU法、克隆形成实验、细胞划痕实验、Transwell细胞侵袭实验分别检测细胞活性和细胞增殖、迁移、侵袭情况；采用亚铁嗪比色法、丙二醛（MDA）检测试剂盒、还原型谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒和BODIPY581/591 C1荧光探针检测评价乳腺癌细胞内氧化应激水平；使用RT-qPCR及Western blot检测验证乳复方对诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞铁死亡关键基因GPX4、xCT及通路关键基因Nrf2的mRNA及蛋白表达的影响。结果：利用生物信息学方法筛选出16个乳复方干预铁死亡靶点，网络药理学分析和分子对接结果发现乳复方作用于乳腺癌的机制与诱导乳腺癌发生铁死亡密切相关。体外实验结果表明，乳复方呈剂量依赖性抑制乳腺癌 MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭, 导致MDAMB-231细胞内Fe2+水平显著增加、MDA水平增加、GSH水平减少、ROS水平显著增加，诱导乳腺癌细胞铁死亡。RT-qPCR及Western blot检测结果表明，乳复方能下调铁死亡相关基因GPX4和xCT及Nrf2的mRNA和蛋白的表达水平。结论：乳复方通过Nrf2/xCT/GPX4通路，抑制Nrf2、GPX4和xCT的表达，诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞铁死亡，为中医药防治乳腺癌提供了体外实验依据。
关键词：乳腺癌；乳复方；铁死亡；网络药理学；体外实验
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乳腺癌是全球女性健康的主要威胁之一。据世界卫生组织下属国际癌症 研究机构（International agency for research on cancer, IARC） GLOBOCAN全球癌症统计数据库发布的数据显示[1]，2022年女性乳腺癌发病率占全球癌症发病率的11.6%，排名第二。在女性中，乳腺癌的发病率和死亡率均位居首位，分别为23.8%和15.4%，严重威胁女性健康。乳腺癌的发生与多种危险因素相关，包括遗传因素、环境暴露、生活方式以及生殖因素等。乳腺癌可分为Luminal A型、Luminal B型、HER2过表达型和三阴性乳腺癌（Triple negative breast cancer，TNBC）4种亚型。尽管现代医学采用的手术、化疗、靶向治疗、免疫治疗和放疗等综合手段都取得了显著进展[2]，但乳腺癌患者的5年生存率仍不理想，且易在3~5年内出现早期转移,常见于中枢神经系统和肺部[3]。然而，现代医学治疗乳腺癌常导致上肢淋巴水肿、骨髓抑制、消化道反应、神经毒性和放射性皮炎等不良反应[4]，不仅对患者的生活质量造成影响，还可能对治疗的持续进行及其效果产生限制，因而，中医药在乳腺癌治疗中的协同作用日益受到重视。因此，探索新的中医药治疗靶点对优化乳腺癌预后效果至关重要。
作为一种新型非传统形式程序性细胞死亡，铁死亡在肿瘤学研究领域逐渐成为焦点。铁死亡主要是由于细胞内铁离子的积累，引发脂质过氧化，最终导致细胞死亡，其与传统的凋亡、坏死等细胞死亡方式有着明显的区别[5]。作为一种与肿瘤发生、发展及治疗耐药性密切相关的细胞死亡形式，涉及铁代谢、脂质过氧化、肿瘤微环境、治疗耐药性肿瘤进展和基因信号通路等多个层面[6]，铁死亡在肿瘤治疗策略的制定中具有重要意义。近年来，随着对铁死亡与乳腺癌发病关系的深入研究, 发现以谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）为核心的谷胱甘肽代谢在乳腺癌铁死亡调控中具有重要地位[7]。有研究发现隐丹参酮通过靶向铁蛋白重链1，能诱导N2型肿瘤相关中性粒细胞和TNBC细胞的双重铁死亡[8]。这些研究成果提示，深入探究乳腺癌与铁死亡的关系，有望为乳腺癌的治疗提供新的靶点和策略，具有重要的理论和临床意义。
乳复方（Rufu formula，RFF）是国医大师潘敏求教授根据其数十载临证经验，从“瘀、毒、虚”理论出发而创制的治疗乳腺癌的经验效方。该方以疏肝健脾、补肾益精、化瘀解毒为治则，药物组成为人参15g、黄芪20g、莪术9g、土贝母6g、白花蛇舌草30g、半枝莲30g、紫花地丁15g、蒲公英15g、柴胡10g、香附10g、全蝎3g、重楼9g。在临证时，潘教授强调“病证结合”的动态施治理念，针对不同治疗阶段灵活化裁，围手术期侧重柴胡、香附疏肝理气；放化疗期间加用枸杞、女贞子补肾填精；维持治疗阶段配伍夏枯草、生牡蛎软坚散结。这种“主方恒定、随证加减”的模式，既保持了核心药群的协同作用，又实现了精准个体化治疗。其临床疗效显著，不仅能够有效控制肿瘤，减少复发转移率，而且能配合放化疗起到减毒增效之力，同时还能提高患者机体免疫力，有效延长生存期。随着肿瘤治疗领域的不断深入，中药复方因其独特的多靶点、多途径、多通路作用机制而备受关注。然而，其复杂的治疗机制也为科学研究带来了挑战。因而深入研究乳复方在抗肿瘤方面的分子机制，不仅有助于诠释乳复方治疗乳腺癌的科学依据, 也为其他肿瘤的治疗提供了新的思路。
1 资料与方法
1.1 乳复方的网络药理学研究及分子对接
1.1.1 乳复方干预乳腺癌铁死亡靶点的获取
在TCMSP、Symmap、Herb数据库中进行搜索，获取乳复方（人参、黄芪、柴胡、香附、白花蛇舌草、半枝莲、土贝母、 莪术、蒲公英、紫花地丁、全蝎、重楼）的有效成分；在Pubchem数据库中根据最佳匹配获取药物成分的 Smiles号；并在SwissADME数据库中根据胃肠吸收度（GI）为high、类药性(Drug likeness)≥3 个yes为筛选条件进行筛选，最后在SwissTargetPrediction数据库预测靶点，以probability>0为筛选条件获取靶点并收集整理。从FerrDb数据库（http://www.zhounan.org/ferrdb）检索并获取铁死亡相关基因（Ferroptosis-Related genes，FRGs）。 以“Breast cancer”为检索词在GEO 数据库中筛选相关数据集，采用R语言“limma”包对GSE42568数据集进行差异表达基因分析，筛选出乳腺癌差异基因。整合3部分的数据，取铁死亡相关基因、乳腺癌差异基因以及乳复方作用靶点3个数据集的交集，借助“ggplot2”包和“VennDiagram”包可视化工具绘制韦恩图，获得乳复方干预乳腺癌铁死亡的潜在作用靶点。
1.1.2 乳复方干预靶点在乳腺癌患者中的表达
分析从癌症基因组图谱（Thecancer genomeatlas, TCGA) 数据库（https://portal. gdc. cancer. gov/）获取TCGA-BRCA队列转录组数据，涵盖1113例乳腺癌组织及113例癌旁正常乳腺组织样本。通过提取干预靶点基因表达谱数据，采用配对/非配对样本检验方法，以外部验证GEO数据集筛选出的干预靶点的表达差异，进一步明确其表达差异的稳定性与可靠性。此外，基于人类蛋白图谱（Human proteinatlas，HPA）数据库（https://www.proteinatlas.org/）下载乳复方干预靶点的免疫组化图像，直观对比乳腺癌组织与正常乳腺组织蛋白表达差异[9]。
1.1.3 乳复方干预靶点蛋白-蛋白互作（Protein protein interaction，PPI）网络构建
基于STRING(https://cn.string-db.org/)数据库构建乳复方干预靶点PPI 网络模型，采用 Cytoscape 3.9.1软件平台绘制相应的PPI网络图。
1.1.4 基因本体（GO）富集与京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析
基于R语言平台，运用“clusterProfiler”包联合“org. Hs. eg. db”包，对乳复方干预靶点系统开展GO与KEGG 富集分析。通过分层解析生物学过程（Biological process，BP）、细胞组分（Cell component，CC）、分子功能（Molecular function，MF）3个功能维度，结合KEGG信号通路富集结果，构建多维功能注释网络，系统分析乳复方干预乳腺癌铁死亡潜在作用机制。
1.1.5 分子对接
利用分子对接技术评估乳复方药物有效成分与干预靶点蛋白质的结合活性。从PubChem数据库（https://pubchem. ncbi. nlm. nih.gov/）获取乳复方药物有效成分的标准化3D 分子结构[10]。从RCSB蛋白质数据[11] (Protein data bank，PDB)（http://www. rcsb. org/）下载Nrf2、xCT、GPX4蛋白的高分辨率X射线晶体结构。对蛋白质结构进行预处理，包括结晶水分子去除、氢原子添加等拓扑结构优化后保存为pdb格式文件。采用AutoDock 4.2.6[12]和PyMOL 2.5.2 软件开展乳复方药物有效成分和Nrf2、xCT、GPX4蛋白之间的对接研究。使用AutoDock工具的网格框功能确定乳复方药物有效成分与蛋白质结合的活性成分的特定口袋区域。通过使用命令提示符执行分子对接计算，并利用PyMOL可视化呈现乳复方活性成分与Nrf2/xCT/GPX4蛋白的特异性结合模式及关键相互作用力类型。
1.2 体外实验探索乳复方对乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响
1.2.1 实验药物及其含药血清制备
乳复方药物由人参15g、黄芪20g、柴胡10g、香附10g、莪术9g、土贝母6g、白花蛇舌草30g、半枝莲30g、紫花地丁15g、蒲公英15g、全蝎3g、重楼9g 等中药组成，全部中药材购自湖南省中医药研究院附属医院新绿药颗粒药房。SD 雌性大鼠30只，体质量为200~220g，随机分组，空白血清组及含药血清组各15只。含药血清组以配制的中药药液灌胃：以70kg成人体质量每日生药量172g进行大鼠等效剂量换算[13]，大鼠的临床等效剂量为15.48g/kg，以2倍量30.69g/kg进行灌胃；空白血清组用等体积的纯净水灌胃，连续给药7d，末次给药后，使用异氟烷麻醉，腹主动脉采血，4℃下4000rpm离心分离血清，0.22μm滤过膜过滤除菌后分装，-80℃冰箱保存备用。 血清配制: 实验前采用生理盐水作为稀释基质, 将含药血清进行梯度稀释，设置5%、10%、15%、20%、25%、30%共6个浓度梯度。
1.2.2 实验试剂及仪器
DMEM/F12培养基（货号：AW-MC005）、PBS缓冲液（货号： AWC0215a）、 胰酶消化液（货号：AWC0238a）、胎牛血清（FBS）(货号：AWC0227a）、青链霉素双抗（货号：AWH0529a）、细胞冻存液（货号：AWC0229）、结晶紫（货号：AWC0333）、BCA蛋白定量（货号：AWB0104c ）、GPX4抗体（货号：AWA11352）、Nrf2抗体（货号：AWA48931）、xCT抗体（货号：AWA10085）、辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(H+L) 二抗（货号：AWS0001）、山羊抗兔IgG(H+L) 二抗、HRP偶联（货号：AWS0002）均购自艾碧维生物科技有限公司；96孔板（货号：0030730119）购自艾本德国际贸易有限公司; CCK-8（货号：NU679）、 6孔板（货号：703001）、中皿（货号：705001）购自无锡耐思生命科技股份有限公司；EDU检测试剂盒（货号：C10310）购自广州锐博生物科技有限公司; DAPI（货号：C1005）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）检测试剂盒（货号：S0131M）、ROS试剂盒（货号：S0033S）购自上海碧云天生物技术有限公司；4%多聚甲醛（货号：N1012）购自苏州新赛美生物科技有限公司；亚铁含量检测试剂盒（货号：JL-T1255）购自上海江莱生物科技有限公司；Transwell小室（货号：3428）购自Corning公司；erastin（货号：HY-15763）购自上海市从事科研化学品和生物活性化合物供应商的公司（MedChemExpress）; 还原型谷胱甘肽（Reduced glutathione，GSH）检测试剂盒（货号：BC1175）购自北京索莱宝科技有限公司；PCR提取试剂盒（货号：DP419）购自天根生化科技（北京）有限公司；PCR 逆转录试剂盒（货号：E047）购自上海近岸科技有限公司;β-actin 抗体（货号：66009-1-Ig）购自武汉三鹰生物技术有限公司。
倒置生物显微镜（货号：DSZ2000X）购自北京中显恒业仪器仪表有限公司；低速离心机（货号：SL02）购自上海知信实验仪器技术有限公司；多功能酶标分析仪（货号：MB-530）购自汇松医疗科技（绍兴）有限公司；荧光显微镜（货号：AE31E）购自麦克奥迪实业集团有限公司；全自动酶标洗板机（货号：PW-812）购自深圳市汇松科技发展有限公司；流式仪（货号：A00-1-1102）购自贝克曼库尔特有限公司；电泳仪（货号：DYY-6C）、电泳槽（货号：DYCZ-24DN）、转膜仪（货号：DYCZ-40D）购自北京六一生物科技有限公司；电子天平(货号：JJ224BC) 购自美国双杰；化学发光成像系统（货号：ChemiScope6100）购自上海勤翔科学仪器有限公司；生物样品均质仪（货号：BioPrep-24）购自杭州奥盛仪器有限公司。
1.2.3 细胞培养
人乳腺癌MAD-MB-231细胞，购于长沙艾碧维公司，产品货号为AW-CCH048。用含10%FBS和1%的青霉素-链霉素双抗溶液（终浓度：青霉素100mg/mL，链霉素50mg/mL）的DMEM培养液在37℃ 、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养。细胞培养2~3d可传代培养，取处于对数期生长状态良好的细胞做后续实验。
1.2.4 CCK-8法检测细胞活性
选取处于对数生长期的MDA-MB-231细胞，以每孔5×103个细胞的密度接种于96孔板中，每孔的接种体积为100μL，每个实验组中均设置3个复孔。待细胞充分贴壁之后，使用不同终浓度的乳复方含药血清（浓度依次为5%、10%、15%、20%、25%、30%）对MDA-MB-231细胞进行处理，然后将细胞放置在温度为37℃、CO2浓度为5%的环境中分别孵育12h、24h和48h。移除孔内的培养基，向每孔中添加100μL的CCK-8溶液孵育30min。之后，在波长450nm处测量吸光度（OD值），以此来确定细胞的活力情况，并计算均值，进而绘制柱状图。运用 GraphPad Prism 9.0 软件来测定半数抑制浓度（IC50）。 细胞存活率(%)=[(OD 实验组-OD空白 )/(OD 对照-OD 空白) ]×100% 。
1.2.5 实验分组
根据CCK-8实验确定乳复方干预的最佳条件。将MDA-MB-231细胞分为5 组，分别为空白对照组、空白血清组（15%空白血清）、乳复方低剂量组（10%含药血清）、乳复方中剂量组（15%含药血清）、乳复方高剂量组（20%含药血清）。
1.2.6 EdU 法检测细胞增殖
选取处于对数生长期的MDA-MB-231细胞均匀地接种于6孔板中，贴壁后分组干预处理。用细胞培养基以1000∶1的比例稀释EdU溶液，制备50μmol/L的EdU培养基。每孔加100μL EdU培养基，孵育过夜后弃去。PBS清洗后，每孔中加入50μL 4%多聚甲醛固定液，室温固定30min。再向每孔中加入50μL浓度为2 mg/mL的甘氨酸溶液，脱色摇床振荡处理5min。PBS清洗后，每孔添加100μL渗透剂，脱色摇床上孵育10min，PBS清洗5min。每孔中加入100μL的1×Apollo，避光、室温条件下，脱色摇床上孵育30min后弃去染色反应液，加入渗透剂脱色摇床清洗3次，每次10min。每孔加甲醇清洗2次，每次5min，PBS清洗1次5min。用去离子水以100∶1的比例稀释Hoechst 33342，避光备用，每孔中加入100μL的Hoechst 33342反应液，避光、室温条件下，脱色摇床上孵育30min后弃去，PBS清洗3次。染色结束后立刻使用荧光显微镜拍摄图片。实验中，经EdU标记的增殖细胞呈现红色，而被Hoechst 33342染色的活细胞则为蓝色。EdU相对数量=EdU阳性细胞数/总活细胞数。
1.2.7 克隆形成实验检测细胞增殖
选取对数生长期的MDA-MB-231细胞均匀地接种于6孔板中，经0.25%胰蛋白酶消化处理，然后通过吹打使其成为单个细胞状态，并将这些细胞悬浮于含有10%胎牛血清的完全培养基中，留作后续实验使用。将上述制备好的细胞悬液，以200个/孔的密度，分别均匀接种于装有1mL培养液的6孔板内，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下连续培养3周，期间定期更换培养基。在培养期间需经常进行观察，当培养皿中出现肉眼可清晰分辨的细胞克隆时，便终止培养，依次进行以下处理：PBS缓冲液轻柔洗涤两次→4%多聚甲醛室温固定15min→0.1%结晶紫溶液染色30min→流水冲洗晾干。最终使用倒置光学显微镜进行克隆集落成像记录，并通过Image J 软件定量分析克隆形成率。
1.2.8 细胞划痕实验评估细胞迁移情况
选取对数生长期的MDA-MB-231细胞接种于6孔板，待细胞成功贴壁后，对细胞进行分组处理。调整细胞密度至5×105个/孔进行单层铺板培养。取一个6 孔板，使用Marker笔在板的背面，借助尺子均匀地画出横线。 另外取一瓶细胞，用胰酶进行消化，消化后对细胞进行计数，然后在每个孔中加入约5×105个细胞。待细胞融合度达90%以上时，使用200μL无菌移液器枪头沿直尺垂直于先前画好的横线方向，在细胞单层表面制造均质划痕。PBS缓冲液轻柔洗涤3次去除脱落细胞, 更换无血清DMEM培养基维持培养。分别在0h、24h和48h时间点于倒置显微镜下采集划痕区域图像（每组设置3个重复视野）。采用Image J 图像分析软件定量计算细胞迁移率，细胞迁移率=（初始划痕面积-各时间点划痕面积）/初始划痕面积×100% 。
1.2.9 Transwell 细胞侵袭实验评估细胞侵袭情况
实验前24h对Matrigel基质胶、Transwell小室及相关耗材进行4℃预冷处理。使用无血清培养基稀释Matrigel至工作浓度（200μg/孔），每小室加入100μL稀释液后37℃聚合30min形成基质膜。将含10%胎牛血清的完全培养基加入下室作为化学催化剂。取对数生长期MDA-MB-231细胞经胰酶消化制备单细胞悬液，调整细胞密度至2×106个细胞/mL，每孔接种100μL细胞悬液于基质胶包被的小室上室。37℃培养48h后，移除上室未侵袭细胞，经PBS漂洗后采用4%多聚甲醛固定细胞20min。0.1%结晶紫染色5min后，在倒置显微镜下随机选取3个视野进行细胞计数，使用Image J 软件对侵袭细胞进行定量分析。
1.3 体外实验探索乳复方对乳腺癌细胞铁死亡的影响及机制研究
1.3.1 实验分组
本部分实验旨在探索乳复方对于乳腺癌细胞铁死亡的影响，故将MDA-MB-231细胞分为6组，分别为空白对照组、空白血清组、乳复方低剂量组（10%含药血清）、乳复方中剂量组（15%含药血清）、乳复方高剂量组（20%含药血清）及erastin（10μmol/L）阳性对照组。 其中，erastin为铁死亡诱导剂。
1.3.2 Fe2+水平检测
本研究采用亚铁嗪比色法试剂盒对MDA-MB-231乳腺癌细胞株中的Fe2+水平进行了定量分析。取对数生长期的MDA-MB-231细胞，将其接种于6孔培养板中。把细胞培养在含有不同浓度乳复方以及erastin（10μmol/L）的培养基中，在37℃的条件下孵育48h。孵育结束后，将各组细胞收集至离心管内，向其中加入200μL提取液，通过超声波破碎细胞（操作在冰浴环境下进行，功率设置为200W，每次超声持续3s，间隔10s，重复操作30次）。随后，在4℃的环境下以12000rpm的转速离心10min，取上清液并放置在冰上等待检测。 运用BCA 法对各组的蛋白进行定量检测，从而计算出各组的蛋白浓度（mg/mL）。 接着，按照亚铁含量（亚铁嗪比色法）检测试剂盒的说明书进行操作：先将酶标仪预热30min，并设定波长为562nm；待所有试剂解冻至室温后，在EP管中依次加入相应试剂，充分混匀，在室温下放置15min。之后，取200μL上清液至96孔培养板中，在波长562nm处读取各组的吸光度值, 并依据标准曲线来计算各组MDA-MB-231细胞中的Fe2+含量。Fe2+含量的计算公式为：Fe2+含量(nmol/mgprot) = 35. 81× (OD 实验组-OD空白 )/(OD标准-OD空白 )/蛋白浓度×稀释倍数。
1.3.3 丙二醛(Malondialdehyde, MDA) 和还原型谷胱甘肽(Reduced glutathione，GSH) 水平的测量
利用MDA检测试剂盒和GSH检测试剂盒，对MDA-MB-231细胞株中MDA和GSH的含量进行了定量分析。实验中，选取处于对数生长期的MDAMB-231细胞，将其接种于6孔培养板中，每孔接种量为5×104个细胞。随后，将细胞置于含有不同浓度的乳复方含药血清和erastin（10μmol/L）的培养基中，于37℃条件下培养48h。为评估MDA和GSH的水平，采用专门的检测试剂盒。首先，对细胞进行裂解处理,然后通过离心分离上清液。接着，将上清液与试剂盒中的试剂混合，进行孵育反应。孵育结束后，再次离心以去除沉淀物。取200μL的上清液加入96孔培养板中，特别注意各样本设3个技术重复以确保数据可靠性。使用多功能酶标仪进行双波长同步检测：MDA定量选择特征吸收波长532nm，GSH测定在512nm 波长下检测黄色产物的吸光值。最后通过标准品建立浓度-吸光度标准曲线（R2>0.99），采用四参数非线性回归模型计算各样本相对浓度值。最终数据以处理组/对照组的相对百分比形式呈现。
1.3.4 细胞内脂质过氧化（Reactive oxygen species，ROS）的检测
本研究利用DCFH-DA荧光探针来评估 MDA-MB-231乳腺癌细胞内的ROS水平。首先，取对数生长期的MDA-MB-231细胞以5×104个/孔的密度接种于6孔培养板中。接着，将细胞置于含有不同浓度的乳复方含药血清和erastin（10μmol/L）的培养基中, 在37℃条件下培养48h。DCFH-DA荧光探针的母液浓度为10mmol/L，用无血清培养液按1∶1000的比例稀释，以获得10μmol/L的工作液浓度。将经过上述处理的细胞收集，用500μL的工作液重悬细胞沉淀，然后在37℃的细胞培养箱中孵育30min。孵育结束后，用无血清培养液清洗细胞，以去除未被细胞摄取的DCFH-DA，最后用PBS缓冲液冲洗细胞3次。通过流式细胞仪检测细胞的荧光强度，并使用荧光显微镜进行拍照观察。此外，还利用Image J 软件对脂质过氧化产生的 ROS水平进行定量分析。
1.3.5 RT-qPCR检测
本研究利用PCR提取试剂盒和逆转录试剂盒，测定 MDA-MB-231乳腺癌细胞中铁死亡相关基因的mRNA表达水平。首先，取对数生长期的MDA-MB-231细胞以每孔5×104个的密度接种于6孔培养板中。随后，将细胞置于含有不同浓度的乳复方含药血清和erastin（10μmol/L）的培养基中，在37℃条件下培养48h。培养结束后，收集细胞样本，并根据PCR提取试剂盒分离总RNA，NanoDrop2000 分光光度计检测RNA纯度（A260/A280 为1.8~2.1）及浓度。随后使用逆转录试剂盒合成cDNA。PCR扩增体系（20μL）包含：SYBR Green Master Mix 10μL，正反向引物各0.4μL，cDNA 模板2μL，RNase-free 水7.2μL。扩增程序设置为：95℃预变性3min；95℃ 变性30s→55℃退火30s→72℃延伸30s，共40个循环。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司提供, 具体序列见表1。以GAPDH作为内参基因，每组实验使用5个独立的生物样本，每个样本进行3次重复实验。通过2-△△Ct 方法计算目标基因的相对表达量，计算公式:ΔΔCt=(Ct 靶基因实验组-Ct 内参实验组)-(Ct靶基因对照组-Ct内参对照组) 。通过比较关键铁死亡调控基因(Nrf2、xCT、GPX4) 的mRNA表达水平变化，评估乳复方诱导乳腺癌铁死亡过程的干预效应。
1.3.6 免疫蛋白印迹（Western blot，WB）检测
采用 WB 技术分析乳复方对乳腺癌细胞铁死亡相关蛋白表达的影响。分别用含有不同浓度的乳复方含药血清和erastin（10μmol/L）处理 MDA-MB-231细胞， 预冷PBS缓冲液洗涤细胞。加入200μL的RIPA裂解缓冲液后，采用超声细胞破碎仪处理（200W，5s脉冲×3次），冰浴裂解30min后，4℃条件下12000g离心15min收集上清液。使用BCA试剂盒测定蛋白浓度后，按比例制备10%分离胶和5%浓缩胶。将等量蛋白样品（30μg/孔）加入SDSPAGE电泳槽，初始电压75V使样品通过浓缩胶，溴酚蓝指示剂到达分离胶后调整为110V，持续电泳约90min。随后采用湿转法（300mA恒流，90min）将蛋白转移至0.45μm硝酸纤维素膜。 封闭阶段使用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液室温封闭2h。一抗孵育条件∶抗Nrf2 （1∶500）、抗xCT（1∶1000）、抗GPX4（1∶1000）及β-actin内参抗体（1∶5000），4℃震荡孵育16h。TBST缓冲液洗涤3次（每次10min）后，分别对应种属选用 HRP标记二抗（1∶5000）室温轻摇孵育1. 5h，再次TBST洗涤3次（每次15min）。使用ECL超敏化学发光底物进行显影，化学发光信号经Image Lab软件采集。目标蛋白条带灰度值通过Image J 1.53 软件分析，以β-actin作为内参进行标准化处理。实验数据采用 GraphPad Prism 9.0进行统计学分析,每组实验独立重复3次。
1.4 统计学方法
所有数据的统计分析采用R软件（version 4.2.1）中的“stats”（version 4.2.1）和“car”（版本3.1-0）包完成。所有数据均以均数±标准误（SE）表示。采用单因素方差分析比较各组间指标的差异。在数据满足正态性和方差齐性假设的样本中，先进行单因素方差分析，再进行Tukey post-hoc检验。然而，方差齐性或正态性不符合，则使用 Games-Howell或Dunnett检验。 以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 乳复方干预乳腺癌的网络药理学研究及分子对接结果
2.1.1 乳复方干预乳腺癌铁死亡靶点的获取
通过数据库收集并经SwissADME数据库筛选后共获得乳复方12味中药的482个有效成分。其中，人参92个、黄芪47个、柴胡160个、香附49个、土贝母7个、莪术10个、白花蛇舌草15个、半枝莲61个、蒲公英21个、紫花地丁17个、全蝎1个、重楼2个。SwissTargetPrediction数据库预测药物干预靶点，剔除重复值后共获取1172个乳复方可能的作用靶点。FerrDb数据库获得905个FRGs，其中包含促进基因、抑制基因、标志基因、未归类的基因。采用R语言“limma”包对校正后的GSE42568转录组数据进行差异分析，以P<0.05且|logFC|>2为条件，筛选出918个乳腺癌差异基因，其中564个差异基因在乳腺癌样本中表达下调，354个差异基因在乳腺癌样本中表达上调。使用“ggplot2”包对差异分析结果进行可视化并绘制火山图。韦恩图分析数据每个组之间的特有和共有的部分，共获得乳复方干预靶点共16个，分别为FABP4、AKR1C1、PPARG、AKR1C3、EZH2、NTRK2、AURKA、 DDR2、ENPP2、TYRO3、VDR、DUSP1、EGFR、PTGS2、KIF20A、TLR4（图1A、图1C）。
2.1.2 乳复方干预靶点在乳腺癌患者中的表达分析
将TCGA-BRCA队列中乳腺癌组织与癌旁乳腺组织进行非配对/配对样本检验，筛选出的16个基因中均在乳腺癌组织中表达有差异。其中，FABP4、AKR1C1、PPARG等12个基因在乳腺癌组织中差异低表达（P<0.001），EZH2、AURKA、VDR等4个基因在乳腺癌组织中差异高表达（P<0.001）。见图1B、图1D。
2.1.3 乳复方干预靶点PPI网络构建
PPI结果显示，16个靶点共有21组蛋白-蛋白互作关系, 其中关系最强的为PTGS2、PPARG和EGFR。在GO、KEGG富集分析中，以P<0.05作为筛选条件，将部分结果进行可视化。GO富集分析结果显示，乳复方干预靶点包含的BP主要有脂质代谢过程的调节、细胞脂质分解代谢过程、对氧化应激的反应、炎症反应的调节及调节细胞酮代谢过程等，细胞组分（CC）主要有染色质沉默复合物、纺锤体极中心体及减数分裂纺锤体等, MF主要有单羧酸结合、羧酸结合、长链脂肪酸结合、核视黄酸受体结合和外源性蛋白结合等。KEGG富集分析结果显示，乳复方发挥抗乳腺癌作用的主要途径包括卵巢类固醇生成、脂肪细胞脂肪分解的调节、类固醇激素生物合成、花生四烯酸代谢、化学致癌作用-活性氧、PPAR信号通路以及影响利什曼病中的通路。这些途径表明乳复方具有治疗乳腺癌的潜力，且其通路机制涉及氧化应激、脂质代谢、炎症因子调节等途径，与Nrf2的调控紧密相关。Nrf2作为关键的抗氧化应激调节因子，与铁死亡之间存在复杂的调控关系，其作用机制主要涉及抗氧化防御、铁代谢平衡及关键信号通路的调控（图2A、图2B）。
2.1.4 分子对接
为了阐明乳复方如何诱导乳腺其对铁死亡的Nrf2/xCT/GPX4抗氧化途径的影响。分子对接研究显示，乳复方有效成分与Nrf2、xCT和GPX4之间存在较强的结合亲和力。其中，乳复方有效成分Celabenzine、panaxatriol、 Gomisin B可以与Nrf2氨基酸之间形成的结合能分别为9.54、13.58、9.89，Celabenzine通过ALA-510 (2. 3 Å) , VAL-465(2.6 Å)和 VAL-418(2.2 Å)氢键与Nrf2结合，panaxatriol可以与VAL-465 (2.3 Å)、VAL-606(2.2 Å、1.8Å)和LEU-557(2.1 Å)氢键与Nrf2结合，Gomisin B通过VAL-514(2.7Å)氢键与Nrf2结合。同样，乳复方有效成分Gomisin B可以与xCT氨基酸之间形成的结合能为11. 7，Gomisin B通过ARG-135(2.8 Å、2.1 Å)、THR-56(2.9 Å) 、ALA-60 (2.7 Å) 、GLY-61(2.8 Å)的氢键与xCT结合。类似地, 乳复方有效成分Celabenzine和panaxatriol可以与GPX4氨基酸之间形成的结合能分别为8. 65、10. 64，Celabenzine通过TYR-63 (2. 8 Å)氢键与GPX4 结合，panaxatriol可 以与ASP-101 (3. 2Å) 、 MET-102(1.8 Å、2. 9Å) 和 LYS-90 (2. 5 Å)氢键与GPX4结合。这表明乳复方与Nrf2/xCT/GPX4途径之间存在直接关联。图2C展示以上阐述的6个乳复方有效成分与通路蛋白的对接结果。
2.2 乳复方抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭
2.2.1 CCK-8法检测结果及乳复方含药血清浓度筛选
采用CCK-8法评估SPXJF对MAD-MB-231细胞活力的影响，并建立最佳给药剂量和给药时间的含药血清。用空白血清组和不同浓度的乳复方含药血清组分别干预MAD-MB-231细胞12h、24h、48h。结果显示，不同浓度的乳复方含药血清对MAD-MB-231细胞活性均具有不同程度的抑制作用，且呈时间、浓度依赖性。因此，选择48h作为干预时间点，10%含药血清作为乳复方低剂量组、15%含药血清作为乳复方中剂量组、20%含药血清作为乳复方高剂量组来开展后续实验（图3）。
2.2.2 乳复方抑制乳腺癌细胞增殖
采用 EdU增殖实验和克隆形成实验检测乳复方对MDA-MB-231细胞增殖的影响。EdU增殖实验结果表明, 与空白对照组相比，低、中、高剂量乳复方含药血清（10%、15%、20%）处理后的MDA-MB-231细胞48h之后，EdU标记细胞的增殖被显著抑制，EdU标记细胞呈剂量依赖性递减，差异具有统计学意义（P<0.05，P<0. 001）。MDA-MB-231细胞48h之后，发现随着乳复方含药血清浓度的增加，由MDA-MB-231细胞形成的菌落的数量显著减少（P<0.05，P<0. 001）。这两个实验结果表明，乳复方呈剂量依赖性抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖（图3）。
2.2.3 乳复方抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭
采用细胞划痕实验和Transwell实验来评估乳复方对MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力的影响。细胞划痕实验结果表明，与空白对照组相比，用低、中、高剂量乳复方含药血清（10%、15%、20%）处理后的MDA-MB-231细胞48h之后，随着乳复方含药血清浓度的增加，迁移到划痕区域的细胞数量逐渐减少（P<0.05，P<0.001），细胞迁移率逐渐下降。Transwell实验结果显示，与空白对照组相比，用低、中高剂量乳复方含药血清（10%、15%、20%）处理后的MDA-MB-231细胞48h之后，随着乳复方含药血清浓度的增加，通过经孔室膜的细胞数量都显著减少（P<0.05，P<0.001）。克隆性形成实验表明，低、中、高剂量乳复方含药血清（10%、15%、20%）处理后的MDA-MB-231细胞48h之后，随着乳复方含药血清浓度的增加，通过经孔室膜的细胞数量都显著减少（P<0.01，P<0.001）。这些数据表明，乳复方含药血清有效地降低了乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力（图4）。
2.3 细胞实验验证乳复方诱导乳腺癌细胞铁死亡机制
2.3.1 乳复方诱导乳腺癌细胞的铁死亡
本研究通过不同检测指标系统评估乳复方对铁死亡相关生物标志物的调控作用。采用铁离子比色法，即Fe2+与亚铁嗪生成的紫红色化合物在562nm处有特征吸收峰，结合标准曲线计算Fe2+含量，适用于检测细胞内的Fe2+含量；通过MDA和GSH检测试剂盒分别定量细胞内脂质过氧化及抗氧化系统关键分子还原型谷胱甘肽的水平；使用ROS试剂盒，即用DCFH-DA活性氧检测探针动态监测ROS，其原理基于ROS将无荧光DCFH氧化为绿色荧光产物DCF，全面评估细胞内Fe2+和脂质过氧化的情况。
在本研究中用不同剂量的乳复方和erastin处理MDA-MB-231细胞，以评估乳复方是否影响了MDA-MB-231细胞的铁死亡。乳复方含药血清（10%、15%、20%）和erastin（10μmol/L）处理导致MDA-MB-231细胞内Fe2+水平显著增加。 从MDA、GSH和ROS水平的测定结果表明，以10%、15%、20%含药血清的乳复方含药血清以及erastin处理会导致 MDA-MB-231细胞内MDA水平增加、GSH水平减少；而且乳复方含药血清和erastin都能显著增加 MDA-MB-231细胞内脂质过氧化ROS的水平。这些结果与空白对照组对比，皆呈剂量依赖性变动（P<0.001），这些结果表明, 乳复方可以诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞发生铁死亡（图5）。
2.3.2 乳复方调控Nrf2/xCT/GPX4通路诱导乳腺癌细胞铁死亡
KEGG富集分析初步揭示了乳复方诱导乳腺癌细胞铁死亡的分子机制可能涉及的多个信号通路与Nrf2相关。分子对接结果表明乳复方与Nrf2、xCT和GPX4之间存在较强的亲和力。为深入探究乳复方是否通过调控Nrf2/xCT/GPX4通路来诱导乳腺癌细胞铁死亡，通过RT-qPCR和Western blot技术系统评估乳复方对通路关键分子Nrf2、xCT、GPX4在转录及翻译水平的调控作用，检测其mRNA和蛋白的表达水平。实验结果显示，在MDA-MB-231乳腺癌细胞中，乳复方含药血清各组相比于空白对照组和空白血清组呈现剂量依赖性的调控作用。不同浓度的乳复方含药血清（10%、15%、20%）和erastin（10μmol）能显著抑制Nrf2、xCT、GPX4的mRNA（P<0.05，P<0.001）和蛋白（P<0.01，P<0. 001）的表达水平。这表明乳复方可能通过抑制Nrf2的表达，进而抑制xCT和GPX4的表达，从而降低细胞对脂质过氧化的清除能力，最终诱发乳腺癌细胞铁死亡，进一步证实了乳复方通过Nrf2/xCT/GPX4信号通路调控乳腺癌细胞铁死亡的分子机制（图6）。
3 讨论
乳腺癌发病率持续升高，严重威胁女性健康，寻找有效的治疗策略迫在眉睫。中医学将乳腺癌归属于“乳岩”“乳癖”“乳疳”等范畴，其病因病机呈现本虚标实之态，外因涉及六淫邪毒侵袭，内因则与肝脾肾功能失调、冲任损伤及情志郁结密切相关。患者先天禀赋不足，或后天饮食失节过食肥甘厚味，致脾胃运化失司、痰湿内生；或长期情志抑郁致肝气郁结、气滞血瘀；更有冲任失调引发胞宫虚寒、气血逆乱，终致痰瘀毒邪互结于乳络。《外科正宗》详述“忧郁伤肝，思虑伤脾，积想在心，所愿不得，致经络痞涩，聚结成核”，揭示情志内伤与肝郁痰凝的核心病机。 现代研究指出，激素代谢紊乱与慢性压力状态可加速痰湿瘀毒形成[14]，与中医“肥人多痰湿”“七情致病”理论相印证。乳腺癌病机演变呈现动态过程：初期以肝郁气滞为主，症见乳房胀痛、情志抑郁；中期痰瘀互结，形成坚硬肿块伴局部脉络瘀阻；后期毒邪炽盛、耗伤气血，出现溃疡渗液及远处流注。
国医大师潘敏求教授在乳腺癌治疗中构建了以“瘀、毒、虚”为核心病机的辨治体系，阐释了乳腺癌“本虚标实”病机动态演变规律[15]。基于乳腺与肝、脾、肾及冲任二脉的生理联系，潘敏求教授提出“疏肝健脾、补肾益精、化瘀解毒”的核心治则，集萃六十载临证经验创制了乳复方，广泛应用于临床乳腺癌的治疗。既往研究表明乳复方联合化疗治疗晚期肝郁脾虚型三阴乳腺癌可有效延长患者生存期，改善临床症状，提高实体瘤疗效[16]。贺立娟[17]的研究显示乳复方联合化疗可降低化疗所致骨髓抑制发生率，具有升高白细胞、粒细胞数量的作用，具有显著的临床疗效。乳复方中选用人参、黄芪扶正健脾以培补后天之本，通过激活脾土生化之源，改善肿瘤微环境中的“虚”态，这与现代研究证实黄芪多糖可调节免疫微环境、抑制肿瘤血管生成的作用机制相契合[18]。柴胡、香附发挥疏肝理气、柔肝缓急之效；莪术、土贝母、半枝莲、白花蛇舌草、重楼等药合用，具有消瘀散结、清热解毒抗癌之功，以消散体内的瘀滞毒邪。现代药理学显示，莪术的有效成分莪术醇可以抑制乳腺癌细胞增殖，阻断乳腺癌细胞 MCF-7和MM-231的RNA合成，导致细胞周期停滞于G0/G1或G2/M期[19]。土贝母苷甲则通过诱导凋亡发挥抗癌作用。土贝母的有效成分土贝母苷甲、白花蛇舌草的有效成分白花蛇舌草苷、重楼的有效成分重楼皂苷Ⅰ均能诱导乳腺癌细胞自噬与凋亡[20-22]。半枝莲的有效成分野黄芩苷能抑制乳腺癌干细胞的增殖和迁移[23]。方中引入虫类药全蝎以毒攻毒、入络祛邪；辅以五味消毒饮中紫花地丁及蒲公英，以发挥清热解毒之功效。诸药配合，组方精妙、配伍严谨，扶正抗癌，标本同治，使肝气得疏、脾肾得健、积聚得消，攻邪之法寓于扶正之中，补养之中又兼有消邪之力。
乳腺癌与铁死亡之间的关联近年来受到广泛关注。铁死亡作为一种铁依赖性的程序性细胞死亡方式，通过脂质过氧化积累和氧化还原失衡触发细胞死亡，在乳腺癌治疗中展现出独特潜力。研究显示，乳腺癌细胞的铁代谢异常和抗氧化系统脆弱性使其对铁死亡高度敏感[24]。研究表明，铁基纳米颗粒可通过靶向递送铁离子至肿瘤微环境，激活芬顿反应并诱导脂质过氧化，显著抑制乳腺癌细胞增殖和转移[25]。此外，铁死亡诱导剂erastin通过抑制xCT、GPX4活性，干扰GSH合成通路，可逆转内分泌治疗耐药和化疗耐药[26]。这些研究为乳腺癌的治疗提供了分子机制支持和新型药物研发方向。
本研究通过网络药理学分析及分子对接技术，整合乳复方有效成分靶点、铁死亡相关基因及乳腺癌差异基因，筛选出PTGS2、PPARG和EGFR等16个乳复方干预乳腺癌铁死亡的关键靶点。TCGA数据库通过配对及非配对样本检测验证显示这16个靶点在乳腺癌中的差异表达。PPI网络构建发现16个乳复方干预靶点间存在21组蛋白-蛋白互作关系，这表明这些靶点并非孤立发挥作用，而是通过复杂的网络相互协作。
富集分析揭示了乳复方干预靶点参与调节氧化应激的反应、炎症反应调节、脂质代谢过程的调节等多种生物过程，与乳腺癌的发生发展密切相关。富集分析显示，乳复方可能通过干预PTGS2（COX-2）的表达活性，促进其催化花生四烯酸生成前列腺素的过程。在此过程中，COX-2同时产生大量ROS，包括超氧阴离子（O-2）和其他氧化产物[27]。ROS通过氧化Nrf2的抑制蛋白Keap1的半胱氨酸残基，导致Keap1构象变化，与Nrf2解离[28]，使Nrf2得以释放并转移至细胞核[29]。核内Nrf2与sMaf蛋白结合，激活含抗氧化反应元件ARE的基因转录。Nrf2通过上调GPX4和xCT的表达，增强细胞对脂质过氧化的清除能力，GPX4依赖GSH还原脂质过氧化物，而xCT负责胱氨酸摄取以维持GSH合成,从而抑制铁死亡[30-31]。有实验表明黄芩素通过激活Nrf2促进GPX4和xCT表达, 减轻脓毒症相关的急性肺损伤中的铁死亡[32]。故本研究选取 Nrf2/xCT/GPX4信号通路，以分子对接技术探索乳复方有效成分与通路蛋白的亲和力, 并开展乳复方的体外实验进行实验验证, 探讨乳复方通过 Nrf2/xCT/GPX4信号通路诱导铁死亡抑制乳腺癌的作用。
分子对接结果显示，乳复方有效成分与通路蛋白 Nrf2、xCT和GPX4之间存在较强的结合亲和力，提示乳复方可能通过调节Nrf2/xCT/GPX4通路诱导乳腺癌铁死亡，进一步支持了乳复方可能通过Nrf2/xCT/GPX4通路诱导铁死亡抑制乳腺癌的观点。体外实验结果显示，乳复方呈剂量依赖性抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭。进一步研究发现，乳复方呈剂量依赖性上调 MDA-MB-231细胞内Fe2+、MDA及ROS水平，下调GSH水平，说明乳复方能通过破坏氧化还原稳态促进脂质过氧化诱导乳腺癌 MDA-MB-231细胞发生铁死亡。通路基因检测提示乳复方能下调铁死亡相关基因GPX4和xCT及Nrf2的mRNA和蛋白的表达水平，说明乳复方诱导乳腺癌细胞发生铁死亡与 Nrf2/xCT/GPX4 信号通路有关。
已有研究表明，氧化应激通过ROS的积累破坏细胞内的氧化还原平衡，直接损伤DNA并激活致癌信号通路，从而促进乳腺癌的发生发展[33]。Nrf2通过调控抗氧化基因、铁代谢和关键信号通路, 在乳腺癌铁死亡中发挥重要作用。从分子机制角度来看，Nrf2通过激活xCT、GPX4等下游抗氧化基因减轻氧化应激，调控铁蛋白、转铁蛋白受体等铁代谢相关基因，影响细胞内铁离子的稳态。铁离子过载是铁死亡的驱动因素之一，Nrf2的激活通过减少游离铁水平，与抑制铁死亡相关[34]。既往研究表明，在乳腺癌干细胞中，Nrf2与ZMYND8形成正反馈环路，通过抑制ROS和铁死亡维持干细胞特性及耐药性[35]。突变型p53通过Nrf2依赖的机制上调GPX4和HMOX1，保护TNBC细胞免受铁死亡[36]。Nrf2通过结合抗氧化反应元件（ARE），直接激活xCT的转录，促进胱氨酸摄取以合成GSH，从而增强细胞对氧化应激的抵抗。Nrf2还通过上调GPX4的表达，增强其依赖GSH的脂质过氧化物清除能力，抑制脂质过氧化进而抑制铁死亡[37]。在辐射损伤、缺血再灌注或药物诱导的氧化应激中，Nrf2的激活通过上调xCT和GPX4，减少脂质过氧化和铁依赖性ROS积累，从而抑制铁死亡[38-40]。Nrf2还可以通过调控铁蛋白和转铁蛋白受体，调节细胞内游离铁水平，间接影响GPX4活性和铁死亡敏感性[41]。本研究表明，乳复方能通过抑制Nrf2的表达，进而下调铁死亡相关基因GPX4和xCT的表达水平诱导乳腺癌发生铁死亡。有实验研究显示杨梅素、辛伐他汀等药物可通过抑制Nrf2/GPX4轴，增加脂质ROS，诱导乳腺癌细胞铁死亡，显著抑制小鼠肿瘤生长[42-43]。还有研究显示，Nrf2及其下游基因xCT、GPX4的表达水平与乳腺癌患者预后呈负相关，高表达提示耐药和不良结局[44]。这些研究与本研究结果一致，可相互印证。
4 结论
乳复方能抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭，其机制可能与调节Nrf2/xCT/GPX4通路诱导乳腺癌铁死亡有关。因此，乳复方具有作为抗乳腺癌方药的潜力，这不仅丰富了中医药理论开发提供了体外实验依据，也为乳腺癌治疗提供了新的策略和方法。
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基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（82205224）；湖南省中医药研究院重点课题项目（202116）；湖南省研究生科研创新项目（CX20230835）
作者简介：汪卫欣（1999—）， 女，湖南中医药大学硕士研究生，研究方向为中西医结合临床防治肿瘤。
通讯作者：潘博（1971—），男，湖南省中西医结合医院主任医师，研究方向为中西结合肿瘤预防及治疗。 E-mail：15675190855@163.com
本文引用格式：汪卫欣,李琳霈,杨笔猜,潘博.基于Nrf2/xCT/GPX4通路的乳复方诱导乳腺癌细胞铁死亡作用机制研究[J].亚太传统医药,2026,22(1):17-29.
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