Hexagon Bio, Inc.

大家好，今天介绍一篇发表在ACS Central Science上的文章“An Antifungal with a Novel Mechanism of Action Discovered via Resistance Gene-Guided Genome Mining”。通讯作者是来自美国生物制药公司Hexagon Bio的Menlo Park博士。 每年导致超过250万人死亡的侵袭性真菌感染是公共卫生的重要威胁。目前，临床抗真菌药物（包括唑类、棘白菌素类和多烯类）面临着耐药性逐年上升的问题。因此，开发具有新作用机制的新型抗真菌药物是一项迫切的研究需求。由于人类与真菌在蛋白质和通路水平的高度保守性，在病原体真菌中存在但在人体内不存在的抗真菌靶点极为罕见。支链氨基酸（branched chain amino acids, BCAA）生物合成是真菌生存所必需的代谢通路，其中乙酰乳酸合成酶（acetolactatesynthase, ALS）作为该通路的第一个关键酶，在人类基因中并不存在，因此成为有吸引力的抗真菌靶点。 本研究采用的抗性基因导向的基因组挖掘（Resistance Gene-Guided Genome Mining）策略是近年来天然产物发现领域的重要方法学创新。该方法的关键在于：真菌生物合成基因簇（BGC）中常含有与产物靶点同源的抗性基因，这种"自抗性"机制是真菌保护自身免受所产生毒素伤害的进化策略。研究团队系统性地挖掘真菌基因组数据库，寻找含有与酿酒酵母中ALS对应编码基因的同源抗性基因，以及该同源抗性基因的对应BGC。通过这一策略，研究人员在土曲霉（Aspergillus terreus）基因组中鉴定出一个新型BGC（命名为sdtBGC），该基因簇包含一个与ALS同源的基因，并提示其产物可能靶向ALS。 研究团队采用了两种互补策略：原位转录因子激活（过表达sdtBGC内的转录因子sdtE）和异源表达（在构巢曲霉中重构完整基因簇）。这种双重策略确保了基因簇的全面激活和产物的有效鉴定。作者成功鉴定出sdtBGC的产物——HB-35018（化合物1），该化合物具有复杂的螺环结构，其绝对构型通过X射线晶体学确证。通过正向遗传学筛选，研究团队在酿酒酵母中获得了对HB-35018具有抗性的突变株。全基因组测序显示，23/24个抗性克隆在ILV2基因（编码ALS）上携带突变，提示ALS是HB-35018的靶点。 作者通过质谱分析和冷冻电镜结构解析揭示了HB-35018独特的作用机制：该化合物通过其C1位酮基与ALS的Lys310残基形成共价酰胺键，结合过程伴随C1-C2’键的断裂，释放环张力，实现不可逆的共价修饰，这种"应变释放"驱动的共价结合模式在天然产物中尚属首次报道。生化实验证实，HB-35018对多种致病真菌的ALS（包括烟曲霉、白色念珠菌和酿酒酵母）具有强效抑制作用，且由于ALS在人类中不存在，在100 μM浓度下HB-35018对原代人脐静脉内皮细胞、肝细胞和肝癌细胞系无细胞毒性。 总的来说，本文通过抗性基因导向的基因组挖掘策略，成功发现了新型抗真菌天然产物HB-35018，并系统阐明了其作用机制和生物合成途径。该研究展示了基因组挖掘在现代药物发现中的强大潜力，并具有巨大的临床应用价值。 本文作者：FTY 责任编辑：ZCL DOI：10.1021/acscentsci.5c02019 原文链接：https://doi.org/10.1021/acscentsci.5c02019

一：基本信息 文章题目：An Antifungal with a Novel Mechanism of Action Discovered via Resistance Gene-Guided Genome Mining文章 DOI 号：10.1021/acscentsci.5c02019期刊名称：ACS Central Science通讯作者：Colin J. B. Harvey通讯作者工作单位：Hexagon Bio (Menlo Park, California, United States)二：核心速览 本研究针对当前抗真菌药物匮乏及耐药性频发的严峻挑战，利用抗性基因导向的基因组挖掘（Resistance gene-guided genome mining） 策略，在土曲霉（Aspergillus terreus）中发现了一个编码乙酰乳酸合酶（ALS）同源蛋白的生物合成基因簇（BGC）。通过异源表达与化学表征，研究者分离得到了一种具有独特螺-顺式-十氢化萘（spiro-cis-decalin）结构的季酮酸类化合物——HB-35018 (1)。生化与结构生物学研究揭示，化合物 1 是一种强效的 ALS 抑制剂，其作用机制涉及独特的逆 Dieckmann 样键断裂反应，从而共价捕获酶活性位点的赖氨酸残基。这种机制与现有的 ALS 抑制剂（除草剂）截然不同。此外，体内外实验证实 1 对包括多重耐药烟曲霉在内的多种病原真菌具有广谱抑制活性，且 ALS 是真菌在宿主体内致病的关键因子。这项工作不仅发现了一个极具潜力的抗真菌先导化合物，也验证了 ALS 作为抗真菌靶点的可行性。三：研究思路 步骤 1：靶点筛选与基因组挖掘基于真菌自我抗性机制的假设，锁定支链氨基酸（BCAA）生物合成途径中的乙酰乳酸合酶（ALS）为靶点。在真菌基因组数据库中搜寻含有 ALS 同源基因（ilv2 同源物）的生物合成基因簇，最终在土曲霉中鉴定了 sdtBGC，并在新印度曲霉中发现了高度相似的 neoBGC。 步骤 2：产物挖掘与结构鉴定通过在原宿主中过表达转录因子以及在构巢曲霉（Aspergillus nidulans）中进行全基因簇异源表达，激活沉默基因簇。利用 LC-MS 差异分析锁定目标代谢物 HB-35018 (1)，并通过 NMR 和 X-ray 晶体衍射确定了其复杂的螺环立体化学结构。 步骤 3：生物合成途径解析利用分步异源表达和体外酶学实验，解析了 1 的生物合成逻辑，特别是鉴定了一个 Lipocalin 家族的 Diels-Alderase（SdtD）负责顺式-十氢化萘骨架的构建，以及细胞色素 P450（SdtG）负责关键的螺环中心形成。 步骤 4：靶点验证与动力学表征通过正向遗传学筛选抗性突变株，发现抗性突变集中在 ALS 基因。利用重组蛋白进行酶活抑制实验，发现 1 表现出紧密结合（tight-binding）动力学特征，且不同于除草剂类抑制剂的“累积抑制”模式。 步骤 5：分子机制解析（结构生物学）利用完整蛋白非变性谱（Intact Protein MS）发现 1 与 ALS 发生共价结合。通过解析烟曲霉 ALS（AfALS）与 1 复合物的冷冻电镜（Cryo-EM）结构，揭示了配体通过 C1-C2' 键断裂与 Lys310 形成共价酰胺键的独特机制。 步骤 6：抗真菌活性与体内药效评估测试 1 对临床分离菌株的 MIC，证明其广谱抗真菌活性。构建 ilv2 敲除的烟曲霉菌株，并在小鼠侵袭性曲霉病模型中证实 ALS 是真菌致病力的必需基因，验证了其作为药物靶点的有效性。四：研究方法 • 基因组挖掘（Genome Mining）: 基于抗性基因同源性搜索真菌 BGC 数据库。 • 异源表达与代谢工程: 使用构巢曲霉作为底盘细胞表达 sdtBGC 及其亚克隆。 • 结构鉴定: 核磁共振（NMR）、X 射线单晶衍射（X-ray Crystallography）。 • 生化动力学分析: 基于重组 ALS 蛋白的酶活抑制试验（IC50 测定）、辅助因子氧化状态监测。 • 质谱分析: 液质联用（LC-MS）、完整蛋白非变性谱（Intact Protein MS）、肽段谱图分析。 • 冷冻电镜（Cryo-EM）: 解析蛋白质-配体复合物的高分辨率三维结构。 • 动物模型: 免疫抑制小鼠的侵袭性曲霉病模型（Invasive Aspergillosis Model）。五：实验设计及结果分析（一）挖掘与生物合成解析：从基因簇到复杂天然产物实验目的与设计逻辑 研究团队旨在利用“抗性基因导向”策略发现靶向支链氨基酸（BCAA）合成途径的新型抗真菌剂。鉴于除草剂已成功靶向 ALS，且真菌中存在编码靶点同源蛋白以赋予自我抗性的先例（如 chlorflavonin 和 harzianic acid），作者在真菌基因组数据库中搜寻与 S. cerevisiae ALS 基因 (ILV2) 同源的 BGC。这一逻辑基于假设：产生 ALS 抑制剂的真菌必须拥有一个抗性拷贝的 ALS 基因以避免自杀。实验结果与深度解析基因组挖掘锁定了土曲霉中的 sdtBGC 和新印度曲霉中的 neoBGC，这两个基因簇均包含一个 ALS 同源基因（Figure 1D）。为了获取基因簇产物，作者首先在土曲霉中过表达了簇内转录因子 sdtE，导致代谢产物谱中出现显著的 m/z 386.233 峰（Figure 1E）。平行地，通过在构巢曲霉中异源表达完整的 sdtBGC，也观察到了相同的特征峰（Figure 1F，迹线 iv），证实该化合物由 sdtBGC 编码。分离纯化后，该化合物被命名为 HB-35018 (1)，其结构经 NMR 和 X-ray 确证为一种罕见的含螺-顺式-十氢化萘骨架的季酮酸（Tetramic acid）。 随后，作者通过分步表达基因簇内的酶解析了 1 的生物合成途径（Figure 1G）。PKS-NRPS 杂合酶 SdtB 与反式烯酰还原酶 SdtF 合作生成聚酮-氨基酸杂合前体，经 Dieckmann 缩合释放产生化合物 9。关键的结构转化涉及 Lipocalin 类型的 Diels-Alder 酶 SdtD，它催化分子内 Diels-Alder 反应生成顺式-十氢化萘中间体 10，这一立体化学特征在真菌中较为罕见。通过在构巢曲霉中逐步添加基因，作者观察到 10 转化为醛 11 和醇 12（由 SdtH 和 SdtA 催化），最终由 P450 酶 SdtG 催化形成高张力的螺环中心得到 1。这一路径通过体外酶活实验得到确证：重组的 NeoA（SdtA 同源蛋白）能将 11 转化为 12（Figure 1H），而表达 NeoG（SdtG 同源蛋白）的微粒体能将 12 转化为 1（Figure 1I）。这些数据完整构建了从基因簇到复杂分子的生物合成逻辑链。 "Upon isolation, the metabolite responsible for this feature was determined to be HB-35018 (1), a unique spiro-cis-decalin containing tetramic acid."（二）靶点验证与动力学机制：区分于传统除草剂的新模式实验目的与设计逻辑 虽然基因簇中抗性基因的存在暗示 1 靶向 ALS，但必须通过实验确证。作者采用了正向遗传学筛选（生成抗性突变株）和体外酶学动力学分析相结合的方法。特别是，考虑到现有的 ALS 抑制剂（如磺酰脲类除草剂）通常表现出特殊的“累积抑制”动力学，作者试图明确 1 是否遵循相同的机制。实验结果与深度解析通过将酿酒酵母暴露于 1 中筛选抗性克隆，全基因组测序显示 24 个克隆中有 23 个在 ALS 基因 (ILV2) 发生突变，且 P192 位点突变频率最高。将这些突变映射到 ALS 结构上，发现其位于底物通道入口附近（Figure 2A）。生化实验显示，1 能有效抑制野生型 ALS，但对 P192S 突变体的抑制活性仅下降 4 倍，而传统除草剂（2-5）对该突变体的活性下降了至少 100 倍（Figure 2B）。这一差异暗示 1 与 ALS 的结合模式与除草剂不同。此外，1 对多种致病真菌（C. albicans, A. fumigatus）的 ALS 均显示出强效抑制（Figure 2C）。 在机制层面，ALS 催化反应依赖 FAD 辅因子（Figure 2D）。已知除草剂（如 2）通过“累积抑制”机制导致 FAD 氧化失活。然而，动力学分析表明 1 表现出标准的紧密结合（Tight-binding）动力学特征（IC50 约为酶浓度的一半）（Figure 2E），且在抑制过程中并未观察到 FAD 的再氧化（Figure 2F）。这一结果有力地证明 1 不通过氧化 FAD 的累积机制起作用，而是通过一种全新的直接结合模式抑制酶活。 "Kinetic characterization indicates 1 does not function via this mechanism as standard tight-binding kinetics... is observed... Furthermore, we see no indication of FAD reoxidation upon treatment with 1."（三）结构机理研究：基于断裂反应的共价修饰实验目的与设计逻辑 鉴于 1 表现出的紧密结合动力学和独特的高张力螺环结构，作者假设其可能与 ALS 发生共价结合。为了验证这一假设并解析原子层面的结合细节，作者利用完整蛋白非变性谱（Intact Protein MS）检测质量偏移，并通过冷冻电镜（Cryo-EM）解析烟曲霉 ALS（AfALS）与 1 的复合物结构。实验结果与深度解析质谱分析显示，AfALS 和 ScALS 在与 1 孵育后均发生了明显的质量偏移，且该偏移对应于 1 的分子量，支持共价结合假设（Figure 3A）。随后的 Cryo-EM 解析获得了 AfALS-1 复合物 2.36 Å 分辨率的结构（Figure 3B）。电子密度图清晰地显示，1 位于二聚体界面的底物通道中，且与 Lys310 残基的侧链相连（Figure 3C）。惊人的是，结合后的配体结构发生了显著变化：原有的 C1-C2' 键断裂，Lys310 的  -氨基与 C1 形成酰胺键。作者提出了一种类似于 Retro-Dieckmann 的断裂机制：Lys310 进攻 C1 酮基，随后高张力的螺环体系驱动 C1-C2' 键断裂，从而不可逆地捕获赖氨酸（Figure 3D）。结构叠合显示，1 的结合位置与除草剂 2 虽然都在底物通道，但具体的空间构象和关键相互作用残基（如 Trp648）完全不同（Figure 3E）。这种通过碳-碳键断裂释放环张力来捕获赖氨酸的机制在天然产物中极为罕见，区别于常见的亲电共价抑制剂（如 Wortmannin 等）（Figure 3F），代表了一种全新的共价抑制策略。 "The structure achieving the best fit... contained an amide between C1 and the  -amine of Lys310 with fragmentation of the C1–C2' bond... The driving force for this fragmentation is likely the relief of ring strain in the spiro center."（四）抗真菌活性与体内致病性验证实验目的与设计逻辑 最后，作者旨在评估 1 的药用潜力并验证 ALS 作为抗真菌靶点的体内相关性。实验设计包括测定 1 对一系列病原真菌的最低抑菌浓度（MIC），测试其对人源细胞的细胞毒性，并利用小鼠模型评估 ALS 缺失对烟曲霉致病力的影响。实验结果与深度解析MIC 测试表明，1 对烟曲霉的抑制活性（IC50 = 0.7  M）与一线药物伏立康唑相当，且显著优于现有的除草剂类 ALS 抑制剂（Figure 4A）。更重要的是，1 对包括唑类耐药菌株在内的多种临床分离株以及其他难治性霉菌（如毛霉、赛多孢子菌）均表现出强效活性（Figure 4B），且在高达 100  M 浓度下对人原代细胞无毒性（Figure 4C）。为了验证靶点，作者构建了 ilv2（ALS 基因）敲除的烟曲霉菌株。在小鼠侵袭性曲霉病模型中，感染 ilv2 敲除菌株的小鼠存活率显著提高（Figure 5A），且肺部真菌负荷降低了 20 倍（Figure 5B），而回补菌株则恢复了致病力。这证明 ALS 是真菌在宿主环境中生存和致病所必需的，确认了其作为抗真菌靶点的有效性。尽管 1 在血浆中不稳定（可能由于同样的断裂化学反应），但结构信息的获得为后续优化提供了明确方向。 "These results demonstrate that ALS is required for full virulence of A. fumigatus in the context of invasive aspergillosis and establish it as a promising therapeutic target."六：总体结论 本研究通过抗性基因导向的基因组挖掘，发现了一种结构新颖的真菌天然产物 HB-35018 (1)。该化合物通过一种前所未见的“张力释放驱动的碳-碳键断裂”机制，共价修饰乙酰乳酸合酶（ALS）活性位点的赖氨酸残基，从而不可逆地抑制酶活。与传统除草剂不同，1 具有强效的广谱抗真菌活性，且对人源细胞无毒。体内实验证实 ALS 是治疗侵袭性真菌感染的有效靶点。这项工作不仅为抗真菌药物研发提供了一个全新的先导化合物和作用机制，也展示了基因组挖掘在发现具有特定靶点活性的天然产物方面的巨大潜力。七：论文评价优点与创新 1. 机制创新：揭示了基于 Retro-Dieckmann 样反应的赖氨酸共价修饰机制，这在天然产物抑制剂中极具创新性，为设计新型共价药物提供了新思路。 2. 技术整合：完美融合了基因组挖掘、合成生物学、结构生物学（Cryo-EM）和药物化学评价，构成了一个完整的“从基因到先导化合物”的发现闭环。 3. 靶点验证：虽然 ALS 是老靶点（除草剂），但本研究首次在分子机制和动物模型层面严格验证了其作为抗人致病真菌靶点的可行性，打破了“除草剂靶点不适合抗真菌”的固有偏见。未来研究方向 1. 稳定性优化：化合物 1 在生理基质中不稳定（易发生同样的断裂反应），未来需基于 Cryo-EM 结构进行构效关系研究，设计更稳定的类似物。 2. 药代动力学改进：虽然体外活性强，但需改善其理化性质以适应体内给药需求。 3. 生物合成酶学：SdtD（Diels-Alderase）和 SdtG（P450）催化的反应具有独特的立体化学特征，值得深入研究其酶学机制。八：关键问题及回答 问题 1：化合物  1 的抑制机制与传统的 ALS 抑制剂（如磺酰脲类除草剂）有何本质区别回答：本质区别在于结合模式和动力学特征。传统除草剂（如化合物 2）通常通过非共价结合堵塞底物通道，并诱导 FAD 辅因子氧化，导致酶的“累积抑制”（Accumulative inhibition）。而化合物 1 则是通过其 C1 酮基与活性位点的 Lys310 发生反应，随后发生高张力螺环驱动的 C1-C2' 键断裂，形成稳定的共价酰胺键。动力学上，1 表现为不可逆的紧密结合，且不依赖 FAD 的氧化状态。 问题 2：为什么本研究认为 ALS 是一个理想的抗真菌靶点？回答：首先，ALS 是支链氨基酸（BCAA）生物合成的关键酶，而人类缺乏该途径（BCAA 为必需氨基酸，需从饮食摄取），因此靶向 ALS 理论上具有很高的选择性和低宿主毒性。其次，动物模型实验表明，尽管宿主环境存在氨基酸，但烟曲霉仍需依赖自身的 ALS 进行 BCAA 合成以维持全致病力（ilv2 缺失导致毒力显著下降），证明该靶点在感染条件下是必需的。 问题 3：SdtD 在 1 的生物合成中扮演了什么角色？其特殊性体现在哪里？回答：SdtD 是一种 Lipocalin 类型的 Diels-Alder 酶（DAase），负责催化线性多烯中间体发生分子内 Diels-Alder 反应，形成 1 核心骨架中的顺式-十氢化萘（cis-decalin）结构。其特殊性在于，通常热力学上反式（trans-）异构体更稳定，而 SdtD 能够特异性地导向顺式产物的形成，这与已知的同类酶（如 CghA 产生反式产物）形成鲜明对比，展示了酶对立体化学的精准控制能力。

美国Hexagon Bio公司Colin JB Harvey团队联合加州大学洛杉矶分校、达特茅斯学院等机构，于2025年10月9日在预印本平台bioRxiv发表。研究背景：抗真菌治疗的“寂静危机”与新型靶点的迫切需求 侵袭性真菌感染是全球公共卫生领域的重大威胁，每年夺去超过250万人的生命，其中仅由烟曲霉引起的侵袭性曲霉病就导致至少130万人死亡。世界卫生组织已将烟曲霉列为“重点真菌病原体清单”中的“关键优先组”。这一严峻形势正因两大趋势而持续恶化：一是免疫缺陷人群（如器官移植者、癌症患者、HIV感染者）不断扩大；二是全球气候变暖可能扩大病原真菌的生态分布范围。 然而，面对如此迫切的医疗需求，抗真菌药物研发管线却异常干涸。当前临床主流药物——唑类、棘白菌素类和多烯类——均已有数十年历史。唑类药物耐药性日益蔓延，棘白菌素的应用范围受限，而多烯类则因其显著的肾毒性等问题使用受限。尽管需求迫切，但近几十年来，具有全新作用机制的抗真菌药物鲜有问世，研发进程严重滞后。 传统抗生素和抗真菌药物的宝库很大程度上源自微生物产生的天然产物。近年来，一种名为“抗性基因引导的基因组挖掘”的策略为定向发现新型活性天然产物带来了曙光。其核心逻辑在于：许多负责合成具有生物活性化合物（如毒素或抗生素）的微生物，其基因簇内往往同时编码一个能使自身对该产物产生抗性的基因（通常是靶点蛋白的同源物或修饰酶）。因此，通过在全基因组中寻找与已知重要靶点（如必需酶）同源的基因，并将其作为“诱饵”，就能反向定位出可能生产相应抑制剂的全新生物合成基因簇。这种方法已在发现糖酵解、蛋白酶体、麦角固醇合成等途径的抑制剂中取得成功。 理想的抗真菌靶点应满足两个关键条件：对病原真菌的生存至关重要；在人体中不存在，以最大程度降低宿主毒性风险。支链氨基酸的生物合成途径便是这样一个极具吸引力的靶标。支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸）是生命体必需的营养物质，但人类必须从食物中获取，而真菌却能自主合成。该途径的第一个关键酶——乙酰乳酸合成酶——因其在植物中作为高效除草剂靶点而被深入研究，已有超过50种以其为靶点的商业化除草剂，如苯磺隆、五氟磺草胺、双草醚等。然而，ALS作为人类抗真菌药物靶点的潜力，却一直未被充分发掘和验证。 本研究旨在运用前沿的基因组挖掘与合成生物学策略，系统性解决抗真菌药物发现中的核心难题： 能否利用抗性基因引导的基因组挖掘策略，从真菌基因组中发现靶向ALS的全新结构类型抑制剂？ 所发现的化合物HB-35018具有怎样独特的化学结构？其复杂的生物合成途径涉及哪些新颖的酶学机制？ HB-35018是否确实以ALS为作用靶点？其抑制机制与已知的ALS除草剂有何根本性不同？ 该化合物的体外抗真菌活性如何？是否对临床耐药菌株有效？其人体细胞毒性如何？ 从治疗角度，ALS这一靶点对烟曲霉的致病性是否真的“必不可少”？即便环境中可能存在支链氨基酸，真菌能否通过“ scavenge”途径绕过ALS抑制？详实的研究结果：从基因簇到动物模型的系统性突破1. 基因挖掘与生物合成：发现独特螺环化合物HB-35018 研究团队首先在真菌基因组数据库中搜寻含有与酿酒酵母ALS基因（ILV2）同源基因的生物合成基因簇。这一搜索在土曲霉的基因组中锁定了一个此前未知的基因簇，命名为 sdt（图1D）。同时，在新印度曲霉中也发现了一个高度同源的 neo。 为了“唤醒”并鉴定该沉默基因簇的产物，研究者采用了两种互补策略：在原宿主体内过表达基因簇内的转录因子 sdtE 以激活整个基因簇；以及将整个基因簇重构后异源表达于构巢曲霉中。两种方法均指向同一个显著上调的代谢物峰，其质荷比（m/z）为386.233。分离纯化后，鉴定出其结构为 HB-35018，这是一个前所未见的、包含螺环和顺式十氢萘骨架的四酸类化合物（图1E， F）。 鉴于其结构的独特性，研究者深入解析了 HB-35018 的生物合成途径（图1G）： 起始与环化：聚酮合酶/非核糖体肽合成酶杂合酶SdtB在反式烯酰还原酶SdtF的协助下，合成一个八聚酮-谷氨酸杂合前体，随后通过分子内狄克曼缩合释放出第一个四酸中间体 9。 关键顺式十氢萘形成：加入编码脂质运载蛋白型DA酶的 sdtD 基因后，中间体 9 被转化为顺式十氢萘产物 10。顺式十氢萘在热力学上不如反式异构体稳定，其酶促形成较为罕见。SdtD是首个被报道能通过正常的分子内狄尔斯-阿尔德反应直接催化形成顺式十氢萘的脂质运载蛋白型Diels-Alderase，其关键氨基酸位点可能决定了其独特的立体选择性（图S2）。 还原与氧化：随后，ATR-like蛋白SdtH和短链脱氢还原酶SdtA依次将十氢萘上的羧基还原为醛基（11）和羟基（12）。最后，细胞色素P450酶 SdtG 催化了整个合成中最具挑战性的步骤：在C2'位构建高度张力的螺环中心。体外实验证实，SdtG的同源蛋白NeoG能将醇 12 转化为最终产物 HB-35018 及其C2'差向异构体 13（图1I）。X射线晶体学最终确定了 HB-35018 的绝对立体构型。2. 靶点验证与独特作用机制：一种非累积性共价抑制剂 基因簇内存在的ALS同源基因强烈暗示ALS是 HB-35018 的靶点。为确证这一点，研究首先进行了正向遗传学筛选：用 HB-35018 处理诱变后的酿酒酵母文库，筛选耐药克隆。对24个耐药克隆进行全基因组测序，发现其中23个在ILV2基因（编码ALS）上发生了突变（图2A）。这些突变主要集中在ALS二聚体的底物通道入口附近，靠近已知除草剂结合位点。其中，Pro192 的突变出现在75%的耐药克隆中，这与之前报道的对另一类ALS抑制剂产生抗性的突变位点一致。 生化实验进一步证实，HB-35018 能强效抑制来自酿酒酵母、白色念珠菌和烟曲霉的重组ALS酶活性，其效力与已知ALS抑制剂相当（图2C）。然而，一个关键区别出现了：当测试对Pro192Ser突变型ALS的抑制活性时，已知抑制剂（如苯磺隆）的效力下降了超过100倍，而 HB-35018 的效力仅下降了约4倍（图2B）。这暗示了它与靶点的结合模式可能与经典抑制剂不同。 已知的许多ALS除草剂（如苯磺隆、五氟磺草胺）属于“累积性抑制剂”。它们不仅占据底物通道，还能在活性中心“困住”活性氧，导致辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸 被不可逆氧化失活，从而产生超化学计量比的抑制效果（图2D）。然而，动力学研究表明 HB-35018 遵循典型的紧密结合抑制剂的动力学特征，其IC50值随酶浓度线性变化，且不引起FAD的再氧化（图2E, F）。这表明其作用机制并非累积性抑制。 基于其独特的张力环结构和紧密结合特性，研究者提出了更大胆的假设：HB-35018可能通过共价键与ALS结合。完整蛋白质质谱分析为这一假设提供了直接证据：用 HB-35018 处理后的ALS蛋白，其分子量出现了与共价加合物吻合的质量增加（图3A）。肽段图谱分析将共价修饰位点锁定在包含Lys251和Asp252（在烟曲霉ALS中对应Lys310和Asp311）的肽段上。3. 冷冻电镜揭示分子“锁死”机制 为了在原子层面看清 HB-35018 如何“锁死”ALS，研究者利用冷冻电镜解析了烟曲霉ALS的apo状态以及与 HB-35018 结合的复合物结构，分辨率分别达到2.76 Å和2.36 Å（图3B, C）。 结构揭示了一个前所未见的抑制模式：HB-35018的螺环中心发生了断裂。其C1羰基与ALS活性中心入口处的关键Lys310的ε-氨基形成了共价酰胺键，同时C1-C2'键发生断裂（图3C, D）。这种结合模式可能源于Lys310对C1酮的亲核进攻，随后高度张力的螺环驱动C1-C2'键发生逆狄克曼式的断裂，从而不可逆地将抑制剂锚定在靶点上。蛋白与配体之间存在着广泛的疏水和极性相互作用，稳定了复合物（图3C）。与apo结构相比，结合 HB-35018 导致了Lys310、Arg441、Trp648、Phe652等关键氨基酸侧链的显著构象变化（图S7B）。 这一共价结合模式完美解释了之前的遗传学和生化数据： 耐药突变：大部分在筛选中发现的突变位点（如Pro251/Phe260/Trp648）都位于 HB-35018 结合口袋的5 Å范围内（表S1）。 对Pro192突变敏感性低：在复合物结构中，Pro251（对应酿酒酵母Pro192）与 HB-35018 柔性的丙基链相互作用较弱；而在与苯磺隆的结构中，Pro192与刚性的苄基环作用更强。因此，Pro192突变对 HB-35018 结合的影响远小于对苯磺隆的影响（图3E 分析）。 HB-35018 代表了又一种以赖氨酸为共价攻击点的天然产物。与常见的靶向半胱氨酸的共价药物相比，靶向丰度更高的赖氨酸具有独特优势，但也因赖氨酸氨基较高的pKa而更具挑战性。HB-35018 通过张力释放驱动C-C键断裂来捕获赖氨酸侧链的机制，在已知的天然产物中尚属首例（图3F）。4. 强效、广谱的体外抗真菌活性与良好安全性 明确了作用机制后，研究者评估了 HB-35018 的实际抗真菌效果。尽管在生化水平上， HB-35018 与已知ALS抑制剂的效力相近，但在抑制烟曲霉生长的细胞实验中，其表现天差地别。 HB-35018 的半数抑制浓度（IC50）仅为0.7 µM，与临床一线药物伏立康唑（0.5 µM）相当；而所有测试的ALS除草剂（如苯磺隆IC50 >200 µM）抗真菌活性都极弱（图4A）。这可能是因为这些除草剂在生理pH下带负电，难以穿透真菌复杂的细胞壁、细胞膜和线粒体膜到达靶点。 更重要的是， HB-35018 的活性不仅限于实验室菌株。它对来自美国疾控中心耐药菌库的临床分离烟曲霉菌株（包括对唑类药物耐药的菌株）均表现出强效抑制（图4B）。此外，它对一系列其他致病真菌，如黑曲霉、米根霉、卷枝毛霉、尖端赛多孢等也显示了抑制活性，展现了广谱抗真菌潜力。 至关重要的是，由于ALS在人类中不存在， HB-35018 在浓度高达100 µM时，对多种原代人细胞（如人脐静脉内皮细胞、肝细胞）和细胞系均未显示任何细胞毒性，预示了其良好的靶点选择性安全性（图4C）。5. 靶点必需性验证：ALS是烟曲霉的“阿喀琉斯之踵” 一个潜在的担忧是：在感染环境中，真菌能否通过从宿主组织中“窃取”支链氨基酸来绕过ALS被抑制的缺陷？为了验证ALS在致病过程中的“绝对必需性”，研究团队构建了烟曲霉AF293菌株的 ilv2基因敲除株。 体外实验证实，该突变株需要培养基中含有极高浓度的支链氨基酸才能生长，说明其从外界摄取支链氨基酸的能力非常有限（图S8）。在小鼠侵袭性曲霉病模型中，感染 ilv2Δ 突变株的小鼠生存率显著提高，其毒力大大减弱。而将 ilv2 基因回补到突变株中，则能完全恢复其致病力（图5A）。感染后第3天，小鼠肺组织中 ilv2Δ 突变株的载菌量比野生株和回补株低了20倍（图5B）。这些数据确凿地证明，在真实的感染情境下，ALS对烟曲霉的致病性是不可或缺的，宿主来源的支链氨基酸不足以补偿其功能的丧失。这为将ALS作为抗真菌靶点提供了坚实的体内实验依据。6. 先导化合物的局限与未来方向 尽管 HB-35018 在体外展现了巨大潜力，但深入的理化性质和药代动力学评估揭示了其作为药物先导化合物的主要短板：稳定性不足。它在pH 7.4缓冲液、小鼠血浆和小鼠肝微粒体中半衰期较短，特别是在肝微粒体中仅3分钟（表S3）。这种不稳定性很可能源于其螺环结构在生物环境中，与水或其他亲核试剂发生了与其抑制机制类似的C1-C2'键断裂反应。因此，研究者认为 HB-35018 本身可能难以在体内达到有效治疗浓度，需要进一步的化学优化以改善其稳定性。结论与展望 本研究成功地运用抗性基因引导的基因组挖掘这一强大策略，从真菌基因组中“钓”出了具有全新化学骨架的强效抗真菌先导化合物 HB-35018。研究不仅完整阐明了其涉及多个新颖酶学反应的生物合成途径，更通过遗传学、生物化学和冷冻电镜结构生物学的多维度手段，揭示了其通过张力驱动、赖氨酸靶向的独特共价抑制机制，这完全不同于已知的ALS除草剂。 更重要的是，本研究系统性地验证了乙酰乳酸合成酶作为抗真菌药物靶点的“双重可行性”：一方面，该靶点在人体中不存在，确保了潜在的安全性；另一方面，通过严谨的小鼠感染模型证明，该靶点对烟曲霉的致病性在体内是绝对必需的，克服了关于病原体可通过环境获取营养而绕过的理论担忧。 尽管 HB-35018 因稳定性问题尚需优化，但本研究提供的高分辨率靶点-抑制剂复合物结构，为基于结构的合理药物设计、改造以获得更稳定、更强效的衍生物铺平了道路。同时， sdtBGC 是继chlorflavonin和harzianic acid之后，第三个被发现的含有ALS同源抗性基因并产ALS抑制剂的基因簇，这强烈提示在真菌的生态竞争中，靶向支链氨基酸合成途径是一种反复进化出的有效策略，进一步增强了该靶点用于抗真菌药物开发的信心。 总之，这项工作不仅报道了一个极具潜力的抗真菌先导化合物和其新颖的作用机制，更示范了一条从基因组大数据出发，结合合成生物学、结构生物学和体内验证，系统性发现和评估全新抗菌靶点与药物的创新研发范式，为应对日益严峻的耐药真菌感染威胁带来了新的希望。 原文链接： https://doi.org/10.1101/2025.10.09.681488