Changzhou Ruiming Pharmaceutical Co Ltd.

声明：因水平有限，错误不可避免，或有些信息非最及时，欢迎留言指出。本文仅作医疗健康相关药物介绍，非治疗方案推荐（若涉及）;本文不构成任何投资建议。 2026年3月24日，康诺亚发布公告称，其NewCo模式下的合作伙伴Ouro Medicines与吉利德科学达成并购协议，吉利德将以现金收购Ouro Medicines全部股权。本次交易总金额最高可达21.75亿美元，其中包括16.75亿美元的首付款（可按惯例调整）及最高5亿美元的里程碑付款。这一收购案也成为近期中国生物医药资产通过NewCo模式实现出海的最大规模交易之一。 根据并购协议，作为Ouro Medicines的股东，康诺亚将在交易完成后获得约2.5亿美元的首付款，以及最高约7000万美元的里程碑付款，合计约3.2亿美元。同时，吉利德将承接康诺亚在CM336/OM336产品上的特许销售分层权益。交易完成后，康诺亚不再持有Ouro Medicines的股权。 早在2024年11月，康诺亚便与Ouro Medicines签订了独家许可协议，授权后者在全球范围内（不含中国内地、香港、澳门及台湾地区）开展CM336/OM336的研发、生产、注册及商业化。CM336/OM336是康诺亚自主研发出的一款创新型T细胞衔接器（TCE）双特异性抗体药物，也是Ouro Medicines当时唯一的核心产品。此次并购后，原有授权协议仍继续有效，康诺亚保留协议中约定的相关权益。 公开信息显示，Ouro Medicines由Monograph Capital与葛兰素史克（GSK）共同孵化，并于2025年1月完成1.2亿美元的A轮融资，投资方包括TPG生命科学创新公司、NEA、Norwest Venture Partners以及LongRiver Investments（江远投资）。随着本次并购交易的达成，江远投资在投入后约一年时间内即实现Homerun级别的回报，成为资本方从NewCo模式中获益的典型案例。 此次收购被视为中国生物医药资产通过NewCo模式出海进程中的标志性事件。交易完成后，CM336/OM336作为具备best-in-class潜力的TCE双特异性抗体药物，有望在多种自身免疫疾病治疗领域加速全球开发进程，进一步释放其临床价值。 CM336/OM336是一种重组抗B细胞成熟抗原（BCMA）和CD3人源化双特异性抗体。其作用机制在于特异性结合BCMA阳性靶细胞与CD3阳性T细胞，将T细胞募集至靶细胞周围，激活T细胞并释放细胞因子，从而诱导T细胞介导的细胞杀伤效应，实现对靶细胞的清除。临床研究已证实，该药物可快速降低患者外周血中的B细胞和浆细胞水平，显示出明确的作用机制。 会议主题 | 2026第十一届生物制药稳定性大会 会议时间 | 2026年4月10-11日（周五、周六）会议地点 | 苏州 主办单位 | 药融圈、浙江省药学会制药工程专业委员会、浙江省药学会生物制药专业委员会、浙江省药学会药物分析专业委员会、浙江大学药物代谢和药物分析研究所、浙江省转化医学学会药学分会、《中国现代应用药学》杂志社、杭州舟帆生物科技有限公司、金华弘药生物技术有限公司 商务合作福利、收费标准等详情请咨询： 张女士15005862516(微信同号) 曹女士15520811395(微信同号) 刘女士13541297643(微信同号) 陈女士 15308188251(微信同号) 【产业朋友圈· CXO企业】 健元医药、晶易医药、南京威凯尔、山东艾格林、新济药业、开元医药、耀海生物、传健生物、威凯尔生物、慧泽生物、上海药坦、则正医药、南京康川济、博腾制药、南京泽恒、艾立康药业、中节能万润、博瑞制药、濠麦科技、良福精合、常州瑞明药业、诺思格、福州华为医药、南京哈柏医药、百诚医药、澳斯康生物、捷方凯瑞 【产业朋友圈· 制药装备&仪器耗材&辅料试剂】 信义惠达、微智源、艾捷博雅、梅特勒、镁伽科技、阿默尼科、天台县海蓝过滤材料、上海润捷、广州哈尔技术、品诚医药、友康厚德生物、普渡机械、上海一实贸易、菲立化学、恺来医药、上海简然实验室、上海麦克林、问度色谱、上海东星、深圳优普惠、华谱科仪、北京新艾进生物、安及义、江西三山活性炭、瑞孚迪生物、合创生物、石榴化工、上海弗雷西阀门、梯尔希、默克、微谱集团、苏州胶囊 【产业朋友圈·原料药&中间体企业】 普瑞曼药业、神奇制药、九典制药、拓新药业、祥瑞药业、新天地药业、众延医药 、诺云生物、新疆天达生物、安吉兴能生物、迪哲医药、荣耀生物、丰金生物、成都百事兴科技、天睿生物、尚科生物、红云制药、新开利安生物、朗健生物、天津全和诚、君隽未来、苏州亚科 【产业朋友圈·创新服务企业】 艾伟拓、伊诺凯、一临云、英铭诚咨询、拜诺维讯、杭州威士德、山东明康产业园、北京泽桥医疗、长城保险、亚思博、宁夏平罗园区、碳硅智慧

皮肤修复新介质：外泌体——从在细胞间传递信息到皮肤临床应用的新探索 近年来，“外泌体”在皮肤科与美容领域成为炙手可热的关键词。它被冠以“细胞信使”“无细胞疗法未来之星”等称号，众多高端护肤品和再生治疗也纷纷以其为宣称。但外泌体究竟是什么？ 今天，我们将深度解读一篇系统性综述，为您揭开外泌体在皮肤病学中的现实面纱。这篇文章全面梳理了外泌体的起源、功能、分离技术，并重点评估了其在伤口愈合、疤痕修复、皮肤年轻化、毛发再生、皮肤肿瘤、炎症性与自身免疫性皮肤病等多个领域的现有证据——既有令人振奋的临床前发现，也直面当前研究与临床转化中的严峻挑战。 通过这篇文章，能从中了较到： 外泌体如何作为纳米级“通信囊泡”，在细胞间精准传递修复指令。 在动物与体外研究中，外泌体如何促进胶原新生、加速愈合、抑制疤痕、刺激毛囊。 目前已开展的少数临床研究，究竟显示了怎样的疗效与安全性数据。 监管的灰色地带：为何FDA、ANVISA等机构对其临床应用持谨慎态度。 市场上所谓“外泌体”产品的真实成分与潜在风险。 从实验室走向临床，必须解决的六大核心问题。 原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39562240/ 原文翻译如下： Exploring the reality of exosomes in dermatology 探究外泌体在皮肤科中的现实应用 摘要 外泌体是由人和动物体内的几种细胞分泌的细胞外纳米囊泡。由脂质膜和包封的蛋白质组成，它们含有生物活性物质，如蛋白质、DNA、RNA、转录因子和代谢物。外泌体发现于20世纪80年代，在细胞间通讯和免疫功能中发挥着重要作用。它们的大小、含量和功能取决于起源的细胞。外泌体由于其在治疗疤痕、皮肤再生、毛发再生和其他皮肤病中的潜在应用而在皮肤病学领域引起了兴趣。然而，需要进一步的临床研究来证明其有效性和安全性。还需要考虑监管问题，因为在化妆品和医疗中使用外泌体在一些国家尚未完全批准。此外，在临床使用前了解与使用外泌体相关的风险和副作用也很重要。尽管前景广阔，但还需要更多的研究来探索外泌体在医学和皮肤病学中的全部潜力。 介绍 外泌体是纳米尺寸的细胞外囊泡，尺寸约为30-150 nm，来源于内体途径并由几种细胞类型分泌，包括干细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、人和动物免疫细胞以及植物细胞。它们由充满包囊表面蛋白的脂质双层组成，分离生物活性货物，包括蛋白质、DNA、信使RNA、微小RNA（miRNA）、转录因子、膜运输蛋白、抗原呈递蛋白、其他肽、代谢物和脂质。 它们在1983年由Johnstone等人首次报道，最初被称为“细胞垃圾载体”。在20世纪90年代，人们发现外泌体在细胞间通讯和免疫功能中起着至关重要的作用，因为它们表达起源细胞的特征，作为与细胞外基质（ECM）和邻近细胞相互作用的旁分泌分子。 从相同细胞类型获得的外泌体可以基于细胞及其微环境的特征而高度可变，在靶细胞或受体细胞中具有不同的大小、含量和功能。鉴于它们的差异，外泌体在结构和功能上是非常异质的。因此，它们对受体细胞的作用取决于它们的含量和细胞表面的不同受体。 近年来，外泌体由于其固有的生物相容性、跨越生理屏障的能力和低免疫原性而成为递送基于核酸的治疗剂的有前景的治疗。因为它们是由人体细胞自然产生的，所以它们被认为可以减少炎症反应。此外，作为再生细胞疗法（使用活细胞，如干细胞，修复或替换受损组织）的替代方案，外泌体理论上具有几个优点，包括稳定性，低毒性，生物相容性，以及减少免疫排斥和肿瘤发生的风险，因为它们的使用不涉及活细胞。 这篇综述旨在根据最近发表的文章和研究，独立解决最近对外泌体在皮肤病学中的使用的极大兴趣，全面总结它们在愈合过程中的真实的作用，疤痕治疗，皮肤再生，毛发再生，皮肤肿瘤，炎症性疾病，自身免疫性疾病，痤疮，黄褐斑和其他色素沉着过度疾病，以及讨论生物安全性，监管问题、巴西市场上的产品、非常规使用和未来前景。因此，期望提供对外泌体在皮肤病学中的作用机制以及可能的当前和未来临床应用的更好理解。 起源 研究表明，外泌体可以从几乎所有哺乳动物物种的细胞、组织或体液中获得。这些来源包括干细胞、癌细胞、免疫细胞、毛囊干细胞（HFSC）和人真皮成纤维细胞（HDF）;唾液、血液、尿液和血小板也被认为是外泌体分离的来源。它们表现出具有生物相容性的分子运输能力，使它们成为细胞间和种间通讯的有前途的试剂。间充质干细胞（MSC）是来源于成体干细胞的多能干细胞，具有自我更新和自我修复的能力，以及在一定条件下分化为多功能细胞的能力。MSC可以从几种来源获得，包括脂肪组织来源的干细胞（ADSC）、胎盘间充质基质细胞（PMSC）、脐带间充质干细胞（UCMSC）和骨髓干细胞（BMSC）。从这些细胞获得的外泌体被称为ADSC-exos、PMSC-exos、UCMSC-exos和BMSC-exos。 植物来源的外泌体被称为植物来源的外泌体样纳米颗粒（PELN），由于其理论上的生物安全性，代表了一种有吸引力的替代方案。据报道，PELN具有再生、抗炎和低免疫原性特性。在最近的文献综述中，PELN由于其结构和功能的相似性而被评价为人类外泌体的有前途的替代品，并被描述为消化系统、呼吸系统、神经系统、血管系统、泌尿生殖系统、内分泌系统和肌肉骨骼系统疾病的潜在治疗剂。它们的来源包括几个来源，如鲜花，生姜，葡萄，花椰菜，芦笋，姜黄，柠檬，葡萄柚，大蒜，大豆，蘑菇，西红柿，梨和草莓。 一些体外和动物研究还评估了来自Alcidlinus linteus的外泌体样纳米囊泡的作用，Alcidlinus linteus是一种以其抗肿瘤和抗炎特性而闻名的药用真菌，而Lactobacillus plantarum是一种能够进行乳酸发酵的细菌。还报道了来自人类肠道微生物群中发现的细菌的其他外泌体。 外泌体分离技术 在临床实践中使用外泌体的潜在理论益处还取决于分离方法的标准化。超离心技术目前被认为是参考方法。然而，已经开发了其他方法，包括通过超滤、免疫亲和和沉淀进行分离。这些技术的困难在于外泌体的排他性分离，而不存在其他ECM组分。描述了技术的组合以确保分离样品中的纯外泌体;然而，它增加了成本和对更高级技术培训的需求。 分离后，由于外泌体的最终产率的变化，有必要进行分析以表征其纯度和浓度。电子显微镜提供了形态学信息，允许观察结合到外泌体膜的结构。诸如动态光散射和纳米颗粒跟踪之类的技术测量它们的尺寸变化和浓度。免疫学方法，包括流式细胞术和蛋白质印迹，使用特异性标记物来检测外泌体，外泌体通常表达四跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81）和热休克蛋白（HSP 70、HSP 90）。质谱法允许鉴定和定量其分子组分，如蛋白质、核酸和脂质，并且定量逆转录聚合酶链反应确认和定量外泌体的RNA。 功能 鉴于外泌体介导细胞通讯的能力以及基于其组成的潜在治疗应用，研究人员已经开始探索它们在医学中的作用，作为一个尚未被认识的领域的一部分，称为再生医学。外泌体的分离来源对于它们的功能和临床应用至关重要。在过去的十年中，研究已经发现了外泌体在细胞存活、增殖、迁移、分化和衰老、免疫调节、血管生成和伤口愈合中的功能，以及肿瘤和自身免疫性疾病的潜在生物标志物。由于它们在体外研究和鼠模型中通过促进细胞迁移、ECM重建和血管生成对愈合具有积极作用，最近已开始探索其在皮肤病学中的用途。在皮肤病的背景下，外泌体调节皮肤细胞与其微环境之间的通讯的发现被认为可能解释慢性炎症和自身免疫性皮肤病的复杂发病机制，因此，研究将其作为有希望的诊断和治疗目标。 在美容学中，一些研究出于美容目的和细胞再生目的研究了外泌体，但大多数研究仍处于临床前阶段。尽管在过去十年中开发了大量的研究，但很少有研究人员发表有希望的临床前结果，包括人类研究。因此，仍然需要更多设计良好的临床研究，主要是随机研究，用载体组对照，以证明使用外泌体及其变体的有效性和安全性。 外泌体在愈合和瘢痕治疗中的作用 愈合是一个复杂的过程，包括不同和重叠的阶段。众所周知，炎症的存在对皮肤再生至关重要。然而，持续的炎症并不是有益的，炎症的程度对整个过程有很大的影响。炎症反应的发生和消失是决定再生组织或瘢痕形成的质量和时间的关键。研究表明，在皮肤伤口愈合过程中，干细胞有能力减少炎症，加速增殖阶段，并帮助组织重塑，通过旁分泌机制发挥作用，并释放生长因子和外泌体。 近年来，由于其独特的特性，外泌体已成为改善伤口愈合的有希望的治疗方法。它们的不同组成理论上允许调节参与伤口愈合的多个细胞过程，包括炎症、血管生成、细胞增殖和ECM重塑。 体外动物研究 2022年发表的一项系统综述发现了105项关于外泌体在伤口愈合中的应用的临床前研究，其中51项是在小鼠模型中进行的。最常用的外泌体是来源于人类的外泌体（MSC-exos和UCMSC-exos），最常用的分离技术是超离心法，研究中发现的最常见给药方式是皮下注射。在该分析中，外泌体治疗改善了伤口愈合，而与施用的模式和频率、浓度或来源无关。 一项动物模型研究表明，病灶内注射源自小鼠巨噬细胞的外泌体可增加成纤维细胞增殖和迁移、胶原沉积和内皮细胞刺激，从而缩短伤口闭合时间。 一项关于外泌体在糖尿病小鼠模型伤口愈合中的应用的荟萃分析显示，共有21项研究，涉及323只动物。在许多使用ADSC-exos的研究中，使用人干细胞来源的外泌体的治疗显示在伤口愈合率、再上皮化、胶原蛋白沉积和瘢痕形成后宽度的减少方面优于对照治疗上级。此外，用外泌体处理的炎症因子的表达显著降低。一项研究表明，来自经血的外泌体增加了糖尿病小鼠的血管生成和伤口上皮再生。 Chen等人评价了源自人胚胎细胞的外泌体局部应用于老年小鼠压疮中的功效，证明了由于衰老内皮细胞的可能复壮而导致的更快的伤口闭合和血管生成刺激。 关于增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，ADSC-exos表现出抑制ECM中成纤维细胞产生和活化的能力，从而防止异常瘢痕形成的出现。在动物模型中，与使用单独治疗相比，HDF-exos与A型肉毒杆菌毒素和UCMSC-exos与分段激光的联合治疗对增生性瘢痕更有效。在四个月的随访期内，与作为单一疗法注射的外泌体相比，将UCMSC-exos结合到水凝胶中似乎更有效地防止了增生性瘢痕的形成。 PELN的一些临床前研究和体外实验已经取得了令人鼓舞的结果，证明了递送生物活性分子、调节细胞反应和改善组织修复过程的能力。在Sahin等人进行的一项研究中，观察到来源于小麦的PELN促进I型胶原的产生，以及成纤维细胞和免疫细胞的增殖和迁移，在人成纤维细胞和角质形成细胞中具有抗凋亡活性。此外，发现这些PELN诱导人脐静脉内皮细胞中的血管生成，证明其用于组织再生的潜在用途。此外，PELN可以增强神经发生，从而确保为愈合组织提供足够的神经肽，通过刺激MSC的神经分化促进其再生。用人参衍生的外泌体进行的体外研究已经证明了它们通过转移它们的miRNA来刺激哺乳动物MSC中的神经发生的能力，这表明它们的使用可以增强神经分化并刺激伤口愈合。 临床研究 关于愈合过程，在11名健康患者的皮肤活检产生的病变中注射一次血小板来源的外泌体的临床试验表明，与未用外泌体治疗的病变相比，愈合时间没有差异。 Kwon等人在2020年发表了一项有25名患者参与的裂面临床试验，结果显示，在每三周进行三次CO2激光治疗面部痤疮疤痕后，ADSC-exos联合给药可减少治疗部位的红斑，缩短治疗后停机时间（4.1天vs. 4.3天），痤疮疤痕评估量表和研究者的总体评估有显著改善，从第二次治疗开始，由评估者自行决定疤痕（分别改善32.5% vs. 19.9%）。治疗后的疼痛和水肿等不良反应在接受ADSC-exos药物递送治疗的一侧略低，但无统计学显著性。 外泌体在皮肤年轻化中的应用 皮肤老化的影响是皮肤科咨询最常见的原因之一。内部和外部因素导致皮肤老化，包括紫外线辐射（UVR），污染和吸烟。特别是光损伤，产生ECM的变化，包括胶原蛋白和弹性纤维的减少，导致皱纹的临床表现以及皮肤紧致度和纹理的变化。由于它们调节细胞通讯和成纤维细胞功能的能力，近年来外泌体因其在皮肤再生中的潜在治疗用途而受到广泛关注。 体外动物研究 最近的综述文章分析了使用外泌体治疗光老化的临床前研究，得出的结论是，通过减少炎症标志物和上调ECM，有可能通过刺激I型胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白的产生和减少III型胶原蛋白的表达来防止成纤维细胞衰老。 一项研究表明，ADSC-exos在注射到小鼠的光老化皮肤中时，在治疗7天后，表皮厚度显著减少，真皮厚度增加，以及紫外线诱导的光老化小鼠皮肤皱纹减少。这些外泌体的体外实验证明了对成纤维细胞增殖的潜在刺激和细胞内自由基产生的减少，表明了相关的抗氧化作用。在光老化真皮成纤维细胞中使用BMSC-exos的体外研究显示，UVB辐射诱导的氧化应激和细胞凋亡减少。用UCMSC-exos预处理（在阳光暴露之前）和用HDF-exos处理也显示出对真皮成纤维细胞的保护作用。 来自真菌Linus linteus和细菌Lactobacillus plantarum的外泌体通过诱导成纤维细胞增殖和调节ECM相关基因在体外显示出抗氧化和抗衰老活性。 临床研究 Park等人评价了在使用1 mm针头进行微针之前应用ADSC-exos治疗面部皮肤老化的临床疗效。在一项为期12周的前瞻性随机分面研究中，28名患者接受了3次治疗，间隔3周。在每次治疗中，将ADSC-exos应用于面部的一侧，然后进行微针，而将盐水溶液和微针应用于另一侧作为对照。第一次治疗后6周，外泌体治疗侧的整体美学改善量表（盖斯）评分显著更高。在12周结束时，接受ADSC-exos治疗的参与者的盖斯评分较高（28%对14%），以及更大的皱纹减少（12.4% vs. 6.6%），改善皮肤弹性（ADSC-exos治疗侧改善11.3%，对照组恶化3.3%）、水合作用改善（6.5% vs. 4.5%）和色素沉着改善（9.9% vs. 1%）。另一项临床试验涉及21名通过每天两次局部应用相同的外泌体治疗色素沉着过度的女性，持续8周，显示黑色素水平显著降低，用Mexameter®评估，治疗后4周通过间接方法评估。然而，在接下来的四周内，皮肤清洁效果降低。 在一项随机、双盲、安慰剂对照研究中，微针穿刺后局部应用PMSC-exos显示出良好的皮肤质量结果。在三个月的疗程中接受外泌体治疗的20名患者在最后一次疗程后120天显示出皱纹、毛孔、油性、均匀性和皮肤血管化的明显改善，但没有描述这些结果的统计分析。与安慰剂组相比，对外泌体治疗的满意度显著更高，并且没有不良反应的报告。在将羟基磷灰石钙注射到5名患者的面部之前立即局部应用相同的外泌体（PMSC-exos），在研究人员和参与者的评估中，30天后，与单一疗法中的可注射生物刺激剂相比，临床反应更快（21天对30天）。 有两例报告称，在面部换肤手术后局部应用干细胞来源的外泌体，与单独使用激光相比，使用部分消融激光约5天后恢复更快，显示再上皮化时间为7至10天。 关于非人类来源的外泌体在年轻化中的使用，韩国的一项研究在16名平均年龄为50岁的女性的眶周区域中以每天两次的剂量进行了源自植物乳杆菌的外泌体的局部应用，持续四周，在图像分析系统中证明，在随访期结束时皱纹减少了15.89%，色素沉着减少了8.5%。 外泌体与毛发再生 脱发是与衰老相关的明显表型之一。已知衰老相关性脱发与毛囊静止和毛发小型化有关。在正常的头发中，生长发生在毛囊水平，作为一个连续的三相周期：生长期（活跃生长），退化期（过渡和退化）和休止期（休息）。毛乳头细胞（DPC），负责毛囊发育，已知释放几种生长因子，与上皮细胞，生殖细胞和干细胞沟通。反过来，这些是负责正常的头发生长和增殖在一个新的头发周期。鉴于DPC在毛囊和毛发周期中发挥的关键作用，它们已被用作外泌体的来源，因为它们上调Wnt/β-连环蛋白信号传导，这是参与毛发调节、再生和形态发生的关键细胞途径。还研究了来源于ADSC、BMSC、角质形成细胞和其他MSC的外泌体。 体外动物研究 使用外泌体治疗雄激素性脱发（阿加）的临床前证据主要使用DPC-外泌体。在鼠模型中，与安慰剂相比，DPCs-exos的皮内注射通过将毛囊从休止期转化为生长期并延迟从生长期到退化期的转变而诱导毛发生长，这在临床和组织病理学上都观察到。DPC-exos还减少了患有斑秃的小鼠的毛发脱落和毛囊周围炎症。 一项在阿加小鼠模型中进行的研究比较了皮内注射MSC-exos与中国传统用于治疗阿加的草药配方，局部米诺地尔和相同配方作为对照，通过临床和组织病理学观察到的毛囊从休止期向生长期的转化，证明了比对照组更早的毛发再生。 在体外和动物研究中，ADSC-exos证明了对DPC增殖、迁移和诱导的刺激，对毛干伸长和毛发生长的促进，以及对双氢睾酮作用的中和作用，确保毛囊数量和毛发厚度的增加。在小鼠中的体内研究表明，当移植物除了真皮和表皮细胞之外还含有ADSC-exos时，毛发移植的临床和组织病理学功效更大，具有显著的毛发再生。 植物来源的外泌体或PELN似乎也通过激活Wnt/β-连环蛋白途径和释放生长因子来促进毛发生长。在鼠模型中的一项研究评估了以两种不同剂量口服和局部施用大蒜衍生的外泌体在毛发再生中的功效。以高剂量口服接受外泌体的小鼠表现出增加的Wnt-B-连环蛋白通路信号传导和具有较大直径的毛囊。低剂量经口途径产生的临床和组织病理学效应与局部给药相似。 临床研究 在一个病例系列中，39名轻度至中度阿加患者在微针注射后接受了人ADSC-外泌体局部应用，每周一次，持续12周，在随访结束时显示头发密度（增加24.9根头发/cm2）和厚度（增加8.8 μm）显著增加。 一例38岁阿加和白发男性患者的病例报告显示，在4个月的1064 nm Nd：YAG皮秒分数激光治疗后，给予源自蔷薇属的外泌体药物后，毛发明显生长，白色毛发重新着色。 皮肤肿瘤中的外泌体 黑素瘤 黑色素瘤导致80%的皮肤肿瘤死亡。近年来，随着该病发病率的增加，早期诊断和检测生物标志物，特别是与预后、监测疾病进展和治疗反应相关的生物标志物是必要的。因此，外泌体由于其免疫逃避的能力而在皮肤肿瘤学中发挥了重要作用，并因此在几种类型的癌症中诱导转移前小生境的形成。来源于黑色素瘤患者细胞的外泌体是潜在的“液体活组织检查”，并且因为它们携带其来源细胞的遗传负荷，所以是用于诊断和预后的有希望的工具。目前，研究人员正在努力确定黑色素瘤的代谢特征和外泌体特征;然而，现有数据仅限于动物模型和体外细胞。 鳞状细胞癌 临床前证据表明，外泌体通过增强参与突变角质形成细胞的细胞翻译、转录和细胞分裂信号传导的蛋白质的活性而与鳞状细胞癌的发病机制相关。然而，需要进一步的研究来了解其机制和潜在的临床应用。 蕈样肉芽肿 虽然外泌体在最常见的皮肤淋巴瘤中所起的作用仍然知之甚少，但鉴于蕈样肉芽肿患者的外泌体中某些miRNA的过表达，特别是miR-155和miR-1246，它们已被研究为潜在的诊断和预后生物标志物以及新疗法的靶点。 自身免疫性和炎症性疾病中的外泌体 银屑病 银屑病的病理生理学继续被研究，近年来，已经有了许多发现。来自银屑病患者的外泌体的体外研究表明，由于其细胞间通讯的高功率和与免疫系统的关系，炎症级联反应和氧化应激增加的有效激活。与未治疗的患者相比，来自接受阿基诺单抗、阿达木单抗和乌司奴单抗治疗的患者的外泌体表现出脂质组成的差异，使用免疫生物制剂的患者的脂质负荷定性较高，这强调了疾病得到控制时心血管风险的降低，以及外泌体在治疗随访中的作用。 体外和鼠模型研究表明，注射UCMSC-exos可减少表皮增殖、疾病扩展和严重程度，并且局部使用来源于人胚胎和ADSC的外泌体可降低白细胞介素（如IL-17）的水平。最近，使用外泌体作为托法替尼的局部递送手段增加了其在小鼠中的治疗效果并减少了不良事件。 特应性皮炎（AD） 利用外泌体调节免疫系统的能力使它们成为可能参与AD发病机制的药剂，但也是可能的治疗剂。在体外，HDF-exos促进了慢性炎症细胞中屏障功能的增加和皮肤恢复，ADSC-exos减少了炎症途径和血管生成。在患有AD的小鼠中，当皮下和静脉内施用时，这些相同的外泌体促进血清IgE水平的降低和症状减轻。一项研究在34名特应性成人中皮下应用单剂量人UCMSC-exos的疗效的临床试验显示，疾病活动和严重程度评分有所改善，无不良事件。在患有中重度和难治性AD的成人患者中静脉内使用同种异体BMSC-exos在5名患者中的4名患者中表现出至少38周的显著症状改善，没有不良事件。 白癜风 与其他自身免疫性疾病一样，外泌体由于其与免疫系统的关系，参与白癜风的病理生理学。在体外，发现来自白癜风患者的外泌体能够抑制黑素生成并降低酪氨酸酶活性，这是由于存在针对黑素细胞的抗体。然而，对作用机制仍然知之甚少，正在开展新的研究，以确定和使用外泌体作为疾病生物标志物，甚至作为一种治疗选择。 结缔组织疾病中的外泌体 系统性红斑狼疮（SLE） 由于上述相同的原因，外泌体似乎与SLE的发病机制有关。与外泌体相关的生物标志物已被研究用于疾病的诊断和预后，特别是在狼疮性肾炎中，以及新疗法的可能靶点。 硬皮病 由于真皮成纤维细胞功能障碍而导致的结缔组织产生加剧所引起的纤维化是硬皮病病理生理学的核心。使用来自硬皮病成纤维细胞的外泌体的研究已经证明了正常成纤维细胞中胶原蛋白I和纤连蛋白的产生增加和失调。 作为一种治疗措施，在小鼠中单次应用UCMSC-exos表现出对成纤维细胞增殖、迁移和活化的抑制。由于皮肤溃疡是该疾病的常见并发症，因此已经研究了用于此目的的外泌体的使用，并且似乎是有希望的。 皮肌炎 体外研究表明，含有遗传货物的外泌体的过度循环激活了患有该疾病的患者的细胞和肌肉抗体的自噬，并且在开始抗风湿治疗后其水平降低。此外，这些外泌体似乎与疾病活动、间质性肺病的存在和血管改变有关。 其他应用 药物反应 来自具有严重药物反应（例如Stevens-Johnson综合征（SJS）和中毒性表皮坏死松解症（TEN））的患者的外泌体已经证明存在能够过表达炎症途径和促进细胞凋亡的基因，并且其浓度越高，细胞凋亡的面积越大。皮肤受影响具有嗜酸性粒细胞增多和全身症状（DRESS）的药物反应和泛发性脓疱性银屑病的患者在其外泌体中也具有促炎性miRNA，并具有T细胞活化。 慢性皮肤移植物抗宿主病 文献中有一例异基因骨髓移植后发展为不受控制的GVHD的病例报告，并接受了体外单采、他克莫司、伊马替尼、环孢素和大剂量皮质类固醇治疗。该病例在移植后一年开始出现皮肤病变，如丘疹、斑块、湿疹、糜烂和溃疡，以及指甲受累和瘢痕性脱发。PMSC-exos的静脉内使用，在四个疗程中每周一次，在最后一个疗程后15天表现出皮肤受累和实验室特征的改善，在随访期间（5个月）没有不良事件，不耐受或感染的出现。然而，没有解释这种改善是如何发生的。 生物安全 许多作者认为外泌体疗法是一种无细胞方法;因此，与干细胞疗法相比，外泌体疗法与致瘤性和免疫原性的风险较低相关，并且降低了不受控制的细胞分化和细胞增殖的可能性。然而，由外泌体递送到受体细胞的蛋白质、代谢物和核酸有效地改变了它们的生物反应，潜在地促进或抑制疾病。 例如，外泌体可以限制或促进病毒感染。外泌体货物可以通过限制病毒复制或增加抗病毒免疫来抑制感染，但它们也可以在劫持外泌体生物发生机制后促进病毒复制。这些可以作为假包膜，促进病毒进入，增加其感染性。包膜逆转录病毒，特别是HIV 1和2和外泌体之间在大小、密度、分子电荷和利用共同组分来利用细胞蛋白和囊泡运输机制方面的相似性支持了这一想法。类似地，源自免疫细胞和肿瘤细胞的外泌体释放可以影响靶细胞中的免疫系统活性的货物，刺激或抑制其增殖和功能。小鼠中超生理水平外泌体的外源剂量与肿瘤诱导和进展相关。 只有少数使用同种异体外泌体的临床研究在其方法中指出，对供体和最终产品进行了感染性筛查，其中包括血型和Rh因子，对病毒性疾病和性传播感染的研究。此外，目前对安全提取、纯化、定量、浓缩方法、剂量和剂量学没有共识/标准化或现行法规，这使得难以用足够的患者样本进行多中心临床试验。 关于植物来源的外泌体，需要进行更多的研究以确保其安全应用。有必要全面了解其毒理学方面、生物降解性和清除动力学。 监管问题 在欧洲和美国，禁止使用基于人类产品的化妆品，因为有可能传播病毒或朊病毒疾病。2019年12月，FDA发布了一份关于使用外泌体的安全通知，此前有多份报告称内布拉斯加州的患者发生了未指明的严重不良事件，这些患者接受了未经批准的含外泌体产品的治疗。尽管一些体外、动物和基础临床研究已经描述了外泌体的潜在益处，但FDA尚未批准外泌体用作局部、注射或静脉内治疗。然而，在美国，有6家公司生产和供应含有临床用外泌体的产品，这些产品都是人源性的，但没有说明来源。在巴西，国家卫生监督局（ANVISA，Agência Nacional de Vigilância Sanitária）授权在2级化妆品中使用非人类来源的外泌体，这意味着产品必须用于外用，也就是说，它们只能应用于表皮完整的皮肤，因此不允许通过注射或作为药物输送使用。然而，无菌小瓶中的呈现鼓励其通过注射使用或在导致皮肤屏障破坏的程序（例如微针或分数激光）之后作为“药物递送”使用。 在巴西的可用产品 主要来自成人干细胞的同种异体外泌体与非处方保湿剂和血清的组合是全球市场的增长趋势。这些产品中外泌体的数量、纯度和安全性尚不明确，因为没有法规或上市后监测。在此次修订之前，巴西国家卫生监督局注册的化妆品产品包括Suprema Marcas销售的INNOAESTHETICS的Inno-Exoma®Exo-skin，以及BENEV Inc.开发的ASCE plus SRLV（用于皮肤），HLRV（用于头发）和ILRV（私密产品）。与ExoCoBio合作。商业产品Inno-Exoma® Exo-skin使用NARBEX（非动物再生生物工程外泌体）技术开发，该技术利用生物工程来模拟细胞来源的外泌体。由于它被认为是一种生物相同的产品，该公司称之为外泌体或合成外泌体。它存在于无菌小瓶中，每个盒子包含10 mL冻干外泌体小瓶，与氨基酸和肽、甘露醇和透明质酸的复合物相关，伴随有2 mL盐水溶液小瓶用于稀释。截至目前，尚未发表关于该产品的临床研究。ASCE Plus产品是来自Rosa植物的外泌体，与ExoCoBio在其他国家（如韩国）销售的来自间充质细胞的外泌体不同。它装在无菌小瓶中，在巴西销售的盒子含有一个20 mL小瓶的外泌体，含有氨基酸和肽以及其他活性成分如抗坏血酸、视黄醇、烟酰胺和硫胺素的复合物，以及一个5 mL小瓶作为稀释剂，含有水、碳酸氢钠、氯化钠、透明质酸钠和氨基酸复合物。在一份病例报告中，在4个月一次的分数皮秒激光和药物输送后，评价了其在治疗阿加和白发中的应用，证明了毛发生长和白色毛发的色素沉着，没有不良反应。没有关于本产品的其他已发表研究。 2024年发表的两篇系统性综述包括9项皮肤病学研究-组织再生（1）、AD（2）、黄褐斑（1）、年轻化（1）、敏感皮肤（1）、黑色素合成（1）、皮肤发光（1）和作为激光治疗痤疮疤痕的辅助剂（1）。作者强调了大量的出版物（体外研究，细胞培养，动物模型），作为对可能的外泌体美学益处的观点的综述。然而，缺乏具有良好方法学和长期随访的临床研究。此外，小瓶中存在许多组分以及相关技术的使用，即使是微创技术，如分数激光和微针，也阻止了关于外泌体实际益处的结论。作者与任何参与外泌体及其衍生物商业化的公司之间没有利益冲突。 结论 尽管未来的应用有无限的可能性，但在其被授权使用之前，需要阐明关于外泌体的重要问题：1）鉴定用于特定病症/疾病的理想细胞来源;优化分离方法及其表征; 2）符合当前良好制造规范法规的大规模生产的标准化，并考虑监管因素; 3）建立给药方案（适当的量，但也需要给药频率）; 4）确定最有效的给药途径; 5）了解外泌体在体内的生物分布和消除; 6）克服缺乏安慰剂对照研究所造成的局限性; 7）仔细评估长期风险和毒性。所有这些考虑都非常重要，特别是因为这些研究大多涉及使用来自人类干细胞的遗传货物，而尚未确定其真正的功效和安全性。 医生和患者欣赏创新，但他们也非常重视安全。尽管临床前数据很有希望，但很难将细胞培养和动物模型中的发现外推到人类生理学的复杂性。需要进一步的研究来了解与外泌体在医学和皮肤病学中的使用和适用性相关的所有问题。确定与使用外泌体相关的潜在风险和副作用对于其批准和开始临床使用至关重要。 参考文献：Dal'Forno-Dini T, Birck MS, Rocha M, Bagatin E. Exploring the reality of exosomes in dermatology. An Bras Dermatol. 2025;100(1):121-130. doi:10.1016/j.abd.2024.09.002 关于科桥生物 科桥生物技术（江苏）有限公司，坐落于南京市浦口区南京国家农创中心公共创新平台,是集合多位经验丰富的生物医药行业专家创办的工程化外泌体研发公司，为疾病治疗和医疗美容客户提供更优的技术和产品选择，同时科桥生物也为广大科研机构和企业提供外泌体技术服务，包括外泌体分离提取，质量表征，功能研究，组学研究，工程化改造等。 此外，科桥生物是瑞士TECAN的液体处理工作站、酶标仪、洗板机，瑞明多模态单细胞监测系统、活细胞监测系统、显微操作仪、芯片点样仪的江苏省代理商。 联系我们 电话：025-85752084

这是一篇有关关于外泌体概述的综述，从宏观上介绍了外泌体的形成、分离、特性以及外泌体治疗等方面。 从这篇文章中我们也可以看到外泌体研究的三个主要方向：（1）不同细胞的外泌体特性分析；（2）外泌体分离技术的研究；（3）工程化外泌体用于靶向治疗的研究。这三个方面前两者是基础，后一个是实际的应用，只有前两个研究深入了，后一个的研究才有数量上、质量上和安全上的保障，而后一个的广阔前景又给了我们足够的动力去研究前两个方向。 下面我把文章的核心内容做了提炼，它有助于快速和全面的了解外泌体的基础知识，文章详细内容在提炼内容之后，它更加详细和完整。 什么是外泌体：细胞膜的向内出芽导致早期内体的形成，早期内体膜向内出芽导致多泡体（MVB）形成，最后，MVB与质膜的融合向细胞外空间脱落的物质就是外泌体。 细胞外囊泡：包括外泌体，微泡和凋亡小体，凋亡小体是细胞死亡的副产品，所以研究微泡和外泌体的价值更大。 外泌体的大小：外泌体的直径一般30至200 nm，微泡的直径为100或200至1000 nm，因为两者有些颗粒有相同的直径，所以从大小上很难将他们区分开来。 外泌体的特异性标志物：阿利克斯和TSG101是外泌体的公认标志物，四跨膜蛋白如CD9、CD63和CD81是外泌体膜上的特异性标志物。此外，外泌体含有多种特异性蛋白质，这取决于它们的来源细胞。 外泌体与干细胞治疗的比较：外泌体具有干细胞的功能，如修复，再生，抗膨胀和免疫调节，而没有干细胞本身的限制和风险，更加安全。 外泌体的分离技术：分离方法虽然很多，但是因为外泌体大小和成分的复杂性，超离心（UC）仍然是从MSC的条件培养基中分离外泌体的最广泛使用的方法。商业试剂盒，是最近报告中分析的126篇论文中外泌体分离的第二选择。 外泌体的质量控制：随着外泌体研究的不断深入，对外泌体的监管也会有严格要求，例如韩国食品药品安全部（MFDS）于2018年发布了细胞外囊泡治疗产品的质量、非临床和临床评估指南。 外泌体生物分布分析：一般通过共价结合、表面修饰、膜整合、封装和代谢标记分析外泌体在体内的生物分布，从发表的文献来看膜整合用的最多，代谢标记最少。分析体内分布的主要目的是通过体内分布提供的信息预测外泌体用药剂量和潜在的副作用，此外通过体外分布，也能确定给药方式，目前主要的给药方式是静脉内注射。 外泌体的表征：外泌体的表征必须要有NTA、电子显微镜分析和特异性标记物分析，表征对于外泌体用于治疗研究至关重要，是属于质量控制的一部分。 外泌体的靶向性：因为外泌体具有天然靶向性，可以作为载体递送物质，调控受体细胞的活动，此外对外泌体进行工程化改造，使它具有人为的特异性靶向性，进而特异性的将所需的物质传递给所需的细胞，这在肿瘤治疗上意义重大。 原文如下： 原文链接：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC7014306/ Advances in Analysis of Biodistribution of Exosomes by Molecular Imaging 外泌体生物分布的分子影像学研究进展 摘要 外泌体是由几乎所有类型的细胞产生的纳米尺寸的膜囊泡。由于外泌体样囊泡以进化上保守的方式产生，用于从起源细胞到受体细胞的信息和功能转移，越来越多的研究集中在它们作为治疗剂、药物递送载体和诊断靶标的应用上。外泌体的体内分布的分析是开发基于外泌体的治疗剂和药物递送载体的先决条件，其具有治疗剂量和潜在副作用的准确预测。已报道了评估从不同来源获得的外泌体的生物分布的各种尝试。在这篇综述中，我们研究了目前的趋势和优点和缺点的方法来确定外泌体的生物分布的分子成像。我们还回顾了29篇出版物，以比较用于分离、分析和标记外泌体以及确定标记外泌体的生物分布的方法。 引言 根据过去半个世纪的研究，地球上几乎所有细胞都会产生由脂质双分子层膜构成的外泌体或外泌体样颗粒。外泌体的释放是一种进化上高度保守的现象，存在于所有生物界。外泌体的发现始于20世纪40年代，1946年首次报道了正常血浆中血小板来源的颗粒，随后于1967年被重新描述为“血小板尘埃”。然而，因其被视为细胞垃圾处理系统，外泌体在随后数十年间鲜受关注。21世纪初，有关外泌体的重要发现改变了这一趋势。2007年，研究报道了外泌体可转运mRNA和miRNA等遗传物质。此后外泌体研究呈爆发式增长，2018年和2019年每年发表论文超过3000篇（图1）。研究显示直径100-200纳米的干细胞外泌体可介导干细胞的旁分泌治疗效应。外泌体是多细胞生物与单细胞生物体内信号传递的重要介质，也是跨物种信号传导的关键媒介。除基础研究外，外泌体在医疗健康产业的临床应用也迅速发展，包括治疗药物研发、药物递送载体开发和液体活检技术等。 图1.关于外泌体的出版物和重大发现的趋势。2019年10月17日，使用关键词外泌体、外泌体、细胞外囊泡、细胞外囊泡和血小板衍生颗粒，通过PubMed检索检索了出版物数量。 2.外泌体 2.1.外泌体和细胞外囊泡 细胞外囊泡是细胞分泌的双层脂质囊泡。已经根据它们的生物起源表征了三种主要类型的EV：（1）外泌体通过最复杂的过程产生;具体地，细胞膜的向内出芽导致早期内体的形成。另一个早期内体膜的向内出芽导致多泡体（MVB）。最后，MVB与质膜的融合使外泌体向细胞外空间脱落。外泌体的直径范围为30至200 nm;（2）微泡由质膜简单的向外出芽产生。已知微泡的大小为100或200至1000 nm;和（3）凋亡小体是凋亡性细胞死亡的结果。凋亡小体是最大类型的EV，直径为500至2000 nm。 由于凋亡小体是细胞死亡的副产品，因此开发基于EV的治疗剂的许多尝试都集中在外泌体和微泡上。特别是，由于对潜在应用的广泛研究，外泌体被广泛接受为下一代治疗药物。如上所述，外泌体和微泡的大小范围重叠，并且难以根据它们的大小区分分离这些EV。最近，提出了一个替代术语，小细胞外囊泡（sEV），指直径小于200 nm的EV。在这篇综述中，我们将这些较小的EV称为外泌体。 已经报道了外泌体的特异性标志物：阿利克斯和TSG101是外泌体的公认标志物，四跨膜蛋白如CD9、CD63和CD81是外泌体膜上的特异性标志物。此外，外泌体含有多种特异性蛋白质，这取决于它们的来源细胞。有趣的是，据报道，来源于间充质干细胞（MSC）或HEK 293 T细胞的外泌体不含I类和II类人主要组织相容性复合体（MHC）蛋白或共刺激分子，如CD80和CD86。外泌体表面上不存在这些蛋白质表明，对于同种异体治疗剂，预期没有免疫排斥。来源于干细胞的外泌体正在积极开发为无细胞疗法，因为它们概括了干细胞的功能，如修复，再生，抗膨胀和免疫调节，而没有干细胞本身的限制和风险。例如，来源于MSC的外泌体对各种疾病具有治疗效果，包括心肌梗死、CCl4诱导的肝损伤、移植物抗宿主病（GvHD）、急性和慢性肾损伤和特应性皮炎。 与基于细胞的治疗相比，外泌体的大小使其能够通过多种途径安全全身给药，而没有栓塞的风险。由于外泌体不能自我复制，因此肿瘤发生的风险也很低。此外，使用外泌体将避免与细胞治疗相关的各种问题，例如无法对细胞进行灭菌、保质期短以及发布前有限的质量控制（QC）。几项研究还报道了来自MSC和HEK 293T的外泌体在体内或体外均不引起毒性。最近的一项研究表明，长期重复注射外泌体不会诱导毒性。纳米大小的外泌体可以通过全身施用到达并积累在治疗感兴趣的组织之外的其他组织中。因此，通过预期途径给药后的生物分布分析是开发基于外泌体的治疗剂的先决条件。 2.2.外泌体的分离技术 对于基于外泌体的治疗，要克服的最重要的障碍是开发用于大规模分离外泌体的适当技术。来自不同来源的外泌体已经用各种实验方法分离，例如微分超离心（UC）、密度梯度超离心（DGUC）、超滤（UF）、尺寸排阻色谱（SEC）、沉淀和切向流过滤（TFF）。根据最近的报道，UC是从MSC的条件培养基中分离外泌体的最广泛使用的方法。商业试剂盒主要基于蛋白质的沉淀，是最近报告中分析的126篇论文中外泌体分离的第二选择。 在各种方法中，TFF已被提出作为外泌体工业生产的理想方法。与其他方法相比，这些方法对药品生产质量管理规范（GMP）的符合性有限，符合GMP的TFF系统的可用性也可能导致验证过程控制和GMP文件。基于UC的方法存在产生具有共沉淀污染物的外泌体的风险，并且由于离心过程中高压引起的外泌体聚集而导致功能丧失。DGUC中使用的培养基可能抑制外泌体的功能。基于蛋白质沉淀的商业试剂盒广泛用于许多学术实验室。然而，用于沉淀的添加剂（例如，聚乙二醇（PEG））可以抑制外泌体的生物学功能。尽管SEC具有去除比外泌体小的蛋白质的优点，但报道了低回收率和外泌体功能的潜在丧失。原则上，SEC不能区分外泌体与具有相似尺寸的非外泌体颗粒。最近的报道揭示了与外泌体表面相关的蛋白质的功能重要性。这些结果表明，仔细选择适当的方法对于分离功能性外泌体而不损失这些表面相关蛋白是重要的。 2.3.外泌体的质量控制 分离的外泌体的QC对于可重复的研究和治疗剂的开发都是重要的。在建立外泌体分析标准的国际努力中，通过一系列出版物提出了细胞外囊泡研究的最小信息2018（MISEV 2018）。许多研究还报道了外泌体的GMP生产，用于开发具有建议的释放标准的治疗剂。基于外泌体的治疗的全球市场预计将从2016年的500万美元增长到2021年的1000万美元，复合年增长率（CAGR）为14.9%。在监管方面，预计韩国、意大利和中国的监管机构将快速批准外泌体治疗。韩国食品药品安全部（MFDS）于2018年发布了细胞外囊泡治疗产品的质量、非临床和临床评估指南。如表一所示，MISEV 2018和MFDS指南中的大多数标准非常相似。MFDS指南还包括起始物料表征、外泌体生产、分离和表征方法、稳定性试验、非临床研究考虑因素、毒理学评价和临床研究考虑因素的指南。 3.外泌体生物分布分析 3.1.生物成像模式 生物发光成像（BLI）、核成像、荧光成像和磁共振成像（MRI）等各种模式已用于体内成像（表二）。一般而言，已知BLI具有最高的灵敏度和高信噪比，而核成像具有最高的穿透力。然而，具有荧光素酶的BLI需要额外施用荧光素酶的底物，并且受到低空间和时间分辨率的限制。核成像需要危险的放射性同位素，空间分辨率低，成本高。近红外（NIR）荧光染料的荧光成像受到空间和时间分辨率的限制。使用荧光蛋白（FP）的荧光成像具有最高的空间分辨率。然而，FP荧光的低穿透性不允许非侵入性体内成像。MRI具有高穿透性和高空间和时间分辨率，但受到低灵敏度和高成本的限制。 3.2.外泌体的标记方法 对于体内成像，外泌体必须使用适当的方法用探针标记。标记探针的方法包括共价结合、遗传修饰、膜整合、包封（或内化）和代谢标记（表三）。 3.2.1.共价结合 共价结合可用于通过使外泌体与具有功能部分的探针反应来标记外泌体。由于共价键合，标记的探针以最小的解离紧密结合到外泌体。然而，当使用该方法时，也可以标记非特异性外泌体蛋白。此外，外泌体表面蛋白的标记可影响其功能和/或结构，导致外泌体与靶细胞的相互作用改变。最近报道，表面蛋白的修饰改变了外泌体的生物分布。根据该报告，与未处理的外泌体的分布相比，用外泌体处理糖苷酶导致小鼠中外泌体的肺分布略微增加。然而，由于研究中每组仅使用了3只小鼠，因此有必要使用大量动物进一步探索这一发现，以获得更具统计学意义的结果。在没有共价结合的情况下进行的另一项研究表明，用亲脂性染料标记外泌体也略微改变了外泌体的生物分布。研究人员用亲脂性荧光染料标记含有荧光素酶的外泌体，并比较了有和没有亲脂性染料的外泌体的生物分布。不含亲脂性染料的外泌体在器官中按以下顺序积累：肺肝脾肾。相反，具有亲脂性染料的外泌体以以下顺序在器官中积累：肝、肺和脾。总之，有必要开发一种方法来分析外泌体表面修饰的效果。 3.2.2.表面修饰 外泌体的表面修饰可以通过遗传修饰来避免，以将探针蛋白加载到外泌体中。迄今为止，荧光素酶蛋白主要用于遗传修饰。然而，基因修饰可能会改变细胞甚至外泌体的性质。探针蛋白的不均匀加载是另一个需要解决的问题。 3.2.3.膜整合 外泌体最广泛使用的标记方法是亲脂性荧光染料的膜整合。这种方法简单易行，但有外泌体聚集的风险。亲脂性染料的另一个问题是它们可以标记脂蛋白和脂质胶束。亲脂性染料已被广泛用于分析细胞的生物分布，用于开发基于细胞的疗法。一项研究报告称，在共培养条件下，亲脂性染料（如PKH 67或Dil）未从标记细胞转移至未标记细胞。这些结果表明，存在由从外泌体膜释放的亲脂性染料转移到靶组织或细胞引起的背景信号的低风险。另一方面，亲脂性染料的长体内半衰期可能在清除外泌体后引起假信号。据报道，PKH2和PKH26的体内半衰期分别为12天和超过100天。二烷基碳菁染料，如DiD、Dil、DiO和DiR也被广泛使用。已知DiR的体内半衰期约为4周。总之，有必要包括仅含有亲脂性染料的对照。使用亲脂性染料的另一个潜在问题是由于染料的亲脂性而在液体中形成胶束。当PKH 26或CM-Dil在不含外泌体的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中孵育时，存在可检测水平的颗粒。相反，在我们的研究中，当PKH染料在不含外泌体的PBS中孵育时，没有观察到可检测到的颗粒。此外，当PKH染料与适当浓度的外泌体反应时，未观察到颗粒数量的可检测变化（未发表的观察结果）。同样，重要的是包括阴性对照，其由相同缓冲液中的亲脂性染料组成，而没有外泌体。由于去除游离未标记染料是先决条件，因此使用相同的去除方法处理该阴性对照也很重要。 3.2.4.封装 封装可以应用于标记外泌体，同时避免表面修饰。然而，电穿孔可能导致外泌体的聚集或膜的结构变形，从而导致融合的外泌体。当亲脂性材料用于包封时，难以排除内化探针从外泌体持续释放的可能性。预期转运蛋白在外泌体膜上的不均匀分布可在转运蛋白用于包封探针时引起探针的不均匀加载。特定转运蛋白的表达也受到细胞类型的限制。 3.2.5.代谢标记 外泌体的代谢标记可通过在细胞培养过程中添加特定物质来实现。在分离代谢标记的外泌体后，可以用点击化学实现探针的共价结合。然而，在细胞培养过程中添加额外的物质可能会导致细胞或外泌体特性的变化。 3.3.文献中外泌体的生物分布分析 我们分析了29篇已发表的论文，这些论文报告了不同外泌体或EV的生物分布研究（表4）。最广泛使用的标记方法是亲脂性染料的膜整合，然后是共价结合、包封（或内化）和基因工程（图2）。只有一篇论文描述了代谢标记。 图2.用于标记外泌体的标记方法和探针 3.3.1.标记方法 所有四篇涉及基因工程的论文都描述了酶的使用。未报道使用荧光蛋白的出版物（表4）。如所讨论的，荧光的低穿透性不适合于非侵入性体内成像（表2）。基因工程可能会导致宿主细胞甚至外泌体特性的改变。当使用遗传修饰的细胞来生产标记的外泌体时，不能排除用于生物分布分析的标记的外泌体和用于治疗用途的未标记的外泌体的特征存在差异的可能性。另一方面，遗传标记的外泌体在比较它们在有和没有额外标记的情况下的体内分布方面具有优势。特别是，基因标记的外泌体可用于监测表面修饰的影响，如共价结合或膜整合，这可能导致外泌体膜的结构或功能变化。 已经用各种标记探针如放射性同位素、纳米颗粒和荧光染料进行了通过包封来标记外泌体（表4）。经常使用被动加载探针。主动装载探针的一个有趣的例子是在外泌体的膜上使用转运蛋白。一项研究报告了葡萄糖包被的金纳米颗粒被外泌体膜上的GLUT 1葡萄糖转运蛋白包封。随着研究的进展，期望有更多的转运蛋白可用于从不同来源获得的外泌体中特异性包封探针。然而，外泌体膜上转运蛋白的分布或丰度可能导致蛋白质的不均匀负载。还采用超声处理将探针包封在外泌体中。然而，超声处理可能导致外泌体膜的变形或损伤，最终影响外泌体的生物分布。此外，超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米颗粒已用于通过转染产生外泌体的细胞来标记外泌体。重要的是要认识到纳米颗粒的负载量受到其尺寸的限制。在先前的报告中，SPIO纳米颗粒的流体动力学半径为62 nm。由于研究中外泌体的直径约为100 nm ，因此外泌体中SPIO纳米颗粒的负载效率似乎有限。 在所综述的29篇论文中，8篇论文报道了通过与探针共价结合来标记外泌体。共价结合最常用的标记方式是放射性同位素标记（八分之五）（表4）。荧光染料（八个中的三个）也用于共价结合。共价结合的优点是由无共价键的探针的自发释放引起的假阳性信号的低风险。然而，需要仔细分析，因为通过探针共价结合修饰表面蛋白可能会改变外泌体与其靶组织或细胞的相互作用。 最广泛使用的标记方法是亲脂性荧光染料的膜整合（图2，左）。评价的研究中有50%使用了亲脂性荧光染料的膜整合策略（表4）。对于膜整合，荧光探针的选择压倒性地超过其他方法（图2，右）。DiR是最常用的亲脂性荧光染料（图3）。DiR是具有NIR荧光的二烷基碳菁，其对于体内成像是理想的，因为其具有生物材料的低吸收。FDA批准的NIR染料吲哚菁绿色（ICG）也能够标记外泌体。一个潜在的问题是亲脂性染料在液体中形成胶束的可能性。因此，比较用亲脂性染料标记前后的颗粒数量至关重要。此外，有必要包括含有适量亲脂性染料的适当阴性对照。使用用于具有亲脂性染料的外泌体的相同程序孵育和处理的具有亲脂性染料的缓冲溶液也可以是良好的阴性对照。 图3.用于外泌体生物分布分析的荧光染料。 3.3.2.外泌体的表征 一个意想不到的发现是，许多研究使用了没有表征的外泌体或EV。如前所述，外泌体的QC对于可重复的基础外泌体研究和外泌体治疗剂的开发都是必不可少的。ISEV还在MISEV 2018指南中提出了通过分析特定标志物识别外泌体的最低要求。令人惊讶的是，我们发现大约40%的研究不包括特定标志物的分析（图4）。除了来自微生物或外泌体模拟物的外泌体样囊泡的出版物外，11篇出版物未提供特异性标志物分析的结果（表4）。尽管在某些情况下报告了NTA或电子显微镜分析的结果，但这些结果不足以确认研究中使用的外泌体的身份。更重要的是，特异性标记物的分析对于比较外泌体的性质和分析标记前后的回收率尤为重要。 图4.外泌体或细胞外囊泡（EV）特异性标志物的分析状态。 3.3.3.外泌体分离方法 选择合适的分离方法对于基于外泌体的治疗剂的工业开发是必不可少的。如图5所示，分离外泌体的主要方法是UC。这意味着UC仍然是大多数学术环境中用于分离外泌体的通用方法，尽管该方法对于用于开发治疗剂的外泌体的大规模生产并不理想。SEC仅在一份出版物中报道。在一些研究中，使用商业试剂盒沉淀来分离外泌体。应仔细监测该过程，以确定用于沉淀的添加剂（如PEG）是否对外泌体的标记或生物分布有不良影响。理想地，这些添加剂应该在施用于实验动物之前从最终的外泌体产物中去除。一份出版物报道，使用UC或SEC分离的外泌体的生物分布没有显著差异。 图5.外泌体生物分布文献中外泌体的分离方法。 另一个需要考虑的重要方面是从标记的外泌体中去除过量的未标记探针。在评价的研究中，UC是去除游离探针的最常用方法（图6）。有趣的是，SEC是去除游离探针的第二种最常用的方法。SEC的一个缺点是在分离过程中增加了具有多个级分的样品体积。为了避免这种情况，基于凝胶过滤（GF）原理的方法是常规SEC的可能替代方案。商业GF柱已经可用于通过简单离心去除游离探针，而不会显著增加样品体积。沉淀方法也用于去除游离探针。此外，如果不进一步除去添加剂，则不能排除用于沉淀的添加剂的不利影响的可能性。 图6.从标记的外泌体中去除未标记的探针的方法。 3.3.4.外泌体剂量的确定 用于生物分布分析的外泌体剂量的确定是另一个重要因素。由于外泌体由脂质、蛋白质和核酸组成，因此可以分别从脂质、蛋白质或核酸的总量确定外泌体剂量。也可以从颗粒总数确定外泌体剂量。如图7所示，外泌体剂量测定最常用的参数是总蛋白的量，其次是颗粒的数量。ISEV在MISEV 2018 中建议，在三篇出版物中也报告了蛋白质量和颗粒数量的平行描述。每只动物的总蛋白范围为10 - 500 μg，颗粒数范围为2.8 ×109-约3.8 ×1011个颗粒（表4）。有趣的是，所有出版物都专门报道了使用小鼠进行外泌体生物分布分析。最近，越来越多的证据表明，使用斑马鱼是研究外泌体体内生理学和病理学的一种有前途的新方法。事实上，斑马鱼胚胎的透明性和小尺寸使得活体全身成像分析能够更好地理解生物分布，包括外泌体摄取和命运。 图7.生物分布中外泌体剂量的确定。缩略语：蛋白质，蛋白质总量;数量，颗粒总数; P + N，蛋白质总量与颗粒总数;脂质，脂质总量。 3.3.5.给药途径 对于外泌体分布的体内分析，外泌体的静脉内（IV）注射是主要的（78%）施用途径（图8）。3篇出版物使用腹膜内注射作为替代途径。通过鼻内、飞节、皮下和眶后静脉窦途径给予外泌体很少使用。IV注射后外泌体最常见的蓄积组织报告为肝、肺、脾和肾（表4）。虽然表面蛋白的修饰，如糖基化，可能会影响外泌体的体内分布在一些报告中，更多的动物的额外研究似乎是必要的更准确的分析。据报道，根据外泌体产生细胞，外泌体的生物分布存在差异。需要进一步的研究来确定这些发现的意义。 图8.用于生物分布分析的外泌体的施用途径。 3.4.外泌体生物分布的治疗意义 如上所述，关于外泌体的体内分布的信息提供了预测剂量和潜在副作用的基础。此外，它还提供了线索的具体治疗应用的靶组织。一些研究已经提供了生物分布和治疗效果之间的相关性。 3.4.1.外泌体的天然靶向性 组织嗜性取决于外泌体的表面组成。不同的整联蛋白组成决定了来源于不同肿瘤的外泌体的亲器官性。分泌的蛋白质如Wnt 4和TGF-β1已被鉴定为与外泌体相关。来源于胸腺上皮细胞的Wnt 4相关外泌体在小鼠胸腺中积累，并且通过在原始细胞中过表达Wnt 4进一步增强这种向性，这可能诱导胸腺再生。更有趣的是，据报道，来自Helicobacter pyroli的EV优先在胃中积累并诱导炎症反应。 3.4.2.外泌体的肿瘤归巢 肿瘤归巢外泌体可以用作靶向递送载体。例如，装载有奥拉帕尼的低氧癌症归巢外泌体在异种移植小鼠中表现出肿瘤生长迟缓。有趣的是，已报道来源于MSC的外泌体（MSC-外泌体）表现出与MSC相似的肿瘤归巢特性。据报道，人UC-MSC-外泌体在裸鼠中的小鼠骨肉瘤K7 M2细胞的肿瘤中积累。这些UC-MSC-外泌体通过诱导细胞凋亡以剂量依赖性方式在体外降低人骨肉瘤143 B和小鼠骨肉瘤K7 M2细胞的增殖。MSC-外泌体的肿瘤归巢已成功用于递送治疗性miRNA，以减少患有患者来源的胰腺癌的异种移植小鼠中的肿瘤和小鼠中的同基因乳腺肿瘤。有趣的是，除了肿瘤外泌体的器官向性之外，还报道了肿瘤外泌体对来自不同类型或物种的肿瘤组织的一般性向性。 3.4.3.MSC-外泌体在受损组织中的蓄积 一个有趣的发现是，与正常小鼠中的分布相比，MSC-外泌体优先在甘油诱导的急性肾损伤小鼠的肾脏中积累。已经研究了MSC作为急性或慢性肾脏疾病的基于细胞的疗法的应用。还报道了MSC-外泌体在各种动物模型中对肾脏疾病有效。由于已知MSC通过MSC和靶组织上的受体的相互作用在受损组织中积累，因此MSC-外泌体也很可能由于这些受体相互作用而定位在受损组织中。同样，来自内皮祖细胞的外泌体在缺血性肾脏中蓄积，通过CXCR 4-SDF-1α相互作用预防缺血性损伤。 3.4.4.外泌体工程的组织靶向性 除了天然的细胞靶向能力外，还可以工程化外泌体以靶向特定的组织或细胞。外泌体的PEG化导致源自小鼠缺血心肌中的心球衍生细胞的外泌体的靶向积累。还报道了通过对外泌体表面蛋白进行遗传修饰来靶向递送外泌体：（1）通过狂犬病病毒糖蛋白（RVG）肽或RGD基序进行脑靶向;和（2）通过EGFR特异性纳米抗体或HER 2特异性单链可变片段进行肿瘤靶向。最近，引入了结合CD 63的肽CP 05作为归巢部分的锚，以改变外泌体的生物分布。具有肿瘤特异性的工程化外泌体也可用于递送化疗剂以减少体内肿瘤。事实上，外泌体正在被开发为药物载体，因为它们是天然的递送载体。各种各样的治疗分子可以通过外泌体递送，包括小分子，抗癌药物如紫杉醇和多柔比星，以及溶瘤病毒。 4.结论 来自不同细胞类型的外泌体根据其起源细胞类型具有独特的特征，并且正在迅速发展为治疗剂、药物递送载体和液体活检标记物。来源于MSC的外泌体对于下一代无细胞治疗剂是有吸引力的，因为它们概括了MSC的修复/再生、抗炎和免疫调节能力，并克服了基于细胞的治疗剂的潜在风险和局限性。 分析外泌体的生物分布是确定治疗剂量和预测外泌体潜在副作用的重要步骤。然而，这是非常具有挑战性的，因为它们的尺寸和复杂的性质，其组成的纳米范围。生产的外泌体的QC对于确保可重现的结果也是极其重要的。此外，标记方法和分析模式受到活细胞产生的外泌体的特征的限制。在不久的将来，越来越多的研究和方法和模式的进展有望为高质量的外泌体治疗提供适当的评估解决方案。 关于科桥生物 科桥生物技术（江苏）有限公司，坐落于南京市浦口区南京国家农创中心公共创新平台,是集合多位经验丰富的生物医药行业专家创办的工程化外泌体研发公司，为疾病治疗和医疗美容客户提供更优的技术和产品选择，同时科桥生物也为广大科研机构和企业提供外泌体技术服务，包括外泌体分离提取，质量表征，功能研究，组学研究，工程化改造等。 此外，科桥生物是瑞士TECAN的液体处理工作站、酶标仪、洗板机，瑞明多模态单细胞监测系统、活细胞监测系统、显微操作仪、芯片点样仪的江苏省代理商。 联系我们 电话：025-85752084