The Institute of Genetics & Developmental Biology

引言 神经系统可以感知环境刺激和内部应激，协调组织间一系列的生理过程，譬如衰老和代谢。当神经元识别到细胞内部的线粒体损伤时，会释放“mitokine”信号，激活外周组织的线粒体未折叠蛋白反应(Mitochondrial Unfolded Protein Response, UPRmt)，系统性的协调蛋白质稳态和机体健康。 田烨课题组以秀丽隐杆线虫(C. elegans)为模式动物，在神经-肠道跨组织线粒体应激反应模型中，先后鉴定到了形态发生素Wnt/EGL-20参与调控神经-肠道的线粒体应激反应【1】(Cell，2018)以及神经-生殖腺的线粒体应激信号的跨代传递【2】（NCB, 2021）。形态发生素是一类分泌型信号因子，会在细胞间形成浓度梯度，进而调控胚胎发育过程中的细胞分化、组织形成和器官建成。那么除了Wnt信号之外，是否还会有其他的形态发生素也参与线粒体应激信号的跨组织传递？转化生长因子β (Transforming Growth Factor-β, TGF-β)作为一种形态发生素，调控生长发育的功能已广为人知。然而，TGF-β信号能否作为mitokine介导细胞非自主性UPRmt激活，并参与相关生理功能的调控仍有待进一步研究。 2024年10月19日，中国科学院遗传与发育生物学研究所田烨课题组在Nature Communications杂志在线发表题为ASI-RIM neuronal axis regulates systemic mitochondrial stress response via TGF-β signaling cascade的研究论文。该研究发现TGF-β信号通路通过ASI-RIM神经元轴调控神经-肠道的跨组织UPRmt的激活，此过程依赖于神经递质多巴胺，并受到GABA的负调控，文章还揭示了TGF-β信号通路对于线虫寿命、免疫和脂质代谢的调控作用。    该课题组首先鉴定到了形态发生素TGF-β配体daf-7 (在哺乳动物中的同源基因为GDF11)基因失活显著抑制神经组织线粒体损伤诱导的细胞非自主性UPRmt。同时，daf-7所在的TGF-β Dauer信号通路的各个组分对于系统性UPRmt的激活都是必须的。进一步研究证明，仅在一对ASI神经元抑制daf-7的功能，就可以抑制神经-肠道线粒体应激信号的传递，并且，从ASI神经元中释放的配体DAF-7，通过RIM神经元上的受体DAF-1，激活下游的TGF-β Dauer信号通路，进而诱导肠道细胞的UPRmt。    图一，TGF-β配体DAF-7介导细胞非自主性UPRmt（Credit: Nature Communications） 研究人员发现，仅在ASI神经元中造成线粒体损伤，就足以激活肠道中的UPRmt。在此模型中，UPRmt的激活不仅依赖于ASI-RIM神经元轴和TGF-β Dauer信号通路，还依赖于神经递质多巴胺并受到GABA的负调控。此外，此前已被鉴定到的参与整个神经组织线粒体损伤激活肠道UPRmt的mitokine：Wnt配体EGL-20、二硫键异构酶PDI-6以及GPCR组分SRZ-75，并不参与此模型中UPRmt的激活【1,3，4】。说明当神经组织的线粒体受损时，多种mitokine信号可能会通过不同方式，将不同神经元的应激信号传递至外周组织。 随后，作者对神经组织线粒体损伤模型线虫的生理表型进行了检测，发现其具有更长的寿命、更强的致病菌抗性和更少的脂质累积，这些生理表型的改变也同样依赖于ASI神经元分泌的DAF-7和RIM神经元中的受体DAF-1。 综上所述，这项研究揭示了一对ASI神经元中的线粒体损伤跨组织激活UPRmt的分子机制——TGF-β Dauer信号通路通过ASI-RIM神经元轴，系统性调节蛋白稳态，并强调了TGF-β在调节机体的适应性变化、代谢改变和衰老进程等方面的关键作用。由于TGF-β信号的具有很高的保守性，因此，在哺乳动物中通过操纵TGF-β信号协调线粒体应激信号，以调控机体的健康衰老将成为可能。同时，靶向特定神经元中的感觉输入或相应受体，也可作为维持线粒体稳态和平衡脂质累积水平的一种有前景的途径。    图二，ASI-RIM神经元轴通过TGF-β信号通路协调系统性线粒体应激反应（Credit: Nature Communications） 参考文献 1 Zhang, Q. et al. The mitochondrial unfolded protein response is mediated cell-non-autonomously by retromer-dependent Wnt signaling. Cell 174, 870-883 (2018). https://doi.org:10.1016/j.cell.2018.06.029 2 Zhang, Q. et al. The memory of neuronal mitochondrial stress is inherited transgenerationally via elevated mitochondrial DNA levels. Nat. Cell Biol. 23, 870-880 (2021). https://doi.org:10.1038/s41556-021-00724-8 3 Liu, Y. et al. Two sensory neurons coordinate the systemic mitochondrial stress response via GPCR signaling in C. elegans. Dev. Cell 57, 2469-2482 (2022). https://doi.org:10.1016/j.devcel.2022.10.001 4 Li, X. et al. Protein disulfide isomerase PDI-6 regulates Wnt secretion to coordinate inter-tissue UPR(mt) activation and lifespan extension in C. elegans. Cell Rep. 39, 110931 (2022). https://doi.org:10.1016/j.celrep.2022.110931 https://doi.org/10.1038/s41467-024-53093-9 责编|探索君 排版|探索君 来源|BioArt End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

在二十世纪九十年代，3D打印横空出世，不仅缩短了加工工序，降低了小批量和个性化生产的成本。数十年后，一位美国学者改造了惠普打印机，并以活细胞为墨水，首次实现了3D生物打印。在2009年，市面上出现了首台商业化3D生物打印机，开启了3D生物打印从实验室走进市场的道路。 在此期间，许多3D生物打印企业如雨后春笋般出现，RegenHU也是其中一员。在2019年，RegenHU推出了首台3D生物打印机，能够逼真的打印皮肤，为植皮患者提供帮助。而在近几年，RegenHU正在尝试通过3D生物打印的方式生产药物，为药物开发、生产提供新方案。 凭借2款产品，成为该领域代表性企业 RegenHU的故事要从2007年开始说起，在当时尚未有3D生物打印机上市，生物打印公司才刚刚开始填补医学和研究领域的空白。 这一年，瑞士连续创业者Marc Thurner也将目光锁定在了这个新兴的赛道。在他看来，未来再生医学将是一个充满机会的新方向，未来3D打印技术能够与细胞、生物材料可以相互作用，加工出模拟自然生理功能的组织和器官。 然而，在当时并没有案例能够证明3D打印的细胞和组织是可以存活并使用的。就连被誉为“生物打印之父”的Thomas Boland教授，也仅是将细胞、培养液、血清及其混合物排布成一定的样式并观察到了打印细胞的存活。 就是这么一个看似不切实际的想法，让Marc Thurner召集了一群同样对3D生物打印充满期待的科研人员，成立了RegenHU。 在2年后，他们顺利推出首款产品——含有8个打印头的生物打印机BioFactory。这款设备能够可以同时打印8种不同的细胞和支架材料，非常适合构建复杂的三维结构。这款设备能够精确控制墨水的喷射位置和量，从而有利于生物显微结构的建立，并且能够局部供给生物活性因子及药物，以控制组织的局部生长发育。 2017年，RegenHU又推出了新一代产品3DDiscovery Evolution。和BioFactory不同，3DDiscovery Evolution是一款生物3D打印平台，同时搭载了11种打印技术，能够适应操作者的各种需求。除此之外，还整合了气动挤压、压电喷墨、螺杆挤出、静电纺丝等十余种生物制造技术，大大增加了可以处理的生物材料范围。 截至目前，RegenHU仅推出了这两款硬件产品，但这两款产品在再生医学、药物研发等领域大放异彩。时至今日，RegenHU依然是3D生物打印领域的代表性企业。 打印“人造皮肤”已进入临床试验阶段 RegenHU的创始人Marc Thurner曾认为，3D生物打印的出现，将推动再生医学的发展。在团队研发出BioFactory后，公司便朝着再生医学的方向发展。 在2015年，有科研团队利用BioFactory打印出了一套体外血液到空气组织屏障的三维模型。手工构建相比，通过BioFactory3D打印出的组织细胞，生长给为均匀，并且能够快速成层生长，形成不同细胞层组成的组织结构。这样的三维模型，不仅更贴近真实的人体结构，准确模拟“血氧屏障”反应，同时更加高效、安全、低成本。最后这项研究获得了突破性成果，最终发表于《Nature》杂志上。 除了打印实验组织以外，BioFactory还能生物打印骨传导支架结构。这类产品主要是应用于齿科垂直骨增量领域。垂直骨增量是一种用于重建垂直方向上牙槽骨高度的外科手术技术，对于牙科植入物的成功至关重要。从目前的技术来看当没有足够的牙槽空间时，便无法进行种植牙手术，这对于牙周病、牙槽骨萎缩的患者而言，将极大程度影响生活质量。 而通过BioFactory ，科研人员打印出了磷酸三钙和羟基磷灰石的多孔骨细胞生长支架。这些支架在羊颅骨模型测试中显示出良好的垂直骨生长效果，其新骨生成量比标准材料高出四倍以上，表明了其在骨组织工程中的潜力。该项研究在《Clinical Oral Implants Research》上发表。 此外，还有通过BioFactory打印皮肤，实现皮肤移植术；打印心脏模型，进行药物实验等。目前BioFactory已经实现打印包括皮肤、软骨、骨骼、血管等多种组织器官，可用于多种组织修复和再生应用。 功能更为全面的3DDiscovery Evolution更是如此，其多款打印生产的产品已经与其他企业合作，获批进入市场。 瑞士公司CUTISS曾于RegenHU合作，通过3DDiscovery Evolution打印技术，推出了denovoSkin。这款产品是一种从患者本身健康皮肤获取活检样本，并根据样本生成皮肤移植物。由于是从患者本身提取的样本作为“墨水”，打印出的移植物，因此在移植过程中基本不会产生排异反应，减少瘢痕以及后续修复手术的概率。另外，也能显著减少对健康皮肤采集的需求，降低患者术中不适和术后康复时间，改善生活质量。 类似的合作还有瑞士的CUTISS AG公司。通过3DDiscovery Evolution，团队打印出了能够模拟天然皮肤的真皮-表皮结构的人造皮肤，能够治疗和覆盖大面积的烧伤伤口。在2024年7月，这项产品已经完成Ⅱ期临床实验，为23名患者植入人造皮肤，试验结果良好。 3D打印片剂，提供个性化的给药系统 在近几年，在组织、器官打印之外，RegenHU产品还被应用于药物发现以及片剂打印方面。 药物研发是目前3D生物打印的重要应用场景。例如Novartis公司利用3DDiscovery Evolution生成肌肉组织模型，用于进行药物测试和疾病研究。研究人员能够在体外模拟肌肉功能和病理变化，从而更好地理解肌肉疾病的机制并测试新的治疗方法。 而片剂打印是个全新的方向。目前，RegenHU的3D生物打印技术，已经实现定制具有特定尺寸、形状及药物释放特性的给药系统。同时，这项技术还能快速完成原型制作、定制设计等，已经用于开发个性化的治疗方案，包括高API加载和将多种活性成分整合到一个个性化的固体剂量形式中，可应对复杂药物配方和递送挑战。 此前，葛兰素史克曾与诺丁汉大学合作，通过3D生物打印技术，生成了可用于治疗帕金森病的3D打印罗匹尼罗片，验证了这一路径的可行性。而在操作上，RegenHU的产品在这一领域展现出了独特的技术优势。如3D生物打印机可进行个性化设计，最多可配备5个打印头，并在打印机上安装各种不同的打印技术。通过更改配置以满足项目不断变化的需求。另外，RegenHU的打印机能够实现工艺的稳定再现，高质量实现量产。 除了硬件设备的创新性以外，RegenHU还将AI引入其中。据悉，RegenHU的3D生物打印机均配备了专有的SHAPER软件，专为生物建模打造，从设计、布局到控制打印位置、多材料打印顺序，只需3步即可构建属于用户的三维生物模型。这也加速了片剂打印的效率，并且减少了人工操作过程，降低人工误差。 已有多款国产3D生物打印设备获批 2023年，RegenHU一举拿下了年度iF和Red Dot两项设计大奖，在国际上获得关注。而国产生物3D打印设备近年来也在在技术创新和应用方面取得了显著进展。 如中国科学院遗传与发育生物学研究所的王秀杰团队与英国曼彻斯特大学教授王昌凌团队、清华大学教授刘永进团队合作，创造性地将六轴机器人改造成为生物3D打印机（六轴机器人生物打印机）。这项技术突破了传统生物3D打印的平层局限，为复杂组织器官的体外制造提供了更可行的解决方案。 除了科研端，在产业端国产企业也在大放异彩。目前，能够研发生产3D生物打印设备的企业有杭州捷诺飞生物科技股份有限公司、赛纳数字医疗、仪智科技（上海）有限公司等。  国内部分3D生物打印企业情况 在技术上的创新，也带来了商业化合作的突破。以捷诺飞为例，该企业曾与科研团队捉，成功打印出了较小比例的人类耳朵软骨组织、肝脏单元，细胞存活率高达到90%以上，可存活4个月。此外，还与珀莱雅公司共建了“高通量3D打印亚洲人皮肤模型联合实验中心”，推动3D打印技术在化妆品安全功效评价等方面的应用。另外，在物筛选、生物医学研究等领域，捷诺飞产品也发挥着重要作用。 国产3D生物打印技术不断取得突破性成就，其在医疗领域的应用潜力也不断显现。随着技术的不断进步，未来国产生物3D打印有望在更多临床领域得到应用。 如果您想对接文章中提到的项目，或您的项目想被动脉网报道，或者发布融资新闻，请与我们联系；也可加入动脉网行业社群，结交更多志同道合的好友。 近 期 推 荐 声明：动脉网所刊载内容之知识产权为动脉网及相关权利人专属所有或持有。未经许可，禁止进行转载、摘编、复制及建立镜像等任何使用。 动脉网，未来医疗服务平台

引言 内吞（endocytosis）是将细胞外的营养物质、细胞膜受体、脂类等通过细胞膜运输进入细胞的囊泡运输过程，大部分物质在内吞后会被运送到早期内体（early endosome）进行分选。约70-80%的内吞后的膜蛋白如受体、通道蛋白和转运蛋白等，会通过循环途径（recycling）再次回到细胞膜。内吞和循环对细胞的生存、稳态和环境交流等至关重要，内吞和循环的紊乱与癌症和神经退行性疾病等多种人类疾病密切相关。 哺乳动物细胞可通过不同途径实现受体等的循环，包括广泛研究的“快速”和“慢速”循环途径。“快速”循环途径主要由小GTP酶Rab4或Rab35调控，可将内吞后的货物从早期内吞体直接运输回细胞膜；“慢速”循环途径则主要由Rab11调控，从近核的早期循环体（early recycling compartment, ERC）或循环内体（recycling endosome）回收货物。然而，目前对于上千种不同的膜蛋白如何正确且高效地循环回细胞膜的途径及相关机制仍然知之甚少，是否存在独立于经典的“快速”和“慢速”途径之外的的循环方式仍待探索。 2024年9月19日，中国科学院遗传与发育生物学研究所的何康敏团队在Nature Cell Biology杂志在线发表了题为Clathrin-associated carriers enable recycling through a kiss-and-run mechanism研究论文。该研究报道了一条新的快速囊泡循环途径，并将其命名为CARP（clathrin-associated fast endosomal recycling pathway）。 在先前合作发表于Nature杂志的研究工作中（Nature 2017;552(7685):410-414），基于耦合探测原理（coincidence detection），开发了一系列clathrin包被内吞囊泡特异的磷酸肌醇脂质分子探针。其中PI(4,5)P2特异的耦合探测探针，含有可同时弱结合PI(4,5)P2的脂质结合结构域以及弱结合clathrin的蛋白结构域，该探针可被特异招募至同时存在clathrin和PI(4,5)P2的囊泡结构上。在将该探针表达至基因编辑同时荧光标记clathrin及其衔接蛋白AP2的细胞中，利用三色全内反射荧光显微镜（TIRFM）对细胞膜进行成像时，该团队发现除了clathrin和AP2同时双阳性的内吞囊泡，还存在一类在细胞膜上短暂停留的clathrin阳性而AP2阴性的囊泡，其能够快速招募PI(4,5)P2特异的耦合探测探针。进一步，通过晶格光片显微镜三维成像和掠入射结构光照明显微镜（GI-SIM）的超分辨成像等多种成像方式，证实了clathrin阳性AP2阴性的囊泡是来自于细胞内的囊泡结构，其能够与细胞膜发生短暂（~5-60 s）互作并再次回到细胞内，其独特的动力学与经典的内吞囊泡和循环囊泡均不同，该团队将其命名为CARP囊泡。通过基因编辑和单分子成像等方法，该团队发现细胞内的CARP囊泡高度富含另外一种clathrin的衔接分子AP1，并通过胞吐的标志物和光电联合成像等，证明了clathrin/AP1阳性的CARP囊泡以“kiss-and-run”的方式，与细胞膜发生半融合。 为了解析CARP囊泡的组成、来源、功能和调控机制，该团队利用clathrin特异的PI(4,5)P2耦合探测探针，建立了基于TIRFM的活细胞成像筛选和图像分析体系。通过对文献报道的参与囊泡运输的近两百种蛋白的时空动态进行分析，发现了一系列与CARP囊泡相关的蛋白分子，包括Arf1、Rab1、Rab11、exocyst组分、VAMP2等SNARE蛋白、dynamin等，这些蛋白在CARP囊泡与细胞膜融合前、融合中、剪切后等不同阶段招募。通过进一步的实验，证明了这些不同的蛋白在CARP囊泡的生成、运输或融合等不同阶段起着重要的调控作用。 通过活细胞成像和超分辨成像等方法，该团队进一步发现CARP囊泡生成于早期内体。有趣的是，CARP囊泡的组分与VPS35等经典的retromer组分在早期内体上定位于不同的区域，敲除和敲降retromer、retriever等retrieval复合物的核心组分，并不影响CARP囊泡的生成，提示CARP囊泡以独立于retrieval复合物的方式生成于早期内体。在功能上，通过追踪配体激活的GPCR家族β2-肾上腺素能受体以及RTK家族表皮生长因子的内吞以及随后的循环过程，发现这些受体可在内吞两三分钟后即通过CARP途径回到细胞膜。此外，CARP囊泡也能够介导转铁蛋白受体等受体的持续性循环。 模式图（Credit: Nature Cell Biology） 综上所述，借助于耦合探测脂质探针、基因编辑、多种成像技术和图像定量分析等，何康敏团队发现的CARP循环途径，其生成方式、与细胞膜的融合方式、功能以及关键调控因子等与经典的循环途径有所不同，可能是一种新的循环方式（下图）。该途径的发现，丰富了对于内吞循环的方式和机制的认知，也揭示了clathrin在介导内吞之外也介导循环的新功能。 参考文献 https://www.nature.com/articles/s41556-024-01499-4 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述