CD5 x CD19

导读：表达嵌合抗原受体（CAR）的基因工程免疫细胞已成为癌症免疫治疗的热门。用mRNA编码的CAR武装免疫细胞代表了癌症及其他领域的新前沿。 2023年9月，深圳市人民医院李斌团队在Trends in Biotechnology（IF:14.3）上发表综述《Chimeric antigen receptor therapy meets mRNA technology》，总结了基于mRNA的CAR免疫疗法的最新进展，及开发新一代活体药物方面的机遇和挑战。 周伯平和李斌两位老师是该文章的共同通讯作者。周伯平教授博士就读于中山医科大学（现中山大学），长期从事肝病研究，现任深圳市人民医院龙华分院院长。李斌老师是中国医学科学院&北京协和医学院博士，师从甄永苏院士。现任南方科技大学医学院临床副教授、硕士生导师，主要研究方向为mRNA药物递送、mRNA CAR疗法和mRNA基因编辑技术等。 01 嵌合抗原受体疗法与mRNA技术的碰撞 将CAR引入T细胞被证明是一种高效且特异性的免疫治疗策略。过去三十年里，基于CAR的疗法通过一系列迭代极大地改变了免疫医学的治疗格局。2017年，首个CAR-T细胞产品Tisagenlecleucel（Kymriah）被FDA批准用于急性淋巴细胞白血病，之后的5年里，又有7种针对血液肿瘤的CAR-T疗法获得批准，但其向实体瘤的临床转化仍受渗透性差、肿瘤异质性和免疫抑制微环境的阻碍，为克服上述问题，自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞等其他免疫细胞用于制备CAR分子（CAR-NK、CAR-M）。近年来，CAR疗法已应用于肿瘤学以外的其他免疫相关疾病，如自身免疫、慢性感染、心脏纤维化和衰老等。 图1基于mRNA的CAR技术的关键进展点 mRNA疗法最近成为关注的焦点，除mRNA疫苗外，其还在蛋白质替代疗法、再生医学、癌症免疫疗法和基因编辑领域得到探索。因简单、低成本和可接受的安全性，用编码CAR的mRNA改造免疫细胞为离体和体内快速大规模制造CAR武装细胞提供了一种替代策略，且无插入诱变的风险。截止2023年有超过10种基于mRNA的CAR疗法正进行临床评估。 图2 CAR-mRNA的构建、转移及翻译 02 利用mRNA技术释放免疫细胞的潜力 CAR-T细胞产品的离体制造过程通常包含T细胞分离、活化、T细胞工程、扩增和回输等流程，需数周至数月，治疗价格为35-50万美元/每次。在临床研究中，逆转录病毒和慢病毒载体等由于高转导率常用于将CAR基因体外转移到免疫细胞中，或通过将CAR基因靶向敲入特定位点来永久表达CAR。但由于长期基因表达及不必要的基因组整合风险，安全性问题日渐突出。 表1 制备CAR免疫细胞的病毒和非病毒方法的比较 利用体外转录（IVT）的mRNA编码CAR，经电穿孔或mRNA递送载体对免疫细胞进行编程，代表CAR疗法与mRNA技术的融合。基于mRNA的CAR疗法具下述优势： （1）mRNA在胞质中合成蛋白质，无转基因整合的风险； （2）mRNA可经体外转录，在体内快速合成任何目标蛋白； （3）mRNA工程（mRNA修饰、非翻译区优化和密码子优化等）可有效降低免疫原性、增强稳定性和翻译能力； （4）mRNA电穿孔和mRNA递送载体均可促进mRNA的内化及运输。 当前这些策略为基于mRNA的CAR疗法铺平了道路（图3）。 图3 CAR-mRNA的体外和体内T细胞工程研究 03 通过离体电穿孔生产基于mRNA的CAR细胞 电穿孔长期作为离体CAR-mRNA的转移方法，常通过优化电场、缓冲液等参数实现高性能电穿孔。 3.1 T细胞 最近研究表明，相较于病毒载体产生的CAR-T细胞，用等渗电穿孔缓冲液抑制人原代T细胞的特异性DNA感应通路可显著降低电穿孔诱导的毒性并产生更有效的CAR-T细胞。 3.2 NK细胞 NK细胞含多种激活受体，可通过天然或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性触发癌细胞的自发裂解。与CAR-T细胞疗法类似，CD19是CAR-NK细胞疗法最常见的治疗靶点。早期研究表明，与DNA电穿孔和慢病毒载体转导相比，抗CD19 CAR-mRNA电穿孔可产生高水平CAR＋ NK细胞，且CAR表达及活性可持续数天。 近年来，CD20、自然杀伤细胞2族成员D配体（NKG2DL）和B细胞成熟抗原（BCMA）已被用作电穿孔CAR-NK细胞疗法的目标靶点。对于用抗CD20 CAR-mRNA电穿孔的NK细胞，与组蛋白去乙酰化酶抑制剂联合使用可增强其在小鼠中对利妥昔单抗敏感和耐药的伯基特淋巴瘤的抗肿瘤活性；对于NKG2DL和BCMA，共同递送编码趋化因子受体和编码CAR的mRNA（如趋化因子受体CXCR1 mRNA和抗NKG2DL CAR-mRNA；趋化因子受体CXCR4 mRNA和抗BCMA CAR-mRNA）或两种类型的CAR-mRNA（如抗CD19 CAR-mRNA和抗BMCA CAR-mRNA）在NK细胞上提供一种增强CAR-NK细胞疗效的新策略。 3.3 巨噬细胞 因巨噬细胞可浸润实体瘤组织并克服靶抗原异质性，CAR-M作为针对实体瘤的新型免疫治疗候选者。用INF-β引发抗HER2 CAR-mRNA电穿孔巨噬细胞诱导巨噬细胞向M1表型持续极化，并显著增强CAR表达的持久性，最终导致抗肿瘤功能增强和对免疫抑制因子的抵抗。 04 通过mRNA递送生产CAR细胞 上述电穿孔会导致大量细胞死亡，不适用于放大应用。基于生物材料的mRNA递送载体，如脂质纳米颗粒（LNP）、聚合物纳米颗粒和外泌体被研究用于CAR-mRNA递送载体。 4.1 LNP介导的体外CAR-mRNA递送 LNP是最先进的RNA递送平台，近年来开发出新型LNP将CAR-mRNA体外递送至免疫细胞。2020年，用封装CAR-mRNA的C14-4 LNP处理人原代T细胞，在体外产生与电穿孔法相当的CAR表达及癌症杀伤活性，但细胞毒性显著降低。另一项研究开发9322-O16B LNP和76-O17Se LNP两种制剂，分别将化学修饰CAR-mRNA递送至原代巨噬细胞和CD8＋T淋巴细胞。两种工程细胞均可在体外显著消除B淋巴瘤。证明了使用mRNA-LNP对免疫细胞进行体外工程改造的可行性。 4.2 其他生物材料介导的体外CAR-mRNA递送 电荷改变可释放转运蛋白（CART）和外泌体也可用于构建CAR-mRNA免疫细胞。CART BDK-O7:N7:A13是一种比电穿孔效率更高、细胞毒性更低的寡聚物，可用于递送编码抗人CD19/4-1BB/CD3ζ CAR的mRNA，并有效生成细胞毒性人CAR-NK细胞，而无需预先的细胞活化和改变NK细胞表型。表达抗CD3/CD28单链可变片段（scFvs）的外泌体可递送CAR-mRNA用于生产CAR-T细胞及癌细胞杀伤，证明了用载有mRNA的CART或外泌体改造免疫细胞的可行性。 4.3 生物材料介导的CAR-mRNA体内递送 离体CAR细胞产品的制造成本高且耗时。将编码CAR的mRNA靶向递送至特异性免疫细胞，无需复杂的离体制造过程即可在体内快速生产CAR细胞。为实现主动靶向，可将靶向配体或抗体掺入mRNA纳米载体中，如用抗CD3或抗CD8抗体功能化的聚（β-氨基酯）聚合物纳米载体PBAE-447能将CAR-mRNA靶向递送到淋巴细胞中。 Matthias Stephan等于2017年首次报道了使用靶向T细胞的抗CD3e f（ab′）2片段修饰的基于PBAE-447的DNA纳米载体在体内对T细胞进行编程；2020年该研究组利用抗CD8抗体修饰的类似纳米载体在体内循环T细胞中表达瞬时CAR-mRNA，重复输注纳米制剂诱导肿瘤消退的水平与推注离体工程化CAR-T细胞相似。在一项独立研究中，抗CD5抗体功能化的DLin-MC3-DMA LNP被制备为一种新型抗成纤维细胞活化蛋白（FAP）CAR-mRNA递送平台，单次静脉注射后可在体内瞬时产生抗FAPT细胞，在建立的小鼠高血压心脏损伤和纤维化模型中最终恢复心功能并减少纤维化。总之，这些革命性的体内制造方法有望大幅降低制造成本，并在未来增加CAR疗法的可及性。 05 基于mRNA的CAR疗法的临床转化 由生物材料介导的CAR-mRNA递送在体外和体内产生的数十种基于mRNA的CAR免疫细胞已在临床前阶段证明其疗效，需进一步临床验证保证进一步的临床转化。目前，除两种抗BCMA CAR-T疗法（NCT04146051和NCT03448978）外，所有基于mRNA的CAR临床试验都基于离体电穿孔，仍处于1期阶段。间皮素（MSLN）是迄今为止评估的所有肿瘤适应症中最常见的治疗靶点，其他靶标包括BCMA、CD19和NKG2DL。综上，mRNA工程CAR-T细胞可作为自身免疫性疾病潜在新治疗选择。  表2 2019-2023年间mRNA CAR疗法汇总 06 总结 利用CAR-mRNA工程化免疫细胞能够以无整合风险方式快速、低成本地制造CAR免疫细胞。但用于CAR-mRNA递送的生物材料的开发仍处于早期阶段，且CAR免疫疗法的临床转化研究必须解决以下挑战： （1）与预防性mRNA疫苗相比，CAR疗法需更高mRNA剂量和重复给药才能达到持久的治疗效果。目前正寻求如缓释mRNA递送系统、mRNA序列优化、自扩增和反式扩增RNA及环状RNA等新兴技术，以延长CAR表达的持续时间； （2）对冷链储存的要求及mRNA递送系统有限的递送效率和趋向性； （3）如何开发用于治疗实体瘤和其他难治性自身免疫性疾病的高活性CAR细胞产品。 基于mRNA的CAR疗法虽仍有待解决的问题，但预计CAR和mRNA技术的迭代改进将加快下一代基于mRNA的CAR疗法的开发，以解决肿瘤学之外未满足的医疗需求。 参考文献  [1] Wu J, Wu W, Zhou B, Li B. Chimeric antigen receptor therapy meets mRNA technology. Trends Biotechnol. 2024 Feb;42(2):228-240. doi: 10.1016/j.tibtech.2023.08.005. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

导读：脂质纳米颗粒 （LNP）是当前最先进的非病毒递送载体，已成功应用于商业化的RNA疫苗/药物品种，在临床阶段药物中也广泛使用。 脾脏和淋巴结这类的次级淋巴器官（SLO）在启动适应性免疫中起关键作用。将mRNA特异性递送至淋巴器官的免疫系统，是mRNA免疫疗法的首要步骤，对于癌症、自身免疫性疾病和体内细胞疗法的意义非凡。 本期文章菌菌汇总了淋巴器官靶向LNP的开发进展，包括脾脏靶向LNP、T细胞靶向LNP和淋巴结靶向LNP。 01 脾脏靶向LNP 脾脏的重要性在于其内部存在多种免疫细胞，如T细胞和B细胞，因此是癌症治疗、病毒感染、炎症和自身免疫性疾病的重要靶点。脾脏靶向LNP-mRNA适用于治疗非霍奇金 B 细胞淋巴瘤和其他免疫疾病。 2020年，得克萨斯大学西南医学中心Daniel J. Siegwart团队在Nature Nanotechnol（影响因子38.1）提出了一种选择性器官靶向（SORT） LNP平台。他们在常规的四组分LNP中添加一种 阴离子SORT 分子（如14PA、18BMP、18PA），能够实现mRNA的脾脏靶向递送。 以荧光素酶作为报告基因mRNA开展了小鼠试验，结果显示，当18PA 占比为10-40%时，SORT LNP 选择性地递送至脾脏，在任何其他器官中都没有荧光素酶表达。脾脏特异性 SORT LNP （30% 18PA） 转染了 ~12% 的B 细胞、~10% 的T 细胞和 ~20% 的巨噬细胞。此外，研究人员利用18PA SORT LNP共递送Cas9 mRNA和sgRNA（靶向PTEN）的，实现了脾脏中PTEN的特异性编辑。 随后，他们还评估了SORT LNP转染CD8+ T细胞的能力，并验证了SORT LNP介导的原位 CAR T疗法的有效性。利用脾脏特异性SORT LNP递送CAR mRNA，能够原位产生CAR T细胞，并显著提高侵袭性较低的 B 细胞淋巴瘤小鼠的总体存活率。 图示 掺入阴离子脂质的脾脏靶向SORT LNP Siegwart团队同样尝试利用多尾可电离磷脂 （iPhos）替换辅助脂质，实现mRNA-LNP的脾脏靶向。 他们筛选得到的脾脏选择性 10A1P16-MDOA iPLNPs 转染了 约30% 的巨噬细胞和 6% 的 B 细胞。这一脾脏特异性LNP的脂质组分包括iPhos（10A1P16）与辅助脂质（MDOA、胆固醇和DMG-PEG2000，摩尔比为25:30:30:1。 图示 脾脏靶向的iPLNP平台 使用阴离子替代辅助脂质改变mRNA的趋向性，也是一种脾脏靶向的四组分LNP开发策略。例如，用磷脂酰丝氨酸（PS）代替磷脂酰丝氨酸，能够使肝脏与脾脏的蛋白表达比由8:1变为1:3。 02 T细胞靶向LNP T细胞是脾脏的重要细胞群，是体外细胞疗法的关键靶点。因此，T细胞靶向的LNP开发也是热点研究方向之一，多项研究发表了基于mRNA-LNP的原位CAR T疗法的概念验证试验。 第一种策略为筛选新型LNP配方。宾大团队通过DoE方法，筛选得到一种最佳的B10 LNP制剂，能够在T细胞中诱导CAR表达，且具有较低的细胞毒性和有效的癌细胞杀伤能力。也有研究使用咪唑衍生的LNP作为Cre mRNA的递送载体，在小鼠CD8+ T淋巴细胞中实现了8.2%的基因重组。 第二种策略为抗体偶联LNP（Ab-LNP），这也是诺奖得主Weissman与宾大Mitchell团队目前的主攻方向之一。通过将针对T细胞标志物（CD4、CD3、CD5和CD7等）的抗体偶联至LNP表面，就能够将mRNA特异性递送至T细胞。 通过定制化的CAR mRNA，如肿瘤杀伤分子CD19、心衰标志物成纤维细胞活化蛋白（FAP）等，原位CAR-T平台有望应用于各种疾病的治疗。 图示 抗体偶联LNP(Ab-LNP)靶向递送平台 03 淋巴结靶向LNP 将mRNA递送到淋巴结，对调节免疫细胞治疗疾病具有重要意义。 塔夫茨大学与中山大学孙逸仙纪念医院合作发表了一种淋巴结靶向的LNP（113-O12B）与ALC-0315的肝脏趋向性不同，113-O12B显示出在淋巴结的表达增加。通过113-O12B LNP递送肿瘤抗原mRNA（皮下给药），在肿瘤模型中观察到显著的肿瘤抑制作用。 图示 淋巴结靶向LNP平台 04 总结 本篇文章汇总了淋巴器官靶向LNP的开发进展，包括脾脏靶向LNP、T细胞靶向LNP和淋巴结靶向LNP，这一主题的深入研究有望克服mRNA免疫疗法、mRNA介导的原位CAR-T疗法的开发难题。 mRNA-LNP的肝外递送是目前的研究热点，以充分释放mRNA-LNP的治疗潜力。 参考文献  [1] Song D, Zhao Y, Wang Z, Xu Q. Tuning Lipid Nanoparticles for RNA Delivery to Extrahepatic Organs. Adv Mater. 2024 Sep 5:e2401445. doi: 10.1002/adma.202401445. [2] Cheng Q, Wei T, Farbiak L, Johnson LT, Dilliard SA, Siegwart DJ. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing. Nat Nanotechnol. 2020 Apr;15(4):313-320. doi: 10.1038/s41565-020-0669-6. [3] Liu S, Cheng Q, Wei T, Yu X, Johnson LT, Farbiak L, Siegwart DJ. Membrane-destabilizing ionizable phospholipids for organ-selective mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing. Nat Mater. 2021 May;20(5):701-710. doi: 10.1038/s41563-020-00886-0. [4] Álvarez-Benedicto E, Tian Z, Chatterjee S, Orlando D, Kim M, Guerrero ED, Wang X, Siegwart DJ. Spleen SORT LNP Generated in situ CAR T Cells Extend Survival in a Mouse Model of Lymphoreplete B Cell Lymphoma. Angew Chem Int Ed Engl. 2023 Oct 26;62(44):e202310395. doi: 10.1002/anie.202310395. [5] Chen J, Ye Z, Huang C, Qiu M, Song D, Li Y, Xu Q. Lipid nanoparticle-mediated lymph node-targeting delivery of mRNA cancer vaccine elicits robust CD8+ T cell response. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022 Aug 23;119(34):e2207841119. doi: 10.1073/pnas.2207841119. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

体外制造T细胞策略在制备过程和成本上面临极大挑战，限制了其可及性。为了解决这些问题，近年来研究人员积极探索和开发体内制造CAR-T细胞疗法，已有疗法进入临床阶段。 2024年8月，“柳叶刀发现科学（Lancet Discovery Science）”系列杂志之《eBioMedicine》杂志发布了一篇题为“Advancements and challenges in developing in vivo CAR T cell therapies for cancer treatment”的文章。该文章总结了癌症治疗中体内制造CAR-T细胞疗法的最新进展与挑战。 1 体外CAR-T疗法和 体内CAR-T疗法简介 除了要克服治疗中的主要困难（如CRS和免疫逃逸）外，体外CAR-T疗法在产业化发展和制备工艺方面存在重大挑战。首先，体外制造CAR-T疗法涉及T细胞分离、改造和体外扩增，然后再重新注入人体（图2），其过程耗时且复杂，持续数周。这一较长的周期不利于因癌症快速进展而需要紧急治疗的患者。 此外，这种制造过程还带来了物流和安全挑战，需要将患者的细胞运送至专业的制造设施。它在技术上要求高且成本昂贵。 图2 | 体外CAR-T疗法过程示意图 体内制造CAR-T疗法利用包含基因编辑工具的递送载体，直接在患者体内将T细胞改造成CAR-T细胞（图3）。与体外CAR-T疗法相比，体内CAR-T疗法有望降低生产成本，缩短周转时间，并为患者提供更大的便利。 图3 | 体内CAR-T疗法过程示意图 多种基因编辑系统被用来转导原代T细胞，使之稳定表达CAR。这些包括转座子、锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子效应核酸酶（TALENs）和CRISPR系统。在这四种编辑工具中，转座子、ZFN和CRISPR系统同时适用于体内和体外制造CAR-T细胞。 2 体内制造CAR-T细胞的递送系统及 靶向T细胞递送CAR构建物的进展 体内递送CAR需要满足一定的标准，包括精确的T细胞靶向、高效的基因编辑和低毒性。目前，病毒载体和纳米载体被广泛探索用于体内递送CAR构建物（图4）。 图4 | 体内制造CAR-T细胞的递送载体 用于CAR-T细胞疗法的病毒载体，通常通过瞬时转染源质粒到HEK-293T或生产病毒的细胞系中，将CAR基因克隆到病毒载体来制备。对于体内制造CAR-T细胞，这些病毒载体可以进一步工程化，通过结合T细胞靶向配体来特异性靶向T细胞。 这些配体可以通过基因融合到病毒包膜蛋白上，或通过化学偶联附着在病毒载体上。精确靶向T细胞是影响体内CAR-T疗法效果和安全性的关键因素。使用病毒载体和纳米载体开发靶向T细胞递送CAR策略和体内CAR-T疗法的实验结果列在表1中。 表1 | 体内CAR-T治疗癌症的临床前研究 3 病毒载体 用于体内制造CAR-T细胞的主要病毒类型包括慢病毒、逆转录病毒和腺相关病毒（AAV）。 Pfeiffer等人首次通过注射靶向CD8+ T细胞的慢病毒载体（LV）来递送CD19-CAR，直接在体内制造CAR-T细胞。Michels等人（VivoVec）开发了抗CD3的scFv修饰的LV，用于在体内CD3+ T细胞中构建抗CD19 CAR。 Agarwalla等人开发了一种可植入的多功能支架，该支架能够同时装载患者来源的T细胞和编码CD19的逆转录病毒颗粒，用于体内制造CAR-T细胞，将整个过程缩短至一天。这种支架通过皮下植入后，αCD3和αCD28介导细胞激活，白介素介导增殖，这促进了T细胞的体内激活和扩增。它能够在5天内持续释放功能完全的CAR-T细胞，并在控制肿瘤生长方面达到与体外CAR-T疗法相当的效果，同时在肿瘤清除后细胞扩增更好和更持久。 有研究显示，用T细胞受体-CD3复合物（CD3-LVs）修饰的LV可以特异性识别并转染循环T细胞以产生CAR基因，这成功地将CD19特异性CAR基因递送到人源化NSG小鼠的T细胞中，进而消除CD19+细胞。 另一项研究中，通过用抗CD3抗体改造偶氮（azide）基团修饰的LV，研究人员建立了一个工程化双特异性LV平台。这些LV在体外和体内都实现了靶向T细胞递送CD19-CAR基因。 AAV也被应用于体内制造CAR-T细胞。在人T细胞白血病的小鼠模型中，研究人员利用AAV-DJ，即2型、8型和9型AAV的嵌合体，将编码CD4 CAR基因的质粒递送到T细胞。然而，关键技术挑战是AAV缺乏用于定向递送到目标部位的膜包裹（membrane envelope）。因此，AAV载体的体内基因递送需要精确选择AAV血清型，进行组织特异性递送或用靶向T细胞的构建物修饰AAV衣壳蛋白。 例如，经设计的锚蛋白重复蛋白（designed ankyrin repeat proteins，DARPins）可以插入到AAV2衣壳蛋白中，以特异性靶向小鼠CD8 T细胞，使小鼠脾细胞中CAR基因递送增加了20倍。该团队进一步工程化双特异性DARPins-AAV2以双重靶向CD4和CD32a，促进了T细胞靶向和体内CAR基因产生。 尽管在临床前阶段取得进展，病毒载体因其可能触发免疫反应和引起组织炎症，其安全问题不容忽视。 4 纳米载体 纳米载体也显示出在体内向T细胞递送遗传物质（如mRNA、质粒和蛋白质）以引入CAR构建物的潜力。与病毒载体相比，纳米载体的脱靶毒性和免疫原性极小，并且可以大规模生产。此外，纳米载体可以通过与不同的靶向生物材料结合来定制设计，以提高靶向能力。此外，它们可以通过化学偶联和冻干处理以延长稳定性。 目前，聚合物（polymers）、脂质（lipids）和外泌体（exosomes）是最常用的体内制造CAR T细胞的纳米载体。 阳离子聚合物纳米粒子可以通过静电凝聚（electrostatic condensation）与负电荷核酸形成复合物。复合物表面带正电荷，可通过静电结合到带负电的细胞膜上，以增强细胞摄取。由于这些复合物能够避免酶降解，并通过它们的质子海绵（proton sponge）效应逃避内体（endosomes），因此他们更稳定。 Smith等人开发了用于体内CAR T疗法的聚合物纳米载体，使用靶向CD3的生物可降解、聚（β-氨基酯）基纳米粒子将特异性CAR基因递送到白血病小鼠模型中的T细胞，可使白血病消退且副作用很小。在尾静脉注射后4小时，这些靶向T细胞的聚合物纳米粒子成功将CAR基因转染到循环T细胞中。 这种治疗策略在免疫功能正常的白血病小鼠以及携带实体瘤的免疫缺陷小鼠中都有效。该系统后来也适用于CAR-mRNA和T细胞受体-mRNA递送，在白血病、前列腺癌和乙型肝炎病毒诱导的肝细胞癌的小鼠模型中可有效重新编程T细胞。 然而，这些研究都缺乏对CAR转基因递送的量化评估。此外，阳离子聚合物在宿主中的生物降解性和不稳定性可能会降低CAR生产能力，并可能抵消体内CAR-T疗法的治疗效果。同时，阳离子聚合物的高毒性需要进一步工程化，包括脂质共复合，以减轻毒性并增强功能。 脂质纳米粒子和外泌体也在促进体内T细胞重编程方面显示出潜力。 Zhou等人开发了载有白细胞介素6短发夹RNA（IL-6 shRNA）和CD19-CAR组合基因（AntiCD3-LNP/CAR19 + shIL6）质粒的靶向CD3脂质纳米载体。这些纳米载体选择性地靶向循环T细胞，使白血病小鼠中CAR表达增加和CAR T细胞的抗肿瘤效果延长，持续至给药后41天，与体外T细胞疗法相当。此外，IL6-shRNA的联合降低了CRS的风险。 Fan等人通过用抗CD3和抗表皮生长因子受体(EGFR)抗体修饰的、肿瘤抗原刺激的、树突状细胞衍生的外泌体（tDC-Exo），开发了一个CAR-T平台，允许同时靶向内源性T细胞和癌细胞。然而，外泌体尺寸小，难以有效地包装大型基因编辑工具，如CRISPR/Cas9 RNP。为了解决这一挑战，科学家们探索了各种策略，包括外泌体工程和混合递送系统。 5 体内CAR-T疗法产业化发展 基于病毒载体的体内CAR-T疗法已有产业转化。例如，与前述Umoja Biopharma推出的VivoVec™同期，EXUMA Biotech已开发了一种编码CD19 CAR的LV，用于在人源化NSG-SGM3小鼠模型中靶向和激活CD3+ T细胞。他们的临床前数据显示，体内编辑CD3+ T细胞可产生功能性CAR T细胞，并清除B细胞。此外，该公司开发了针对HER2阳性复发或难治性IV期转移性实体瘤的新治疗策略，目前正在进行I期临床研究。 基于纳米粒子的体内CAR-T疗法的产业转化也有进展。例如，Ensoma开发了一种病毒样颗粒Engenious™平台，可以递送高达35千碱基对的包装DNA基因材料，是AAV载体上限的七倍以上。Capstan Therapeutics利用mRNA-脂质纳米粒子平台，在心脏病小鼠模型中成功制造了体内CD5特异性CAR T细胞。该公司使用靶向CD5离子化脂质纳米粒子（CD5/LNP）包裹针对成纤维细胞激活蛋白的CAR mRNA分子。在LNP注射后48小时，一个新的CAR-T细胞亚群出现了，占总T细胞群的20%。 6 体内CAR-T疗法开发中的挑战 如前所述，体内CAR-T疗法的一个主要问题是如何有效地将CAR转基因递送到体内的目标T细胞中。病毒载体可以促进细胞摄取和核穿透，然而，直接向患者注入携带CAR构建物的病毒载体，其靶向能力有限。此外，这种方法还带来了脱靶效应的风险，其他细胞类型可能被转染。工程化病毒载体有望增强其靶向递送至T细胞的能力。 纳米载体平台相比病毒载体，相关的风险和生产成本较低，似乎更适合于体内靶向T细胞，但还需要额外的研究来提高这些纳米粒子在生物环境中的稳定性和生物相容性，以防止它们在到达并靶向T细胞之前，在体内被降解和产生潜在的不良反应。与纳米载体相关的另一个主要问题是它们有限的转染效率。 在临床环境中使用的脂质纳米粒子从内/溶酶体（endo/lysosomal）室逃逸进入细胞质之前，可能导致遗传物质（如mRNA）在溶酶体中被酶降解。质粒DNA的一个额外障碍是必须将其运输到细胞核中进行转录，然后在细胞质中翻译成蛋白质。为了解决这个问题，研究人员已开发了多种策略，包括使用pH反应性纳米载体和结合触发逃逸机制的成分，如孔形成蛋白或肽。 与体外CAR-T疗法类似，体内CAR-T疗法对于实体瘤的治疗比血液恶性肿瘤更具挑战性。 在临床前研究中使用的动物模型的临床相关性对于成功的治疗开发也至关重要。非人灵长类动物模型将对评估体内CAR T细胞产品的安全性和药代动力学特性至关重要。 7 体内CAR-T疗法的监管考量 与体外CAR-T疗法一样，体内CAR-T疗法若要在临床上复制临床前的成功，在临床环境中的安全性和有效性非常重要。监管机构如美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）要求病毒和纳米载体在批准之前遵守严格的质量、安全和有效性标准。譬如，由于脂质纳米载体在健康组织中的积累可能导致细胞毒性和/或遗传毒性，毒理学评估对于确保脂质纳米载体符合法规至关重要。在临床用于递送CAR基因的病毒载体也需要仔细测试其纯度、安全性、稳定性和功能性。某些用于递送CAR的病毒载体有致癌插入性突变风险，或在修饰的T细胞中触发不必要的炎症反应，极少情况下会偶发癌变。 另一个关于体内CAR-T疗法的监管问题是基因编辑工具的安全性，如CRISPR/Cas9系统。譬如，它可能导致在目标T细胞内非目标位点引入可变长度插入/缺失（indel），从而可能导致功能基因中断和表观遗传修饰，使疗效降低，甚至在宿主中导致过度的细胞因子释放或不良免疫反应等危险后果。为了最小化CRISPR/Cas9编辑工具在体内外修饰T细胞期间的脱靶效应，可以考虑使用高保真Cas9变体。 — 结论 — 作为一种可行的现货型替代，体内CAR-T疗法有潜力提高安全性和有效性，减少治疗等待时间，免除清淋化疗，为患者提供更大的便利。 参考文献： Bui TA, Mei H, Sang R, et al. Advancements and challenges in developing in vivo CAR T cell therapies for cancer treatment. EBioMedicine. 2024 Aug;106:105266. doi: 10.1016/j.ebiom.2024.105266. Epub 2024 Aug 1. PMID: 39094262. 同写意媒体矩阵，欢迎关注↓↓↓