IL-12 x CXCR3 x TGF-β

摘要调节性T细胞（Treg）的过继转移在控制炎症反应方面受到关注，但成人外周血中Treg的回收率和质量是当前方案的主要障碍。脐带血作为Treg来源很有前途，但分离的Treg数量有限。最近提出，用在儿科心脏手术中丢弃的人胸腺作为Treg细胞的新来源，该策略克服了当前Treg来源的主要限制，允许获得大量未分化Treg。我们开发了一种新的GMP方案，从儿童胸腺中获得大量高纯度、具有抑制能力的Treg。在7天的短期培养后，手术结束时获得的thyTreg总量平均达到1,757 x106（从50x106—13,649x106）来自单个胸腺的细胞。用我们的方案获得的thyTreg产品显示出高生存力（平均93.25%；范围83.35%-97.97%）、高纯度（平均92.89%；CD25+FOXP3+细胞范围70.10%-98.41%）、高稳定性以及强抑制能力（抑制75%以上的活化CD4+和CD8+增殖）。我们已获得西班牙药品管理局（AEMPS）批准将thyTreg产品作为细胞疗法使用。我们正在招募患者参加首次人体I/II期临床试验，以评估在接受心脏移植的儿童中使用自体thyTreg的安全性、可行性和有效性(NCT04924491)。通过我们的方案获得的thyTreg产品具有高质量和数量，以及具有差异特征的最终产品可以从单个胸腺制备数百个剂量，这些剂量可以冷冻保存，并可以在另一个人身上使用同种异体。引言免疫系统在对抗病原体和有害物质方面发挥重要作用，但也可能引发移植排斥和自身免疫性疾病。GVHD是造血细胞移植后的主要死亡原因。CRS成为新冠肺炎重症患者的主要死亡原因。标准免疫抑制治疗不能提供明确解决方案且有副作用。促进免疫耐受可减少有害免疫反应且不损害免疫系统功能完整性。Treg是研究最多、最有前途的替代品，可抑制多种细胞的效应子功能，在预防免疫系统过度激活方面具有关键作用，已在成人和儿童移植、GVHD、克罗恩病和其他自身免疫性疾病中得到证实。除了在GVHD中使用脐带血来源的Treg外，所有Treg的临床试验和治疗都采用相同的设计。Treg疗法在临床试验中显示出安全性和潜在疗效，可以减少或预防免疫疾病。然而，实体器官移植中的排斥风险持续存在。许多临床试验使用Treg疗法来防止成年患者的器官移植排斥，但输注的Treg的治疗效果低或短，数量较少且质量可能受到影响。脐带血是一种有前途的Treg细胞来源，但单个脐带血单位中可回收的Treg数量非常低。寻找以未成熟状态为主的Treg替代来源，以获得足够数量的细胞，对于克服外周血和脐带血中的限制至关重要。胸腺是一种负责T和Treg细胞成熟和分化的初级淋巴器官，可以用作高度未分化Treg的新来源。材料和方法胸腺组织采集本研究中使用的胸腺是在Gregorio Marantn医院（HGUGM）小儿心脏外科手术中切除和丢弃的。收集的胸腺组织存放在含有1%抗真菌抗生素（青霉素——链霉素——两性霉素B）的TexMACS GMP培养基（Miltenyi Biotec）的无菌容器中，并在4℃保存直至处理。该研究是在HGUGM伦理委员会批准后根据《赫尔辛基宣言》的原则进行的，并获得了患者法定监护人的知情同意。研究实验室中 ThyTreg 的生产胸腺组织碎片在TexMACS GMP培养基中用gentleMACS解离器机械分解。总胸腺细胞通过40 μm孔过滤，使用人CD25微珠II和LS柱免疫磁性选择CD25+细胞。CD25+和CD25-细胞在TexMACS GMP培养基中以106 cells/ml在37℃和5%CO2下补充600 U/ml IL-2培养。按照制造商的说明，用聚合物纳米基质T Cell TransAct刺激细胞，通过CD3和CD28激活和扩增人类T细胞。在第3天，用新鲜培养基替代一半培养基。在第7天收获细胞，分析表型、功能性和稳定性。干燥的细胞沉淀和培养上清液储存在-80℃，用于DNA甲基化研究和细胞因子定量。细胞生产单元的GMP thyTreg生产规程为了在符合GMP的方案中实施thyTreg分离和培养过程，必须调整一些程序和试剂。制造过程在Gregorio Marantn健康研究所(IISGM)的细胞生产单元(CPU)进行。首先解离胸腺片段，将总胸腺细胞悬浮在补充有0.5%人血清白蛋白（白蛋白20%）的PBS/EDTA中，并倒入转移袋中。使用CliniMACS CD25 GMP微珠、CliniMACS导管组和CliniMACS plus设备分离CD25+ thyTreg。对含有thyTreg的阳性部分进行计数并离心以除去选择缓冲液，并以1x106细胞/ml重悬于TexMACS GMP培养基中。在保持500,000 cells/cm2浓度的烧瓶中培养ThyTreg。7天后进行测试以证明CPU中获得的thyTreg的质量。干细胞沉淀和细胞培养上清液储存在-80℃。在thyTreg细胞的整个制造过程中，进行了无菌分析以确认不存在微生物。通过细胞培养上清液中的生物发光检测支原体，并进行了一系列血液培养，以评估使用自动系统BACTEC检测需氧和厌氧微生物的情况。基因异常的检测通过NIMGenetics的array-CGH 进行。流式细胞术和细胞分选我们通过流式细胞术评估了手术不同阶段的细胞活力和表型。简而言之，细胞表面标记物染色后用Fixable Viability Dye-eFluor 450 染色。然后，使用FOXP3转录因子染色试剂盒固定并透化细胞进行细胞内染色。所有抗体均列于附表2中。使用MACSQuant16细胞计数器对标记细胞进行流式细胞术分析，获得至少100,000个事件，并使用Kaluza软件分析数据。分离出CD4+ 单阳性（SP）和CD4+CD8+ 双阳性thyTreg细胞，50x106 用抗CD4-VioBlue和抗CD8-FITC标记总thyTreg细胞。将细胞洗涤并以5x106细胞/ml重悬于MACSQuant Tyto运行缓冲液中，并用高速MACSQuant Tyto柱进行连续两轮分选。第一轮后，从阳性部分收集CD4+SP细胞。将阴性部分装入第二个盒中，从阳性部分收集CD4+CD8+ DP细胞。体外抑制试验外周血单核细胞（PBMC）取自马德里输血中心健康供体的血沉棕黄层，冷冻保存直至进一步使用。解冻的PBMC在补充有5%血清胎牛血清和60 U/ml IL-2的RPMI 1640（Biochrome）中培养过夜。第二天，PBMC用1 μM的CellTrace Violet染色。1x105 CTVio标记的同种异体PBMC与thyTreg在不同的thyTreg条件下共培养：图 1 / 制造的 thyTreg 的特征。(A)获得thyTreg的分离和培养方案。(B)代表性流式细胞仪点状图，显示了在分离后（第0天）或培养后（第7天）thyTreg的活力、纯度和CD4/CD8表型。(C)在第0天（蓝色）和第7天（橙色）的n=16 thyTreg的细胞活力、纯度和CD4/CD8表型的总结。该图显示了最小值——中值——最大值。**，P<0.01和***，P<0.001（配对Wilcoxon检验）。(D)显示在thyTreg CD4/CD8亚群中CD25（左）和FOXP3（右）表达的代表性流式细胞术直方图。为了确定背景信号，显示了FOXP3的荧光负1（FMO）。(E)发生率之间的相关性CD4+CD8+DP和thyTreg产品的纯度（Pearson 相关分析）。在存在抗CD3/抗CD28包被珠的情况下，在珠上的PBMC比率（1：1、1：2、1：4和1：8）：在圆底96孔培养板中补充有5%血清人AB和600 U/ml IL-2的X-VIVO 15中PBMC比率为0.5：1。在存在或不存在Dynabeads的情况下单独培养的PBMC分别用作阳性 （C+）和阴性（C-）增殖对照。培养3天后，用抗CD4-PC7、抗CD8-FITC和0.5 μ g/ml 7AAD标记细胞，以区分活细胞和死细胞。在MACSQuant16细胞计数器中采集细胞，并使用Kaluza软件进行数据分析。根据“分裂指数法”计算CD4+ 和CD8+ T细胞内的增殖抑制百分比。细胞因子生成分析使用ELLA Protein-Simple免疫测定技术在thyTreg产品的培养上清液中测量不同分泌细胞因子或可溶性蛋白的水平（第7天）。将上清液在室温下解冻并离心以除去细胞碎片。根据制造商对样本进行预处理（在检测TGF-β的情况下）和稀释。然后将样品与必要的质控品一起装入SimplePlex柱中，按照试剂盒说明一式三份进行定量。图表显示每个分子的浓度（pg/ml）；每个点代表重复测量的平均值。每个评估分子的检测限 (LD) 和定量范围为：IL-10, 0.14 (0.46-5530 pg/ml); TGF-β, 5.29 (20.8-12684 pg/ml); Granzyme-B, 0.385 (1.31-5000 pg/ml); LAG-3, 15 (39.6-151050 pg/ml); TIM-3, 0.33 (2.04-7780 pg/ml); IFN-g, 0.05 (0.17-4000 pg/ml); IL-17A, 0.38 (0.82-8490 pg/ml); IL-4, 0.05 (0.319-1290 pg/ml); and PD-L1, 0.741 (3.45-13172 pg/ml). 超过定量限的值显示为定量的最大限。低于 LD 限值的值显示为 0。促炎条件下的稳定性测定将thyTreg细胞产品（第7天）在补充有600 U/ml IL-2的TexMACS GMP培养基中以1 × 106 cells/ml培养，并单独用TransAct或与下列细胞因子一起再刺激：10ng/ml IL-12（极化条件为Th1）；以及10 ng/ml IL-1b、10 ng/ml IL-6、10 ng/mL IL-23和20 ng/mL TNF-α（极化条件为Th17）。所有细胞因子均购自ImmunoTools。PBMC也在相同条件下平行培养。细胞培养3天，在第2天去除多余的TransAct基质。在第3天，将thyTreg和PBMC培养上清液冷冻在-80℃用于细胞因子分析，并如上所述评估thyTreg的细胞活力、表型和抑制能力。剩余的细胞在-80℃下保存为干沉淀，用于TSDR甲基化研究。甲基化分析使用 DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) 从细胞沉淀中分离 DNA。通过EpigenDx Inc进行的靶向下一代亚硫酸氢盐测序（NGS070V3测定）分析了位于包含20个不同基因的29个不同基因组区域中的141个CpG位点的甲基化状态，包括Treg特异性去甲基化区域（TSDR）。统计分析结果表示为平均值±SEM（平均值的标准误差）或最小-中值-最大。使用 Shapiro-Wilk 检验对连续数据进行正态性检验。比较基于非参数数据的非配对 Mann-Whitney U 检验和配对 Wilcoxon 检验。用于评估每个实验的统计测试在相应的图例中指定。通过线性回归和Pearson相关分析计算变量之间的统计关联。p值<0.05被认为具有统计学意义。使用了以下标准来区分显著性水平：*=<0.05、**=<0.01和***=<0.001。结果ThyTreg的分离与表型通过机械解聚从新鲜取出的儿科胸腺中获得的胸腺细胞（n=20；年龄范围0-48个月；表1）表现出高活力（96.33%±0.99%）。其中大多数（76.68%±2.03%）表现出CD4+CD8+双阳性（DP）表型，而12.57%±1.23%为CD4+单阳性（SP）细胞，6.98%±1.26%为CD8+SP细胞。因为已经表明CD4+CD8+DP胸腺Treg细胞对人胸腺中的Treg库有显著贡献，所以我们决定直接分离CD25+ 胸腺细胞（2.36%±0.34%），而不预先消耗CD8+ 细胞。FOXP3+ 细胞在分离的CD25+胸腺细胞上的平均发生率为67.08%±2.22%。通过比较在CD8+ 缺失或不缺失的情况下获得的thyTreg细胞，支持了保存DP thyTreg的益处。在CD8+缺失的情况下，甲状腺激素的产量显著更高，以及DP细胞的比例，同时保持细胞活力和CD8+SP与FOXP3+细胞的百分比。按照这一策略，经过CD25+免疫磁选后，我们每109胸腺细胞获得了6.54 x 106 thyTreg（范围2.44 x 106 - 11.65 x 106）（表1），并具有细胞活力超过85%。因此，估计每克胸腺中的thyTreg数约为9.96 × 106 （范围1.32 x106-21.59 x106），对应于200.3 x 106 胸腺平均重量为20.10克的高纯度thyTreg。ThyTreg培养及产品表征thyTreg分离后，细胞被激活3天，再培养4天，如图1A所示。值得注意的是，培养条件尽可能简单，以保持thyTreg的不成熟性质，避免在Treg扩增过程中通常使用的额外化合物，如雷帕霉素和人AB血清，它们在thyTreg纯度、表型或倍数扩增方面没有优势。使用TransAct代替Dynabeads进行细胞激活也保持了这些细胞特征，以避免与去除Dynabeads相关的细胞损失。第0天和第7天的细胞表型如图1B、C（n=16）所示。第 7 天收获的 thyTreg 细胞表现出非常高的活力 (92.41% ± 1.02%) 和 CD25+FOXP3+ 的纯度 (95.2% ± 0.74%)；与第 0 天相比，这两个参数都更高。在这一短时间培养期间，thyTreg增殖了6.9±1.42倍。考虑到在第0天分离的200.3 × 106 thyTreg和平均倍数扩增，可以从单个胸腺获得的thyTreg的理论数量约为1,500 × 106，在最佳情况下从单个胸腺达到13,649 × 106 thyTreg细胞的产量。我们观察到CD4+SP thyTreg的比例在细胞培养过程中降低，被CD4+CD8+DP thyTreg的比例增加所抵消（图1B，C；底板）。值得注意的是，在第7天，这些CD4+CD8+DP thyTreg呈现出与CD4+SP thyTreg相似的表型，其特征在于CD25和FOXP3的高表达（图1D）。事实上，CD4+CD8+DP thyTreg的比例与CD25+FOXP3+ thyTreg的频率呈正相关（图1E）。表 1 | 加工胸腺和thyTreg获得的特性为了进一步表征thyTreg产品，分析了与Treg表型和功能相关的细胞标记（图2A）。结果表明，thyTreg产品具有高表达的CTLA-4、ICOS、HELIOS和CD27，以及中表达的TIGIT、GITR、LAP、HLA-DR和CD45RA。同时，CD39、CD73和LAG-3表达较低。此外，评估了趋化因子受体CCR4、CXCR3和CD62L的表达（图2B），结果表明thyTreg细胞具有高表达的CCR4和CD62L，这表明它们具有迁移到具有大上皮表面的器官（如皮肤、肠道或肺）的能力，以及有利于在淋巴结中定位的能力。在细胞培养过程中，包括CTLA-4、CD73、ICOS、GITR和LAP在内的几种功能性标记的表达显著增加，而CD39表达下降。此外，CD45RA表达增加，这可能反映了作为胸腺成熟的最后一步发生的从CD45RO到CD45RA的最后转换。关于趋化因子受体的表达，CCR4和CD62L在培养7天后显著增加；而CXCR3表达降低，表明未分化表型。分析了培养上清液中thyTreg分泌分子的分布（图2C），发现IL-10和TGF-β水平较高，以及高水平的抑制分子如颗粒酶B、可溶性LAG-3和可溶性TIM3。检测到低表达的促炎细胞因子如IFN-g、IL-4、IL-17A和PD-L1。体外评估了thyTreg细胞抑制CD4+和CD8+ 刺激的T细胞增殖的能力，发现thyTreg表现出高抑制能力（图2D，E），在thyTreg：应答细胞比例为1：1时，平均抑制率超过80%，在比例为1：4时，平均抑制率超过40%。为了确定thyTreg产物的稳定性，对暴露于Th1或Th17极化细胞因子混合物的thyTreg细胞进行再刺激，观察到表型稳定（图3A，B），不产生IFN-g或IL-17A，并保留抑制功能（图3D）。通过分析TSDR甲基化谱支持这些发现（图3E，F），发现thyTreg细胞中的TSDR去甲基化处于中等水平，培养后去甲基化水平增加，性别间差异是由于女性中一条X染色体的甲基化介导的失活。相反，新鲜分离或培养的胸腺CD25-的TSDR去甲基化约为5%。thyTreg和thyTconv之间的差异甲基化模式不仅在FOXP3基因中观察到，而且在其他8个与Treg相关的基因中观察到。促炎条件下，thyTreg细胞中的TSDR去甲基化状态得以维持（图3G）。图2 | thyTreg细胞产品的表型和功能。（A）thyTreg细胞内表型和功能标记的发生率（第7天）。（B）thyTreg细胞内归巢标记的发生率（第7天）。（C）在第7天的thyTreg培养物上清液中分泌的分子的定量。蓝色的为抗炎分子；红色的为促炎分子。（D）代表性流式细胞术直方图，显示当 CellTrace Violet 丢失时 CD4（绿色）和 CD8 T（紫色）细胞增殖。C-，阴性增殖控制，PBMC单独培养，无刺激；C+，增殖阳性控制，抗CD3/抗CD28刺激单独培养的PBMC；1：1至1：8，在不同的thyTreg下用thyTreg细胞培养的刺激PBMC：PBMC比率。（E）总结thyTreg细胞的抑制能力，定义为在所示比率下对CD4（绿色）和CD8 T（紫色）细胞增殖的抑制百分比。图表显示平均值±SEM。由于我们的thyTreg产品的标志之一是CD25+FOXP3+CD4+CD8+ DP群体的存在，我们决定通过分析TSDR的甲基化状态来评估它们对Treg表型的保证。为此，在thyTreg培养7天后，我们对CD4+SP和CD4+CD8+DP群体进行了分类，并与整个thyTreg细胞产品进行了比较，分析了它们的TSDR去甲基化状态。我们确实证实了具有去甲基化TSDR的CD4+CD8+DP细胞的比例（94.1%）与在CD4+SP或总thyTreg群体中观察到的比例（分别为92.8%和91.6%）相似，证实了FOXP3在该细胞亚群中表达的稳定性。GMP thyTreg为了关注thyTreg细胞可能的治疗用途，在研究水平上进行的所有生产方案都考虑到所用的试剂和设备符合GMP，或者市场上有GMP认证的等效物。为了证实thyTreg细胞在GMP条件下表现出相同的质量和功能，在Gregorio MarahOn健康研究所的细胞生产单元（CPU）生产了四种thyTreg细胞产品（胸腺供体的平均年龄=8.23个月，表1）。 图 3 | thyTreg 细胞产品的稳定性。（A-D，G）thyTreg细胞产品在对照条件（CT，蓝色）下或在Th1（橙色）或Th17（绿色）极化条件下重新刺激，并在培养3天后进行评估。PBMC在相同条件下平行培养。（A）显示FOXP3表达的代表性流式细胞术直方图。为了确定背景信号，显示了FOXP3的荧光负1（FMO）。（B）不同培养条件下thyTreg内FOXP3、CTLA-4、CD39和HLA-DR的发生率。配对Wilcoxon测试显示条件之间没有显著差异。（C）thyTreg 或 PBMC 在不同培养条件下对分泌的 IFN-g 和 IL-17A 进行定量。使用配对Wilcoxon测试进行相同细胞类型内培养条件之间的比较，使用不成对Mann-Whitney测试进行相同条件内thyTreg和PBMC之间的比较（#P<0.05）。（D）总结（n=4）在不同极化条件下培养的thyTreg细胞的抑制能力，定义为在指定比率下CD4（上图）和CD8 T（下图）细胞增殖的抑制百分比。图表显示平均值±SEM。配对Wilcoxon测试显示条件之间没有显著差异。（E）在平行培养7天的n=4个thyTreg细胞产品和n=2个thyTconv中，FOXP3的TSDR区的11个保有CpG的去甲基化水平。ID13和ID14是女性供体。（F）细胞分离后（第0天，蓝色）或培养7天后（第7天，橙色）thyTreg和ThyTconv的总TSDR去甲基化水平（计算为11个CpG去甲基化的平均值）。三角形代表女性供体，圆形代表男性供体。（G) 在不同极化条件下培养的 thyTreg 的全局 TSDR 去甲基化水平。胸腺解离后，用CliniMACS进行CD25+筛选后，thyTreg 细胞的回收率约为5.91 x 106/109标记的胸腺细胞，该值类似于在实验室中使用柱筛选获得的值(6.69 x 106/109标记的胸腺细胞)。培养7天后在CPU中获得的GMP-thyTreg细胞产品显示出与在实验室中获得的thyTreg非常相似的质量（表2）。表2中的结果显示，GMP-thyTreg产品具有高活力和纯度（图4B，C），与实验室thyTreg相当。GMP-thyTreg在培养物中的增殖与在实验室中获得的相似(补充图6A)。GMP-thyTreg细胞产品在CD4方面表现出相似的表型+SP和CD4+ CD8+ DP丰度和其他成熟和功能标记（图4D，E）。值得注意的是，GMP-thyTreg细胞产品中CTLA-4和CD39的表达略低于实验室thyTreg中获得的结果。尽管如此，它们的值仍在实验室thyTreg细胞中观察到的范围内，并与其他研究的值相当。它们还分泌类似模式的调节分子：高水平的IL-10（560.33±137.56 pg/ml）、TGF-β（129±12.1 pg/ml）、颗粒酶B、可溶性LAG-3和可溶性TIM3；和极少量的促炎细胞因子IFN-g、IL-4、IL-17A；和PD-L1（图4F）。据此，GMP-thyTreg细胞保持高抑制能力，抑制CD4+ 和CD8+ T细胞增殖（图4G）。此外，GMP-thyTreg产品在促炎Th1和Th17条件下是稳定的，保持其表型（图4H，I），没有过表达IFN-g（Th1）或IL-17A（Th17），并且其功能保持不变。它们还表现出高百分比的TSDR去甲基化，表明FOXP3表达的稳定性（图4J）。此外，就无污染物和无基因组异常而言，thyTreg细胞符合细胞治疗公开的所有安全标准。总之，根据 GMP 条件对方案进行调整和扩展并进行验证，证明我们正在生产符合人体使用所需规格的 thyTreg 细胞产品。事实上，我们定义为“自体Treg淋巴细胞，取自胸腺组织，用IL-2扩增和刺激（thyTreg）”的治疗产品获得了西班牙医疗机构（AEMPS）的批准，可用于人类细胞治疗。表 2 | 研究方案和 GMP 生产方案之间主要 thyTreg 特征的比较。讨论现有的科学证据表明，通过诱导免疫耐受可克服有害的免疫反应，消除药物免疫抑制的使用，维持有能力的免疫系统。Treg细胞在恢复免疫平衡中发挥重要作用，已在成人中进行许多临床试验，使用从外周血获得的Treg细胞的自体治疗来防止实体器官排斥。但很少有人发表其作为预防移植排斥的疗法的疗效结果。先驱之一是“The ONE Study”，该联盟在成人肾移植受者中施用外周血自体Treg。已发表的结果证明自体Treg给药的可行性和安全性，Treg输注与较低的感染发生率相关。体外扩增外周血Treg的治疗用途存在一系列限制，影响了其有效性。外周血中Treg的发生率低，可从成人中获得的Treg的最大量有限。成人血源性Treg的表型不稳定性、复制潜力和体内存活有限，需要长时间的扩增回合，导致更衰老的表型、抑制能力的显著丧失，甚至Treg转化为效应细胞，可能造成额外的排斥风险。相比之下，儿科Treg细胞质量较高，未成熟表型丰富，适合用于治疗目的的扩展。然而，从外周血中纯化儿科Treg细胞的常规策略无法实现，因为从儿科受试者中抽取的血量较低，回收的Treg细胞的最大量有限。可从脐带血中获取Treg，这些细胞具有未成熟表型的优点，但也限制了可恢复的细胞数量。需要多轮扩增才能获得足够的细胞数量。尽管可用细胞数量有限，但脐带血Treg的潜在功效已通过将其用作同种异体疗法在预防成人GVHD等方面的优异结果得到证明。图 4 | thyTreg 的 GMP 生产。（A）thyTreg GMP 生产的细胞生产单元中使用的程序和设备的示意图。此外，虚线表示在不同阶段执行的质量评估过程的方案。（B-E）n=4 GMP thyTreg的细胞活力（B）、纯度（C）和表型（D，E）的总结。图表显示平均值±SEM。（F）在第7天GMP thyTreg培养物上清液中分泌的分子的定量。蓝色的为抗炎分子；红色的为促炎分子。（G）总结GMP thyTreg细胞的抑制能力，定义为在指定比率下对CD4（绿色）和CD8 T（紫色）细胞增殖的抑制百分比。图表显示平均值±SEM。（H）代表性流式细胞术直方图，显示 GMP thyTreg 细胞产品在对照条件（CT，蓝色）或 Th1（橙色）或 Th17（绿色）极化条件下在再刺激 3 天后评估的 FOXP3 表达的稳定性。为了确定背景信号，显示了FOXP3的荧光负1（FMO）。（I）不同极化条件下GMP thyTreg内FOXP3、CTLA-4、CD39和HLA-DR的发生率。（J）GMP thyTreg细胞产品（n=4男性）的总体TSDR去甲基化水平（计算为11个CpG去甲基化的平均值）。胸腺作为Treg的新来源，可以提供大量稳定、长寿和有效的FOXP3+ Treg。通过符合GMP的分离和扩增方案，胸腺来源的Treg细胞的可行性得到证实。胸腺切除术通常用于清理手术区域，因此丢弃的胸腺可以为治疗性Treg提供极好的来源。采用胸腺作为Treg来源的thyTreg制造方案与其他方案相比具有几个不同之处。首先，采用一步完成的Treg纯化过程，无需事先去除CD8+细胞，保留了CD25+群体即CD4+CD8+双阳性（thyTreg DP），具有Treg的保证。其次，采用新型可溶性纳米基质系统取代其他策略中的激活机制，该系统可以通过离心轻松去除。第三，培养基保持在最低成分，避免使用化合物或人血清。最后，培养时间非常短（7天），允许thyTreg的激活和增殖，但避免可能降低Treg质量的大量扩增。获得的thyTreg产品表现出高纯度和抑制能力，具有稳定的FOXP3表达，其特征在炎症条件下得以维持。此外，从胸腺中分离的Treg可能呈现不同的成熟状态，并且受到部分胸腺选择的影响。然而，大多数FOXP3+胸腺细胞存在于胸腺髓质中，已经过选择。初步数据表明，我们的thyTreg产品可以在符合GMP的方案下冷冻保存，能够保持thyTreg的生存力、表型和功能，这将使冷冻细胞的使用变得可行。免疫稳态失衡和炎症反应可导致严重病理。通过改进方案，我们提高了thyTreg的质量和数量，从单个胸腺制备数百种治疗剂量，可用于自体或同种异体治疗其他疾病，如器官排斥反应、GVHD、自身免疫过程和新冠肺炎。正在探索给予同种异体甲状腺激素是否会保持其治疗抑制作用，而不会被受体的免疫系统识别为外来物并排斥。在thyTreg产品的低免疫原性被完全证明之前，应考虑HLA一致性的重要性，以防止同种异体使用时的排斥反应。正在探索对thyTreg进行基因改造，以增强其有效性和多功能性，例如通过表达嵌合抗原受体 (CAR) 使其具有抗原特异性，并通过消除CAR-thyTreg表面的HLA使其具有通用性。重要的是，我们的thyTreg产品已被西班牙药品管理局（AEMPS）批准作为细胞疗法使用，我们正在招募I/II期临床试验患者，评估自体thyTreg给药预防心脏移植儿童排斥反应的安全性和有效性（NCT04924491）。这是第一次采用Treg疗法来防止移植儿童的排斥反应，也是世界上第一次在人类中使用thyTreg作为从血液中获得的Treg的替代品。本次试验证实了我们策略的可行性和安全性，为该疗法新适应症的开发铺平了道路，这可能会彻底改变不同疾病高发病率的治疗。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

溶瘤病毒开发的困难其实早已是老生常谈，并且也没有谁交出了一份让人惊艳的答卷。不过令人惊讶的是，“中等生”的赛道还蛮拥挤的，五月以来新进入临床阶段的产品不止一个，大部分刚完成首例给药。（1）BioInvent&TransgeneBT-001：设计：基于Copenhagen OVV牛痘病毒毒株，被改造为包含CTLA-4抗体和GM-CSF，通过以引发强大而有效的抗肿瘤反应。该CTLA-4抗体经过筛选，能更优异地消耗Treg的活性。2021年发表在J of ImmunoTherapy of Cancer上题为"Vectorized Treg-depleting αCTLA-4 elicits antigen cross-presentation and CD8 T cell immunity to reject ‘cold’ tumors"的文献验证了这种加强的Treg消耗能力。结果显示，与伊匹木单抗全身性给药相比，VVGM-αCTLA-4的瘤内给药实现了肿瘤限制性CTLA-4受体饱和，以及更强的Treg耗竭效果，这引起了抗原交叉呈递和更强的肿瘤特异性CD8 T细胞的全身性扩增，增加抗肿瘤免疫力。但检查点阻断作用也同样增强。疗效与FcγR介导的瘤内Treg耗竭相关。Journal for ImmunoTherapy of Cancer临床数据：其临床试验安排为1期作为单一药物进行评估，1/2a期展开联合帕博丽珠单抗的疗法。公布的1a期数据包含18例入组患者进行的单药治疗，平均分为三个剂量组。显示无安全问题。11名患者出现病灶稳定，其中10^6pfu剂量组2人、10^7剂量组5人、10^8剂量组4人。此外，共2例患者达到OR，注射病灶大小减少50%及以上。临床前试验检测了其脱靶水平和有效性。不过可以看到，虽然联用的治疗效果突出，但在临床前肿瘤模型中，BT-001单药治疗效果和PD-1抗体单药效果相似甚至稍低。官网TG6050：Transgene还有另一款单独开发的产品TG6050，也在五月份宣布完成首例给药。TG6050则是增强IL-12和全长CTLA-4抗体的表达，通过静脉给药途径治疗NSCLC。（2）Valo Therapeutics：PeptiCRAd-1设计：称之为“肽包被条件复制腺病毒”，即在肿瘤特异性腺病毒上“涂上”源自NY-ESO-1和MAGE-A3蛋白的肿瘤特异性肽疫苗，用于产生针对多种肿瘤抗原的强全身细胞毒性T细胞反应。官网其临床前研究展示了其联合帕博丽珠单抗的全身性抗瘤效果和抗PD-1复发能力，但并未展示单药效果。Mol Ther Oncolytics.（3）KaliVir：VET3-TGIVET3-TGI是基于牛痘病毒增强模板平台(Vaccinia Enhanced Template,VET)，经过修改以最大限度地提高病毒复制能力并增强静脉内递送和传播。VET3-TGI表达CXCR3、IL-12和TGF-β抑制剂，允许其有效地运输到肿瘤，激活抗肿瘤免疫反应并抑制免疫抑制活性。例如，其限制TGF-β1活性从而增强TME中的1型免疫应答。官网今年5月19日在ASGCT2023上的临床前数据表明：在三个临床前体内肿瘤模型中，VET3-TGI与对照病毒进行了比较，并显示出强大的治疗活性，CR达到100%，甚至在远低于同等临床剂量和存在预先存在的抗病毒免疫的情况下改变了TME。VET3-TGI治疗与1型炎症反应的大幅增加有关。1型炎症趋化因子的急剧增加，同时与TGF-β1相关的表达减少。与对照组相比，VET3-TGI在全身给药后显示出更好的肿瘤输送和更低的系统性毒性。对照组没选择标准疗法而是对照病毒，倒是可以突出其病毒改造工程带来的优势。小结还有三四家溶瘤病毒产品并未披露具体的创新细节，没有一一表述。国内亦诺微、复诺健都在这一领域相当活跃。其中例如，亦诺微正在同时推进至少三个溶瘤病毒管线，一款T3011在六月的ASCO公布1/2期数据；一款C5252在四月份获批IND；还有一款T7011也在四月份公布临床前数据。而这三款之中，最新研发的T7011也是最“花里胡哨”的。它被设计为表达CD19和BCMA，同时还携带趋化因子CCL5、PD-1抗体和IL-12基因。这比上述几家国外药企的产品都更为复杂。但是加的越多不代表效果越好。影响TME的细胞因子、趋化因子那么多，如何选择？很多产品还面临着单药数据差、联用毒性大的挑战，一定程度上也限制了应用的范畴，差异化消失。溶瘤病毒的迭代方向还未清晰。参考材料：1.biospace2.Semmrich M, Marchand J, Fend L, et al.Vectorized Treg-depleting αCTLA-4 elicits antigen cross-presentation and CD8+ T cell immunity to reject ‘cold’ tumors.Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2022;10:e003488. doi: 10.1136/jitc-2021-0034883.Ylösmäki E, Ylösmäki L,et al. Characterization of a novel OX40 ligand and CD40 ligand-expressing oncolytic adenovirus used in the PeptiCRAd cancer vaccine platform. Mol Ther Oncolytics. 2021 Feb 10;20:459-469. doi: 10.1016/j.omto.2021.02.006.4.各公司官网近期热门视频更多精彩视频，尽在佰傲谷视频号，欢迎关注~本周好文推荐如需转载请联系佰傲谷并在醒目位置注明出处﹀ 点亮在看，传递信息♥

PITTSBURGH, May 19, 2023 /PRNewswire/ -- KaliVir Immunotherapeutics, Inc., a biotech company developing cutting-edge, multi-mechanistic oncolytic viral immunotherapy programs, today announced the presentation of new data on its lead pre-clinical candidate VET3-TGI at the American Society of Gene & Cell Therapy (ASGCT) 26th Annual Meeting. VET3-TGI is based on KaliVir's unique Vaccinia Enhanced Template (VET™) platform, capable of generating potent novel oncolytic vaccinia viruses with modifications to maximize viral replication and enhance intravenous delivery and spread. Modifications grant VET3-TGI the expression of CXCR3, IL-12 and a TGF-β inhibitor, allowing for efficient trafficking to the tumor, activation of anti-tumor immune responses and the overcoming of local immunosuppressive activity. The functionality and therapeutic activity of VET3-TGI were tested in multiple models, and the mechanism of action and toxicity profile were assessed. VET3-TGI was compared to control virus in three pre-clinical in vivo tumor models, and demonstrated potent therapeutic activity, including 100% complete responses, even at several logs below equivalent clinical doses and in the presence of pre-existing anti-viral immunity. Profound changes in the tumor microenvironment (TME) were observed in VET3-TGI treated mice, including polarization to a type-1 immune response and recruitment of cytotoxic T cells. Analysis of gene expression profiles revealed that VET3-TGI treatment was associated with a dramatic increase in type-1 inflammatory chemokines, and a concomitant decrease in the expression of TGFβ1-associated genes that are involved with immuno-suppression. Compared to control virus-treated mice, VET3-TGI showed improved delivery to tumors following systemic administration, as well as reduced systemic toxicity. "This new in vivo data is very encouraging and is a further validation of VET3-TGI as our lead pre-clinical candidate," said Stephen Thorne, PhD, CSO and co-founder of KaliVir. "These results build upon our already robust in vitro data as we expand into the next phase to develop a human version of the virus for efficacy and toxicology testing." About KaliVir Immunotherapeutics, Inc. KaliVir Immunotherapeutics is a privately held biotech company developing cutting-edge, multi-mechanistic oncolytic viral immunotherapy programs. The company has developed a unique vaccinia virus-based platform, Vaccinia Enhanced Template "VET" Platform, that can generate potent novel oncolytic vaccinia viruses with modifications to maximize viral replication and to enhance intravenous delivery and spread. VET™ platform utilizes the large transgene capacity of the vaccinia virus to deliver therapeutics matched to tumor immunophenotypes to stimulate patients' immune systems and modify the tumor microenvironment. KaliVir's oncolytic virus candidates are designed to be safe, potent and systemically deliverable to treat cancer patients across multiple tumor types. KaliVir has separate collaborations with Roche and Astellas Pharma to design and generate novel oncolytic vaccinia viruses derived from the VET™ platform. In addition, Astellas entered into a world-wide exclusive license to develop and commercialize KaliVir's initial lead clinical candidate VET2-L2 oncolytic vaccinia virus. KaliVir is currently advancing multiple therapeutic candidates toward the clinic. For more information, please visit . Media Contact: Michael Falcone MacDougall Advisors [email protected] 781-591-3448 SOURCE KaliVir Immunotherapeutics