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最近甲3型流感肆虐，好多朋友问我今年的流感疫苗怎么选，是接种四价流感还是三价流感？四价的是不是更好一点？听说现在流行的是甲3的细胞株的疫苗是鸡胚株的所以接种了是不是也没用？……我的回答就是有三价就接种三价，没有三价就接种四价。虽然保护效力只有几成，但至少能提供一些保护，就算不幸中招也可以减缓一些流感症状。下面就带大家详细了解一下流感疫苗的几种制备工艺。（参考下图①）      目前国内市场在售的流感疫苗主要三价流感病毒裂解疫苗、三价流感减毒活疫苗、四价流感病毒裂解疫苗、四价流感病毒亚单位疫苗（其实也算是裂解苗）这么几种，其生产基质都是鸡胚，统称为“鸡胚苗” 三价与四价: 流感疫苗根据疫苗所含组分分类，可分为三价流感疫苗和四价流感疫苗，与三价流感疫苗相比，四价流感疫苗组分中增加了乙型流感的一个BY谱系(自2020年4月以来WHO未监测到乙型BY谱系自然流行，现已开始建议取消疫苗中BY谱系的抗原成分，个人预计国内也将会在近两年内取消四价流感）。 裂解与亚单位：裂解苗：通过化学物质裂解流感病毒，去除病毒核酸，保留病毒表面抗原成分（如：血凝素HA和神经氨酸酶NA）和部分内部抗原成分（NP蛋白和M蛋白）。能刺激机体产生较全面的免疫应答，但有一定的不良反应；亚单位疫苗：这里所指亚单位疫苗的在裂解基础上进一步提纯，仅提取病毒表面的关键抗原（如血凝素HA和神经氨酸酶NA），其纯度更高，仅含关键抗原，所以相应的不良反应发生率更低。 减毒疫苗：是指病毒经弱化处理后制备而成，减毒活疫苗采用鼻内喷雾法（免除针刺之痛）。疫苗通过模拟自然感染途径进入机体并在体内复制，刺激机体产生保护性免疫。 下面再聊一下目前正在研发阶段（未上市）的几款新型流感疫苗; “高剂量苗”：所谓的高剂量苗，国外获批应用于免疫力较差的65岁以上老年人接种，传统疫苗组分中血凝素含量为不低于15μg/株/剂；高剂量疫苗为60μg/株/剂。血凝素含量较传统疫苗的4倍；但实际保护效力较传统苗提升效果有限。 “细胞苗（MDCK）”：细胞培养疫苗，简单说就是用哺乳动物细胞（MDCK细胞而非鸡蛋）作为“培养基” 繁殖病毒。进一步来说“细胞苗（MDCK）”可分为细胞裂解苗和细胞亚单位苗。 由于病毒在鸡蛋中繁殖时，表面的血凝素（HA）抗原（疫苗诱导免疫的关键靶点）可能发生鸡蛋适应性突变。简单说，就是病毒为了在鸡蛋里“存活”，会悄悄改变自己的“外貌”，导致疫苗里的病毒株与实际流行的病毒株 “长得不一样”，直接削弱疫苗保护力。而在细胞培养环境更接近人体生理条件，病毒繁殖时相对不易发生抗原突变，能尽可能保证疫苗株与流行株“外貌一致”，从而提升保护效果。此外，鸡蛋培养还存在其他局限：比如需要大量受精鸡蛋，供应易受禽流感等因素影响；生产周期长（约6-8 周），难以应对突发疫情；部分人对鸡蛋蛋白过敏，无法接种等。 细胞苗比鸡胚苗好？ 未必是这样，细胞苗虽解决了鸡胚工艺的周期长、易变异、卵白过敏等因素，但细胞苗的生产同时也引入了DNA残留、宿主蛋白等问题，另外其疫苗的保护率并未见得比鸡胚苗好很多②。拿今年的甲3型流行株来说（下图），抗原性分析93.8%为细胞株的类似株③，可见细胞株匹配性较好，但回到2022年，抗原性分析结果显79.0%为鸡胚株的类似株。由此可见比起生产毒株的变异影响，生产毒株的匹配性更能决定疫苗保护效果的高低。如Seqirus的细胞基质流感疫苗Flucelvax早在2012年就已获批，计划逐步取代鸡胚疫苗成为主流选择，但至今全球普及率仍低于鸡胚疫苗。  “重组苗”：也是细胞苗的一种，基于昆虫细胞来表达的HA 蛋白，是仅具有单一目标抗原的流感疫苗。真正意义上的亚单位。国外最早于2013年获批。传说中的三代苗，已获批疫苗产品中重组血凝素（HA）蛋白含量是标准剂量卵源四价灭活流感疫苗的3倍，但其实其保护效力也并不是很出众（详见下图）。  佐剂苗or复合佐剂苗。       佐剂流感的效力：目前已批的佐剂流感只有CSL Seqirus）的季节性老年流感疫苗 FLUAD，临床试验显示佐剂疫苗接种者的血清保护率和血清转化率均高于未添加佐剂的疫苗接种者。另外佐剂抗体对接种多年后出现的异变株反应的反应性，展示了扩大反应的潜在价值④。虽然佐剂在提升流感疫苗免疫应答能力上具有显著优势，但同时也引发了一些副反应，综合考虑能适用于流感疫苗产品的佐剂并不是很多。目前只有MF59佐剂获批应用到流感疫苗之中。       佐剂的发展：1926年，铝佐剂被发现，直到90年代，铝佐剂一直是唯一被批准用于人用疫苗的佐剂。新型佐剂的组分来源有限；制造工艺复杂且质量控制标准极高；知识产权集中在GSK、CSLLimited、Croda、SEPPIC、Novavax等少数几家 MNC 公司，FDA批准在疫苗中应用的新型佐剂只有6种：      国内新型疫苗佐剂企业均处于研发阶段，代表性企业有瑞科生物、迈科康、湖岸生物、华诺泰、盛科为正等，发展制约因素如下： MPL：2个糖环下的6条碳链的长度不完全固定，是一个多种类似分子的混合体，因此利用沙门氏菌生产的MPL，提纯至佐剂级要求是有难度的；而通过合成技术生产的MPL，效果暂时不太理想。（瑞科、华诺泰等） PIC类佐剂：PolyIC在体内迅速降解，导致活性成分无法有效发挥作用，国外PICLC佐剂毒副作用严重。（湖岸生物、盛科为正、迈科康等） QS21：来源于树皮，树皮成分众多，QS21是第21种成分，且QS21存在AB两种构象，纯化出合格的产品难度大。造价高，不适用于季节性疫苗产品。（瑞科、华诺泰等） 角鲨烯：深海鲨鱼的肝脏中提取，原料来之不易，同时工艺稳定放大也面临巨大挑战。 CpG：存在种属特异性差异、TLR9受体分布的局限性，与疫苗配伍时，需关注CpG序列选择及免疫持久性问题。（华普等） 新型流感疫苗研发企业目录： 序号 企业名称 项目 生产基质 阶段 1 长春百克生物科技股份公司 三价流感病毒裂解疫苗（BK-01佐剂） 鸡胚 获批临床 2 安徽智飞龙科马生物制药有限公司 三价流感病毒裂解疫苗（ZFA02佐剂） 鸡胚 获批临床 3 江苏中慧元通生物科技股份有限公司; 流感病毒亚单位疫苗（佐剂） 鸡胚 获批临床 4 沈阳盛科为正生物有限公司 流感病毒裂解疫苗（佐剂） 鸡胚 临床前 5 武汉所、上海所 流感病毒裂解疫苗（高剂量） 鸡胚 获批临床 辽宁成大 流感病毒裂解疫苗（高剂量） 鸡胚 临床前 金迪克 流感病毒裂解疫苗（高剂量） 鸡胚 临床前 6 武汉所、北京所、上海所、浙江天元、深圳康泰、成都欧林、艾美诚信 四价流感病毒裂解疫苗（MDCK细胞） MDCK 获批临床至I-III期 7 长春所 四价流感病毒亚单位疫苗 MDCK I期 8 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 四价流感重组蛋白疫苗（佐剂） 昆虫细胞 I期 ①Recent advances in the influenza virus vaccine landscape: a comprehensive overview of technologies and trials    Tristan W. Clark,John S. Tregoning Helen Lister Tiziano Poletti, Femy Amin, Jonathan S. Nguyen-Van-Tam  https://doi.org/10.1128/cmr.00025-24②Effectiveness of cell culture-based influenza vaccines compared with egg-based vaccines: What does the literature say? PMCID: PMC9134893PMID: 35298111   doi: 10.37201/req/117.2021 ③中国国家流感中心https://ivdc.chinacdc.cn/cnic/ ④Ansaldi F, Bacilieri S, Durando P, Sticchi L, Valle L, Montomoli E, Icardi G, Gasparini R, Crovari P. Cross-protection by MF59-adjuvanted influenza vaccine: neutralizing and haemagglutination-inhibiting antibody activity against A(H3N2) drifted influenza viruses. Vaccine. 2008. 26:1525–1529

中文摘要 目的   开发抗NF-κB受体激活蛋白配体（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）单克隆抗体（单抗）的纯化工艺。 方法   采用深层过滤澄清上游细胞培养液去除细胞，澄清后的培养液经过亲和层析捕获、低pH病毒灭活、阴离子交换层析、阳离子交换层析、除病毒过滤、超滤浓缩、透析置换、除菌过滤等步骤，获得单抗原液。通过收率和产品相关杂质去除情况评价亲和层析纯化效果，通过监测穿透点计算填料的动态载量（dynamic binding capacity，DBC）；通过考察不同的pH和温度条件对样品的纯度和活性影响，确定低pH病毒灭活条件；通过考察目的蛋白在不同缓冲体系下的稳定性、工艺相关杂质去除情况，确定合适的阴离子交换层析缓冲体系并考察纯化效果和DBC；通过线性洗脱，分段收集考察杂质情况确定阳离子交换层析工艺参数；通过处理量、通量、流量衰减确定病毒滤器的型号；根据浓缩、透析及过滤除菌说明书和平台技术确定滤膜孔径、进液流速和跨膜压力，再根据确定的参数进行浓缩及透析置换；最后经0.2 μm膜除菌过滤获得原液，并检测纯度和杂质。 结果   以MabSelect SuRe为亲和层析填料，DBC 45.3 mg/mL填料，25 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）-盐酸（pH7.5）为平衡液，150 mmol/L醋酸（pH2.8）为洗脱液；pH3.5灭活1 h；以Sepharose QFF为阴离子填料，最大DBC 60 mg/mL填料，50 mmol/L Tris-醋酸（pH7.5）为平衡液；SP HP为阳离子填料，上样量21.9 mg/mL，100%缓冲液A（10 mmol/L柠檬酸，pH5.5）—100%缓冲液B（10 mmol/L柠檬酸+1 mol/L NaCl，pH5.5）线性洗脱20柱体积；以Viresolve Pro为除病毒过滤器；采用PLCTK 30 kDa超滤膜包（C流道）超滤透析浓缩至（40.00±5.00） mg/mL，并以等体积方式10倍体积置换成原液缓冲液后除菌过滤；单抗纯度和杂质含量均符合质量标准。 结论   成功开发出抗RANKL单抗的纯化工艺，产品符合要求。 正文 单克隆抗体（单抗）药物因其高特异性和靶向性，已成为治疗肿瘤、自身免疫性疾病和感染性疾病的重要工具。随着生物技术的快速发展，抗体药物的研发与生产日益受到关注，纯化工艺作为抗体生产的关键环节，直接影响产品的质量、安全性和生产效率。抗NF-κB受体激活蛋白（receptor activator of NF-κB，RANK）配体（RANK ligand，RANKL）单抗通过抑制RANKL与RANK的结合，阻断破骨细胞的活化和分化，在骨质疏松症和骨相关疾病的治疗中临床效果显著。 抗RANKL抗体的复杂结构和功能特性对其纯化工艺提出了更高的要求，如何高效去除宿主细胞蛋白（host cell protein，HCP）、核酸、聚体及病毒等杂质，同时保持抗体的活性和稳定性，是工艺开发中的核心挑战。目前，单抗的纯化通常采用多步层析技术，包括亲和层析、离子交换层析和疏水相互作用层析等。尽管已有多种平台化工艺可供参考，但特定抗体的纯化仍需根据其理化性质和杂质谱进行个性化优化。 本研究旨在开发高效、稳定的抗RANKL单抗纯化工艺，通过系统优化各步骤的关键参数，包括亲和层析填料的选择、低pH灭活条件的确定、离子交换层析缓冲体系的筛选以及除病毒过滤器的性能评估等，最终获得符合质量要求的抗体原液。研究不仅可为抗RANKL抗体的生产提供可靠的技术路线，也可为其他单抗的纯化工艺开发提供借鉴，为抗体药物的工业化生产和临床应用奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 抗RANKL单抗（R抗体）基因由珠海市丽珠单抗生物技术有限公司自主设计并构建，通过基因工程将目的基因转染至中国仓鼠卵巢细胞，经过克隆筛选后获得单克隆细胞培养表达，收取细胞培养液。 三羟甲基氨基甲烷（Tris）、三水醋酸钠、冰醋酸、氢氧化钠、氯化钠均购自美国J.T.Baker公司，均为分析纯；分析纯山梨醇购自德国默克公司；注射级聚山梨酯20购自法国Seppic公司；对照药Prolia（原研药）购自美国Amgen公司。 亲和层析填料MabSelect SuRe〔柱体积（column volume，CV）1.0 mL〕、MabSelect SuRe LX（CV 4.7 mL）均购自美国GE公司，Minichrom Column Eshmuno A（CV 5.0 mL）购自美国Merck公司，Amsphere Protein A Column JWT 203CE（CV 5.0 mL）购自日本JSR Life Sciences公司。阴离子交换层析填料Sepharose Q FF（CV 4.7 mL）和阳离子交换层析填料SP HP（CV 1.0 mL）均购自美国GE公司。 除病毒滤器信息见表1。PLCTK 30 kDa系列超滤膜包（C型流道，复合再生纤维素材质，截留孔径30 kDa），购自美国Millipore公司，货号P3C030C05，面积0.5 m2，上样载量为240~360 g/m2。Sartopore 2系列除菌滤器（聚醚砜材质，孔径0.45 μm+0.2 μm），购自德国赛多利斯公司，货号5445307H7--SS--A，面积500 cm2，上样载量＜206 L/m2。 1.2 亲和层析工艺开发 分别用市场上4款耐碱亲和层析填料（1.1节）进行亲和层析，比较填料的动态载量（dynamic binding capacity，DBC）和纯化效果。 1.2.1　DBC的测定和比较　以相同保留时间（6 min）用4款填料分别上样，设定穿透点（流穿液中目的物浓度达到进样浓度一定比例时）约为5%，计算公式：DBC=（上样蛋白总量－穿透点前流出蛋白总量）/CV。 1.2.2　纯化效果的比较　分别使用不同填料，按70% DBC上样R抗体进行亲和层析，比较纯化效果。考察以下指标：收率=收集液中蛋白总量/上样蛋白总量；产品相关杂质（聚体和降解片段）通过分子排阻色谱-高效液相色谱（size exclusion chromatography-high performance liquid chromato-graphy，SEC-HPLC）、非还原十二烷基硫酸钠毛细管电泳（non-reduced capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate，nrCE-SDS）、成像毛细管等电聚焦电泳（imaged capillary isoelectric focusing，icIEF）检测；工艺相关杂质（HCP、脱落的亲和层析填料配基蛋白质A）通过ELISA检测；宿主DNA通过实时荧光定量PCR检测。 按下面步骤进行层析。用25 mmol/L Tris-盐酸（pH7.5）平衡1个CV；以保留时间6 min上样；依次用25 mmol/L Tris-盐酸、0.5 mol/L磷酸钾（pH6.0）、25 mmol/L Tris-盐酸冲洗，分别平衡3个CV；用150 mmol/L醋酸（pH2.8）洗脱4个CV；用0.1 mol/L NaOH冲洗柱床再生，保留时间15 min；用4个CV的25 mmol/L Tris-盐酸冲洗柱床再平衡。 1.3 低pH病毒灭活条件的确定 将亲和层析收集液分别在pH3.4、3.5、3.6条件下孵育30、60、90 min，检测SEC-HPLC纯度、nrCE-SDS纯度、icIEF酸性峰含量、时间分辨荧光共振能量转移（time-resolved fluorescence resonance energy transfer，TR-FRET）活性等指标，考察对R抗体质量的影响，确定低pH病毒灭活工艺。 1.4 阴离子交换层析工艺开发 以Sepharose Q FF为阴离子交换层析填料，纯化低pH灭活后的R抗体，测定DBC，比较2种平衡液（20 mmol/L 磷酸缓冲液 pH7.0和50 mmol/L Tris-醋酸pH7.5），首先考察蛋白的稳定性，其次考察纯化效果（工艺相关杂质水平）。 1.4.1　样品稳定性比较　用1 mol/L Tris溶液将样品（浓度12.57 mg/mL）pH分别调至与2种平衡液相同，置于室温（25 ℃），将未调pH（pH5.5）样品置于相同条件下作为对照，分别在第1、4、8天考察SEC-HPLC单体、聚体和降解物，nrCE-SDS纯度，icIEF主峰和酸性峰。 1.4.2　纯化效果　按照表2程序进行样品纯化，比较2种缓冲液纯化后样品的收率和工艺相关杂质（HCP、蛋白质A、DNA）水平。 1.4.3　填料DBC的测定　在温度23.2 ℃、浓度4.64 mg/mL样品中加1 mol/L Tris溶液和纯化水调至pH7.5，电导率2.94 mS/cm，用50 mmol/L Tris-醋酸1 mL/min平衡1个CV；1 mL/min上样；用1.0 mol/L NaCl 1 mL/min冲洗3个CV再生；用0.5 mol/L NaCl 1 mL/min冲洗3个CV清洗，完成纯化。过程中取样检测工艺相关杂质去除情况，确定DBC。 1.5 阳离子交换层析工艺开发 使用SP HP填料以线性洗脱方式纯化阴离子层析收集的R抗体。根据平台化经验和产品说明书选用缓冲液A（10 mmol/L柠檬酸，pH5.5）和缓冲液B（10 mmol/L柠檬酸、1 mol/L NaCl，pH5.5），洗脱参数：100%缓冲液A—100%缓冲液B，20 CV；保留时间：4.7 min；进样量：21.9 mg/mL填料。分别收集洗脱峰，检测单体、聚体、降解片段和纯度，考察电荷异质性、HCP、DNA、蛋白质A等，分析产品质量及收率。 1.6 除病毒过滤工艺开发 阳离子纯化收集液蛋白浓度为10.94 mg/mL，使用3款除病毒滤器（每款滤器前对应1款预过滤器）分别进行过滤。设定工艺时长3 h，考察：工艺时间内处理量、通量、流量衰减（与初始滤速相比）等，选择最优的过滤器。 1.7 浓缩/透析和除菌 通过参考膜包说明书、公司平台工艺，确定进液流速为5~6 L/（min·m2），跨膜压力为（0.8±0.3）×105 Pa，其中入口压力（1.2±0.3）×105 Pa，回流端压力（0.5±0.3）×105 Pa。按照确定的参数先浓缩抗体至（40.00±5.00） mg/mL，再以等体积置换方式用10倍料液体积置换成原液缓冲液，最后经0.2 μm膜除菌过滤，获得R抗体原液。 2 结果 2.1 亲和层析 2.1.1　DBC　由表3可见，亲和层析填料MabSelect SuRe LX的DBC最高（57.2 mg/mL填料），其次为Eshmuno A和Amsphere Protein A，MabSelect SuRe的DBC最低。 2.1.2　纯化效果　由表4可见，4种填料纯化收率（低pH灭活前）从高到低顺序为：Amsphere Protein A＞MabSelect SuRe LX ＞Eshmuno A＞MabSelect SuRe。 4种填料纯化后的样品，SEC-HPLC单体含量均在96%以上，nrCE-SDS纯度均在87%以上，纯化效果无明显差异；Amsphere Protein A的HCP残留最高，其他3种填料无明显差异；DNA残留无明显差异，MabSelect SuRe LX和MabSelect SuRe的蛋白质A残留无明显差异。 综合分析，4种填料的纯化效果无明显差异，收率范围都可以接受，而MabSelect SuRe填料采购价格明显更低，即具有性价比优势，最终选择MabSelect SuRe作为本品亲和层析填料。 2.2 低pH病毒灭活 图1的结果显示，pH3.4~3.6条件下，在90 min之内，SEC-HPLC单体含量均在98.5%~100.0%（聚体小于1.5%），nrCE-SDS纯度均在91.3%~92.0%（片段在8.0%~8.7%），icIEF主峰含量均在73%~76%，TR-FRET活性（ELISA）均在105%~112%，无明显差异，即pH3.4~3.6均可作为病毒灭活条件。 2.3 阴离子交换层析 2.3.1　不同缓冲液中样品稳定性　从SEC-HPLC结果（图2）可知：pH值的增加对聚体形成影响不大，pH7.0和pH7.5条件下稳定性优于pH5.5；从nrCE-SDS检测结果（图3）可知：在3种pH条件下R抗体降解差别不大；从icIEF检测结果（图4）可知：放置4.8 d，pH值升高时酸性峰比例虽略有增加，但pH7.0和pH7.5之间无明显差异。 综上，R抗体在20 mmol/L 磷酸缓冲液和50 mmol/L Tris-醋酸缓冲液中稳定性无明显差异。 2.3.2　纯化效果 2.3.2.1　收率　实验1和2的收率分别为93.86%、93.53%，二者无明显差异。 2.3.2.2　工艺相关杂质残留水平　在pH7.5条件下，工艺相关杂质HCP、蛋白质A、DNA残留纯化后与纯化前之比（分别为4.3×10-3、0.065、2.93×10-4）均低于pH7.0条件下（分别为6.4×10-3、0.208、3.69×10-4）。 2.3.3　DBC　综合稳定性和纯化效果，选用50 mmol/L Tris-醋酸作为R抗体项目阴离子交换层析步骤平衡液。因蛋白质A含量较低且在合格范围内，所以不再检测蛋白质A残留。由表5可见，DBC超过69 mg/mL填料后，DNA、HCP残留量开始显著增加，以69 mg/mL填料为该步骤最大上样DBC，为留出安全空间（系数1.15），确定阴离子交换层析最大上样量为60 mg/mL填料。 2.4 阳离子交换层析 如图5所示，根据洗脱峰形将其分为3个组分（从前向后： SP HP 1-1、SP HP 1-2、SP HP 1-3）收集，分别进行检测分析。 由表6可见，SEC-HPLC结果显示，SP HP纯化后聚体减少；聚体和片段都主要分布在洗脱峰末尾；NR CE-SDS检测发现，线性洗脱的3个组分中都有降解（大小为完整抗体的一半），比例依次增加，表明峰尾有较多半抗体。 羧肽酶B酶切前后，主要组分SP HP 1-1的主峰比例高于Prolia；洗脱峰尾的酸、碱性峰比例高，见表7。 工艺相关杂质方面，SP HP纯化后，主峰HCP、蛋白质A都减少，洗脱峰尾HCP、蛋白质A、DNA杂质都较多，见表8。 综上，高分辨率阳离子填料SP HP可用于R抗体的精纯，通过线性盐梯度洗脱和分段切峰收集，可有效去除产品相关杂质（聚体、片段和碱性峰）和工艺相关杂质（HCP、蛋白质A、DNA），最终工艺收集SP HP 1-1段较纯组分收率可达76%。 2.5 除病毒过滤器选型 实际工艺时间约为170 min，由表9可见，在该工艺时间内，Viresolve Pro处理量最大，Virosart HF和SV4的分别为其56.88%和12.33%；Viresolve Pro通量也最大，Virosart HF和SV4的分别为其57.20%和11.25%；Viresolve Pro流量衰减相对较快（14.70%），SV4和Virosart HF基本没有衰减。综合上述技术指标和成本，最终选择Millipore公司的Viresolve Pro作为R抗体项目除病毒过滤器。 2.6 超滤、透析及除菌过滤后原液的结果 按照确定的参数执行工艺操作，在中试规模下，获得了纯度和杂质含量符合企业预定标准的R抗体原液，各项结果见表10。 3 讨论 本研究成功开发了抗RANKL单抗的纯化工艺，涵盖从细胞培养液澄清到最终抗体原液制备的全过程。通过系统优化各工艺步骤，包括亲和层析、低pH病毒灭活、离子交换层析、除病毒过滤和超滤透析等，最终获得了高纯度、高收率且符合质量要求的抗体原液。以下对各工艺步骤的开发结果进行讨论。 亲和层析作为单抗纯化的核心步骤，其填料的DBC和纯化效果直接影响最终产品的质量和收率。蛋白质A亲和层析虽以高选择性和载量成为抗体捕获的首选方法，但其成本较高且可能引入配基脱落等问题。本研究比较了4种蛋白质A亲和层析填料（MabSelect SuRe、MabSelect SuRe LX、Eshmuno A和Amsphere Protein A）的性能。结果表明，MabSelect SuRe LX虽DBC最高（57.2 mg/mL填料），但其纯化后的HCP残留较高；而MabSelect SuRe虽然DBC较低（45.3 mg/mL填料），但纯化效果更优，HCP和DNA残留较低，且产品相关杂质（如聚体和片段）较少。选择MabSelect SuRe作为亲和层析填料，能够在保证产品质量的同时兼顾工艺的经济性。 低pH病毒灭活是单抗纯化工艺中不可或缺的步骤，主要用于灭活脂包膜病毒。本研究考察了不同pH值（3.4~3.6）和孵育时间（30~90 min）对R抗体质量的影响，SEC-HPLC、icIEF和TR-FRET等检测结果表明，低pH处理后的抗体单体含量、电荷异质性和活性均保持稳定。pH3.5、60 min的灭活条件被确定为最佳工艺参数。 阴离子交换层析主要用于去除工艺相关杂质（如HCP、DNA和蛋白质A残留）。本研究比较了2种平衡液的纯化效果，发现50 mmol/L Tris-醋酸在HCP和DNA去除方面表现更优。DBC结果表明，50 mmol/L Tris-醋酸的最大上样载量为60 mg/mL填料，能够有效控制杂质残留。选择50 mmo/L Tris-醋酸作为阴离子交换层析的平衡液，能够在不影响收率的前提下，显著提高纯化效果。 阳离子交换层析作为精纯步骤，主要用于去除产品相关杂质（如聚体、片段和电荷异质体）以及残留的工艺相关杂质。本研究采用SP HP填料进行线性盐梯度洗脱，结果显示，通过分段收集洗脱峰，能够有效去除聚体和酸性峰，同时显著降低HCP和DNA残留。主峰组分的收率达到76%以上，且单体含量高达99.7%，表明SP HP填料在R抗体精纯中具有优异的性能。 除病毒过滤是确保抗体药物安全性的关键步骤。本研究比较了Millipore Viresolve Pro、Sartorius Virosart HF和Pall SV4这3款滤器的性能。结果显示，Viresolve Pro在处理量、通量和流量衰减方面表现最优，能够在170 min内完成1 365 L/m²的过滤量。选择Viresolve Pro作为除病毒过滤器，能够满足大规模生产的需要。 超滤透析用于将抗体浓缩至目标浓度并完成缓冲液置换。本研究参考平台工艺，确定了进液流速5~6 L/（min·m2）和跨膜压力（0.8±0.3）×105 Pa等关键参数。使用Millipore PLCTK 30 kDa超滤膜包，成功将抗体浓缩至（40.00±5.00） mg/mL，并以等体积置换方式完成缓冲液置换，再经过除菌过滤获得原液。 尽管本研究成功开发了抗RANKL单抗的纯化工艺，但在实际生产中仍需进一步优化，如可以探索新型亲和层析填料或混合模式层析技术，以进一步提高纯化效率和产品质量。随着连续生产工艺的发展，未来可以考虑将部分步骤整合为连续操作，以进一步提高生产效率和降低成本。总之，本研究为抗RANKL单抗的纯化工艺开发提供了系统的技术路线和实验依据，为抗体药物的开发提供了参考。 作者 冉永梅1,2  赵永强2  许方岩2  郭春1 1沈阳药科大学制药工程学院，沈阳 110016；2珠海市丽珠单抗生物技术有限公司研发部，珠海 519045 通信作者： 郭春，Email：chunguo@syphu.edu.cn 赵永强，Email：yq_008008@126.com 引用本文：冉永梅, 赵永强, 许方岩, 等. 抗RANKL单克隆抗体纯化工艺的开发 [J]. 国际生物制品学杂志, 2025, 48(5): 301-308.   DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20250211-00011 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观不本站。

一、前言 凝胶剂（Gel）是指原料药与能形成凝胶的辅料制成的具凝胶特性的稠厚液体或半固体制剂。凝胶剂可分为全身用凝胶剂（Transdermal gel）和局部用凝胶剂（Topical gel）两类。按给药途径不同，可以进一步将局部用凝胶剂分为皮肤用凝胶剂、眼用凝胶剂、阴道用凝胶剂、直肠用凝胶剂等。 表12000年至2024年FDA批准的局部皮肤用凝胶剂产品（NDA） 笔者研通过调取FDA网站上发布的新药申请批准情况，收集了从2000年至2024年这25年时间里FDA批准上市（已撤市的产品不纳入统计）的具有专有名称的局部皮肤用凝胶剂产品。各产品的具体信息见表1和表2。从表中可以看出，从2000年至2024年，FDA共批准上市了26款局部皮肤用凝胶剂NDA上市申请，平均每年批准1款。 表22000年至2024年FDA批准的局部皮肤用凝胶剂产品处方组成 二、产品分析 2.1 凝胶基质选择 局部皮肤用凝胶剂的常用辅料有凝胶基质、pH调节剂、保湿剂、防腐剂、稳定剂、助溶剂、增溶剂及透皮吸收促进剂等。其中，凝胶基质的选择在凝胶制剂的处方开发中尤为重要。 在FDA批准的这26款局部皮肤用凝胶剂中，除Zelsuvmi用到了两种凝胶基质（羟丙基纤维素+羧甲基纤维素钠）外，其余25款均只用了一种凝胶基质。而在这25款产品中，共有16款使用了卡波姆（Carbomer）作为凝胶基质，占到总数的64%。其次是丙烯酰胺/丙烯酰基二甲基牛磺酸钠共聚物（3款，12%）、羟丙基纤维素（2款，8%）、羟乙基纤维素（2款，8%），黄原胶（1款，4%）、葵花油（1款，4%）。 2.1.1 卡波姆 卡波姆是凝胶剂中一种常用凝胶基质，常用比例为0.5%-2.0%。卡波姆是丙烯酸的高分子聚合物，结构中含有52%至68%的羧基基团，当使用中和剂（如氢氧化钠、三乙醇胺、氢氧化钾等）中和后其卷曲的分子会因电荷斥力而张开，从而显著增加其黏稠度，形成凝胶。 卡波姆有多种型号，包括卡波姆940、941、974、980、981等。在16款以卡波姆为凝胶基质的产品中，有6款使用了卡波姆980（占比37.5%），其次是卡波姆940（5款，31.25%）。卡波姆941、卡波姆981和卡波姆974等型号均各有一款产品（如上图所示）。 根据交联剂的不同可将卡波姆分为卡波姆均聚物、卡波姆共聚物和卡波姆互聚物。卡波姆940、941、974、980、981都属于卡波姆均聚物，即通过烯丙基蔗糖或季戊四醇烯丙基醚交联得到的丙烯酸聚合物。卡波姆940、941在合成过程中使用了苯作为聚合溶液，而如今药品辅料应用中对苯的使用限制越来越严格，因此这两种型号现在很少使用。卡波姆980、981在合成中使用环己烷和乙酸乙酯制成的共溶剂体系，适合作为外用凝胶制剂的凝胶基质；卡波姆980和981是卡波姆940和941的对应产品，若已在上市老品种中使用了卡波姆940和卡波姆941，则可以分别替换成卡波姆980和卡波姆981。卡波姆974使用乙酸乙酯作为聚合溶液，完全不含苯，是更为安全的一种卡波姆型号，可用于口服以及粘膜接触的制剂处方中。 2.1.2丙烯酰胺/丙烯酰基二甲基牛磺酸钠共聚物 法国Seppic公司开发的Sepineo P600主要由丙烯酰胺/丙烯酸二甲基牛磺酸钠共聚物（acrylamide/sodium acryloyldimethyl taurate copolymer）组成，这种共聚物被分散在异十六烷（isohexadecane）中，并以聚山梨酯80（polysorbate 80）作为稳定剂。在FDA批准的这26款局部皮肤用凝胶剂中，共有3款（见表2）使用到了到了这种凝胶基质。该凝胶基质具有自凝胶化、增稠和乳化油相的能力，适合用于凝胶和油包水乳胶剂（emulgel）的处方中，常用比例为1%-5%。Sepineo P600以液体形式存在，遇水时由于静电排斥作用，带负电的聚合物会瞬间膨胀，形成一个三维网络结构。在较低浓度下，Sepineo P 600就能提供较高的粘度，在广泛的pH范围内（3-12）都能保持稳定，这使其能够适应不同配方的需求，且与多种溶剂（如乙醇、甘油等）相容性良好。 2.1.3其它 羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠均为纤维素衍生物，也常用于外用凝胶剂的制备中，具有良好的生物相容性和安全性，由于型号以及生产厂家众多，因此使用方法及用量还应具体参考的产品说明书。 黄原胶（Xanthan gum）能够在溶液中形成不同形式的螺旋结构，并通过分子间的相互作用（如氢键、疏水作用等）形成复杂的网络结构，这种网络结构是黄原胶作为凝胶基质的基础。黄原胶是一种阴离子聚合物，这意味着它在水中电离后带有负电荷。由于电荷相互作用，黄原胶通常与阳离子表面活性剂、聚合物或防腐剂不兼容，因为它们之间的电荷吸引会导致沉淀现象的发生。黄原胶溶液能在含有高达60%的有机溶剂（如乙醇或异丙醇等）时保持稳定，这意味着黄原胶可以在这些溶剂的混合体系中作为凝胶基质使用。 葵花油（sunflower oil）严格意义上来说并不算是一种凝胶基质，目前它仅在Filsuvez这款产品中作为凝胶基质使用。Filsuvez的活性成分桦木三萜是从桦树皮中得到的提取物，由天然存在的三萜类物质组成，该处方中含有10%的桦木三萜和90%的葵花油。这种桦木三萜提取物可以使油类物质凝胶化，从而可以形成半固体、粘弹性的油凝胶（oleogel），并具有触变性。 2.2 适应症分析 FDA批准的这26款局部皮肤用凝胶剂NDA上市申请中，适应症以寻常痤疮居多，占到总数的一半（即50%）。其次是玫瑰痤疮（11.6%）、足藓（7.7%）、皮肤T细胞淋巴瘤患者的皮肤病变（7.7%）以及其它（23%）。关节炎痛、光化性角化病、热烧伤患者皮肤焦痂的去除、结节性硬化症相关的面部血管纤维瘤、大疱性表皮松解症、传染性软疣等适应症均各有1款产品。 2.3 药物类型分析 在这些局部皮肤用凝胶剂中，药物类型以小分子药物居多，包括贝沙罗汀、克林霉素磷酸酯、壬二酸、甲硝唑、氨苯砜（2款）、特比萘芬、阿达帕林、维A酸、双氯芬酸钠，盐酸萘替芬、盐酸氮芥、酒石酸溴莫尼定、盐酸5-氨基酮戊酸、西罗莫司。此外还包括三款具有特殊结构或组成的药物（anacaulase-bcdb、桦木三萜、贝达西美钠），其中anacaulase-bcdb是一种从菠萝植物的茎中提取的蛋白水解酶混合物，富含多种具有生物活性的蛋白质和糖类，通过无菌过滤和冷冻干燥技术制成；桦木三萜是从桦树的树皮中提取的植物药（botanical drug）, 是一种由五环三萜类化合物组成的混合物；贝达西美钠结构复杂，是一种包含多个硅氧烷和硅酸根的共聚物，这些部分通过特定的比例和方式连接在一起，可以释放一氧化氮从而发挥治疗作用。 这些产品中还包含4种固定剂量组合复方药物，即过氧苯甲酰+克林霉素磷酸酯（3款）、克林霉素磷酸酯+维A酸（2款）、阿达帕林+过氧苯甲酰（2款）、阿达帕林+过氧苯甲酰+克林霉素磷酸酯（1款），均用于治疗寻常痤疮。这些组合通过药物间的协同作用可以更好地发挥治作用。 来源：药事纵横 投稿/内容沟通：华籍美人（Ww_150525） 近期精华文章