作者：
斯蒂芬·A·巴斯廷（Stephen A. Bustin）a,*、扬·M·吕伊特（Jan M. Ruijter）b、莫里斯·J·B·范登霍夫（Maurice J.B. van den Hoff）b、米卡埃尔·库比斯塔（Mikael Kubista）c、迈克尔·W·普法夫尔（Michael W. Pfaffl）d、格雷戈里·L·希普利（Gregory L. Shipley）e、恩哈姆·陈（Nham Tran）f、斯特凡·勒迪格（Stefan Rödiger）g、安德烈亚斯·昂特加斯纳（Andreas Untergasser）h、莱因霍尔德·米勒（Reinhold Mueller）i、塔尼亚·诺兰（Tania Nolan）j、莫伊察·米拉韦茨（Mojca Milavec）k、马尔科姆·J·伯恩斯（Malcolm J. Burns）l、吉姆·F·哈格特（Jim F. Huggett）l、若·范德松佩勒（Jo Vandesompele）m、卡尔·T·维特沃恩（Carl T. Wittwern）n
背景
2009年，《实时定量聚合酶链反应（qPCR）实验发表最低信息（MIQE）指南》为研究中qPCR的设计、实施和报告制定了标准。qPCR在众多新领域的拓展推动了新型试剂、方法、耗材和仪器的研发，因此需要修订最佳实践，以适应现代qPCR应用不断变化的复杂性。内容
为确保qPCR结果的可重复性和再现性，必须透明、清晰、全面地描述和报告所有实验细节。这些修订后的MIQE指南反映了qPCR技术的最新进展，就样品处理、实验设计和验证提供了明确建议，并为qPCR数据分析提供了指导。鼓励仪器制造商支持原始数据导出，以便稿件评审人员和相关研究人员进行深入分析和重新评估。指南强调，应根据所选定量方法，将定量循环（Cq）值转换为效率校正后的靶标量，并附上预测区间，同时报告每个靶标的检测限和动态范围。此外，指南还概述了标准化和质量控制的最佳实践，并明确和简化了报告要求。其目的是鼓励研究人员提供所有必要信息，同时避免不必要的负担，从而促进更严谨、可再现的qPCR研究。摘要
基于国际研究团队的协作努力，我们对原始MIQE指南进行了更新、简化并提出了新建议，旨在使其在新兴技术和不断发展的qPCR应用背景下保持相关性和适用性。引言
实时定量聚合酶链反应（qPCR）和逆转录-实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）（1）在健康和生命科学研究中仍被广泛应用（2）。近年来，其应用已显著拓展至临床诊断、农业、环境监测、法医学和监管检测等多个领域。然而，在实际应用中对qPCR的依赖日益增加，使得不准确或不一致结果的影响被放大，可能导致误诊、误判以及公共卫生措施失效等严重后果。因此，修订《实时定量聚合酶链反应实验发表最低信息（MIQE）指南》（3）以适应qPCR应用日益增长的复杂性已成为当务之急。
a英国埃塞克斯郡切姆斯福德市安格利亚鲁斯金大学健康、教育、医学与社会关怀学院医学技术研究中心；b荷兰阿姆斯特丹阿姆斯特丹大学医学中心（AMC校区）医学生物学系；c捷克共和国韦斯特茨捷克科学院生物技术研究所Precision BioAnalytics AB公司；d德国慕尼黑慕尼黑工业大学生命科学学院动物生理学与免疫学系；e美国华盛顿州温哥华市希普利咨询公司；f澳大利亚悉尼科技大学生物医学工程学院；g德国森夫滕贝格勃兰登堡工业大学；h德国海德堡海德堡大学分子生物学中心；i美国加利福尼亚州圣地亚哥市RM咨询公司；j英国萨福克郡伯里圣埃德蒙兹市基因团队；k斯洛文尼亚卢布尔雅那国家生物研究所生物技术与系统生物学系；l英国米德尔塞克斯郡泰丁顿市国家测量实验室（NML）LGC生物计量学部；m比利时根特市根特大学生物分子医学系；n美国缅因州卡姆登市克雷斯伍德科技公司。
*通讯作者联系方式：英国埃塞克斯郡切姆斯福德市毕晓普霍尔巷安格利亚鲁斯金大学医学技术研究中心，邮编CM1 1SQ；电话：+44-0-7920032728；电子邮箱：stephen.bustin@aru.ac.uk。
收稿日期：2024年12月2日；接受日期：2025年3月10日。https://doi.org/10.1093/clinchem/hvaf043
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qPCR的典型工作流程难以统一界定，因为核酸制备的样品类型和方法取决于预期应用，而这也会影响实验设计和适用分析方法的选择。此外，可通过多种试剂、仪器和方案获取结果。这种灵活性，再加上快速、便捷获取大量数据的特点，使得数十万篇经过同行评审的出版物应运而生，涵盖了从古代生物学（4）到国际空间站基因表达分析（5）等多个主题。遗憾的是，这种异质性也导致大量数据发表，这些数据往好里说可能令人困惑，往坏里说则可能具有误导性（6）。
MIQE指南制定了一套标准化建议，涉及qPCR结果的设计、优化、验证、分析和报告。遵循这些指南不仅提高了单个实验室内部结果的质量，还使不同实验室之间的数据对比更加可靠，即使采用不同的实验方案也是如此（7）。透明的报告能够提高结果的准确性，验证解释的合理性，并增强结论的影响力。它还有助于识别变异的潜在来源，区分真正观察到的生物学相关性与方法学不一致性（8）。然而，尽管鼓励研究人员遵守MIQE指南，许多使用qPCR的出版物仍然缺乏透明度，并且采用了不恰当的方法（9-12）。
自MIQE指南发表以来，qPCR试剂、方法、耗材和仪器取得了诸多进展，提高了检测限（LOD）、精密度和通量。例如，qPCR引物设计取得了重大突破（13），同时寡核苷酸修饰的种类也更加丰富、易于获取。实验验证的定义更加明确（14），参考物质和对照物质也逐渐面市（15,16），并且已有关于单细胞（17）和细胞外囊泡（18）基因表达谱的报道。一项令人振奋的进展是“极速PCR”，其扩增可在不到1分钟内完成（19,20）。当超快加热和冷却与高浓度引物和聚合酶相结合时，一个PCR循环可在不到1秒内完成，且不会影响特异性、灵敏度或产量。如果这种方法能够实现标准化和验证，那么它对于现场分析（如即时诊断、微生物鉴定和病原体快速检测）的变革性意义将十分显著（21）。
技术的快速发展要求对MIQE指南进行更新，以确保其始终反映最佳实践，这与数字化MIQE指南的更新类似（22,23）。MIQE 2.0旨在提供清晰、经过深思熟虑的建议，既为研究人员提供支持，又推动科学进步。有效的指南应确保关键最低信息的一致报告，同时促进实验和研究设计的创新性和灵活性。在涉及多个科学家和实验室的合作项目中，标准化方案对于确保互补实验和合作实验室之间的一致性起着重要作用。尽管原始MIQE指南并非旨在成为严格的强制性规则，但它们已成为ISO20395:2019标准的基础，该标准规定了核酸定量方法的评估要求（https://www.iso.org/standard/67893.html），并已被纳入支持基因治疗药物研发的qPCR实验方法开发和验证建议中（24）。
在此基础上，MIQE 2.0解决了影响实验准确性、一致性和再现性的关键因素，包括：（a）变异来源；（b）实验设计；（c）样品储存和核酸制备；（d）逆转录和模板稀释；（e）qPCR方案；（f）PCR效率；（g）熔解曲线分析；（h）数据处理和分析；（i）适当对照的使用。通过关注这些要素，MIQE 2.0为研究人员提供了一个更新后的框架，以生成可靠且具有生物学意义的qPCR数据。
变异来源
RT-qPCR和qPCR实验容易受到变异和误差的影响，这些变异和误差主要分为三类：生物学变异、方案变异和技术变异（10,25,26）。要最大限度地减少这些误差，需要在实验规划、优化、标准化、验证和报告过程中采取严谨的分步方法（27）。生物学变异
这包括研究对象固有的变异以及由个体样品差异（包括基因组序列变异）等因素引起的变异。在比较处理组和未处理组时，由于个体之间的内在差异及其对处理的不同反应，处理组的生物学噪声通常会增加。变异程度在很大程度上取决于研究对象，虽然无法完全控制，但可以通过制定严格的纳入和排除标准来提高研究队列的同质性，同时不丧失组特异性特征，从而减少变异。然而，确保处理组和未处理组之间具有相当水平的同质性对于减轻偏倚至关重要。在许多情况下，生物学噪声会限制分析的效力（28）。可以通过增加个体数量、完善实验设计、使用适当的对照进行标准化以及应用适当的统计分析来评估变异的影响，从而对其进行管理。方案变异
方案变异，即标准程序的差异，源于不同的试剂、仪器和数据分析方法。试剂变异包括引物和探针的选择及浓度、酶和预混液成分（如Mg²⁺、pH值、单价阳离子和脱氧核苷三磷酸（dNTPs））的差异，所有这些都可能导致PCR效率的变异。qPCR仪器本身在温度准确性、升温速率、反应板温度均一性以及温度和荧光采集的精密度方面存在差异。与样品制备、逆转录（RT）和PCR循环的温度和时间相关的选择也会影响结果。此外，数据分析方法的变异，如背景扣除算法、Cq值计算、定量阈值、异常值检测和排除、缺失值处理、定性实验的诊断临界值、标准曲线的使用以及定量实验中参考基因的选择等，都可能系统性地影响报告结果。这些程序变异导致了不同实验室数据的不一致性。技术变异
技术变异存在于整个实验工作流程中，可能源于多种来源，包括样品储存和处理、移液、成分混合、偏离推荐的时间和温度方案以及其他与操作人员相关的变量。特别是RT步骤，是RNA样品定量分析中变异的重要来源（29）。不同实验的PCR效率可能存在差异（30），并且样品异质性（尤其是在分析固体组织或单细胞时）也可能混淆受试者或组间的差异（28）。
为了减少方案变异和技术变异，重要的是实施适当的对照、质量保证措施、标准化方案以及严谨的实验设计和数据分析（31,32）。在靶标拷贝数较低时，技术变异主要受不可避免的泊松抽样分布影响。为了减轻这种影响并提高准确性，研究人员可以增加技术重复次数、浓缩样品或分析更大体积的样品。qPCR中的误差可分为随机误差（影响精密度）或系统误差（影响准确度），两者共同构成总误差，总误差决定了准确性。准确性表示测量值与真实值的接近程度，由准确度（重复测量的平均值相对于真实值的偏离程度）和精密度（重复测量内部的变异程度）决定。精密度的两个关键方面包括：（a）重复性，即在单个实验中对同一生物样品进行重复测量所观察到的变异（实验内精密度）；（b）再现性，即在不同天数、操作人员、仪器或实验室之间观察到的变异（实验间精密度）。此外，还必须考虑稳健性。稳健性是指单个实验在不同条件下（如试剂浓度、引物或探针批次或退火温度的变化）运行时结果的一致性。确保稳健性对于获得可靠和可再现的qPCR结果至关重要。
总之，抽样、基因组序列、PCR抑制剂、PCR效率、阈值设置、PCR伪影、移液、仪器、操作人员和分析方法的变异都可能导致qPCR结果的高度变异。当结果以Cq、ΔCq或ΔΔCq值报告时，这种变异尤为明显，从而使解释变得复杂（33）。因此，这些指南的一个关键目标是突出技术误差和方案差异，从而减少其影响，以便更准确地评估实验和实验室内部及之间的生物学变异。实验设计
引物提供了PCR实验的序列特异性，而这种特异性是实验稳健性和分析灵敏度的关键标准（13）。引物的序列和位置及其浓度是决定实验PCR效率并影响其LOD的关键因素。引物设计的通用建议包括：使用最近邻法确定每个引物的熔解温度（Tm），两个引物的Tm应彼此接近（ΔT<3°C），同时目标长度为18至24个碱基，GC含量为40%至60%，避免稳定的二级结构，并最大限度地减少导致二聚体形成的引物相互作用。调整反应混合物中的单价和二价离子浓度对于准确计算Tm至关重要。如果未知，50 mM Na⁺和3 mM Mg²⁺是良好的起始点。此外，避免重复序列可最大限度地提高特异性，因为PCR失败率与背景DNA中替代结合位点的数量相关（34）。qPCR中的荧光信号可以使用DNA结合染料或探针生成，并产生相似的扩增曲线，尽管对于某些化学物质和输入，需要校正Cq值（见基线荧光校正部分）（35）。虽然探针提供了额外的特异性，但染料由于成本较低，可能更便于优化。然而，当使用染料时，扩增后进行熔解曲线分析对于识别非特异性产物至关重要。
必须仔细考虑模板序列变异，以确保特异性扩增目标靶标，同时避免扩增非目标靶标。在微生物学中，这通常通过不同分离株的序列比对来实现，以确定排除密切相关微生物的合适序列区域。在遗传学中，有必要区分假基因、旁系同源物和活性基因。在表达谱分析中也应考虑假基因，因为加工后的假基因通常缺乏内含子，即使使用跨内含子引物，残留的基因组DNA也可能被扩增。在设计实验时，还必须考虑可变剪接。虽然带有登录号注释的序列提供了共有序列和可变剪接信息，但重要的是使用变异数据库或基因组浏览器（如加州大学圣克鲁斯分校基因组浏览器（https://genome.ucsc.edu）、Ensembl基因组数据库/浏览器（https://www.ensembl.org）和美国国立卫生研究院引物-BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/））审查潜在引物和探针结合位点的序列变异。引物3'端的变异可能会阻碍扩增，而5'端附近的错配通常更易耐受（36）。当靶标序列变异较高时，较短的引物或探针可能具有更好的匹配潜力，并且可以通过核苷酸类似物维持结合亲和力。
设计引物对时，需要特别注意避免相互作用（如引物二聚体），当引物部分彼此退火时可能会产生引物二聚体。使用评估Tm和自由能（ΔG）等参数的工具进行热力学分析，这些工具包括但不限于Primer 3Plus（https://www.primer3plus.com/）、OligoAnalyzer（https://www.idtdna.com/pages/tools/oligoanalyzer）、PrimerROC（http://www.primer-dimer.com/roc/）、Dinamelt（http://www.unafold.org/Dinamelt/applications/hybridization-of-two-different-strands-of-dna-or-rna.php）和mFold（http://www.unafold.org/）。使用这些工具可以预测并最大限度地减少这些不期望的相互作用，确保引物的最佳性能。确保多个引物同时退火需要匹配它们的最近邻Tm估计值。然而，仍然需要优化退火温度，因为预混液成分可能会以通常可变且未充分记录的方式影响Tm（37）。
引物之间的距离决定了扩增子长度，扩增子长度通常在50至200个碱基对（bps）之间。较短的扩增子通常更稳健，特别适用于分析福尔马林固定组织、液体活检、法医样品和考古标本中的降解核酸。它们也更易于使用高分辨率熔解（HRM）进行基因分型，尽管区分引物二聚体变得更具挑战性。另一方面，较长的扩增子可能表现出多个熔解域，这可以增强HRM表征。至关重要的是检查引物和探针结合位点处扩增子的二级结构，以避免潜在的引物结合或探针检测抑制。同样，当使用基因特异性引物进行RT时，应避免RNA在引物结合位点处的任何二级结构，以确保有效的RT。
实验设计的标准应根据具体应用进行调整，此处提供的建议不应限制创新的设计方法。最简单直接的建议是设计外显子-外显子跨接引物和探针，和/或跨内含子扩增子，以在针对特定RNA转录本时避免检测基因组序列。具有低扩增子Tm的实验可以受益于使用较低的变性温度，以最大限度地减少扩增高Tm伪影的风险（38,39）。此外，具有快速温度控制能力的仪器可以缩短聚合酶延伸时间，以防止产生非预期的长产物。PCR的多功能性鼓励实验设计的灵活性。开发新实验的实用方法是设计2或3对备选正向和反向引物，这些引物具有匹配的Tm，位于同一区域，可以在相同条件下同时测试它们的不同组合，以找到最佳引物对（13）。样品储存和核酸制备
生物样品的适当储存对于维持核酸完整性和确保准确的qPCR结果至关重要，因为核酸可能通过酶促、化学或物理方式降解（40）。RNA比DNA更不稳定，需要特别严格的储存条件。组织样品或细胞沉淀应快速冷冻并储存在液氮气相（-180°C）或-80°C冰箱中。其他保存方法包括高盐溶液或裂解缓冲液。对于血液样品，应使用能够裂解细胞并保存生物RNA谱的收集介质，因为活细胞会对环境条件的变化迅速做出反应。虽然某些收集管中的添加剂（如EDTA和柠檬酸盐）会深刻影响表达谱，但市场上有许多替代管可稳定全血，用于下游RNA或DNA处理。或者，当不需要红细胞RNA时，可以通过差异离心分离和储存外周血单个核细胞。分析前过程是qPCR工作流程的重要组成部分，SPIDIA联盟（[www.spidia.eu](www.spidia.eu)）对此进行了研究，该联盟为许多行业指南和标准的制定做出了贡献。
核酸完整性可能因组织类型、储存条件和提取方案而异。重要的是报告提取方法和产量，因为RNA分离物的均质化、提取或DNase处理不足可能导致靶标浓度的低估或高估。此外，不同的提取方法可能选择性地富集或耗尽特定大小的核酸片段。提取的RNA应储存在尽可能低的温度下，以最大限度地减少水解。RNA可在-20°C下储存数天，在-80°C下储存数月（41），在液氮气相中至少稳定5年（42）。虽然DNA比RNA更稳定，但其质量也受储存条件的影响（43,44）。为防止降解，应通过将RNA和DNA储存在小等分试样中来避免多次冻融循环（45,46）。当储存稀释样品（<1 ng/μL）时，核酸可能会吸附到容器壁上，从而可能导致物质损失。为确保准确定量，解冻后应检查浓度。
核酸质量控制对于准确的RT和qPCR至关重要。质量控制程序应评估核酸完整性、是否存在抑制剂以及浓度。简单的分光光度法可用于评估核酸浓度，而分子量标准品可通过突出片段分布来评估完整性。使用DNA或RNA结合染料的荧光法具有很高的灵敏度，但缺乏关于污染和完整性的信息。建议将染料染色与电泳相结合，以评估大小、数量和完整性，尽管这仍然无法揭示污染情况。了解DNA或RNA的浓度可以估算基因组（通常每个哺乳动物基因组7 pg）或转录组（通常每个哺乳动物细胞10至30 pg总RNA）当量。使用5 ng RNA当量（170至500个转录组当量）通常足以定量大多数哺乳动物转录本，尽管植物和环境检测中的稀有转录本有不同的要求，可能需要更多的核酸（47）。
COVID-19疫情凸显了对快速、可扩展诊断方法的需求。使用粗样品的直接RT-qPCR的采用是一项显著进展，因为它降低了与传统纯化方法相关的污染风险，保留了有限的生物材料，并受益于最近开发的耐抑制剂的稳健酶制剂。显然，这种向更高效、简化的核酸分析方法的转变对诊断和环境监测具有重要意义（48-51）。然而，要获得稳健和准确的诊断结果仍然面临挑战。这些挑战包括RNA数量和质量的变异，这可能会影响实验的定性和定量可靠性。为了平衡速度需求与准确性和再现性要求，进一步优化和验证直接RT-qPCR工作流程至关重要。逆转录（RT）和模板稀释
RT反应的产量和特异性对RT-qPCR结果的准确性有重大且通常被忽视的影响。两者都受RNA输入的质量和数量（52）、二级结构和回文序列、引物设计方法（53,54）、逆转录酶（29,53,55）和反应条件的影响。当使用将RT和qPCR反应合并在单个管中的一步法RT-qPCR方案时，RNA的丰度尤为重要，因为RT步骤的产量可能低于qPCR实验的灵敏度（56,57）。另一方面，过多的RNA可能导致某些转录本的定量不准确（58）。
RT可能不是一个线性过程（59），因此需要使用RNA而非DNA标准品来准确估算动态范围和RNA拷贝数。不同靶标的RT产量也存在差异（60）。可以使用合成RNA标准品作为对照，尽管它们的性能可能与天然靶标RNA不同。为了最大限度地减少系统变异，重要的是在整个实验过程中保持一致的RNA输入、引物设计策略、酶和反应条件。然而，随机变异（如设置反应或进行稀释时的移液误差）仍然会发生。引物设计策略应根据RNA靶标进行调整，例如，对于mRNA，使用与qPCR兼容的特异性反向引物、锚定polyT引物或随机引物；对于微小RNA（miRNA），使用双尾PCR（61,62）。
在研究实验室中，通常的做法是在RT步骤后稀释互补DNA（cDNA），以减轻RT试剂的干扰，或者根据靶标丰度，确保PCR靶标输入在实验的动态范围内。通常使用一组靶标基因和参考基因评估cDNA样品。至关重要的是认识到稀释可能会影响定量结果，并考虑RNA或cDNA稀释引入的变异（63）。这在临床环境中不太相关，因为由于一步法RT-PCR和定性实验的普及，RT后直接使用样品更为常见，而定性实验的主要关注点是检测下限。实时定量聚合酶链反应（qPCR）方案
qPCR条件的优化和验证对于可靠的qPCR工作流程至关重要。关键参数包括扩增效率、线性度、动态范围、LOD和定量限（LOQ）（30,64）。定量下限（LLOQ）定义为在给定实验中能够可靠定量的最小核酸量，满足指定的准确性和精密度标准。相反，定量上限（ULOQ）是在没有信号饱和或线性度损失的情况下能够准确测量的最大量。LOD低于LLOQ，表示能够以通常95%的确定性可靠检测到的最小靶标量，但不允许精确量化。报告这些值对于评估定量结果的可靠性至关重要（65）。
优化PCR条件涉及评估变性和退火温度以及循环时间等因素，以最大限度地提高扩增效率和特异性。这可以通过使用许多仪器上可用的温度梯度功能或测试一系列温度来实现。聚合酶、缓冲液和试剂的选择会对qPCR结果产生重大影响。使用一个制造商试剂盒中的试剂获得的数据可能难以用另一个制造商的反应物重现，即使在相同的反应条件下也是如此（66,67）。因此，当更换试剂盒或供应商时，必须重复实验的优化和验证，并在更换批次时进行验证。如果使用定制缓冲液，必须注意影响退火温度和扩增效率的缓冲液成分（68）。建议将反应成分分装储存在-20°C或按照制造商的说明储存，并在引入新批次的试剂、引物或探针时重新验证实验。
虽然为简化起见，通常使用两温度PCR设置，在60°C至65°C下进行合并的退火/延伸阶段（13），但单独的退火和延伸温度可能会提高特异性，并且对于较长的扩增子或当快速温度控制允许较短的循环时间时可能是必要的。此外，可以通过改变Mg²⁺（1.5至4 mM）或引物（100至800 nM）浓度来调整特异性。添加剂（如二甲基亚砜（DMSO）、甘油或甜菜碱）可以帮助降低高GC含量产物的扩增子熔解温度，这些产物难以变性。切换到无K⁺缓冲液有助于扩增能够形成四链体的富含鸟嘌呤的序列。PCR效率
qPCR定量依赖于初始靶标量的对数与从荧光扩增曲线获得的观察到的部分Cq之间的线性关系。这种线性关系在PCR的指数期很明显，能够计算实验扩增效率和灵敏度（69）。然而，在进入平台期的过渡期间，这种关系变得非线性，此时荧光不再随产物量线性增加，并且由于试剂耗尽、扩增子重新退火和检测系统饱和等因素，当反应达到最大产物产量时趋于平稳（即平台期）。采用多种方法评估PCR效率并确保在整个指数期进行准确定量（30,70）。基于稀释系列的标准曲线得出的效率值
通常通过使用一系列已知量的扩增子特异性DNA或RNA标准品的稀释液生成标准曲线来评估qPCR实验的效率和动态范围（2,71）。理想情况下，该标准品已被准确定量（例如通过数字PCR（72）），并在序列和基质背景方面代表靶标分析物。Cq（y轴）与靶标浓度对数（x轴）的线性回归斜率由扩增效率（E）决定，计算方式为%E=100*(-1+10^(-1/斜率))。标准曲线理想情况下应包括每个稀释步骤至少3个技术重复，通过单独的反应混合物制备并在单独的孔中处理。该系列应覆盖4至5个数量级的模板浓度（37）。报告的数据点应限于标准曲线在线性范围内的那些点，即介于LLOQ和ULOQ之间。还应报告置信区间，以表明PCR效率估计值的精密度。
标准曲线的一个主要问题是x轴代表预期稀释的对数。因此，连续稀释过程中移液的校准误差会引入系统误差，例如斜率低于-3.32，这表明PCR效率>100%（30）。这些系统误差在对数尺度上可能代表微小差异，但在关注小的线性差异时可能导致显著差异。随机误差也可能源于不一致的移液，并且每个稀释步骤的重复反应数量较少可能导致较宽的置信区间（73）。从单个反应的扩增曲线确定的效率值
也可以从单个扩增曲线确定PCR效率。有多种方法可用于拟合荧光与循环数数据，包括用于线性荧光数据的指数、多项式或S形模型，或用于对数转换荧光数据的直线模型（69,70,74-77）。在后一种方法中，指数期（即基线噪声（基线期）和过渡到平台期开始（即过渡期）之间）数据点的斜率直接反映了单个反应的PCR效率（%E=100*(-1+10^斜率)）。这些方法之间的比较显示出相似的结果（70）。对于标准化实验室实验，使用标准品和未知样品的共同定量阈值，从单个曲线提取的平均效率提供了最灵敏和精确的效率校正靶标定量。然而，对于具有不同水平PCR抑制的临床样品，如果扩增曲线数据准确反映了抑制剂存在引起的任何效率差异，则从单个反应中获取PCR效率可能更为合适（30）。如果靶标以高度不同的浓度存在，多重反应也适用相同的考虑，可能导致定量不准确。此外，用户必须确保多重反应的结果与单重分析获得的结果相同。如果不是，则可能无法进行定量多重分析。PCR抑制
PCR抑制剂会影响标准曲线和单个扩增曲线方法中计算的PCR效率。在标准曲线方法中，稀释样品也会稀释抑制剂，从而在较高稀释度下降低Cq值，导致计算出的效率人为升高（73）。相反，当存在抑制剂或引物3'端附近发生错配时，从单个扩增曲线获得的效率值往往较低（36）。与对照靶标的效率进行比较，或分析稀释样品的Cq值，可用于识别受抑制的样品。识别具有异常PCR效率值的样品在基于qPCR的即时诊断中尤为重要，此时异常值测试可以检测到含有高浓度抑制剂的样品（30）。总体效率降低的PCR实验通常表现出较低的灵敏度（78）。数据处理和分析熔解曲线分析
对于基于染料的实验，扩增曲线（循环数与荧光图）无法区分目标产物和任何由相同引物扩增的非目标扩增子，这些非目标扩增子通常具有相似的退火和PCR效率。因此，无法从其扩增曲线的形状推断不同产物的身份（79）。然而，在双链DNA结合染料存在下生成的PCR扩增子的熔解曲线分析可以提供关于PCR产物独特性和特异性的信息。在该分析过程中，PCR结束时加热反应，同时持续监测荧光。当温度超过扩增子的Tm时，扩增子变性，导致荧光急剧下降。
尽管扩增子的Tm取决于反应混合物组成、升温速率和qPCR仪器的校准，但Tm对单个扩增子是特异性的，因为它由其长度、GC含量和序列组成决定（38,79）。当扩增和熔解程序标准化后，可以在使用阳性对照的预实验中确定产物的Tm，并在后续实验中用作参考。或者，诸如“uMELT Quartz”（https://dna-utah.org/umelt/quartz/）之类的软件工具可以预测扩增子Tm以及熔解曲线的形状（80）。GC含量不平衡的扩增子可能会成块熔解，产生多个峰，这有助于进一步表征。某些“饱和染料”（例如LCGreen™）比其他染料（例如SYBR™ Green I）更灵敏地检测多个峰，后者在存在多个峰时由于熔解过程中的染料重新分布而难以检测低Tm产物（79）。当使用双链特异性DNA染料时，通常不检测单链DNA。熔解分析前不需要最后的聚合酶延伸步骤，因为变性后冷却时产物重新退火很快。虽然可能检测到某些二级结构，但它们的Tm通常较低，不会干扰扩增子熔解。例如，可将折回引物或未标记探针用于低于扩增子Tm的基因分型（38）。不对称PCR对定量的影响取决于引物浓度不对称的程度。如果指数期受到限制，效率和Cq测定可能会受到影响。
熔解曲线分析比琼脂糖凝胶上的大小分级更灵敏。然而，正如两种不同的PCR产物可能具有相同的大小一样，它们也可能具有相同的Tm。因此，在正确的Tm处出现单个峰并不能保证识别出目标扩增子。临床实验通常将扩增子特异性荧光探针与靶标特异性引物一起使用，以解决这一限制。尽管如此，随着仪器分辨率的提高，使用熔解曲线区分不同产物的能力也在增强。由于其简单性，熔解曲线分析通常用于替代凝胶进行PCR优化，尤其是因为它减少了实验室污染的风险。熔解曲线分析还有其他多种应用，包括通过竞争性PCR进行相对定量（38）。qPCR结果的准确性
当结论转化为临床实践时，准确的qPCR结果尤为重要（26）。观察到的Cq值取决于多个因素，包括样品处理方法、荧光采集和数据分析。重要的分析步骤包括以下内容：
如何扣除基线荧光；
是否使用定量阈值以及如何使用；
阈值是在不同运行中保持一致还是为每个运行单独确定；
是否应用平滑算法计算Cq。
此外，将Cq值转换为靶标量或由于实验处理导致的基因表达倍数变化的方式显著影响qPCR结果的准确性（33,81）。分析RNA时，RT产生单链cDNA。在PCR过程中，第一个循环然后产生双链DNA，而不是进行扩增。因此，当将Cq值转换为mRNA/cDNA量时，应减去一个循环（2）。这消除了使用荧光染料和靶向cDNA的探针时，从DNA或cDNA开始的反应之间Cq值的一个循环的系统偏移。然而，如果使用靶向原始mRNA序列的荧光探针，则不需要扣除（35）。原始（未处理）荧光采集
荧光是一种相对测量，所有qPCR仪器在数字化之前都会使用电子偏移和增益调整模拟信号。这种调整消除了大部分背景荧光，背景荧光与PCR监测化学物质无关，但包括来自光学系统和耗材的自发荧光（82,83）。由于qPCR中荧光没有绝对零点，因此在检测到扩增之前，使用早期循环荧光定义基线（可能不是线性的）。
应收集原始荧光数据，并应要求提供。理想情况下，这些数据应作为补充材料附上或存放在数据存储库中。原始数据无法从Cq值或基线校正数据重建，允许使用新工具进行重新分析或解决不同的研究问题。目前有两种独立于供应商的qPCR数据交换文件格式：
实时PCR数据基本电子表格格式（RDES）（84），包括样品识别和原始荧光数据，具有简单的行对列导出格式；
实时PCR数据标记语言（RDML）（85），一种更全面的基于XML的格式，包含进一步分析所需的所有必要信息。
两种格式都可以使用免费软件（如RDML-Tools（86））生成和分析。仪器制造商应实施其中一种选项，以支持原始荧光数据导出。在此之前，我们鼓励研究人员以可访问的格式（如Excel）作为补充文件提供qPCR数据。基线荧光校正
基线荧光源于与扩增无关的PCR监测化学物质，必须从每个反应中单独扣除。较早的qPCR仪器将基线荧光计算为用户定义的早期循环范围的平均值。然而，现代仪器通常将基线荧光计算为通过基线期荧光值的趋势线，并从每个循环的测量荧光值中减去外推趋势线的相应值。
向上或向下倾斜的基线会显著影响扩增曲线的形状和位置，影响Cq值的读数和计算的PCR效率（69）。当原始荧光数据可用时，可以解决不适当的基线校正带来的误差（86）。一些商业探针基试剂盒具有高基线荧光，这会损害荧光采集的动态范围和分辨率。对于DNA结合染料，基线荧光部分受模板和引物浓度的影响，这表明只要维持PCR效率，降低浓度可能会改善荧光检测（69）。同样，淬灭效率低的探针可能表现出高基线荧光，并且在终点荧光水平仍然可接受的情况下，降低其浓度可能是有益的。质量控制
qPCR中的质量控制至关重要，涉及评估扩增曲线和熔解曲线，以确认靶标特异性扩增、有效的背景荧光扣除以及合理的基线和阈值设置（86-88）。这些评估确保扩增是特异性的，并且没有非特异性产物或引物二聚体。在某些情况下，需要手动调整用于定义基线的早期循环，以排除异常读数并包括足够的循环以获得最佳估计。基线校正的扩增图（通常y轴为log[荧光]，x轴为循环数）有助于可视化指数扩增期，这对于准确定量至关重要。
当使用标准曲线进行定量时，有必要报告Cq与log浓度图的置信区间和预测区间。置信区间反映了用于计算PCR效率的标准曲线估计斜率的不确定性。另一方面，预测区间提供了通过在标准曲线上插值从观察到的Cq值得出的单个靶标量的不确定性度量。由于预测区间考虑了单个测量的变异，因此它比置信区间更宽，因此是报告靶标量精密度的正确度量。数据分析
存在多种分析qPCR数据的方法，并且这些方法并不总是兼容的（33）。因此，重要的是报告使用哪种方法。从qPCR获得的Cq值是中间数据，有意义的结果需要根据实验目的进行进一步处理。qPCR实验设计用于各种目的，例如：
确定每个反应或生物样品中的靶标量；
标准化每个样品的靶标表达（靶标表达/参考表达）；
计算实验组和对照组之间标准化表达的倍数差异。
中间Cq值是输入靶标浓度的量度，但受PCR效率和定量阈值的影响。因此，每个结果都需要仔细处理Cq、PCR效率值和标准化阈值设置。然而，许多出版物假设PCR效率为100%，或者要求读者在解释Cq、ΔCq或ΔΔCq值时做出这一假设（33）。
每个基因的靶标量：在qPCR研究中，特别是在临床诊断中，通常仅报告每个反应的Cq值，或者对于技术重复，报告每个样品的平均Cq值。然而，重要的是要理解Cq值与靶标核酸的量呈指数关系（17）。因此，Cq值的算术平均值反映了靶标量的几何平均值，而不是算术平均值（32,89）。应避免对Cq值进行进一步的统计测试，因为这些值未经过效率校正且未标准化。因此，在分析前应将Cq值转换为靶标量（33）。
靶标量通常通过使用校准曲线插值从Cq值计算。该曲线由已知标准品的稀释系列创建，这种方法通常称为“绝对定量”。然而，结果的准确性取决于标准品的准确性和稀释系列的精密度。另一种不需要稀释系列的方法是使用Cq值、定量阈值和PCR效率计算靶标量。这产生了效率校正的靶标量，以荧光单位表示（69）。然后可以通过将这些荧光单位与单个已知标准品（通常进行多个重复）进行比较，将其转换为绝对拷贝数（30,90）。这种方法更简单，并减少了与制备稀释系列相关的误差风险。
每个样品的标准化表达：在基因表达分析中，使用参考基因对qPCR数据进行标准化是支持精确测量的另一个基本步骤。该程序有助于校正由于不同反应中核酸输入的差异而产生的技术偏倚（91-93）。然而，标准化的执行方式不一致（例如所选参考基因的数量、表达稳定性或丰度的变异）可能会在结果中引入额外的误差和变异（94,95）。为了实现稳健的标准化，至关重要的是仔细证明参考基因的选择和数量。这需要证明它们的表达水平的稳定性，因为这些表达水平可能因组织类型、实验条件或疾病状态等因素而异。
计算表达比率的最常用方法是使用2^(-ΔCq)公式，其中ΔCq是靶标基因和参考基因的Cq值之间的差异。尽管这篇具有影响力的论文的作者提出了一种测试，以确定PCR效率是否足够相似以忽略其差异（96），但这一要求通常被忽视。至关重要的是，当靶标基因和参考基因之间的扩增效率不同时，假设PCR效率为100%会在标准化表达中引入Cq依赖性偏倚。对于技术重复和多个参考基因，ΔCq计算使用参考基因的重复反应的平均Cq值。因此，会丢失有关基因绝对表达水平的信息，使得更难检测偏离反应和可能具有生物学意义的表达差异（30）。
标准化的另一种方法是使用每个反应的靶标量计算每个样品的靶标/参考表达比率。这种方法考虑了多个参考基因、基因特异性扩增效率以及整个计算过程中所有测量参数的相关误差（89）。由于不同参考基因的表达水平可能差异很大（有时相差几个数量级），使用它们表达的几何平均值确保每个基因对标准化做出比例贡献。这最大限度地减少了来自任何单个参考基因主导计算的偏倚风险（91）。
组间倍数差异：假设目的基因和参考基因的扩增效率均为100%，这会显著影响使用公式2^(-ΔΔCq)计算处理组和对照组之间的倍数差异（96）。尽管与ΔCq方法相比，这种方法的总体偏倚有所减少，因为处理组和对照组的偏倚部分处于相同方向，但我们不鼓励使用ΔΔCq方法（33）。当表达水平受到实验条件的显著影响时，报告的倍数差异仍然存在偏倚，导致可能具有误导性的结论（30）。虽然该方程的效率校正版本可以减轻与效率相关的偏倚（97），但ΔΔCq方法仍然存在关键限制。它在处理技术重复和多个参考基因方面存在挑战，并且加剧了ΔCq方法固有的问题，例如绝对表达信息的丢失。此外，通过在实验组内平均Cq值，ΔΔCq方法掩盖了生物学变异，使得难以进行稳健的统计比较（98）。出于这些原因，我们强烈建议在定量分析中不要依赖ΔΔCq方法。
因此，组间倍数差异应根据处理组和对照组的平均标准化基因表达量计算，公式为：（处理组目的基因表达/参考基因几何平均表达的平均值）/（对照组目的基因表达/参考基因几何平均表达的平均值），其中GOI是目的基因的表达，RG是参考基因表达的几何平均值（89）。为了评估处理效果，应在每组平均之前对每个样品的标准化数据进行统计分析。
LOD和LLOQ：对于每个实验，应确定并报告LLOQ和LOD，因为它们提供了关于实验灵敏度和准确性的关键信息（64）。如果低靶标表达水平不是问题，则不需要进行这些确定。在分子诊断中，这两个参数对于法规遵从性都很重要，并作为实验验证研究的接受标准，这些研究证明了方法的准确性并确保符合法规标准。LLOQ和LOD有助于实验优化，但不应用作定性实验中报告阴性结果的临界值。在经过验证的定性实验中，在没有污染或探针降解的情况下，阳性反应表明存在靶标，应予以报告，无论Cq值如何。值得注意的是，泊松抽样分布表明，对于任何给定的qPCR，LOD不能低于3个靶标拷贝（3）。同样，当每个反应的拷贝数低于10个时，变异会增加，这是良好实验的LLOQ。在PCR效率为90%时，这种LLOQ在35个循环时达到，LOD在37个循环时达到。对于70%的效率，相应的Cq值分别为42和45个循环（33）。对照
qPCR实验中需要适当的对照，以区分真实的生物学信号与技术伪影。这些对照确保了实验的可靠性、特异性和灵敏度。必不可少的对照包括阳性对照、阴性对照、无模板对照和无逆转录酶（无RT）对照。阳性对照
阳性对照含有靶标核酸序列，作为评估基于qPCR的实验性能的基准。理想情况下，阳性对照应包含来自靶标生物的基因组核酸样品，其基质与临床样品或实验条件相同。然而，这可能并不总是可行的（例如在COVID-19疫情早期），特别是当高突变率使获得可靠的对照样品来源变得复杂时（99）。
作为替代方案，通常使用合成双链DNA片段或RNA分子。这些可以轻松合成，更新以匹配新出现的突变，并优化以检测在天然样品中可能难以检测的稀有变异。合成核酸应使用载体分子（如5 ng/μL的转运RNA（tRNA））稳定，并且在可能的情况下，添加到实验中使用的相同基质中（39）。包含不同浓度的阳性对照可以评估RT和qPCR扩增效率，以及确定LOD和LOQ。这确立了实验的灵敏度和线性动态范围。在log[荧光]轴上比较阳性对照和未知样品的扩增曲线，可以检测潜在的抑制剂或非最佳反应条件。阳性对照还为质量控制提供参考点，有助于阈值设置，并帮助解释结果。阴性对照
阴性对照含有载体核酸，但缺乏特异性靶标序列，需要用于确认PCR实验的特异性。阴性对照中的扩增信号表明污染或非特异性引物结合和扩增，在基于探针的实验中，这也可能表明非预期的探针杂交或降解。阴性对照在检测细微的遗传差异（如区分野生型和变异等位基因）时特别有价值。在这些情况下，用作阴性对照的野生型DNA可能与变异DNA几乎相同，增加了非特异性扩增的风险。同样，当靶向小型非编码RNA（如健康受试者中不存在的小干扰RNA或病毒miRNA）时，基质匹配的阴性对照中的背景核酸可能与潜在阳性样品中的背景核酸非常相似。因此，包含阴性对照通过确保观察到的信号是针对目标靶标的，从而增强了结果的可靠性。当阴性对照显示扩增时，只有当未知样品的Cq比阴性对照提前至少5个循环时，才应将其视为阳性。无模板对照（NTCs）
无模板对照（NTCs）是通过用水或缓冲液替换样品核酸制备的，确保不存在模板。它们的主要目的是检测来自试剂或实验室环境的污染，这可能导致假阳性结果。如果NTC中发生扩增，这可能表明试剂污染或样品之间的交叉污染。根据污染的严重程度，可能需要使整个运行的结果无效，或者在解释未知样品的结果时应谨慎。
伪影也可能在NTC中产生信号。在基于染料的qPCR实验中，通常可以通过分析熔解曲线来区分这些伪影与真实产物（39）。然而，在诊断实验中，如果NTC显示探针荧光可检测到的增加，则不应报告该运行的结果，而应重复分析。无逆转录酶（无RT）对照
在RT-qPCR实验中，有必要包含无RT对照，该对照省略逆转录酶，但包含与实验样品相同的核酸。该对照检查是否存在污染的基因组DNA，这些DNA可能被错误地扩增并导致假阳性结果。没有RT，只有DNA（如果存在）会被扩增，而真实的RNA靶标不会产生任何信号。该对照对于确认观察到的扩增来自RNA而非污染的DNA至关重要。为了评估引物是否能够扩增基因组DNA中的随机靶标，可以同时运行所分析物种的纯基因组DNA。另一种方法是扩增非转录基因组DNA的实验，从而测量cDNA样品中的基因组DNA背景。结合对基因组DNA标准品的对照测量，可以校正RT-qPCR数据中的基因组DNA背景（100）。多重（样品内）对照
在临床测试中，通常使用多重qPCR在与靶标相同的反应中纳入内部对照。虽然这些样品内对照不能替代外部阳性和阴性对照，但它们提供了样品和试剂足以进行扩增的实时证据。内部对照应与靶标属于相同类型的核酸（DNA或RNA），并且添加浓度应比LOD高3至10倍。
在传染病测试中，人类参考基因或额外的外部模板（最好在样品制备前添加）可以用作内部对照。这确保了从提取到扩增的整个工作流程正常运行。检测内部对照对于验证阴性测试结果至关重要，确保病原体信号的缺失不是由于技术故障造成的。唯一的例外是在病原体载量高的情况下，此时试剂竞争可能会阻止内部对照的扩增。在这种情况下，对于阳性测试结果，无法检测到内部对照是可接受的，因为病原体信号仍然是主要的诊断指标。
通常通过使用具有不同荧光标记的探针来区分对照和靶标，以便能够同时检测而不会产生交叉干扰。经过验证的多重反应应与各个单重反应具有相同的结果。结论
MIQE 2.0指南解决了原始版本的局限性，并为qPCR结果的发表提供了全面的框架，以及实施这些结果的实用建议。
这些修订后的指南基于专家共识制定，就样品处理、实验设计、实验验证、质量控制、数据分析和报告提供了改进的建议。
修订后的指南强调效率校正的数据分析、适当的统计方法、技术重复的一致报告以及阳性和阴性对照的纳入。这些措施对于最大限度地减少偏倚和提高定量应用中qPCR实验的严谨性至关重要。
在包括基础研究、诊断、法医、兽医、环境和农业任务在内的多个领域实施MIQE 2.0指南将促进实验实践的一致性，并提高报告结果的可靠性和可解释性。
MIQE 2.0鼓励使用数字资源和数据存储库共享实验细节、原始荧光数据和分析脚本。这促进了合作，允许对结果进行独立验证，并提高了研究成果的透明度。
虽然该指南提供了一个稳健且适应性强的框架，但需要不断完善以应对新兴技术和qPCR方法的进步。这需要科学界的持续参与和合作。
我们建议实验室将随附的建议（见在线补充文件“MIQE 2.0建议”）作为常规研究实践的一部分。MIQE 2.0清单（表1）可用于指导实验规划和稿件评审。相同的清单可以编辑格式下载（在线补充表1）。期刊、资助机构和其他利益相关者应提供激励措施，鼓励研究人员采用和遵循这些指南。例如，可以将该清单纳入期刊的提交过程（某些期刊已经这样做，例如《临床化学》），或者资助机构可以鼓励提交包含受MIQE启发的拟议实验工作流程详细说明的资助申请。
总之，采用MIQE 2.0将提高qPCR研究的整体质量和透明度，增强其在科学界的可信度和影响力。通过促进一致性、严谨性和可再现性，这些指南将加强qPCR应用的基础，并确保其在不断发展的科学环境中继续具有相关性。
补充材料
补充材料可在《临床化学》在线获取。非标准缩写
MIQE：实时定量聚合酶链反应实验发表最低信息；qPCR：实时定量聚合酶链反应；Cq：定量循环（以前称为Ct或Cp）；RT-qPCR：逆转录-实时定量聚合酶链反应；LOD：检测限；RT：逆转录；Tm（熔解温度-50%的核酸双链体为单链时的温度）；LLOQ：定量下限。作者贡献
通讯作者对所有作者均符合以下作者资格的必要标准承担全部责任：（a）对概念和设计、数据收集或数据分析和解释做出重大贡献；（b）起草或修改文章的智力内容；（c）最终批准发表的文章；（d）同意对文章的所有方面负责，确保与文章任何部分的准确性或完整性相关的问题得到适当调查和解决。没有任何符合作者资格的人被排除在名单之外。
斯蒂芬·巴斯廷（调查-同等贡献，写作-初稿-主导，写作-评审与编辑-同等贡献）、扬·吕伊特（形式分析-同等贡献，写作-初稿-支持，写作-评审与编辑-同等贡献）、莫里斯·范登霍夫（形式分析-同等贡献，写作-初稿-支持，写作-评审与编辑-同等贡献）、米卡埃尔·库比斯塔（形式分析-同等贡献，写作-初稿-支持，写作-评审与编辑-同等贡献）、迈克尔·普法夫尔（形式分析-同等贡献，写作-初稿-支持，写作-评审与编辑-同等贡献）、格雷戈里·希普利（形式分析-支持，写作-评审与编辑-同等贡献）、恩哈姆·陈（形式分析-支持，写作-评审与编辑-同等贡献）、斯特凡·勒迪格（形式分析-同等贡献，写作-评审与编辑-同等贡献）、安德烈亚斯·昂特加斯纳（形式分析-同等贡献，写作-评审与编辑-同等贡献）、莱因霍尔德·米勒（形式分析-支持，写作-评审与编辑-支持）、塔尼亚·诺兰（形式分析-支持，写作-评审与编辑-支持）、莫伊察·米拉韦茨（形式分析-支持，写作-评审与编辑-支持）、马尔科姆·伯恩斯（形式分析-支持，写作-评审与编辑-同等贡献）、吉姆·哈格特（形式分析-同等贡献，写作-初稿-支持，写作-评审与编辑-同等贡献）、若·范德松佩勒（形式分析-同等贡献，写作-初稿-支持，写作-评审与编辑-同等贡献）、卡尔·维特沃恩（形式分析-同等贡献，写作-初稿-支持，写作-评审与编辑-同等贡献）作者披露或潜在利益冲突
稿件提交时，所有作者均完成了作者披露表。研究资助
斯蒂芬·A·巴斯廷获得了美国国立卫生研究院（研究资助：33421/NIHR204688）、托尼·比德尔先生的资助、赛默飞世尔科技、MBS、Optigene和PrimerDesign提供的qPCR仪器短期贷款，以及LGC提供的过期预混液赠品。莫里斯·J·B·范登霍夫得到了阿姆斯特丹大学医学中心的支持。米卡埃尔·库比斯塔得到了RVO：86652036、捷克共和国资助局GA24-12027S的支持。迈克尔·W·普法夫尔得到了德国联邦经济事务和气候行动部ZIM资助：KK5368301AD1、KK5367301AD1和KK5022312 AD1的支持。恩哈姆·陈获得了澳大利亚REDI MTP Connect奖学金的支持。马尔科姆·J·伯恩斯和吉姆·F·哈格特：LGC的国家测量实验室（NML）由英国政府科学、创新和技术部（DSIT）资助。若·范德松佩勒得到了佛兰德斯科学研究基金会、抗癌基金会、站起来对抗癌症（KotK）、根特大学（BOF、GOA、基础研究资助）的支持。卡尔·T·维特沃恩得到了美国国立卫生研究院、惠特克基金会、犹他州、犹他大学和BioFire Diagnostics的多项资助。披露
斯蒂芬·A·巴斯廷从Co-Dx获得了专家证词资金，从MDPI出版商获得了会议出席支持，并持有TTA-LG HoldCo AB股份和TTA TopCo AB股份。米卡埃尔·库比斯塔是MultiD Analyses AB的董事长。迈克尔·W·普法夫尔得到了国际细胞外囊泡学会（ISEV）和德国细胞外囊泡学会（GSEV）的会议支持，并持有瑞典TATAA生物中心的股份。安德烈亚斯·昂特加斯纳是RDML和RDES格式、RDML-Tools、Primer3Plus和Primer3的开发者和维护者。莱因霍尔德·米勒拥有专利：美国8283148B2：用于实时定量聚合酶链反应的DNA聚合酶组合物及其方法（2003）和美国7361469B2：双标记荧光探针（2005）。塔尼亚·诺兰受雇于LGC，在商业和研究环境中支持客户使用分子生物学技术（包括qPCR和dPCR）。若·范德松佩勒从Qiagen和Hoffmann-Eitle获得了咨询费，从罗氏获得了差旅费报销，并且是pxlence的联合创始人。卡尔·T·维特沃恩从犹他大学获得版税（由bioMerieux通过BioFire提供）；从CoDiagnostics、MegaRobo USA、Magic LifeScience和HP Inc.获得咨询费；拥有与熔解分析相关的专利：美国-11351545-B2、美国-11332779-B2、美国-11066696-B2、美国-20200248247-A1、美国-10655169-B2；快速核酸扩增专利：美国-20240068021-A1、美国-11834708-B2、美国-20210254132-A1、美国-11021744-B2、美国-10900074-B2；在CoDiagnostics、Crestwood Technology、Nusantics和Scope Microfluidics拥有股权；并且是《临床化学》（ADLM）的副主编。资助者的作用
资助机构在研究设计、入选患者的选择、数据的审查和解释、稿件的准备或稿件的最终批准中没有发挥任何作用。参考文献
（参考文献部分内容繁多，此处省略翻译）
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