PLP1

耳蜗是听觉系统的第一级声音感受器，其内部的柯蒂氏器官有序排列着三排外毛细胞、一排内毛细胞及不同类型的支持细胞。内毛细胞负责将声波转换为电信号，并传递给螺旋神经节（听神经）。 《Development》杂志在线发表了题为《In situ  regeneration of inner hair cells in the damaged cochlea by temporally regulated coexpression of Atoh1 and Tbx2》的研究论文。该研究由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心（上海脑中心）刘志勇研究组完成。研究团队构建了耳蜗内毛细胞特异性损伤的小鼠模型，并在该模型的基础上把幼年耳蜗支持细胞转分化为新的内毛细胞，从而实现了损伤耳蜗内源性内毛细胞后的原位再生，并对新的内毛细胞进行了全面详细的转录组学，形态学和电生理特性等分析。 耳蜗是听觉系统的第一级声音感受器，其内部的柯蒂氏器官有序排列着三排外毛细胞、一排内毛细胞及不同类型的支持细胞。内毛细胞负责将声波转换为电信号，并传递给螺旋神经节（听神经）。与非哺乳类动物（如鱼类和鸟类）不同，哺乳类动物丧失了再生毛细胞的能力，因此毛细胞一旦损坏将导致不可逆的永久性耳聋。IBCs/IPhs是耳蜗支持细胞的两种亚型，它们与内毛细胞在空间位置上彼此相邻，并且在发育过程中具有相似的细胞起源。因此，IBCs/IPhs是内毛细胞再生的潜在细胞来源和基因操纵靶点(图1A)。本实验室前期通过在新生小鼠耳蜗IBCs/IPhs中条件性地异位过表达Atoh1和Tbx2，在正常（没有损伤）耳蜗内成功地将IBCs/IPhs转分化为vGlut3 新生内毛细胞。但仍有几个关键问题亟待解决：1）在内毛细胞损伤的耳蜗内，能否再生出新的内毛细胞？2）新的内毛细胞与野生型内毛细胞在转录组水平和电生理特性方面的相似度如何？3）新的内毛细胞能否实现听力的恢复或者部分恢复？ 为解决以上科学问题，研究人员首先构建了内毛细胞特异性损伤的小鼠模型Fgf8-DTR/ 小鼠模型。当Fgf8-DTR/ 被注射白喉毒素（DT）后，可以导致97.8%的内毛细胞死亡。为了探究损伤野生型内毛细胞能否增加支持细胞转分化为内毛细胞的效率，研究人员构建了一个能够进行精细调控基因表达的小鼠模型，Plp1-CreER ;Rosa26-Loxp-stop-Loxp-Tbx2-P2A-DHFR*Atoh1*DHFR-T2A-tdTomato/ ;Fgf8-DTR/ (简称Plp1-TAT-DTR)，并分为两组: 1)第一组作为对照组，仅在P2注射DT (图1B-B”和图2A-A’); 2)第二组在P0和P1注射他莫西芬(TMX)﹑P2注射DT，P3和P4注射甲氧苄啶(TMP,用于结合DHFR，从而瞬时稳定Atoh1的表达)，被定义为TMX/DT/TMP实验组(图1C-C”和图2B-B’)。实验结果显示，实验组有477.0±48.0个内毛细胞，远远高于对照组（17.3±4.0）。并且损伤情况下的新生内毛细胞的再生效率（73.5%±2.3%）显著高于未损伤的再生效率（29.5%±1.2%，图1D）。更为重要的是，单细胞转录组分析（图1E）和膜片钳电生理分析（图1F-G）表明新的内毛细胞和野生型的内毛图2.A-B.扫描电镜可观察到在内源内毛细胞损伤的情况下，新生内毛细胞可再生出新的纤毛结构；C-D.透射电镜可观察到新生内毛细胞有囊泡结构的产生；E.但小鼠听力未能得到有效的改善；F-H.电生理技术发现新的内毛细胞不具备机械敏感的MET通道电流。细胞具有高度的相似度（达60%以上），透射电镜可观察到新的内毛细胞囊泡结构的产生（图2C-D’）。本研究首次证明了当内源性内毛细胞受损时，新生IBCs/IPhs中异位表达Atoh1和Tbx2，可以再生出新的内毛细胞，它们在转录组和电生理水平上，与内源性内毛细胞有60%以上的相似度，并且再生效率比没有内源性内毛细胞损伤时有显著提高。 图1：A.内毛细胞损伤再生的示意图；B.内毛细胞损伤小鼠模型可以高效特异的损伤内毛细胞；C.在内毛细胞损伤的情况下，异位表达Atoh1与Tbx2可再生出vGlut3 的新生内毛细胞；D.损伤情况下的再生毛细胞效率显著提高；E.转录组水平上，新生毛细胞与野生型P30内毛细胞聚为一群；F-G.新生内毛细胞的电压依赖的Ca电流与野生型内毛细胞相似。 为了探讨再生出的新生内毛细胞是否具有生物学功能，研究人员通过听觉脑干反应检测并比较了Plp1-Ai9（TMX/TMP，阳性对照组）、Plp1-TAT-DTR（DT，阴性对照组）和Plp1-TAT-DTR（TMX/DT/TMP，实验组）三者之间的听力，结果显示实验组小鼠的听力未能得到恢复（图2E）。为了进一步寻找听力不能恢复的主要原因，研究人员利用电生理技术，发现新的内毛细胞不具备机械敏感电转导通道电流（图2F-H）。该发现解释了新的内毛细胞无法感知外界声音信号，无法恢复听力的原因，从而为未来如何再生出有功能的毛细胞提供了方向。 图2.A-B.扫描电镜可观察到在内源内毛细胞损伤的情况下，新生内毛细胞可再生出新的纤毛结构；C-D.透射电镜可观察到新生内毛细胞有囊泡结构的产生；E.但小鼠听力未能得到有效的改善；F-H.电生理技术发现新的内毛细胞不具备机械敏感的MET通道电流。 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心刘志勇研究员与毕政鸿副研究员为本论文的通讯作者，刘志勇组副研究员李响为本论文的第一作者，博士研究生任旻蕙在生物信息学分析上做了大量工作，博士研究生顾云鹏和研究助理朱彤为本项目做了重要贡献，上海交通大学第九人民医院张宇博士和脑智卓越中心李杰博士共同完成电生理研究内容，脑智卓越中心副研究员李超和王广琴博士也对本项目提供了帮助，上海交通大学第九人民医院宋雷教授对本课题电生理内容给予了重要的指导。中国科学院脑智卓越中心光学平台、电镜平台、分子细胞技术平台和啮齿类实验动物平台提供了重要技术支持。该研究获得了国家自然科学基金委员会、科技部、上海市科委和中国科学院的资助。

PALO ALTO, Calif., Sept. 20, 2022 /PRNewswire/ -- Koji Tanabe of I Peace, Inc. () and a researcher Hiroko Nobuta of the University of California, San Francisco (currently assistant professor at Rutgers University) successfully achieved the direct reprogramming: the direct and rapid transformation of Dermal fibroblasts into Oligodendrocyte precursor cells by inducing four genes into the cells. This research was jointly conducted with Prof. Wernig at Sanford University and Prof. Rowitch at UCSF. The research was published in the online edition of an academic journal "Development" on June 24th. Continue Reading Oligodendrocytes are cells that form myelin around the axons of neurons, which act as insulators surrounding the neurons and accelerate the rate at which electrical signals flow. Abnormalities in oligodendrocytes cause cerebral leukodystrophy. The production of a large number of oligodendrocytes is necessary for understanding its pathology, drug discovery, and transplantation medicine. The conventional method of inducing differentiation of human iPS cells or ES cells into oligodendrocytes is inefficient and requires a long time for differentiation induction. Therefore, it has required high cost for the transplantation medicine and the clarification of the pathology, which hinder the development for early treatment and drug discovery. In addition, transplantation treatment has accompanied with problems such as the possibility of tumor formation due to contamination of undifferentiated cells. In this study, we have successfully transformed dermal cells into oligodendrocyte precursors without undergoing the stem cell state. Surprisingly, oligodendrocyte precursors produced directly from dermal cells finally differentiated into functional oligodendrocytes that wrapped around neurons to form myelin sheaths both in vitro and in vivo mouse brain after transplantation. Furthermore, we successfully reproduced the clinical condition in vitro using oligodendrocyte precursors cells generated from dermal cells of a patient with Pelizaeus-Merzbacher disease (PMD), a type of congenital myelination failure. PMD is a developmental disorder that occurs in children and is caused by an abnormality in the oligodendrocyte specific gene PLP1. It is known that the gene abnormality causes oligodendrocytes to die in the brain during differentiation, which prevents myelination. At present, there is no fundamental treatment for the disease, with only palliative treatment for symptoms such as movement impairment, spastic paralysis, and epilepsy. The direct reprogramming from this study successfully reproduced the pathological condition within a significantly reduced production time, which will surely accelerate drug discovery and development in the future. The oligodendrocyte precursor cells produced in this study have been proven to engraft in the mouse brain after transplantation and wrap around neurons. Therefore, they are expected to be technically applied to transplantation regenerative medicine for other congenital myelination failure disorders and myelinopathy (multiple sclerosis, optic neuromyelitis, etc.) which effective treatments are rare. The link to the article published in the journal Development is as follows: The Rowitch and Wernig labs have declared no financial interest in the company and that the company did not fund the research. Researcher Hiroko Nobuta established a laboratory at Rutgers University in New Jersey in September 2020. She works for drug discovery and regeneration research for myelin diseases using oligodendrocytes created by the direct programming. I Peace, inc. I Peace, inc. globally develops sales of GMP iPS cell and entrusted manufacturing services of medical grade cells. The company was founded in 2015 by Koji Tanabe, a graduate of Professor Shinya Yamanaka's laboratory at Kyoto University and the second author of the paper that reported the successful establishment of the world's first human iPS cell line. Tanabe has been involved in iPS cell research since the early days of its development, and is daily working on innovative technical development to make iPS cells accessible to everyone through I Peace, inc. Our unique technology enables us to produce multiple donor-derived iPS cells in parallel without contamination concerns and to provide a large number of iPS cells at a reasonable price. We support drug discovery and cell medicine development by providing our iPS cell and other cell products as high-quality cell products that meet PMDA and FDA standards to pharmaceutical companies and cell medicine development companies. We are also promoting the production of iPS cells for individuals so that everyone in the world can prepare for the future by possessing his or her own iPS cells. We support pharmaceutical companies and cell medicine development companies so that cell medicine will be within the reach of patients as soon as possible. We aim the soonest prevalence of the regenerative medicine by establishing iPS cell banking services for individuals. I Peace, Inc. Founder・CEO：Koji Tanabe Established：2015 Headquarter：Palo Alto, California, U.S.A. Subsidiary in Japan：I Peace, Ltd., Kyoto iPS cell manufacturing base : Peace Engine Kyoto, Kyoto Website : Media contact：[email protected] SOURCE I Peace, Inc.

摘要：草甘膦是许多商业除草剂中的活性成分，是全球应用最广泛的除草剂。在小麦、水稻、玉米和大豆等作物中使用草甘膦的增加与阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）和其他神经退行性疾病导致的死亡率增加呈正相关。此外，草甘膦暴露会增加血浆中的促炎细胞因子，尤其是TNFα（Tumor necrosis factor α）。草甘膦已被证明可以穿过血脑屏障，但尚未在体内得到验证。异常的TNFα信号传导与许多病理有关，包括癌症、类风湿性关节炎、牛皮癣、多发性硬化症以及免疫、炎症和神经退行性疾病。在健康的大脑中，成年期TNFα的表达较低，而相比之下，成年神经退行性疾病的大脑则表现出非常高水平的TNFα。神经炎症在AD发病机制中起着核心作用，而TNFα与AD的进展密切相关。TNFα死亡结构域通路在AD中逐渐激活并导致细胞变性。鉴于草甘膦暴露与体内TNFα之间的关系，以及TNFα与神经变性之间的联系，必须确定草甘膦暴露导致大脑中TNFα水平变化。2022年7月28日，亚利桑那州立大学研究团队在Journal of Neuroinflammation发表题为“Glyphosate infiltrates the brain and increases pro-inflammatory cytokine TNFα: implications for neurodegenerative disorders”的研究成果（图1）[1]。研究结果表明草甘膦可穿过血脑屏障并渗入大脑，提高TNF-α和可溶性Aβ的表达，并以剂量依赖的方式破坏转录组，可影响AD等神经退行性疾病。图1 研究成果（图源：[1]）此项研究以48只小鼠（雌雄各24只）为研究对象，探究草甘膦是否渗入大脑并提高4个月大C57BL/6J小鼠的TNFα水平。小鼠按性别和剂量分组（每笼3只小鼠）并通过口服管饲法接受125、250或500mg/kg/天的14天草甘膦处理。在给药的最后一天收集小鼠尿液、血浆和脑样本，并通过UPLC-MS和ELISA进行样本分析。原代皮层神经元来源于APP/PS1幼崽淀粉样蛋白生成，以评估Aβ40-42负荷和细胞毒性的体外变化。对C57BL/6J脑样本进行RNA测序以确定转录组的变化（图2）。图2 研究设计（图源：[1]）结果发现：  01草甘膦暴露导致大脑中同时检测到草甘膦及其代谢物  草甘膦暴露剂量对脑草甘膦测量有显著主效应，增加剂量会导致大脑中草甘膦水平升高（P <0.0001）。草甘膦主要代谢物氨基甲基膦酸（Aminomethylphosphonic acid，AMPA）在大脑中有剂量的显著主效应，与对照小鼠相比，250mg/kg和 500mg/kg剂量组在大脑中的AMPA表达更高。脑组织中的草甘膦和AMPA含量之间存在强烈的显著正相关（r=0.9031，P<0.001），尿液和脑组织中草甘膦含量之间存在显著的正相关（r=0.4879，P=0.0182）。这些发现表明，草甘膦暴露会导致大脑中同时检测到草甘膦和AMPA，并且大脑中草甘膦的水平与尿液中检测到的水平相关。 02 草甘膦暴露以剂量依赖性方式增加外周血浆和脑TNFα的水平  草甘膦暴露剂量对脑匀浆、海马匀浆和皮质匀浆的TNFα水平均有显著的主效应，且TNFα水平呈剂量依赖性增加。在大脑中，TNFα的表达与神经毒性和细胞死亡有关，这些结果表明草甘膦暴露会以大脑区域特异性方式增加促炎细胞因子TNFα的水平。 03 脑草甘膦水平与外周血浆和脑TNFα水平相关  脑草甘膦和脑、外周血浆和尿中的TNFα水平均有显著的正相关，尿草甘膦水平与外周TNFα相关，而脑草甘膦水平与外周血浆和脑TNFα水平相关。  04APP/PS1衍生的原代皮层神经元中的草甘膦暴露会增加可溶性淀粉样蛋白β40-42的水平并降低细胞活力  Aβ水平是AD病理学的标志。研究人员从APP/PS1幼崽中分离并铺板原代皮层神经元，并将它们与0µg/mL、10µg/mL、20µg/mL 或40µg/mL草甘膦共培养，并在24小时后从培养板中收集培养基并测量Aβ40-42的可溶性水平。研究发现Aβ40和Aβ42水平和细胞活力均对草甘膦有显著的剂量依赖效应。这些结果表明，当使用源自APP/PS1小鼠的原代皮层神经元进行体外测试时，体内大脑中检测到的草甘膦暴露水平足以以剂量依赖性方式增加Aβ40-42水平并降低细胞活力。 05 草甘膦暴露导致剂量依赖性转录组失调  为了表征草甘膦暴露后转录组的变化，研究人员从小鼠脑中分离RNA，并在Illumina HiSeq 2500上通过100 bp双端测序进行测序。差异表达基因（Differentially expressed genes，DEG）的FDR截止值设置为5%。DEG的初始剂量回归分析显示226个基因以剂量依赖性方式显著失调。为了检查这些基因的功能概况，使用基因本体（Gene Ontology，GO）、Kegg和Reactome数据库进行了通路分析。GO和Reactome分析显示没有功能富集，Kegg分析显示一个通路富集了11个失调基因。随后用于确定基因表达的细胞类型特异性变化的去卷积分析显示少突胶质细胞和GABAergic神经元显著富集。对少突胶质细胞和GABA能神经元进行通路分析，发现少突胶质细胞富集了四个生物学过程：中枢神经系统髓鞘形成、中枢神经系统中的轴突鞘、神经胶质细胞发育和少突胶质细胞发育。这些途径中的DEG包括Abca2、Arhgef10、Cntn2和Plp1，所有这些都以剂量依赖性方式随着草甘膦暴露显著上调。Kegg和Reactome对少突胶质细胞没有显著的结果，并且GABA神经元没有在任何途径中富集。此项研究表明草甘膦能够穿透血脑屏障，渗入脑组织，并且导致促炎细胞因子TNFα水平升高；此外，用体内小鼠大脑中检测到的相似草甘膦剂量剂量处理皮层神经元时，能够增加Aβ40-42水平和降低原代皮层神经元体外细胞活力；大脑中的草甘膦与TNFα水平升高相关，这表明接触这种除草剂可能会引发大脑中的神经炎症，这可能会导致神经退行性疾病中出现的变化；RNAseq发现进一步支持了这一点，该发现显示受TNFα水平升高影响的重要少突胶质细胞过程失调。总的来说，鉴于很大一部分人可能会接触到这种化学物质，这些结果提高了人们对草甘膦接触可能对大脑和人类健康造成的不利影响的认识。草甘膦暴露可能导致AD病理的早期发作或加速进展。这种潜在联系的影响将为玉米和大豆作物的草甘膦施用与AD导致的死亡人数增加之间的相关性提供因果支持。虽然本研究中使用的剂量高于典型的每日人体暴露量，但这些高剂量提供了有关草甘膦在AD中的潜在作用机制的宝贵信息；研究的另一个限制是使用草甘膦作为单一药剂。常见的除草剂含有多种活性成分，此项研究专门针对草甘膦穿过血脑屏障和在大脑中的积累，还需要进一步的研究来探索导致相关后果是否与复杂的配方有关。撰文|文竞择排版|文竞择 End 参考资料：[1]Winstone JK, Pathak KV, Winslow W, et al. Glyphosate infiltrates the brain and increases pro-inflammatory cytokine TNFα: implications for neurodegenerative disorders. J Neuroinflammation. 2022 Jul 28;19(1):193. doi: 10.1186/s12974-022-02544-5. PMID: 35897073; PMCID: PMC9331154. 本文系生物探索原创，欢迎个人转发分享。其他任何媒体、网站如需转载，须在正文前注明来源生物探索。 往期精选 围观 WHO：全球新增新冠病例下降25% 热文 北极暖化比全球快4倍，冰川融化释放致命病毒和细菌？人类是最大的元凶...... 热文 感染新冠病毒两年后，这些疾病风险仍然增加！ 热文 徐开骋口中的“酒后乱性”有无科学依据？酒精：这个锅我不背！ 热文 慢性病高发，原来是饮食不对？每日少吃一克盐，竟可拯救数百万人！ 点击“阅读原文”，了解更多~