PolyTherics Ltd.

汉康生技 首席商务官的 跨国授权经验谈 转自：GeneOnline 完整专访请见：https://geneonline.news/hanchorbio-cbo-interview....../ 汉康生技： 免疫肿瘤学领域的崛起与布局 根据世界卫生组织2022年统计数据显示，全球每年新增癌症病例超过2000万例。在癌症患者年轻化与人口老龄化的双重因素影响下，癌症疾病负担持续居高不下，相关药物市场规模每年以两位数百分比持续增长。在众多癌症治疗方案中，通过激活人体免疫系统来摧毁肿瘤细胞的免疫疗法，已成为产业重要焦点之一。该领域市场扩张迅速，据Global Information数据显示，免疫肿瘤学市场规模将从2024年的1259亿美元增长至2034年的6341亿美元，年复合增长率约为17.5%。市场竞争也日趋激烈，催生了多起十亿美元级别的交易，类型涵盖药品或技术授权、共同开发、产品收购、公司并购等。 作为一家专注于免疫肿瘤学的全球生物技术公司，汉康生技凭借旗下专有的FBDB™技术平台，开发出融合蛋白抗癌药HCB101，后续更挑战难度极高的三功能生物药，研发属于市场首创的HCB301和HCB303。其中，前两者已进入临床试验阶段（HCB101更已推进至临床Ib/II期）。乘此强劲势头，汉康正为其候选药物积极寻求区域及国际合作伙伴。继2025年6月底与上海复宏汉霖就HCB101签订大中华区及东南亚独家授权合作协议后，在日本、韩国及欧洲等地的授权洽谈也在积极推进中，汉康已与多家药厂签署保密协议，并已进入尽职调查阶段。 基因线上团队荣幸邀请到汉康生技首席商务官丛越华博士接受专访。访问中她不仅分享了过去在欧洲和中国大陆从事生命科学商业开发与投资的宝贵经验，也深入探讨了汉康的商务开发与授权策略、交易评估逻辑与尽职调查重点。 平衡科学创新与商业现实 以实战经验构建商发战略 丛博士早年在德国取得有机化学博士学位后，加入英国生物技术公司PolyTherics创始科学团队，参与其第一代ADC研发。后来她转战生命科学商业开发与投资领域，在加盟汉康之前先后在PolyTherics、F-star Biotech及中国先声药业任职，负责商务开发业务，参与完成多起国际授权合作交易，完整交易金额范围约在4亿至12亿美元之间。 丛博士指出，多年来通过参与及主导各类型跨国授权合作项目，她积累了丰富且多元化的买卖方谈判及商发团队管理经验。这一系列跨地域、跨职能的实务经验使她既理解技术细节，也熟悉国际药厂的决策与投资逻辑，为她目前在汉康领导商发部门打下稳固基础。这个基础可以总结为三点——"全球视野"、"核心价值"和"科学叙事"，以实现长期共赢。 谈到全球视野，丛博士表示在全球获得批准的创新药物中，约有一半来自像汉康这样快速成长的新兴生物制药企业。她说："我们正在参与一场'全球创新淘汰赛'，挑战与竞争皆来自国际。"鉴于此，她强调汉康自成立伊始即具备国际视野，期望"做世界一流创新药，致力服务全球患者"。因为唯有面向全球患者，才能拥抱广大国际市场，取得更大的商业回报。 丛博士提到，"以数据为本"是汉康一直坚守的价值。尽管自成立五年来不断面对市场与政策的波动，她坚信唯有通过扎实且具说服力的证据，公司的科学创新才能被市场、监管机构与潜在合作伙伴理解、欣赏并采信。她也反复强调，患者始终是整个生物医药产业的核心，所有创新最终必须让患者真正受益，才能创造真正的价值。在确立核心价值之后，她认为商发团队要履行的任务不只是促成单笔交易，还要为每个产品提出清晰明确的科学叙事，让潜在合作伙伴看见其独特性和临床价值，使之在竞品众多的免疫肿瘤领域中脱颖而出。简而言之，临床科学奠定产品价值，商务开发则让价值被看见。 总体而言，丛博士的谈话勾勒出一套明确的商发逻辑：一方面致力将具潜力与前景的科学成果（例如HCB101）推上国际舞台，另一方面则通过平衡科学创新与商业现实的商发流程分散风险，规划明确的上市途径。此外，商发团队要选择理念相近的合作对象，"共同做大市场"，从而放大商业价值，实现长期共赢。 打造全球能见度 数据力、主动性、交易准备度 缺一不可 谈到台湾生物技术公司如何在国际舞台提升能见度、让国际大药厂视为具合作潜力的对象，丛博士凭借自身经验提出一套具体且可复制的方法论，不仅适用于汉康，也能让其他生物技术初创或中小型药厂借鉴。其中包含三大要素：世界级的科学数据、主动成熟的商发团队、以及跨部门共同具备的"交易准备度"。 "如果想和国际药厂谈合作，首要条件一定是能拿得上谈判桌的世界级数据。"在丛博士的观察中，许多公司在创新方向上不乏想法，但能否提供质量足以支撑交易的真实证据，是完全不同的门槛。然而，扎实的数据必然是所有合作的基础。她也补充："'酒香也怕巷子深'，再好的科学原理和实验数据，若没有被清晰、持续地带到国际舞台，市场就很难真正理解其价值。"因此，生物技术公司必须建立专业和主动的商发团队，在各个国际舞台，以持续不懈地主动出击，讲好公司的故事，凸显产品的科学价值。 "交易准备度"是丛博士在整个访问中反复强调的关键概念。她指出，为潜在交易案做好准备不仅是商发团队的职责，而是整个公司的事情，需要各职能部门通力合作，让公司在正确时间点拿出完整且可直接使用的数据包，这样才能提升后续授权合作谈判的效率，做到事半功倍。以汉康生技的经验为例，在产生正式数据包前，他们会主动建立一个内部"虚拟数据室"。通过结构化的资料整理、差距分析与跨部门校准，公司能在进入正式洽谈和尽职调查前就清楚掌握自身资料的强弱项，也能预先补强可能被合作方质疑的环节。 汉康另一个强化"交易准备度"的例子就是研发团队的持续积极曝光，不论是参与国际学术会议并作海报论文发表、投稿国际级期刊发表高影响力研究（例如近期在Journal of Hematology & Oncology的发表）、举办研发日等等，都是为了打造公司的品牌标签和科学叙事，提升汉康在学术界与业界的能见度和信任度。 尽职调查 从签署保密协议开始 为对方着想 构建可即用数据包 要成功落实交易，尽职调查是一项必须通过的步骤。所以如何有效应对尽调也是生物技术公司在为潜在交易案作准备时必须考虑的一环。丛博士提醒："尽调并不是在对方进入数据室的时候才正式展开，而是在双方签署保密协议那一刻就已经启动，对方自那天起就会持续评估我们是否值得成为合作伙伴。"整个过程要到签署最终协议，虚拟数据室关闭才算告一段落。 她进一步指出，尽调内容横跨技术、法规、商业与知识产权等多重维度，每一项都是合作方极为重视的核心信息。其中IP完整度往往是重点，以HCB101为例，这款融合蛋白药在美国已取得完全专利，而非尚在"专利申请中"的状态，两者保护等级截然不同，而且也会直接影响合作方对产品的信心。 至于技术层面的资料准备，丛博士则提出一个简单但极关键的衡量准则："对方能不能拿着我们的数据包无缝接手，并在实验室和临床试验中重现我们的数据？"在这个大原则下，汉康团队会尽可能从合作方的角度着想，不断思考缺少某些资料会否让临床操作出现断点，或使对方在和监管机构沟通时遇到困难。这个过程涉及跨部门的沙盘推演，需要预估合作方可能提出的问题、制定Q&A清单并进行内部演练，务求未雨绸缪，让尽调更为顺畅，继而加速推进交易。 以科学证据回应市场疑虑 多角度切入 证明HCB101有力突围 作为汉康当前的主力候选药物，HCB101是其众多肿瘤产品管线中临床试验进度最快的，现已推进至临床Ib/II期，并持续于美、中、台三地多中心收案。鉴于此，无论是在授权洽谈阶段，或是在面对跨国药厂的尽职调查时，HCB101自然成为备受关注的焦点。 谈到如何向潜在合作方证明HCB101在抗CD47药物中具备成为"同类最佳"的潜力，丛博士将焦点带到汉康生技成立的初衷——"每一个产品都必须以成为first-in-class或best-in-class为目标来设计"。但是她也坦言，考虑到CD47通路经历过一波全球热潮，后续却接连传出负面消息，不少国际大厂的候选药物都因临床结果不如预期而中止研发，要在授权洽谈的场景中让对方相信HCB101的抗肿瘤实力并非易事。 "前一代的候选药都失败了，你们凭什么说HCB101能成功？"几乎是汉康在每场谈判中都会被问及的问题。面对这个历史包袱，丛博士选择正面应对，指出汉康会从三个层次来回应：生物学机制、临床前数据和临床数据。在生物学层面，团队会先回到CD47-SIRPα通路的核心，说明通路本身并无不妥。问题症结在于前代竞品在分子设计上未能真正发挥先天免疫系统的抗肿瘤潜能。HCB101的分子设计即是针对早期失败原因进行修正，能同时高效启动先天与适应性免疫反应，双管齐下击杀肿瘤细胞。 至于在临床前阶段，汉康已就HCB101与竞品进行多项头对头比较，无论是在体外实验还是动物实验中，药效及安全性数据皆可直接对照，对方从中可以清楚看出HCB101已明显处于领先地位。在临床方面，丛博士承认不少人会质疑HCB101仍在临床II期的早期阶段，目前尚不足以下定论。但即便如此，根据现阶段的临床结果，HCB101的表现已经远胜历史竞品。因此在对外简报的第一章，汉康就会将双方的安全性与疗效数据完整呈现，用科学证据解答所有潜在疑虑。 跨越地域与政策挑战 从细节着眼赢得信任 回顾多年来参与生物医药产业商务谈判的经验，丛博士认为，从初次接触到最终签约，其实是一段不断建立信任的旅程。真正推动交易谈判往前走的，是团队在过程中展现出的原则和执行力。每一次会议、每一句回应、每一次准备是否充分，都会塑造潜在合作方对公司的观感与信任，而这些看似不起眼的细节，都是决定尽调能否过关、交易案最终能否实现的关键。 谈到具体案例，她分享了一笔在COVID-19疫情期间促成的大型合作案。合作双方是初次接洽，彼此并不熟悉，不少细节原本都需要实地确认。可是碍于各种防疫隔离措施，导致实体尽调无法进行。面对如此困境，她带着时任公司团队主动出击，从设备型号、仪器配置到操作流程，一项项通过录像拍摄与线上讨论重建"现场"情境，尽力克服地域障碍。最终他们的努力没有白费，合作协议顺利达成，后续更衍生出新的合作案。丛博士强调，这个例子说明了在瞬息万变、不确定因素众多的国际商务战场中，商发团队需要积极主动，跳出传统思维框架，尽一切方法展现诚意、赢得信任。 然而，除了疫情这种不可抗力因素之外，面对世界各地的药厂，商发团队在授权谈判中还会遇上很多不同的挑战。例如有些大型企业因内部流程繁复、文化偏保守，在面对政策或监管法规变动时，有时会出现"分析瘫痪"。此外，美国近年政策更动频繁，FDA对药品生产地点与供应链的要求都在不断调整，这些不确定性往往让药厂难以快速做出判断。再者，即便是同一种适应症，放到不同地区的市场中，不论是患者族群组成、诊疗指南、临床试验设计、药品监管要求等都可能截然不同。 丛博士指出，生物医药产业的特性是监管门槛极高，所有交易案的判断都应当以患者利益为依归，为患者带来价值。因此，商发团队在构思交易架构时必须因地制宜，并深入理解各地患者的实际需求。面对重重挑战，汉康固然无法代替潜在合作方消除疑虑，但他们可以做的是站在对方角度思考，预判对方可能担心的细节，提供透明信息及即时数据分享，协助对方加快决策流程。 以人为本建立互信 团队协作是致胜关键 要成功实现授权合作，领先同侪的技术和疗效卓越的药品固然不可或缺，但是团队协作也同样极为重要。丛博士以至汉康整体均深明此道，重视团队精神和人的价值，致力建立畅通无阻的跨部门沟通管道。除了每两周一次的正式会议之外，团队之间可以按需要随时提出自己的想法、疑问和忧虑。这种"养兵千日"的运作模式，让公司上下在任何时刻都准备好走出去，讲好汉康的科学与业务叙事，争取每一个潜在合作机会。 丛博士又提到，在真正进入授权洽谈时，汉康的策略是尽早让各职能部门的主管尽快与对方相应部门的负责人彼此认识，及早开始直接对话。此外，汉康会组织"部门对部门"的正式商谈，让对方事先准备问题，再由自家对应的团队逐一讨论。商发部门的成员虽然全程在线，但他们的角色并非回应者，而是刻意隐身，在背后担当协调者，只在必要时协助补全信息或统整后续行动。她以谈婚论嫁为比喻："签约仪式就像婚礼，但真正一起'过日子'的还是双方的功能团队。"因此商发团队就是要尽力撮合双方，促进互信建立。她深信，只要双方功能团队越早累积信任、越早产生化学作用，后续合作推进和尽职调查就会顺畅得多。 拥抱灵活多元合作模式 发挥优势实现互惠共赢 访问接近尾声，丛博士指出，创新药物开发本质上是"三高一长"——高风险、高投入、高回报、长周期。随着AI技术迅速发展，她相信AI将成为降低风险与缩短周期的重要利器。事实上，汉康自创立早期就积极拥抱AI与数据技术，期望借此加速临床研发与营运决策效率。谈到汉康目前活跃的免疫肿瘤学及自身免疫疾病领域，她表示虽然市场竞争激烈，但凭借公司旗下具差异性的技术平台和融合蛋白候选药，长远而言有望在其中占据一席之地。 "FBDB™技术平台可用于开发双特异性或多特异性融合蛋白药物，而且不受特定治疗领域限制。"丛博士强调，这样的优势为商务开发和授权合作洽谈开辟了广阔的空间，除了单纯的平台或产品授权之外，汉康可以针对潜在合作方的需求，量身定制交易案。以HCB101为例，考虑到这款融合蛋白能应用于多个肿瘤适应症，而且能做到"单药即见效"，目前汉康的态度是希望尽量保留其核心价值，而不是过早将产品授权给其他药厂。在这样的前提下，可行的合作模式至少包括共同开发、平台合作、股权投资、授权等等。总的来说就是除了将汉康自身的利益最大化之外，也期望通过找到理念契合的合作伙伴，共同"做大市场"，创造长期价值，实现互惠共赢。 ▼

文章首发在“药理毒理开发”微信公众号，作者：曾子像，欢迎关注。40多年前，随着重组人胰岛素和人生长激素的出现，生物药物的研发开始起步。当时，这些药物主要用于替代治疗代谢或免疫疾病中涉及的天然蛋白质，其在人体内的循环半衰期仅为几小时，这一较短的半衰期在最初被当作生物学事实所接受。与传统小分子药物的药代动力学（吸收、分布、代谢和排泄，即ADME）相比，早年对蛋白质或肽类药物快速消除的生物学机制的研究相当有限。进入21世纪后，随着嵌合和人源化抗体特别是曲妥珠单抗等抗体药物的出现，它们具有长半衰期，可达1-3周（在小鼠中为6-8天），使人们对长半衰期生物药的研发兴趣大增。IgG及其融合蛋白的长半衰期不仅源于其“大块头”，还归因于FcRn介导的内质网循环机制，其循环时间比细胞因子和其他小到中等大小的生物药物长几个数量级。此外，聚乙二醇化（PEGylation）技术的发展，为延长传统蛋白质药物的半衰期，减缓肾脏消除，提供了另外一种路径。这些基本原理的广泛认可，激发了其他几种延长生物治疗药物半衰期的技术的发明。到目前为止，已有超过50种基于不同半衰期延长技术（Fc融合、PEG化、白蛋白融合等）的药物获批，并有大量药物处于临床前和临床不同研发阶段。如下表所示，*代表已撤市。本文拟对延长生物药物半衰期的策略进行详细介绍。聚乙二醇化技术聚乙二醇化是一种通过将药物与合成的亲水性高分子聚合物进行化学结合，以增加其水动力学体积，从而减缓肾脏清除、延长药物在体内的作用时间的技术。该技术的基本概念最早可追溯到20世纪50年代。在早期研究中，肽胺类药物甘氨酰-L-亮氨酰-美斯卡林与血浆扩容剂聚乙烯吡咯烷酮结合，以延长其在体内的停留时间，并实现药物的缓慢酶催化释放。尽管当时也提出了将这种方法应用于合成内源性肽激素（如催产素或加压素），但这一方法并未进入临床实践。20年后，在重组生物药物出现之前，研究发现将甲氧基聚乙二醇与牛血清白蛋白和牛肝过氧化氢酶结合，可以降低动物免疫反应，延长半衰期。这些研究的作者Frank Davis博士和他的博士生Abraham Abuchowski随后创立了Enzon制药公司，旨在将“聚乙二醇化”从实验室转化为临床应用。Enzon公司首批获得FDA批准的产品是非人类酶类药物：pegademase（Adagen®），一种聚乙二醇化的牛腺苷脱氨酶，用于酶替代疗法，于1990年获批；以及pegaspargase（Oncaspar®），一种聚乙二醇化的来自大肠杆菌的天冬酰胺酶（ASNase），用于治疗对天冬酰胺酶天然制剂产生过敏反应的急性淋巴细胞性白血病（ALL）患者，于1994年获批。这两款药物均是通过表面赖氨酸残基的ε-氨基基团与多个5 kDa的聚乙二醇链进行随机结合，有效地屏蔽了人体免疫系统，从而减少了抗体反应和蛋白降解，延缓了肾脏清除，使得pegademase可以每周给药一次，而pegaspargase可以每两周给药一次。Enzon公司开发的下一个产品是聚乙二醇化的重组干扰素α2b（IFNα2b）。通过将单个12 kDa的线性聚乙二醇以琥珀酰亚胺碳酸酯的形式与IFNα2b进行化学结合，得到了药物peginterferon alfa-2b（PegIntron®），该药物于2000年获得FDA批准用于治疗丙型肝炎。Peginterferon α2a（Pegasys®）采用了Shearwater技术，通过将分支的40 kDa N-羟基琥珀酰亚胺激活的聚乙二醇与干扰素α2a（IFNα2a）的赖氨酸侧链结合，于一年后获得FDA批准用于相同适应症。对这两种聚乙二醇化干扰素版本的比较表明，连接化学和聚合物结构都可以显著影响PK和PD特性。Peginterferon alfa-2b在人体内的血浆半衰期为27.2-39.3小时，而未修饰的IFN约为2小时，并作为异构体混合物在体外保持了28%的活性。相比之下，peginterferon α2a的半衰期为61-110小时，但其在体外的活性已降至仅7%。Peginterferon alfa-2b从皮下注射部位迅速吸收（t1/2 = 4.6小时），而peginterferon α2a进入血液的释放显著延迟（t1/2 = 50小时）。此外，peginterferon alfa-2b的生物分布与自然IFN相似（VD = 31-73小时），而peginterferon α2a的平均表观分布容积减少到6-14 L，这很可能与更庞大的分支40 kDa聚乙二醇链有关。尽管如此，这两种生物药物在治疗丙型肝炎方面都显示出了疗效，其中peginterferon α2a达到了更高的总体持续抗病毒反应。聚乙二醇化技术在早期成功应用的基础上，多年来不断发展和完善。例如，在制备聚乙二醇化干扰素β-1a（Plegridy®）和聚乙二醇化粒细胞集落刺激因子（G-CSF，商品名Neulasta®）时，采用了醛化学方法，在低pH条件下选择性地将20 kDa的线性PEG链与N末端肽氨基基团结合。而对于抗肿瘤坏死因子α（TNF-α）Fab片段certolizumab pegol（Cimzia®），则通过工程化的未配对巯基基团，使用马来酰亚胺化学方法位点特异性地结合了分支的40 kDa PEG。这两种方法都使得药物制剂更加均一。另一种实现PEG聚合物位点特异性结合的策略是通过引入非天然氨基酸。利用其专有的ReCODE™技术，Ambrx公司开发了ARX201，这是一种重组人生长激素（hGH），在35位通过琥珀终止密码子抑制引入了单个对乙酰基-L-苯丙氨酸残基。然后将30 kDa的PEG链与其正交反应基团结合，得到了单一的聚乙二醇化hGH。与WHO的hGH标准相比，ARX201在细胞增殖实验中的生物活性仅降低了约5倍，而在大鼠中的血浆半衰期增加了约9倍。然而，在2期临床试验后，由于临床前灵长类动物研究表明PEG成分在脉络丛上皮细胞中累积，开发被终止。另一种聚乙二醇化hGH（PHA-794428）采用N末端结合40 kDa分支PEG，显示出约20倍的受体亲和力降低，但在每周给药去垂体大鼠时，与每日给药的hGH相比，诱导了相似的体重增加。该产品由于在2期临床后期观察到注射部位脂肪萎缩而终止开发。最近，lonapegsomatropin（Skytrofa®），一种每周一次的聚乙二醇化hGH，获得了FDA批准。该分子是通过一个可自水解的所谓TransCon®连接子，将四臂PEG与hGH结合。除了由于其增加的水动力学体积而具有更长的循环时间外，这种修饰的hGH由于表面附着的双分支PEG的空间干扰而没有受体结合活性，从而也减少了受体介导的清除。然而，在血液pH和体温下，PEG连接子会稳定水解，导致生物活性激素的持续释放。因此，在临床开发期间未观察到注射部位的脂肪萎缩和PEG空泡化。同样的聚乙二醇化技术最近被应用于甲状旁腺激素（PTH，1-34残基）肽，以开发长效的palopegteriparatid（TransCon PTH），用于治疗成人甲状旁腺功能减退症，并于2024年获得FDA批准，商品名为Yorvipath®。为了减少黏度、进一步改善药代动力学或规避免疫识别，已经提出了几种创新的PEG衍生物，例如由Holger Frey博士最近合成的一种结构上“随机化”的、多分支的PEG链。另一个例子是来自Polytherics（后来与Antitope合并，现为Abzena）的PolyPEG™技术。这种聚合物将PEG链连接到聚甲基丙烯酸酯主链的重复单元上，从而形成类似梳子的结构。与线性30 kDa PEG结合物相比，70 kDa PolyPEG与IFNα2a结合后的黏度约降低了3倍，在大鼠中的终末半衰期延长了一倍。然而，在细胞培养实验中的效力比30 kDa PEG版本低约13倍，仅为天然IFN生物活性的0.5%。聚乙二醇化技术的局限性主要体现在可能导致药理学活性的降低，且带来一些安全性风险，比如注射部位脂肪萎缩和细胞质空泡化等。还有一点需要注意，聚乙二醇化的最初想法是降低免疫原性，特别是对于非人类来源的蛋白质，但近年来越来越明显的是，PEG本身可以触发免疫反应。这可能导致通过抗PEG抗体加速聚乙二醇化药物的血浆清除，或激活补体系统。这点是在COVID-19大流行之后开始受到关注，因为大多数疫苗使用PEG屏蔽的脂质纳米颗粒（LNPs）进行mRNA递送，并且报告了几例与COVID-19 mRNA疫苗Corminaty®和Spikevax®接种相关的PEG相关过敏性反应。事实上，PEG特异性抗体可以通过这种mRNA疫苗接种被诱导或增强，这可能会影响其他基于PEG的药物的清除。聚乙二醇的替代品近年来，已有多种其他天然或化学合成的聚合物被提议作为PEG模拟物。这些大分子与PEG具有相似的生物物理特性，例如分子量大、在水性环境中溶解度高，且有望克服PEG的一些缺陷，如免疫原性和组织蓄积性。其中一个例子是线性或超支化聚甘油（PG），它通过乙氧基乙基缩水甘油醚的阴离子开环聚合获得。一种40kDa的聚甘油与IL-1受体拮抗剂（IL-1Ra，阿那白滞素）结合后，其半衰期与聚乙二醇化蛋白相似，且在动物中表现出比聚乙二醇化更低的免疫原性和更长的血浆半衰期。不过，聚甘油一般不能被体内的内源性酶降解。聚肌氨酸可能是一种很有前景的可生物降解合成聚合物。肌氨酸（N-甲基甘氨酸，Sar）是一种非蛋白氨基酸，在哺乳动物体内作为胆碱代谢的中间产物存在。有研究显示，聚肌氨酸-干扰素较PEG类似物具备相似的半衰期，但药效更强，且免疫原性更低。还有些其他类型的人工多肽样聚合物，与聚乙二醇化生物制剂相比，具有可生物降解性、更好的药代动力学特性并降低免疫原性。例如，人工α-螺旋多肽L-P(EG3Glu)——基于聚谷氨酸，其γ-羧酸盐基团被修饰为带有短PEG链的（不带电荷的）酯，这种修饰被称为PEPylation；还有所谓的高两性离子密度多肽，如羧基甜菜碱功能化多肽（PepCB）。L-P(CB-EG3Glu)是一种带有羧基甜菜碱侧链的L-P(EG3Glu)，用于修饰细菌L-天冬酰胺酶II，形成类似海胆的大分子结构。这种结合物的流体动力学大小与随机偶联5kDa甲氧基聚乙二醇（mPEG）的天冬酰胺酶相似，与未修饰的酶相比，在大鼠中的血浆半衰期增加了约20倍。与聚乙二醇化版本相比，L-P(CB-EG3Glu)-天冬酰胺酶在反复给药后几乎不会引发抗天冬酰胺酶或抗聚合物抗体。虽然这些方法在合成聚合物设计领域确实令人关注，但它们都涉及复杂的化学合成过程，且到目前为止均未进入临床阶段。合成聚合物与生物药物成分的化学偶联需要额外的加工和纯化步骤，这会降低产量并增加生产制造成本，而且对于产品分析（特别是对于具有多分散组成的聚合物）所需的额外工作也是挑战。与这些合成方法相比，天然多糖提供了另一类有趣的亲水性聚合物，可用于增加治疗性蛋白质的分子大小或对其进行屏蔽。事实上，某些细菌病原体合成的荚膜碳水化合物在结构上与哺乳动物体内的多糖相似甚至相同，这有助于它们逃避免疫系统。这类非免疫原性、可生物降解的碳水化合物包括多唾液酸、硫酸乙酰肝素前体、透明质酸和软骨素，它们都已被评估为PEG的替代品，不再逐一细表。高糖基化天然糖蛋白上的碳水化合物部分不仅会影响溶解度和稳定性等生物物理特性，还会通过调节受体亲和力和外周清除率对生物活性产生显著影响。以人促红细胞生成素（EPO）为例，天然EPO含有3个N-连接和1个O-连接糖基化位点，由不同糖型的异质混合物组成，糖链末端的唾液酸残基数存在差异。通过在30位和88位引入两个额外的含唾液酸碳水化合物的N-连接糖基化位点，研发出了高糖基化EPO类似物——darbepoetinalfa（阿法达贝泊汀，Aranesp®）。在透析患者中静脉注射后，这种修饰后的人EPO终末半衰期延长了3倍（26.3小时vs 8.5小时）。半衰期延长很可能是由于分子大小增加以及额外唾液酸残基带来的负电荷升高，导致其与带负电荷的肾小球基底膜相互排斥，从而延缓肾脏过滤。人绒毛膜促性腺激素（CG）是另一种带强负电荷的天然糖蛋白，在人体中的血浆半衰期异常长，为32-33小时。其循环时间延长是由β亚基富含脯氨酸/丝氨酸的羧基末端肽（CTP）介导的，该肽包含28个残基，带有4个O-糖基化位点，且均带有末端唾液酸基团。通过将促卵泡生成素（FSH）的β链与1个CTP肽融合，得到了长效FSH类似物corifollitropinalfa（促卵泡素α，Elonva®），于2014年在美国上市。与CTP融合不会干扰FSH与受体的结合，但会使人体内的半衰期延长2-3倍，这对接受体外受精的女性来说是一个优势，无需每天注射7次，单次皮下注射即可满足卵巢刺激需求。最近，长效人生长激素somatrogon-ghla（Ngenla®）已获批作为每周一次的治疗药物，用于患有生长激素缺乏症（GHD）的儿科患者。在该药物中，人生长激素与多个CTP肽融合，N端1个，C端串联重复1个，与常规重组人生长激素相比，在GHD儿童中半衰期延长5-10倍。因此，对于希望适度延长半衰期且高负电荷不构成问题的生物药物，高糖基化似乎颇具前景。特别是CTP融合技术，由于患者耐受性良好，可能具有更广泛的应用。然而，与所有糖蛋白一样，这些融合蛋白需要使用真核表达系统生产，且最终得到的药物制剂具有异质性，附着的碳水化合物数量和组成存在差异，这就需要在纯化和产品分析方面投入更多精力。基于重组氨基酸的生物聚合物作为聚乙二醇的另一类替代物，近年来出现了多种利用基因编码多肽的方法。这类方法均由天然蛋白源L-氨基酸的特定子集组成，旨在设计出与PEG具有或多或少相似生物物理特性的重组生物聚合物。原则上，治疗性蛋白质或多肽与这类结构无序多肽的基因融合，可直接得到具有固定氨基酸序列和长度的均一制剂，无需化学修饰或偶联步骤。这一特性使这些基因编码生物聚合物有别于其它所有天然或（半）合成大分子。PASylation®技术是将药物与由天然小分子氨基酸脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）和/或丝氨酸（Ser）组成的特定重复多肽序列进行基因融合（或化学偶联），该序列在生理缓冲条件下形成无规卷曲，与PEG的生物物理特性高度相似。与PEG一样，这种无结构、生化惰性、强亲水性但不带电荷的生物聚合物能增大蛋白质或多肽的流体动力学体积，从而显著延缓肾脏和眼部清除，并增强体内药物效力。与PEG不同的是，PAS生物聚合物已被证明在动物体内可生物降解且无免疫原性，并且能在微生物表达系统中以每升数克的产量高效生产，形成链长可达1200个残基的单分散多肽——其中PAS（800）的特性与40kDa PEG大致相当。PAS技术应用已经比较广泛。例如，瘦素与600个残基的PAS序列（PAS600）融合后，在小鼠体内的血浆半衰期延长了45倍（从26分钟延长至20小时），这使其穿过血脑屏障后，在下丘脑引起的STAT3磷酸化显著增强且持续时间延长。尽管受体亲和力降低了7倍，但在Lep ob/ob小鼠中，注射4次PAS（600）-瘦素后，体重减少了40%以上，代谢状态也恢复正常，且无任何不良反应；相比之下，在该小鼠疾病模型中，以相同摩尔剂量注射未修饰的重组瘦素，与溶媒组相比几乎无效。除了这些临床前研究外，一种PAS化天冬酰胺酶（JZP-341）已经进入实体瘤1期临床试验。此外，一种PAS化的89Zr标记抗HER2 Fab片段被用于一名转移性乳腺癌患者的正电子发射断层扫描（PET）成像，成功识别出先前未检测到的小原发肿瘤病灶。另一种基于更多种天然氨基酸（P、E、S、T、A、G）的氨基酸聚合物，称为XTEN™，被设计为无二级结构的非重复多肽，带有多个负电荷（由于谷氨酸残基含量高）。Efanesoctocog alfa（ALTUVIIIO®）基于B结构域缺失的单链重组凝血因子VIII（rFVIII），是首个（也是迄今为止唯一一个）XTEN融合蛋白，于2023年获美国FDA批准，用于治疗遗传性A型血友病。最近，XTEN被用于暂时屏蔽抗体片段的结合位点，并构建包含蛋白酶可切割连接子的前药蛋白。通过这种方式，Amunix公司开发了一种新型双特异性T细胞连接器（TCE）融合蛋白，包含两个单链可变片段（scFv），一个靶向CD3，另一个靶向肿瘤相关抗原。在这种方法中，融合蛋白在健康组织和血液中被XTEN部分功能性阻断——同时介导延长循环——但一旦进入肿瘤微环境，通过细胞外基质中局部激活的蛋白酶切割XTEN而被激活。凭借基于这种条件激活生物制剂的免疫肿瘤学研发管线，Amunix公司于2021年被赛诺菲收购。考虑到XTEN序列的高内在负电荷会降低药理活性成分的结合活性，并阻碍组织穿透（由于细胞表面和细胞外基质对阴离子的排斥），研究人员构建了一种相关的无结构但不带电荷的多肽，称为PsTag。为此，排除了谷氨酸（E），并使用重复序列单元，这与XTEN不同，但与PAS化相似。将成纤维细胞生长因子（FGF）21与这种600个残基的PsTag序列融合后，FGF21在小鼠体内的血浆半衰期从0.34小时延长至12.9小时。这种分子的衍生物PsTag-FGF21（V169L）在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）小鼠模型中显示出疗效。PsTag也被用于屏蔽蛋白酶可激活的双特异性T细胞衔接器。遗憾的是，尚未公开PsTag与XTEN的直接对比数据。另一种方法是基于缬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-Xaa-甘氨酸五肽重复序列构建人工弹性蛋白样多肽（ELP），其中Xaa可以是除脯氨酸外的任何氨基酸。ELP的独特之处在于其会发生可逆的温度依赖性相变，这由Xaa位置的残基决定。因此，ELP经过工程设计后在室温下可溶，但在体温下会聚集，形成凝胶状状态。这种相分离特性不仅可用于纯化融合蛋白，还为治疗应用中的短暂储库制剂提供了可能。基于这项技术，PhaseBio制药公司开发了多种长效肽，并进入临床阶段，包括Vasomera™——一种ELP化血管活性肠肽（VIP），以及Glymera™。一种称为EKylation的方法涉及将药理活性蛋白或多肽与由谷氨酸和赖氨酸组成的交替电荷（两性离子）氨基酸序列进行基因融合。最初，β-内酰胺酶及其不稳定突变体TEM-19的C端与10kDa和30kDa EK多肽融合。虽然保留了催化活性，并观察到热耐受性和耐盐性显著增强，但尚未公布此类或其他类似类型融合蛋白的药代动力学参数。Fc融合蛋白首个带有免疫球蛋白（Ig）Fc片段的融合蛋白是由DanielJ.Capon博士于1989年首次提出的，当时是为了设计一种针对HIV感染中病毒包膜蛋白gp120的阻断剂，其中Fc融合的作用包括：1）溶解易聚集的受体胞外区；2）利用Fc部分的同源二聚体特性改善亲和力；3）提高在哺乳动物细胞培养中的产量；4）通过蛋白A亲和层析便于纯化；5）实现更长的半衰期。此后，Fc融合技术成为继PEG化之后，改善药理活性和肽类药代动力学特性的第二大成功策略。Fc融合蛋白的循环延长主要通过内体回收介导，这是一种自然机制，使IgG1、IgG2和IgG4亚类抗体在人类中的血浆半衰期极长，约为21天。与抗体类似，Fc融合蛋白通过胞饮作用被内皮细胞内化，但并非在溶酶体中降解，而是在酸性内体环境（pH≤6.5）中，Fc部分与FcRn结合；随后，融合蛋白被转运回细胞表面，在生理pH（≈7.4）下复合物解离，再次释放到血液中。比如依那西普（Etanercept，Enbrel®），一款肿瘤坏死因子（TNF）-α受体（TNFR2，又称p75）与IgG1 Fc的融合蛋白，于1998年获批用于类风湿性关节炎（RA）治疗。RA患者中其血浆半衰期约为4天（70小时），可每周给药1-2次。但其半衰期（4天）显著短于完整重组IgG1抗体（如同样阻断TNF-α的阿达木单抗，半衰期15-19天），原因可能是FcRn结合位点（靠近抗体铰链区）的构象变化或空间位阻，导致受体亲和力降低，内体回收效率下降。事实上，依那西普与FcRn的亲和力约为阿达木单抗的1/4，且与靶标TNF-α结合后，对FcRn的亲和力会进一步降低。已知抗体Fc区中，在酸性（而非中性）pH下增强FcRn亲和力的突变可改善工程化IgG的药代动力学。比如，人α1-抗胰蛋白酶（AAT）-Fc融合蛋白INBRX-101（SAR447537）通过工程化提高FcRn亲和力，在AAT缺乏症成人中，其末端消除半衰期可达15.7-18.2天，与天然IgG接近。索塔西普（Sotatercept，Winrevair®），一款近期获批用于肺动脉高压（PAH）治疗的药物，是由人激活素受体IIA（ActRIIA）胞外区与IgG1 Fc连接的同源二聚体Fc融合蛋白，在健康人中半衰期约23天，这也得益于Fc工程化改造。此外，还要考虑目的蛋白与Fc之间连接子的重要性，主要影响蛋白活性。以度拉糖肽（Dulaglutide，Trulicity®）为例，DPP-IV保护的GLP-1（7-37）类似物与IgG4 Fc的融合蛋白，获批用于II型糖尿病治疗。当GLP-1衍生物通过天然铰链区与IgG1 Fc融合时，体外活性较游离肽降低95%；而通过优化连接子长度和序列，选择IgG4亚型的Fc，效力提升4倍。其在人体中的血浆半衰期为4.7天，可每周给药一次。还要注意的是，连接子还可能导致Fc融合蛋白对蛋白水解敏感。例如，依那西普对克罗恩病无效，因这类患者体内激活的基质金属蛋白酶上调，会切割铰链区的IgG和Fc融合蛋白。Fc融合蛋白已经有很多技术平台。比如Genexine的hyFc技术平台，通过人IgD的高柔性铰链区将治疗性蛋白与IgG4的Fc连接，避免因空间位阻导致的结合活性损失。又如Hamni的LAPSCOVERY™技术，使用合成PEG连接子共价连接Fc部分与药理活性成分，以防止活性或FcRn结合能力损失，并最小化免疫原性。另外，Fc融合蛋白不只有同源二聚体，Syntonix Pharmaceuticals开发了Fc融合单体技术，很多Fc偶联凝血因子，如依特诺凝血素α（rFIX-Fc，Alprolix®）、依莫凝血素α（rFVIII-Fc，Eloctate®）等均属此类。白蛋白融合蛋白与偶联物人血清白蛋白（HSA）是肝细胞大量合成的66.5kDa蛋白（每日约14g），是血液中最丰富的蛋白，浓度为35-50mg/mL。在血浆中，它不仅作为两性电解质和渗透剂，还充当多种生理相关化合物的载体，如激素（孕酮、睾酮、甲状腺激素等）、胆红素，尤其是多种脂肪酸。HSA在人体具有极长的血浆半衰期（19天），部分原因是其较大的分子量和生理pH下的净负电荷（等电点5.9）减少了肾脏清除；更重要的原因是内体回收机制——HSA与FcRn的结合方式类似免疫球蛋白，但结合界面与Fc部分不同。白蛋白融合蛋白延长半衰期的案例很早就已经出现。1992年发现，CD4胞外区与HSA融合后，在兔子中的消除半衰期延长140倍。但首个重组白蛋白融合蛋白阿必鲁肽（albiglutide，Eperzan®/Tanzeum®）直到20多年后才获批，用于2型糖尿病治疗——它由两个DPP-4抗性GLP-1类似物串联偶联于HSA的C端，将GLP-1拮抗剂的半衰期从几分钟延长至6-8天，实现每周给药。该药物最初被证实安全且能有效控制血糖，甚至降低心血管事件风险，但因竞争不过Fc融合蛋白度拉糖肽和脂肪酸偶联物利拉鲁肽、销售不佳，且叠加FDA对过敏反应和甲状腺C细胞肿瘤风险的警告，于2017年停产。目前唯一上市的白蛋白融合蛋白：albutrepenonacogalfa（Idelvion®）于2016年获FDA批准，用于血友病B治疗。通过白蛋白融合，其半衰期延长至102小时，是传统重组FIX的4.3倍。那么，为什么白蛋白融合蛋白临床转化成功率那么低呢？原因主要包括：1）生产难度大：HSA结构复杂（含17个二硫键和1个暴露的游离半胱氨酸），需毕赤酵母等真核表达系统实现正确折叠；若融合的活性蛋白本身也有复杂的二硫键结构，情况会更糟；2）种属差异影响临床前评价：小鼠FcRn不结合人HSA，而内源性小鼠白蛋白在pH6时与人FcRn的亲和力约强5倍。因此，即使表达人FcRn的转基因小鼠，也因小鼠白蛋白的竞争而不适合作为人HSA融合蛋白的临床前模型。需构建同时表达人FcRn和白蛋白的转基因小鼠，以开展药代动力学研究；3）内源性HSA的竞争：融合蛋白对FcRn的结合仅受轻微影响，但内源性HSA浓度（至少高三个数量级）远高于治疗性融合蛋白，因体内受体数量有限，未结合的白蛋白最终在溶酶体降解，可能阻碍融合蛋白的内体回收。例如，G-CSF-HSA融合蛋白balugrastim在III期临床试验中的终末半衰期仅35.5小时，甚至短于PEG化G-CSF（45.3小时）。改善白蛋白融合蛋白半衰期的策略之一是工程化HSA变体提高FcRn亲和力。例如，三重突变（E505Q/T527M/K573P）使HSA与多种蛋白（如broculizumab、GST、rFVII）的融合蛋白在pH5.5时对人FcRn的亲和力提高168-353倍。其中，rFVII融合蛋白在转基因小鼠中的半衰期是普通白蛋白融合蛋白的3.6倍。策略之二是与白蛋白的非共价结合。部分生物药与白蛋白共价融合后会出现活性损失，例如FIX、IFNα2b和GLP-1，原因主要是白蛋白的体积较大导致空间位阻，或干扰蛋白折叠。为解决这一问题，研究人员开发了非共价结合白蛋白的策略，而非共价连接，具体包括两种方式：1）通过化学连接脂质烃链，利用白蛋白的天然脂肪酸结合位点；2）与具有白蛋白结合活性的小蛋白结构域进行基因融合。先看下脂质化（Lipidation）方式。脂质化即通过化学酰化将脂肪酸连接至肽或蛋白药物，使其与白蛋白短暂结合，从而延长血浆半衰期。目前已有多种脂质化疗法获批，主要包括胰岛素衍生物、GLP-1类似物、hGH等。比如，每日给药一次的脂质化GLP-1类似物利拉鲁肽（liraglutide，Victoza®），其N端可被DPP-4切割，但与白蛋白形成复合物后，空间位阻部分保护其免受DPP-4降解，从而延长生物活性。此外，长链酰化肽可在皮下注射部位自发寡聚化，延缓吸收。每周给药一次的GLP-1类似物司美格鲁肽（semaglutide，Ozempic®）通过两点优化实现长效：用2-氨基异丁酸（Aib）替代Ala-8以避免DPP-4切割；连接比利拉鲁肽更长的C18脂肪酸（利拉鲁肽为C16），增强与HSA的复合物形成。但其开发需平衡脂肪酸和连接子的组合，以最大化白蛋白结合能力同时保留对GLP-1受体（GLP-1R）的亲和力，过程颇具挑战。再看下与白蛋白结合域（ABD）的基因融合。除脂质化外，另一种非共价结合HSA的策略是将药理活性成分与具有白蛋白结合活性的小蛋白结构域进行基因融合。链球菌蛋白G的ABD最初作为细菌表面蛋白被发现，可通过结合血浆蛋白为病原体提供“伪装”。ABD首次被用于延长血浆半衰期的研究，是与可溶性补体受体1型、抗Her2 Fab片段及单链双抗体融合，在动物模型中验证了效果。如靶向PCSK9的Anticalin®蛋白与ABD融合后，在大鼠中的血浆半衰期延长24倍，并进入I期临床试验。当然，还有一些其他非共价结合策略，比如抗HSA纳米抗体技术、蛋白支架等，篇幅所限，不再一一赘述。药理毒理开发1-6群已满，7群还有名额，进群的加微信，备注姓名+企业名称+专长领域。比如王**+A企业+注册或毒理。名额有限，已经在1-6群的朋友就不要跨群了。

摘要：我们从工业角度讨论了抗体-药物偶联物（ADCs）的化学偶联策略，并比较了三种有前景的化学偶联技术，以生产位点特异性ADCs。涵盖领域：目前，有九种ADCs获得商业批准，全部是通过化学偶联技术生产的。然而，其中七种ADCs含有相对广泛的药物分布，可能限制了它们的治疗指数。2019年，第一只位点特异性ADC由Daiichi-Sankyo推向市场。这一成就以及过去十年的临床试验分析表明，ADC领域的当前工业兴趣正在转向位点特异性偶联技术。从工业角度出发，我们旨在提供已经应用于扩大阶段的既定偶联方法的指导。本文讨论了ADC生产的偶联方法，强调了高产、可扩展性和合成过程的鲁棒性。专家意见：本文综述中描述的三种化学偶联技术各有优缺点，因此药物开发者可以根据其生物学和/或蛋白质靶标利用这些技术。ADC领域的未来前景也进行了讨论。 1.抗体-药物偶联物概述 在过去的十年中，抗体-药物偶联物（ADCs）已成为癌症治疗的有前途的方法。目前，有九种ADCs可供商业使用（表1）：Mylotarg（gemtuzumab ozogamicin）、Adcetris（brentuximab vedotin）、Kadcyla（trastuzumab emtansine）、Besponsa（inotuzumab ozogamicin）、Polivy（polatuzumab vedotin）、Padcev（enfortumab vedotin）、Enhertu（trastuzumab deruxtecan）、Trodelvy（sacituzumab govitecan-hziy）和Blenrep（belantamab mafodotin-blmf）已获批准；两种ADCs（Trodelvy和Blenrep）于2020年获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，目前有超过85种ADCs正在进行临床试验。ADC的结构可以分为四个部分（单克隆抗体、细胞毒性有效载荷、连接子和偶联位点，图1）。单克隆抗体具有对肿瘤相关抗原的特异性亲和力，因此ADCs可以被认为是最有前途的药物递送系统之一。许多商业上可用的治疗性抗体，包括用于ADCs的抗体，都来源于中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的发酵。使用CHO细胞的抗体生产平均成本为每克59美元，采用微生物生产平台等方法试图降低这一成本。ADC有效载荷通常基于有机合成化学家熟悉的化合物。几个世纪以来，大量具有作为有效载荷潜力的天然产物已经通过新颖的化学反应和优雅的合成策略（如发散合成、原子经济策略、氧化还原经济策略或无保护剂合成）生产出来。到目前为止，只有少数天然产物类似物已成功用于ADCs。然而，许多有吸引力的合成有机化合物的全合成，如肽衍生物、萜类化合物、蒽环类化合物和auristatins，定期有报道，预计这些可能在不久的将来作为成功的ADC有效载荷使用。 除了抗体和有效载荷外，连接子和偶联化学也是生产稳定和有效ADCs的关键。抗体和有效载荷之间的共价键需要足够的稳定性以形成稳定的ADC并在治疗给药后具有体内药代动力学。连接子还需要在被目标细胞内化后释放其有毒有效载荷。 偶联方法的发展是肿瘤学领域的热门话题。已经发表了一些关于这一不断发展技术的综述手稿。迄今为止，所有FDA批准的ADCs都是通过偶联到溶剂暴露的赖氨酸的氨基或通过二硫键还原的链间二硫键的半胱氨酸的硫醇基团生产的。产生的ADC的药物-抗体比率（DAR）已知对其药物疗效和安全性概况有显著影响。通常，高DAR物种不仅可能导致ADC聚集，而且还可能在体内快速清除，可能导致安全性降低和药物疗效降低。低DAR物种可能出现与药物疗效相关的问题，因为裸抗体（或轻载物种）可能与有限的目标抗原竞争；根据有效载荷本身的药物疗效，ADC的最佳DAR将有所不同，需要控制最佳DAR以制造ADC。已知连接子的稳定性取决于抗体上偶联位点的位置，这表明偶联位置可以影响ADC的稳定性和药代动力学。为了生产具有增强临床相关TI的最佳ADC格式，生物偶联行业正在进行广泛的研究，探索受控的偶联方法。 有前景的偶联方法对于生成临床有效和安全的抗体-药物偶联物（ADCs）以及建立简化的ADC生产和制造过程都是有益的。迄今为止，对于药物开发者和合同开发与制造组织（CDMOs）来说，开发可扩展和鲁棒的ADC流程仍然是一个极具挑战性的任务。然而，目前有限的综述文章从直接的CMC（化学、制造和控制）角度进行报道。因此，我们旨在提供对已经应用于放大阶段的既定偶联方法的指导性展望，强调高效、可扩展和鲁棒的合成过程。 图1. (a) ADCs的每个部分的要求 (b) 偶联过程的要求 2.化学偶联的优势  通常，ADC生产的偶联方法可以分为三个主要类别。其中一种主要方法涉及通过安装半胱氨酸残基或纳入非天然氨基酸残基作为有效载荷偶联的反应标签，进行抗体工程和修饰。2008年，Junutula、Mallet及其同事首次在化学文献中报道了通过半胱氨酸工程生产位点特异性ADCs的例子。一些通过这种偶联方法生产的位点特异性ADCs目前正在进行人体临床试验，但其他一些则遇到了困难。尽管抗体工程方法在技术上具有吸引力，但确定适当的插入位点的详细优化不仅使最初的ADC考虑变得复杂，而且对于与裸抗体细胞培养条件优化相关的ADC制造过程的放大和可重复性也提出了一些挑战。尽管与生产和表达有关一些问题，但结合抗体工程和化学偶联技术的合成琥珀密码子技术已经开发出来，并似乎已准备好进行大规模ADC生产。 另一种生产ADCs的主要方法涉及使用酶触发偶联。已有几种酶被用来将天然或基因工程抗体与各种有效载荷偶联，或向抗体引入合适的生物正交功能团。这些酶以位点特异性的方式修饰抗体，通常允许生产具有良好控制的DAR的单占据ADC。糖基重塑是一种有前景的酶促ADC偶联生产方法。在抗体的Fc部分的Asn297处酶促修饰天然糖基，引入生物正交的叠氮功能团，可以生成DAR=2的位点特异性ADC。目前，使用这种技术生产的ADC正在进行几项临床前研究。然而，酶促方法在生物制药制造中使用酶有两个潜在问题。首先是过程开发，包括酶的生产和纯化。由于酶本身是一种蛋白质，其分子大小和物理性质与抗体衍生化合物相似。因此，简单切向流过滤（TFF）纯化，一种用于清除化学化合物的成熟方法，可能不足以完全去除残留的酶，可能需要制备性柱色谱。为解决这一问题，已有几种纯化策略，包括使用固定化蛋白A。此外，为了将酶作为药物原料使用，还需要CMC策略。最近，辉瑞的一个团队报告了一种从大肠杆菌生产转谷氨酰胺酶的方法，展示了酶平台技术在GMP生产中的实用性。转谷氨酰胺酶正在被深入研究用于许多除偶联外的应用，预计GMP制造将在未来不久成为可能。在追求用于ADC制造的酶促偶联方面，预计将有更多的报告。 化学偶联策略对肿瘤治疗社区非常感兴趣，因为这些方法受益于相对直接的ADC CMC。事实上，目前市场上所有的ADC都是通过化学偶联方法生产的。2000年，首个名为Mylotarg的ADC获得了FDA的批准。自这一显著成就以来，已有六种ADC（Adcetris、Kadcyla、Besponsa、Polivy、Padcev和Blenrep）通过随机化学偶联方法生产。2019年，首个位点特异性ADC（Enhertu）出现在市场。Enhertu和随后获得批准的Trodelvy是通过位点特异性化学偶联生产的，这表明市场对控制偶联技术的接受，并预示着向位点特异性ADC的转变趋势。 3.通过化学偶联生产随机ADC  传统的随机化学偶联方法基于非选择性修饰，使用天然存在的氨基酸残基，如天然赖氨酸和还原的链间天然半胱氨酸（图2）。 3.1.原生赖氨酸偶联 天然赖氨酸偶联是将药物-连接子与抗体连接的传统方法。活化酯基团（如NHS）可以与赖氨酸残基侧链上存在的溶剂可及氨基反应，形成新的稳定酰胺键。这项技术为三种FDA批准的ADC（Mylotarg、Kadcyla和Besponsa）奠定了基础。T-DM1（曲妥珠单抗emtansine；Kadcyla）是一种2013年批准用于乳腺癌的ADC，是通过天然赖氨酸偶联生产的，合成过程分为两个步骤：使用称为SMCC的NHS连接子的活化步骤，然后是硫醇-马来酰亚胺偶联（图2a）。 图2. a) T-DM1的合成过程，b) 曲妥珠单抗-MMAE的合成过程。 乍一看，赖氨酸型偶联似乎是一种高效的ADC生产方法，因为它具有良好的转化效率，副产品只是可以通过TFF纯化的低分子量化合物。然而，天然的IgG1抗体大约有80个赖氨酸残基，因此相应的合成ADC可能是许多不同但相关物种的混合物。事实上，Chari及其同事已经鉴定了大约10个可访问的赖氨酸残基，这些残基可以不同程度的标记和组合。Lazar及其同事也提到了T-DM1的广泛药物分布。这些DAR分布可能对治疗性ADC的药物疗效、安全性概况和稳定性产生影响。此外，观察到的异质性使得ADC的分析非常困难：T-DM1的DAR分析是通过UV-bis和TOFMS进行的，而通过HPLC分析几乎没有意义。尽管存在这种分析挑战，但三种基于赖氨酸的ADC已经克服了由于药物异质性导致的技术和监管困难，并且已经商业化，但这种基于赖氨酸的偶联需要相当大的努力来建立一个稳健的ADC生产过程，具有可重复的有效载荷分布和DAR。 3.2.原生半胱氨酸偶联 原生半胱氨酸偶联是利用还原的链间半胱氨酸生产“半随机”ADC的主要方法。这种基于半胱氨酸的偶联方法已经产生了四种商业上可用的ADC（Adcetris、Polivy、Padcev和Blenrep）。这种合成过程也分为两个步骤：通常使用三（2-羧乙基）膦（TCEP）的活化（还原）步骤，然后是硫醇-马来酰亚胺偶联（图2b）。 从CMC的角度来看，基于半胱氨酸的偶联优于基于赖氨酸的，因为它产生了具有相对控制的DAR和减少异质性的ADC混合物。这种偶联方法目前是ADC合成的首选选项，并且用于许多正在进行临床试验的ADC。如上所述，已经建立了制备半胱氨酸型ADC的通用程序，但进一步的改进和改进是可能的。TCEP还原通常在37摄氏度下进行，这种未优化的程序有时会产生混浊的反应溶液，暗示存在蛋白质聚集体。已有几项实验设计（DOE）研究报告了克服这种聚集问题的方法。通常，由于抗体的反应性取决于它们的等电点（PI），因此很难建立一个黄金标准平台程序，因为它们需要在个案基础上进行研究和优化。 从分析或监管的角度来看，由于较低的异质性，基于半胱氨酸的ADC可能比基于赖氨酸的ADC更受青睐。它们的简化组成允许分析化学家使用高效液相色谱（HPLC）技术，这些技术通常用于定量分析。基于半胱氨酸的ADC的HIC-HPLC显示了它们的DAR分布，RP-HPLC也可以提供DAR结果和位置异构体的存在。最近，已经报道了几组通过半胱氨酸型偶联生产的单批ADC的分析比较，但观察到分析方法之间的DAR值略有不同。正如DAR值的差异所示，基于半胱氨酸的ADC在获得准确的DAR值方面存在困难。 4.通过化学偶联生产位点特异性ADC  近年来，许多研究人员承担了开发生物相容方法以生产位点特异性ADC的挑战，目标是提高临床相关治疗指数的希望。然而，只有少数这些技术从研究阶段过渡到工艺开发和放大阶段。 4.1.高DAR负载的ADC 高DAR负载的ADC通常与DAR=2和DAR=4的ADC相比显示出不太理想的特性，因为它们的药代动力学特性和体内的系统暴露。然而，在2014年，Lyon及其同事报告说，通过含有PEG的亲水性连接子掩盖有效载荷的疏水性，可以改善负责体内早期清除的有效载荷的疏水性。众所周知，可以使用基于多聚乙二醇的聚合物合成含有大量有效载荷的ADC。这种聚合物载体方法被Mersana称为Fleximer，基于该技术的ADC现在正在进行人体临床试验。Amunix的研究人员开发的XTEN平台是另一种延长高负载ADC半衰期的方法。XTEN是一种由丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸组成的肽连接子。尽管这些基于聚合物的方法很有用，但使用这些方法生产相应的ADC时，抗体偶联位点仍然不受控制。因此，为了生产位点特异性偶联物，需要额外的技术，如抗体工程。最近，位点特异性偶联的高DAR ADC开始在ADC领域流行；2019年，首个获得FDA批准的位点特异性ADC，称为trastuzumab-deruxtecan，出现了。第一三共集团展示了他们原创的药物-连接子组合，作为克服传统DAR=8 ADC常面临的疏水性问题的优雅解决方案。他们解决方案的背后理念模仿了基于天然半胱氨酸的ADC，这两种类型的ADC都是通过还原链间二硫键生产的。然而，随机ADC含有使质量控制、可重复性和分析更加困难的位置异构体，而像trastuzumab-deruxtecan这样的DAR=8 ADC由于大多数半胱氨酸基团被偶联到有效载荷上，含有最少的位置异构体。第一三共的有效载荷来源于喜树碱类似物exatecan，并通过四肽连接子（甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸）与抗体共价连接。这种四肽连接子在血液循环中相当稳定，并在ADC定位到目标肿瘤组织后被溶酶体酶有效切割。也许令人惊讶的是，这种药物-连接子组合可以增强高DAR ADC的总稳定性，从而保持与裸抗体相比的清除率。基于deruxtecan连接子-有效载荷的PEG单元被认为可以减少高DAR ADC的聚集；直接将药物与抗体连接而不引入亲水性间隔物会导致不可接受的聚集水平。总之，引入短长度PEG单元巧妙地抑制了ADC生产中聚集的发生。 继这一商业成功之后，sacituzumab govitecan-hziy于2020年获得FDA批准（图3）。这种ADC也属于高DAR类型，每个针对Trop-2的抗体平均含有八个SN38有效载荷。Trop-2是一种在多种实体瘤中高度表达的蛋白质，包括大多数非小细胞肺癌，因此被认为是癌症进展和降低存活率的重要因素。sacituzumab govitecan-hziy的连接子部分由七个亲水性PEG单元组成，从而改善了ADC的物理性质。在细胞内化后，碳酸盐基团在适当的酸性条件下被切割，以释放SN-38有效载荷。 图3. sacituzumab govitecan-hziy的合成过程。 4.2.原生半胱氨酸重新桥接 半胱氨酸重新桥接是一个两步过程，利用一系列迈克尔/逆迈克尔反应（图4）将天然抗体转化为位点特异性ADC。2014年，PolyTherics（现为Abzena）的一个团队报告了这种称为“ThioBridge®”的优雅方法。这种独特的方法提供了低异质性DAR=4的ADC，拥有适合的亲水间隔物以改善物理和生物性质。使用这种方法，从完整抗体到ADC的转化已知可以以70-95%的高产量进行，包括纯化在内的总工艺产量超过70%。此外，所需的试剂是相对分子质量较小的还原剂和含有亲水间隔物的药物-连接子，这些可以通过TFF纯化轻松去除。偶联和纯化过程的这种简单性是半胱氨酸重新桥接方法的一个显著优势。此外，PolyTherics团队还在AKTA Pure系统上建立了适当的分离策略，通过制备性HIC HPLC获得几种DAR种类的半胱氨酸重新桥接ADC，通过色谱法额外控制DAR值。 图4. 基于半胱氨酸重新桥接的曲妥珠单抗-MMAE合成过程。 关于重新桥接位点特异性方法的额外报告已经在化学文献中发表，因为其相对简单和高效的偶联过程。特别是，双烷基化试剂，如溴甲基吡咯酮、二硫马来酰亚胺、二溴吡嗪二酮或芳基二丙烯腈，对许多有机合成化学家来说都很熟悉，并且在与抗体的位点特异性偶联反应中非常有效。此外，双(乙烯基磺酰)哌嗪实现了均匀的DAR=2 ADC合成。这些结果表明，ADC的DAR可以根据烷基化试剂进行控制。 4.3.Fc亲和肽偶联 具有高抗体亲和力的化合物已经被研究了相当长的时间；来自细菌的相对较小的蛋白质，如蛋白A、蛋白G和蛋白L，由于它们对抗体的特异性而得到了特别好的研究。这些化合物通常用作独立固定相亲和柱，用于抗体纯化。许多研究也已经进行，以用更短的肽替换这些抗体亲和蛋白；在1996年，Wells及其同事发现了一个33个残基的肽Z33，它是由蛋白A修饰而来的，并显示出潜力替代固定化的蛋白A柱。Z33肽被转化为环肽Z34C，以增加抗体亲和力。同样，Wells及其同事还报告了一个17个残基的肽Fc III，它特别附着在人IgG1的Fc位点上。此外，Z33、Z34C和Fc III已经与人类IgG1抗体的Fc部分共晶，揭示了结合位点。这种共晶结构激发并启发了化学家开发来自这些Fc亲和肽的新型标记试剂。 利用这些亲和化合物进行的化学偶联，称为亲和标记，是蛋白质位点特异性修饰的有前途方法之一。光亲和标记是该领域最常用的技术。几个小组报告了他们使用各种亲和化合物的独特方法，如蛋白A的Z结构域、模拟蛋白G的肽或Fc III衍生肽，但紫外线照射对蛋白质结构构成潜在风险。为了避免这种情况，已经报道了使用活性基团，如活化酯（例如4-氟苯基氨基甲酸赖氨酸（FPheK）或NHS酯）。在过去的十年中，这种偶联策略已经被几个实验室用于位点特异性ADC合成。然而，直到2019年，尽管这种相对简单的偶联程序具有潜在优势，但在同行评审的文献中还没有报道过使用亲和标记方法进行ADC生产的工业研发活动。2019年，味之素集团应用了一种源自Fc III的肽试剂，该试剂具有可切割的连接子，用于无痕标记技术，称为AJICAP®，并证明了所得到的位点特异性ADC的充分体内效力。然后，这一过程迅速应用于放大，建立了使用AJICAP技术生产GLP材料的GMP策略（图5）。 图5. 基于AJICAP®第一代的曲妥珠单抗-MMAE合成过程。 结合一个活化酯的亲和肽试剂以位点特异性的方式结合到曲妥珠单抗Fc区域的Lys 248，提供曲妥珠单抗-肽偶联物。抗体和肽部分之间的二硫键被切割，然后重新氧化以提供含硫醇的抗体。新安装的硫醇基团与市售的MC-VC-MMAE反应，得到AJICAP®-ADC。这个位点占据是通过亲和肽控制的，并由肽图谱分析确定。四个步骤的总产品产量为90%，获得了1.72克位点特异性ADC。这种ADC生产过程包括一个简单的程序，其中包含一个TFF（切向流过滤）纯化步骤，从而省去了制备色谱纯化的需求。5.专家意见5.1.三种化学偶联过程的比较 本文综述中描述的三种化学位点特异性偶联方法已经非常成熟，并且在相应的ADC生产和制造中似乎很难找到明显的缺陷。因此，在本节中，我们比较了三种化学偶联方法，重点关注所得ADC的不同特性（表2）。 表2. 三种化学位点特异性偶联方法的比较 高DAR饱和方法在工艺稳健性和使用记录方面具有显著优势，因为它被用于商业上可用的ADC中。因此，通过微调CMC和制造条件，它可以适用于其他ADC生产方法。然而，目标DAR和/或药物-连接子的兼容性似乎有限。例如，传统的药物-连接子MC-VC-MMAE不能在不重新设计药物-连接子的情况下轻易应用于高DAR方法。有报告称，由于其高度疏水性，它会引发相当数量的聚集。在其他含有DM1和MMAF的常见药物-连接子的情况下也观察到了这个问题（内部数据）。此外，高DAR ADC的重链和轻链仅由较弱的（非共价）键组成，这可能是一个缺点。铰链区缺乏二硫键可能会影响所得ADC的物理性质。实际上，已知sacituzumab govitecan-hziy的ADCC活性显著降低；随着市场上有两种ADC，我们可以预期这不是一个固有问题，但它可能限制了可以应用于高DAR ADC的抗体和药物-连接子的组合。 半胱氨酸重新桥接在偶联反应条件方面具有很高的灵活性，因为可以通过简单地改变双烷基化试剂来调整目标DAR。不应忽视的是，半胱氨酸重新桥接不需要硫醇-马来酰亚胺化学，这带有Retro-Michael反应的风险。Retro-Michael反应可能会在血液循环中脱落连接子-有效载荷，导致不希望的效果。虽然可以使用琥珀酰亚胺环开口来避免Retro-Michael反应，但这种处理需要碱性条件，可能会导致抗体脱酰胺。半胱氨酸重新桥接是形成稳定连接的快速有效方式，但可能的缺点是存在产生一些不希望的“错误桥接”ADC的风险。然而，这可能通过使用新型双烷基化试剂和偶联过程开发来解决。 Fc亲和肽偶联在应用于各种抗体和药物-连接子方面具有显著潜力。这种偶联方法可以在不需要亲水连接子或双烷基化试剂的情况下提供位点特异性DAR=2的ADC。Seattle Genetics小组报告了从通过色谱纯化准备的随机ADC混合物中分离出的纯化DAR=2、DAR=4和DAR=8 ADC的体内效力和药代动力学，说明降低每个抗体的药物负荷可以提高治疗指数。这一发表的结果暗示DAR=2的ADC可能是某些肿瘤学设置中理想的ADC格式。Fc亲和肽方法的一个缺点是相对长的合成序列的要求。然而，味之素的研究人员已经指出，最近进行了简化序列的优化，这个问题可能会得到解决。 总之，我们建议在追求生物药物计划中的抗体偶联方法时，将这三种偶联方法都视为潜在工具，具体取决于特定的目标，如目标DAR或偶联格式和生物学要求。 5.2.未来展望 最后，预测了ADC领域的未来方向。由于CMC优势和由此带来的扩大的治疗指数，对位点特异性ADC的需求将变得更大。显然，与高异质性ADC相比，位点特异性ADC能够简化ADC分析，因为它们的组成更简单，并且在监管方面是可取的。此外，可以预期，位点特异性和均匀DAR的ADC将有增加的需求，并且可能需要通过色谱纯化分离DAR种类。可扩展的HIC HPLC纯化方法的开发正在稳步进展，已经提出了适合药物-连接子疏水性的适当树脂。此外，HPLC纯化的关注点之一——回收率正在逐渐提高。 未来的偶联物将利用双特异性抗体和Fc融合蛋白等各种其他分子格式。由于结构复杂，一些由此产生的结构可能在生产条件下不稳定，制造这些可能需要开发专门的偶联条件。本文综述中报告的大多数偶联方法涉及通过TCEP进行二硫键切割过程，对于某些高度工程化的下一代抗体（如可能对氧化还原敏感的双特异性抗体）是否适合这种切割反应存在不确定性。将来，可能需要开发省略二硫键还原需求的位点特异性偶联方法。例如，学术界有许多引人入胜的报告，涉及开发非共价ADC、色氨酸选择性或酪氨酸选择性偶联方法，以及金属催化的抗体标记反应。我们强烈希望这些技术能够从研究阶段进入开发和放大阶段，成为工业相关的技术。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。