CD72

自2000年以来，在进入临床试验并终止的97个ADC中，84%在1期或1/2期就被终止。与大多数药物一样，ADCs开发停止通常是由于缺乏疗效、安全问题、管线策略（例如产品组合优先级）等等。TME造成ADC疗效不佳的原因可能包括扩散不良、对细胞毒性的固有耐药性以及核分裂比例降低。因此，ADC开发也在不断研究新型靶抗原、具有新作用机制的有效载荷、可提供更好治疗指标的linker技术以及新的抗体和载体形式。Nat Rev Drug Discov.1.触发免疫原性细胞死亡：iADCs越来越多的研究在探索ADC的免疫刺激特性。免疫原性细胞死亡(ICD)的诱导可能是ADC与免疫检查点抑制剂联合应用有效的原因。除了ADC中的抗体本身引起的免疫刺激，能够诱导ICD的还包括免疫刺激性抗体结合物( immune-stimulating antibody conjugates,iADCs)。iADCs是将免疫刺激小分子与抗体的靶向能力相结合，目前已经在TLR激动剂靶向HER2+ 实体瘤中得到验证。临床前模型中免疫刺激剂的局部递送可以将抑制的肿瘤驻留APC重新编程为能够处理肿瘤相关抗原（包括新抗原）并将其呈递给T细胞的活化细胞，随后介导抗肿瘤免疫。Carmi等人开创的一种此类策略表明，使用TLR3激动剂或TNFα和CD40L在肿瘤内递送同种异体肿瘤靶向抗体可功能挽救肿瘤相关APC，从而增强抗原摄取并随后诱导抗肿瘤T细胞免疫。这种组合策略利用抗体效应功能与TLR激动作用相结合，根除原发性肿瘤和转移性病变，并保护宿主免受肿瘤复发。同样，激动型OX40抗体与TLR9激动剂CpG联合使用，能激活肿瘤内的APC和T细胞，在临床前小鼠模型中效果极佳。Nat Cancer.2.靶向细胞外抗原：非内化ADC标准ADC依赖有效载荷内化后的释放。旁观者效应，以及有效载荷在肿瘤内扩散的能力，取决于有效载荷物理化学性质和效力。但是这也要求所选择的靶点具有高表达的内化抗原和有效的细胞内作用。因此，目前一种开发的新方向是针对肿瘤微环境中细胞外成分的非内化抗体。在非内化ADC中，有效载荷在与内化不良的抗原或其他肿瘤成分结合时可以从可切割的接头中细胞外释放，作为目前标准ADC释放细胞毒性的替代作用。非内化的方法有几个优点：①不需要溶酶体降解来释放细胞内的有效载荷，因此其linker可以设计为在细胞外肿瘤环境中不稳定。②利用了癌症独特的化学或酶环境，不会在健康组织中裂解，靶向性和安全性良好。③细胞外释放的有效载荷可以扩散到周围的癌细胞中以发挥其细胞毒性作用。这消除了对高抗原表达的依赖，增强其旁观者效应，避免了潜在的低效内化，并且可以极大地扩大癌症靶标的范围到细胞外肿瘤基质的成分。Chem Soc Rev.有研究证实，即使对体内内化程度极差的B细胞抗原靶标CD20、CD21和CD72，采用可裂解的二硫键linker的ADC也是有效的。其他已知可用于非内化ADC的靶标还包括CEACAM5、质膜离子泵NKA等等。对于TME，非内化ADC的思路是靶向细胞外肿瘤微环境的成分或靶向肿瘤基质的丰富结缔组织和血管来间接根除恶性细胞。例如：①靶向细胞外基质中的蛋白质：半乳糖凝集素-3结合蛋白(Gal-3-BP)、富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1(LRG1)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)。②靶向基质或肿瘤中的脉管系统：胶原蛋白、纤维素、纤连蛋白、Tenascin-C。③外源性触发ADC释放有效载荷的因素：“Click-to-release”化学探针、外源性钯、外源性铂等。3.消耗TME中的特定免疫抑制亚群ADC甚至可以用于通用型干细胞移植前清髓。相比目前的全身性非靶向预处理方式，这种预处理可以减少其介导的组织损伤、减少放大和刺激GvHD的可能性。小鼠模型中，靶向造血细胞的抗CD45 ADC可以可以特异性地消耗宿主干细胞和免疫细胞，实现骨髓消融，为同种异体造血干细胞移植提供条件。在MHC不同的同种异体HSCT模型中，移植前CD45-ADC（3mg / kg）结合低剂量TBI（150cGy）和抗CD40配体抗体的短期共刺激阻滞使89%的受者实现了稳定的同种异体植入。但作为单药或以较低剂量与降低强度预处理联合给药时，毒性显著降低。4.改变ADC中抗体部分结构针对ADC中的抗体部分，目前有探索条件激活的ADC(即PDCs)和双异位或双特异性ADC等替代传统单抗的思路，从而试图增强肿瘤特异性和减少对健康组织的毒性。PDC：AbbVie/CytomX的CX-2029具体原理为利用掩蔽肽将抗体的目标结合区域掩盖以限制其在健康组织中被激活而发挥毒性，当在肿瘤组织附近遇到特有的活性蛋白酶时，其底物被切割，从而去除掩蔽肽并被激活，与肿瘤靶标结合后发挥杀伤肿瘤细胞的作用。CX-2029含有MMAE有效载荷，靶向CD71，同款产品CX-2009则是靶向CD166。二者均在治疗实体瘤的临床1/2期阶段，试验编号分别为NCT03543813和NCT03149549。BioAtla的BA3011则被设计为仅在酸性环境下激活，靶向性针对酸性的肿瘤微环境。目前已经进入2期临床(NCT04681131)，治疗NSCLC。双抗体ADC：已有9种双特异性ADC进入临床1期阶段，其中一种已经暂停(MEDI4276)。其中，4种是针对同一靶标上的两个不同的表位的双异位ADC，5种是针对两种不同的肿瘤相关抗原。阿斯利康和百济神州均开发相关管线。其中，阿斯利康的AZD9592是一款靶向EGFR/cMET的ADC产品，利用阿斯利康内部专有的ADC技术研发，以拓扑异构酶-1为载药，靶向奥希替尼耐药的NSCLC。该药于2023年3月在国内申报了IND，于4月在AACR上公布了临床前安全性数据。参考资料：Dumontet, C., Reichert, J.M., Senter, P.D. et al. Antibody–drug conjugates come of age in oncology. Nat Rev Drug Discov (2023). https://doi.org/10.1038/s41573-023-00709-2Ackerman SE, Pearson CI,et al.Immune-stimulating antibody conjugates elicit robust myeloid activation and durable antitumor immunity. Nat Cancer. 2021 Jan;2(1):18-33. doi: 10.1038/s43018-020-00136-x.Ashman N, Bargh JD, Spring DR. Non-internalising antibody-drug conjugates. Chem Soc Rev. 2022 Nov 14;51(22):9182-9202. doi: 10.1039/d2cs00446a.Saha A, Hyzy S,et al. A CD45-targeted antibody-drug conjugate successfully conditions for allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in mice. Blood. 2022 Mar 17;139(11):1743-1759. doi: 10.1182/blood.2021012366.

截至2022年7月，全球总计14款ADC药物（其中FDA批准了12款）获批用于血液系统恶性肿瘤和实体瘤，此外，尚有100多款ADC候选药物处于临床试验的不同阶段。ADC通常需要内化到癌细胞中，以释放其payload，需要具有高表达高内化靶点才能发挥优异的疗效，事实上，目前FDA批准的所有12种ADC都是内化ADC，其中大多数（10/12）含有可裂解的连接体。有7款（7/12）ADC针对非实体肿瘤类型，即血液癌症，包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。 尽管抗乳腺、宫颈和膀胱等实体瘤的ADC已经成功，也需要非内化ADC来扩大癌症靶点范围，尤其是治疗具有致密肿瘤基质的癌症。非内化ADC使得payload可以在内化不良的抗原或其他肿瘤抗原结合时从可裂解linker中释放出来。这不仅可避免ADC药物开发对高表达抗原的依赖，潜在的低效内化导致的疗效不佳，并且可以将癌症靶点的范围大大扩展到细胞外肿瘤基质。这篇综述综述了非内化ADC的最新进展，包括最新的癌症相关细胞表面和细胞外蛋白、癌症基质靶向以及能够释放细胞外有效载荷的连接化学。靶向膜蛋白靶抗原的特征对ADC的成功至关重要，优秀靶抗原应在癌细胞上高度表达，而在健康细胞上不表达，以确保治疗的特异性并避免靶外毒性。抗体-抗原结合相互作用的性质决定了ADC是否发生内化（以及速度）。内化ADC，抗体必须可以诱导快速受体内化、内体运输和溶酶体加工。相反，对于非内化ADC，由于抗原抗体结合后不需要高效内化也能产生较好的疗效。随着人们对非内化ADC的兴趣越来越大，越来越多的不被内化的抗原被发现。B细胞抗原CD20、CD21和CD72Polson等人研究了CD20、CD21和CD72等非内化ADC靶点。在该工作中，使用二硫键、Val-Cit二肽、不可裂解的linker合成了多种ADC（图。研究发现，可裂解的二硫键ADC在体内即使内化非常差的抗原靶点CD20、CD21和CD72也能产生疗效。据推测，二硫键接头可以在细胞外裂解，并通过非内化机制起作用。此外，在这项工作中，包含Val-Cit连接子的抗CD21 ADC的MMAE有效载荷被MMAF替代，MMAF是一种含有带电羧酸末端的类似物（图4C），这阻碍了其发挥旁观者效应。这一变化使得以MMAF为payload的非内化ADC无活性，表明释放的有效载荷在细胞膜上的扩散对活性至关重要，该实验表明Val-Cit连接子可在细胞外释放的作用机制。  显然，这一数据与经典观点相矛盾（二硫键和Val-Cit可裂解接头需要内化以释放有效载荷），因此二硫键、VC linker可在TME胞外裂解，释放payload，从而发挥药效。DiJoseph等人的研究证明CD20是有效非内化靶点。通过酸不稳定（腙键）或酸稳定（酰胺）接头将卡利霉素与抗CD20抗体利妥昔单抗偶联。酸可裂解ADC对小鼠B细胞淋巴瘤能有效抑制，而酸稳定ADC（药效与未偶联的利妥昔单抗类似）效果明显不如酸可裂解的ADC，这表明酸介导的连接体裂解的重要性，并意味ADC内化效率较低（否则内化后两种ADC在胞内二硫键均会断裂释放卡利霉素，两者药效可能不会有显著差异）。通过与内化抗原CD22的类似ADC的比较来验证。在这种情况下，酸不稳定ADC与不可裂解ADC的药效相似。因此，由于肿瘤细胞的相对酸性（pH 5.5–7.0）细胞外环境，酸性不稳定的ADC预计可在胞外裂解。PD-L1PD-L1抗体有效率受肿瘤异质性及致密肿瘤基质的不良渗透的限制。因此，开发非内化PD-L1 ADC具有吸引力，因为细胞外有效载荷释放可以克服这些问题。然而，对PD-L1的性质及其内在作用知之甚少。例如，Hung等人构建了几种特异性识别PD-L1糖基化位点的PD-L1抗体。在评估的10种抗体中，只有识别N192和N200糖基化位点的抗体被内化。这表明抗体-抗原结合相互作用的性质是决定其作用机制和是否诱导内化的关键。对于任何ADC的设计，都应仔细考虑这一点。利用FDA批准的avelumab单抗的ADC以前被证明能内化, Boerman等人通过对抗人PD-L1抗体的放射性标记研究表明只能缓慢内化，其在PD-L1 阳性的MDAMB-231孵育24h后仅有25%被内化。，Xiao et al等人发现，avelumab-Val-Cit-MMAE ADC在体外对PD-L1阳性细胞系无效，其IC50与avelumab相似。这是因为ADC缺乏内化（这可能是溶酶体二肽裂解所必需的） 。流式细胞术分析显示，孵育2h后，在MC-38、SK-MES和MDA-MB-231细胞系中仅有约20%的avelumab内化，但在MDA-MB231细胞系中约有40% atezolizumab内化。鉴于avelumab缀合物的有限内化，avelumab可能更适合于开发抗PD-L1非内化ADC。尽管在先前的研究中，观察到可裂解的Val-Cit连接子在细胞外裂解，但在本研究中，可能是因为在细胞外Val-Cit连接子裂解水平不够，因此仍需要内化。胞外蛋白酶或其他连裂解接触因素因细胞系、肿瘤类型以及临床前小鼠模型和人而异。CEACAM5癌胚抗原细胞粘附分子5（CEACAM5）是许多种类型癌症的生物标志物，通常不会显著内化。靶向该抗原已在临床前肿瘤模型中得到成功验证，利用pH敏感的碳酸盐或酯连接体与中间体在细胞外酸性肿瘤微环境中ADC释放SN-38。22–24Goldenberg等人研究了抗CEACAM5 labetuzumab ADC，ADC含有酸不稳定的碳酸盐或酯、另外也具有蛋白酶可裂解的苯丙氨酸赖氨酸（Phe-Lys）（图6）。酸不稳定接头具有中等稳定性，在人血清中的半衰期为10-65小时。令人欣慰的是，尽管CEACAM5内化不良，但24个ADC在靶CEACAM4阳性淋巴瘤肿瘤模型种具有良好的效果，其中携带双可裂解连接子CL2的ADC的体内表现最佳。作者提出了SN-38从ADC细胞外缓慢释放的非内化机制，游离药物的局部积累。SN-38与Auristatin或maytansinoid有效载荷相比，具有中等的细胞毒性，碳酸盐/酯键的相对不稳定性被认为适合与SN38一起使用，这允许药物较易释放而不会产生明显的靶向毒性。高度内化抗原Trop-2，用高度稳定的连接取代CL2A连接显著降低效率，表明从CL2A接头逐渐释放SN-38有助于效率。26NKANa+/K+-ATP酶（NKA）的非内化ADC。NKA是一种质膜离子泵，对所有细胞的功能至关重要：抑制NKA可导致细胞死亡。与经典的ADC方法不同，没有开发针对NKA的抗体（正常细胞也表达该蛋白），而是利用了与NKA之间的关联性的其他癌症相关蛋白。Dysadherin是一种细胞膜糖蛋白，在许多转移性癌症中过度表达，并与NKA相互作用。将NKA的抑制剂与抗Dysadherin抗体结合，使抗体与dysadherin结合，从而使抑制剂与NKA非常接近。抑制剂与NKA的结合随后通过诱导细胞肿胀和随后的膜破裂导致细胞死亡。这种策略特别有趣，因为其无需可裂解linker，抑制剂在细胞外起作用。  已知与NKA相互作用的靶蛋白包括CD20、CD38、CD147和CD56。令人兴奋的是，ADC剂量低350倍就能达到与游离药物相似的抗肿瘤效果，这验证了靶向方法的优越性。靶向肿瘤微环境依赖靶向膜抗原有几个缺点：很少有癌症均匀地过表达抗原肿瘤可以通过抗原表达的改变获得抗性细胞外基质中的靶蛋白Gal-3-BP半乳糖凝集素-3-结合蛋白（Gal-3-BP）是大多数癌症中大量持续分泌的，这使其成为靶向癌症微环境的ADC的一个有吸引力的靶点。Iacobelli等人开发了一种对Gal-3-BP的凝集素结合域具有特异性的人源化抗体。通过直接与C端半胱氨酸和含硫醇的DM1、DM3或DM4形成二硫键，以“无接头”方式实现药物的偶联。LRG1富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1（LRG1）是一种在许多肿瘤的微环境中丰富的分泌型糖蛋白。LRG1的高表达与不良预后相关，因为它会导致血管功能障碍并阻碍治疗药物通过血流输送.Chudasama等人证实，LRG1在分泌后保持在细胞外，因此可构建非内化ADC，包括通过蛋白酶裂解的Val-Cit接头与magacizumab、MMAE偶联。在体外，由于细胞培养中细胞外组织蛋白酶浓度有限，其最初对LRG1阳性的B16F0细胞无效。尽管无效，但证实了LRG1 ADC的非内化特性。用小剂量顺铂联合治疗（5 mM）后将使组织蛋白酶从濒死细胞中有效释放，以激活其ADC。这种组合方法ADC的IC50为15 pM，表明通过联合使用额外的化疗药物启动连锁反应，随着细胞死亡的增加，ADC的药物释放得到改善。MMP9基质金属蛋白酶（MMPs）是一个蛋白酶家族，在癌症进展中具有多种作用，在乳腺癌中经常上调。尽管抑制MMP是一种有吸引力的抗癌策略，但由于该家族催化域中的序列相似性，已证明很难用小分子选择性靶向家族中的一种MMP，靶向MMP抑制剂通常选择性较低，因剂量限制毒性或临床效率不足而终止。为了改进这些小分子MMP抑制剂，Merritt等人通过将泛MMP抑制剂与高度特异性的MMP9靶向抗体结合，开发了细胞外ADC。靶向基质或肿瘤血管系统许多实体瘤表现出致密的细胞间基质：结缔组织和血管网络，阻碍大分子深入肿瘤。这是ADC治疗实体瘤的障碍。靶向基质屏障后面的肿瘤细胞的一种新兴策略是靶向基质本身。基质中ADC的积累可以使细胞外有效载荷在肿瘤微环境中释放，然后可以扩散到附近的肿瘤细胞中。  由于小分子的扩散大于抗体，活性药物对实体肿瘤的渗透性有望提高。这被称为“肿瘤基质靶向治疗”（CAST）。此外，由于靶抗原表达的异质性，对几种实体肿瘤ADC（结肠、肺、胰腺）的治疗受到限制。肿瘤细胞外基质的成分包括Collagen、Fibrin、tenascin-C和Fibronectin，这些是治疗实体瘤有吸引力的靶点。CollagenCollagen是肿瘤细胞外基质中基质的主要成分。Matsumura及其同事的针对肿瘤微环境设计了一种靶向Collagen-4的ADC，以使SN-38能够在肿瘤微环境中持续释放。SN-38通过酯酶可裂解的酯键与Collagen-4的单抗偶联， DAR为7-8。FibrinFibrin是一种实体肿瘤基质含量较高的纤维蛋白，Matsumura等人开发靶向Fibrin的ADC。与针对Collagen-4的工作类似，他们利用酯键结合SN-38。在这种情况下，分支接头在每个半胱氨酸偶联三个SN-38，得到DAR24的ADC。Fibronectin快速血管生成是大多数浸润肿瘤的特征，但不是健康组织的特征，因此选择性靶向肿瘤血管是可能的。此外，与靶向异质表达的抗原相比，靶向癌症血管系统使肿瘤治疗分布更广泛。Fibronectin是一种与血管生成相关的糖蛋白，是肿瘤血管内皮下细胞外基质的组成部分。由于选择性剪接，存在不同形式的纤维连接蛋白，即EDA和EDB。这些物质在实体肿瘤中大量存在，积聚在新形成的血管周围，健康组织中很少，这使其成为针对新形成的肿瘤血管中的诱人靶点。L19抗体已被确定为纤维连接蛋白EDB结构域的高亲和力抗体，且不内化。F8抗体为了靶向纤维连接蛋白的EDA结构域高亲和力抗体。Tenascin-CTenascin-C是一种存在于实体瘤基质中的丰富蛋白，但不存在于健康组织中。Tenascin-C的A1结构域可以被F16抗体靶向。Val-Cit-MMAE合成了非内化抗tenascin-C ADC。令人印象深刻的是，ADC在两种不同的小鼠异种移植模型疗效达到100%。虽然这表明在肿瘤部位成功释放有效载荷，但IgG ADC在小鼠血浆中不稳定，在瓜氨酸部位观察到裂解，可能是由于小鼠血浆中的羧基酯酶1c（Ces1c），已知其可酶切该部分。因此，尚不清楚有效载荷的释放和由此产生的ADC功效是否是连接子在小鼠血浆不稳定性的结果，还是细胞外肿瘤组织蛋白酶切割的结果。通过外源触发在细胞外释放虽然大多数ADC依赖于内源性触发物来释放有效载荷，例如肿瘤相关酶或不同的pH，但已经开发了一种替代方法，通过该方法，小分子触发物被外源性地引入使ADC发生裂解。外源触发可裂解的非内化ADC，允许有足够的时间使ADC与靶抗原结合，并有足够时间从血液中清除任何未结合的非靶向ADC。随后，施用外源性释放触发器，仅激活作用部位的ADC。与传统的ADC不同，这种方法不依赖于天然生物激活机制的切割，因此，外源激活具有可预测的药物释放速率。Click-to-release肿瘤相关糖蛋白72（TAG72）在多种实体肿瘤的癌细胞表面过表达。Rossin等人证明了其作为非内化ADC靶点的适用性，他们利用生物正交反电子需求Diels-Alder（IEDDA）反应生成非内化抗TAG-72 ADC。Exogenous palladiumBernardes等人开发了一种含双功能硫醚炔丙基氨基甲酸酯接头，允许外源钯激活裂解释放有效载荷。HER2纳米体ADC通过半胱氨酸与连接到阿霉素的硫醚炔丙基氨基甲酸酯接头的生物连接构建。Exogenous platinum非内化抗tenascin C ADC的通过铂外源激活释放有效载荷，Oliveira等人描述了一种基于抗tenascin-C的F16抗体的非内化ADC，利用铂外源激活释放有效载荷。结论目前越来越多的注意力转向了具有细胞外有效载荷释放机制的非内化ADC的开发，目的是改善与经典内化ADCs相关缺陷。非内化ADC是一个令人兴奋的新兴领域，可能有助于克服内化ADCs一些障碍，并有望在未来实现更广泛实体瘤治疗。参考文献：Non-internalising antibody–drug conjugates.DOI: 10.1039/d2cs00446a‍‍