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点击上方“蓝字”关注我们吧！ 呼吸道合胞病毒（RSV）是儿童急性呼吸道感染的主要病因之一，暴露于包括香烟烟雾、颗粒物、苯、臭氧（O3）、一氧化碳（CO）或二氧化氮（NO2）在内的空气污染则可能增加RSV发病率和严重程度。世界卫生组织（WHO）已公布六种最重要的空气污染物清单，包括颗粒物≤直径10μm的颗粒物（PM10）、直径在0.1至2.5μm之间的颗粒物（PM2.5）、NO2、O3、二氧化硫（SO2）和CO。 目前关于RSV和空气污染的确切病理机制数据较少，主要结论集中在宿主抗病毒能力下降、促进病毒进入和病毒载量增加、病毒从主要感染细胞释放增加、炎症反应延长和/或加重（可能导致组织病理改变，粘液分泌增强和气道高反应（AHR）），其中最重要的共同机制之一似乎由氧化应激所介导。 N-乙酰半胱氨酸（NAC）作为一种具有抗氧化和抗炎特性的粘液溶解药物，已广泛应用于慢性阻塞性肺疾病（COPD）、支气管扩张症、特发性肺纤维化等临床研究中。一篇发布在《International Journal of Molecular Sciences》（IF=4.9）的系统综述回顾现有文献以确定NAC在治疗RSV感染和空气污染中的分子作用机制[1]。 研究设计 研究者对Scopus、PubMed（Medline）和Cochrane数据库进行了系统的文献检索，检索数据库中1998年至2023年9月7日期间所有分析NAC在RSV感染或空气污染中的分子作用机制的原始研究。共检索出167项研究，去重后，根据摘要和标题排除了122项研究，阅读全文最后筛选出28项原始研究纳入系统综述。 研究结果 NAC可减少病毒进入 空气污染主要通过两种机制促进病毒进入： (1)损伤保护屏障（由于现有屏障受损或存在额外的运输通道）； (2)病毒吸附增加（由于细胞表面的变化促进病毒粘附，或RSV获得特殊毒力，从而促进其粘附到细胞表面或进入），但暂未发现关于RSV毒力增加的信息（图1）。 ①NAC可改善上皮屏障通透性 Smallcombe等人在人支气管上皮细胞和小鼠模型中证明，TiO2-NP通过破坏顶端连接复合物（AJC）和重塑细胞内细胞骨架肌动蛋白对AJC的锚定以增强RSV诱导的上皮屏障瓦解，使上皮变得“渗漏”，从而增强病毒感染。通过评估病毒降低滴度，NAC治疗减少了AJC分解，改善了上皮通透性，降低了RSV感染程度。 氧化应激在其中扮演着不容忽视的作用，研究发现共暴露于RSV和TiO2-NP后细胞内活性氧（ROS）水平迅速增加，并保持高水平长达36小时；Wen等人的研究证实暴露于TiO2-NP后过氧化氢酶（CAT）活性增加，ROS上调，许多细胞间隙和内皮层通透性增加，内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）表达降低，而NAC的使用逆转了氧化应激和间隙的形成，表明其在氧化应激中发挥关键作用。 ②NAC可抑制血清细胞间粘附分子1（ICAM-1）表达 ICAM-1是一种存在于多种细胞表面的糖蛋白，包括上皮细胞和内皮细胞、淋巴细胞和单核细胞，RSV感染诱导人内皮细胞上ICAM-1表达呈时间和剂量依赖性过度增加。 Mata等研究表明，在RSV培养的原代正常人支气管上皮细胞（NHBEC）中，使用NAC预处理可消除ICAM-1表达增加现象；Modestou等人发现香烟烟雾提取物抑制干扰素-γ（IFN-γ）诱导的人器官支气管上皮细胞（hTBE）中ICAM-1的表达，但NAC和谷胱甘肽单乙基酯（GSH-MEE）能够减轻这种抑制作用。 除ICAM-1外，空气污染还可能诱导其他表面分子表达：TiO2-NP诱导内皮细胞中ICAM-1、血管细胞间黏附分子1（VCAM-1）、血小板内皮细胞黏附分子（PECAM-1）和选择素（E和P）的表达，以及它们在单核细胞上的配体包括早期[E-选择素配体（sLex）和P-选择素配体（PSGL-1）]和晚期粘附分子[ICAM-1配体（LFA-1）、VCAM-1配体（VLA-4）和PECAM-1配体（αVβ3）]的受体表达，而NAC可抑制表面受体的表达。 ③NAC可阻断表皮生长因子受体（EGFR）磷酸化 RSV进入细胞的另一种机制涉及EGFR的磷酸化和激活以及与EGFR相关信号因子的级联反应（PI3K、PKC、Cdc42、PAK1和N-Wasp）。RSV与细胞表面结合即激活EGFR的磷酸化及其下游信号级联，通过微胞饮作用引起肌动蛋白重排和内吞。NAC可阻断人支气管上皮细胞（HBECS）中EGFR的磷酸化，从而阻止病毒的内吞作用并减少感染。 NAC可抑制病毒载量增加 病毒载量增加可能源于宿主抗病毒反应降低、感染开始后RSV释放加速（通过促进从主要感染细胞释放）或由于RSV获得异常毒力（图2）。 ①NAC可恢复抗病毒反应 人T细胞和自然杀伤（NK）细胞具有产生IFN-γ的能力，IFN-γ与其受体结合，并通过磷酸化Stat1导致Janus激酶/信号转导和转录激活因子（JAK/STAT）通路激活，二聚磷酸化的Stat1随后易位到细胞核并激活抗病毒基因。香烟烟雾提取物（CSE）抑制Stat1的磷酸化，并抑制IFN-γ介导的RSV mRNA和RSV蛋白表达降低，而使用NAC或GSH-MEE可恢复IFN-γ的抗病毒作用。 ②NAC可抑制病毒释放 在暴露于CSE和RSV的hTBE细胞中观察到较高的病毒载量似乎与香烟烟雾可能阻止RSV诱导的caspase激活有关。在受CSE和RSV侵袭的细胞中，坏死比凋亡更明显，这导致病毒从感染细胞中释放出来，而不是凋亡。 一系列实验表明，使用NAC和醛脱氢酶能够部分逆转上皮细胞从凋亡到坏死的转变，这表明ROS和丙烯醛在这一复杂系统中发挥了重要作用。细胞模型显示，无香烟烟雾暴露的RSV也会产生ROS，并激活蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶点（AMPK-MTOR）信号通路，从而诱导自噬，促进病毒感染。敲除自噬基因（如beclin1）或用AMPK抑制剂（化合物C）或NAC治疗能够抑制RSV复制，但化合物C仅能阻断自噬依赖性RSV复制，NAC则具有抑制自噬依赖性和自噬非依赖性途径的能力。 Zhou等人的研究将细胞凋亡标志物的评估与临床角度相结合，在126例老年慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者中采用口服NAC、吸入硫酸特布他林和两者联合三种治疗方法。所有治疗方案均可降低Fas受体/凋亡抗原1（Fas/APO-1）和可溶性Fas（sFas）水平，改善氧化还原状态，即ROS降低、氧化应激指标丙二醛（MDA）降低，并伴有超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）升高，且两药合用效果最佳。 NAC可减轻过度的宿主反应 ①NAC可减轻过度的促炎反应 A． NAC可减少促炎趋化因子和细胞因子的产生 许多促炎趋化因子和细胞因子被认为与RSV感染和空气污染共同暴露后的强烈的免疫反应有关，具有广泛数据支持的包括白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）、白细胞介素-17（IL-17）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的作用，以及在激活后调节的正常T细胞表达和分泌（RANTES）（图3）。 Lei Chi等人的研究证实了NAC的抗炎作用：NAC处理后细胞上清液中mRNA表达和细胞因子浓度（TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18）均显著降低；Mata等人的研究也表明NAC抑制IL-6、IL-8和TNF-α的表达；在苯并[a]芘引起的急性肺损伤小鼠模型中，NAC预处理能够减轻炎症反应，降低TNF-α、IL-6、MCP-1、MIP-2（巨噬细胞炎症蛋白2，Cxcl2）基因的表达。 B．NAC可降低NF-κB刺激作用 Carpenter证明了NAC抑制RSV诱导的趋化因子表达的方式与TNF-α不同，提示氧化还原敏感的NF-κB通路参与了IL-8、MCP-1和RANTES的诱导。 当HBEC（BEAS-2B）、正常人支气管上皮（NHBE）和COPD人支气管上皮（DHBE）细胞暴露于PM2.5后，NF-κB靶细胞因子的结合活性和分泌均表现出剂量依赖性增加。长时间暴露于PM2.5会导致核因子-红细胞2p45相关因子2（NRF2）信号通路部分失活，破坏线粒体氧化还原稳态。NRF2/Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（KEAP-1）是抗氧化反应的关键调节因子，KEAP1释放NRF2导致其蛋白体降解，从而刺激包括血红素加氧酶1（HO1）基因在内的NRF2靶基因产生抗氧化作用。 Mata等人的研究描述了NAC作用诱导的抗氧化机制：感染RSV后第15天HO1表达下降，NAC预处理后HO1表达不仅恢复且升高。由于NRF2本身表现出复杂的时变反应，RSV感染后，总抗氧化状态（TAS）即细胞对氧化事件的反应能力下降，使用1mM NAC预处理恢复，使用10mM NAC预处理后增加。此外，NAC能够抑制NF-κB向细胞核的易位以及p38/丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化以调节NRF2的表达。 IL-8和RANTES的产生均受柴油尾气颗粒诱导，p38/MAPK磷酸化在HBECs中起关键作用，NAC预处理不仅降低了p38 MAPK磷酸化酪氨酸和苏氨酸的数量，也因此降低了IL-8和RANTES的浓度。MAPK信号通路包括三个信号通路：细胞外信号相关激酶（ERK）、Jun氨基末端激酶（JNK）和p38，它们将信号从细胞膜传递到细胞核，Wang等人使用细胞（HBECs）和动物（小鼠）模型进行的一项研究表明，在暴露于颗粒物之前使用NAC预处理可阻断ERK、JNK和p38的磷酸化。 C．NAC可阻止或减少氧化应激 氧化应激在RSV和空气污染的相互作用中起着至关重要的作用，NAC可有效阻止或减少氧化应激的危害。RSV感染HBECs模型（BEAS-2B）显示，RSV诱导ROS和MDA的产生，SOD活性和细胞内还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）比值。NAC处理可抑制ROS和MDA的产生，提高SOD活性和GSH/GSSG比值，从而减弱RSV感染的病理效应。柴油尾气暴露的体外模型表明，NAC具有恢复细胞内GSH/GSSG比值、抵消脂质和蛋白质氧化、抑制氧化应激诱导的HO-1表达的能力。 在人体和动物模型中，颗粒物均可诱导ROS以剂量和时间依赖的方式产生，而NAC预处理能够阻断ROS的产生；缺氧-再氧化应激通过增加ROS的产生对人上皮细胞造成损伤，NAC可有效缓解该现象；此外，RSV感染会增加热休克70kDa蛋白6（HSPA6），而NAC可有效阻断HSPA6 mRNA和蛋白表达。 D．NAC可减轻病原相关分子模式（PAMP）激活带来的影响 toll样受体（TLRs）是膜结合的模式识别受体（PRRs），TLR3、TLR7、TLR8和TLR9识别特定的病毒基因组成分，并在病毒诱导的信号转导中发挥关键作用。Wang等人的研究证实了人肺上皮A549细胞中TLR3的激活与氧化应激之间存在相关性。 RSV感染细胞羟基自由基（·OH）和一氧化氮（NO）浓度升高，SOD总活性降低，NAC预处理可降低这些影响，并且·OH和NO水平均与RSV感染持续时间呈时间依赖性；在mRNA表达方面，RSV感染后TLR3和NF-κB上调，干扰素调节因子-3（IRF3）和超氧化物歧化酶1（SOD1）基因下调，NAC预处理可逆转mRNA和蛋白的表达模式，提示氧化应激可能在TLR3激活和炎症反应增强中起调节作用。 ②NAC可抑制过度的粘液分泌 RSV感染和空气污染（如香烟烟雾）可能增加粘液分泌，MUC5AC作为一种形成凝胶的粘蛋白，是人类粘液的主要成分之一，Mata等人的研究表明，NAC能够抑制粘蛋白基因MUC5AC的释放。 ③NAC可改善肺部结构异常 在慢性鼻窦炎或COPD等病理条件下，杯状细胞化生和MUC5AC表达增加，而香烟烟雾增强了病理反应，这主要是由EGFR通路介导的。Mata等人研究发现，感染RSV的NHBECs的纤毛阳性和β管蛋白阳性细胞数量下降，并伴有轴突基底体超微结构异常，而NAC能够以剂量依赖的方式抑制上调，恢复上皮功能；Lei Chi等人的研究也表明，在人HBECs（BEAS-2B细胞）中，NAC处理抑制了EGFR的磷酸化和MUC5AC的激活。 大鼠肺支气管肺泡灌洗（BAL）表现为高浓度环境颗粒引起的多形核白细胞内流，并伴有细支气管血管增厚、细支气管炎症和肺水肿等组织病理改变，NAC预处理逆转了多形核白细胞内流，动物无组织学变化。此外，NAC预处理可逆转小鼠肺部颗粒物诱导的PM沉积周围炎症细胞浸润，减少支气管肺泡灌洗液（BALF）中中性粒细胞和巨噬细胞数量，提高肺损伤评分。 ④NAC可减轻肺气肿 Cai等研究显示NAC可减轻吸烟致COPD大鼠晚期肺气肿，NAC处理大鼠的平均线性截距（MLI）和破坏指数（DI）均较低。重要的是，NAC降低了肺泡间隔细胞的凋亡指数（AI），逆转了血管内皮生长因子（VEGF）及其受体蛋白（VEGFR2）表达的下降，AI与VEGF水平呈负相关。苯并[a]芘引起的小鼠组织病理学改变包括气道壁增厚，MLI减少，DI增加，经NAC预处理后均有缓解，肺病理总评分均有改善。 另一种小鼠模型研究了臭氧诱导的COPD，并比较了NAC的预防和治疗作用，结果显示，暴露前给予NAC能够减少BAL和气道平滑肌（ASM）肿块中的巨噬细胞数量，而治疗性给药能够减少ASM肿块和凋亡细胞数量，但肺气肿不可逆。肺气肿的机制复杂，与基质金属蛋白酶（MMP）尤其是MMP-9和MMP-12相关，在颗粒物暴露模型中，NAC预处理后HBECs和BALF中MMP-9的表达和水平均降低。 ⑤NAC可减轻DNA损伤和衰老 氧化应激诱导DNA损伤，并可能引发细胞衰老（增殖停止），这已在RSV感染中得到证实。RSV感染后，ROS产生增加，DNA损伤和增殖阻滞标志物表达增加，而NAC可显著减少受损细胞核的数量，但其保护作用仅对新生DNA损伤灶有效，对先前存在的DNA损伤灶几乎无效。 各种空气污染物包括颗粒物（PM2.5、PM10）、NO或香烟烟雾对衰老和细胞衰老也有类似的影响，而氧化应激则是最合理的相互作用机制。Kang等人研究证实NAC预处理可逆转空气污染物对ROS生成和DNA断裂的影响，在防止DNA损伤和细胞衰老方面发挥保护作用。 NAC可降低气道高反应（AHR） 混合暴露于RSV和空气污染可导致RANTES、MCP-1和NGF水平升高，白血病抑制因子（LIF）水平降低，从而导致AHR，而上述研究证明了NAC在RSV暴露和空气污染暴露（分别为柴油排放和苯并芘）模型中降低RANTES和MCP-1水平的有效性，这可能进一步导致AHR降低或消失。 · 总结 · 本综述确定了NAC用于减轻RSV感染和空气污染影响的潜在分子机制，包括阻断病毒进入、降低病毒载量和过度的宿主反应（炎症反应增强、粘液分泌增加、AHR、DNA损伤和/或细胞衰老）等。未来应开展进一步研究以调查RSV感染期间NAC的作用，并重点关注NAC在最重要的六种空气污染物中发挥的分子机制。 参考文献 [1]Wrotek A, Badyda A, Jackowska T. Molecular Mechanisms of N-Acetylcysteine in RSV Infections and Air Pollution-Induced Alterations: A Scoping Review. Int J Mol Sci. 2024，25(11):6051.  提示：本材料仅供医疗卫生专业人士进行医学科学交流，不用于推广目的。

学术前沿 单细胞结合空间转录组的研究思路和案例分享 ——肿瘤免疫研究领域（下） 01 引言 单细胞转录组测序是在单个细胞水平进行高通量转录组测序的一项技术，其能有效解决细胞异质性以及之前bulk RNA-seq被掩盖的种种问题。随着该技术在分辨率和通量方面的不断优化，研究者从异质性样本中分析细胞类型特异性基因调控网络的能力也相对提高，但是在细胞的空间位置水平尚有欠缺。空间转录组技术于2020年被《自然》杂志评为年度技术，可以解析时间和空间维度上单个细胞的基因表达模式，以及细胞类群的空间位置关系及生物学特征。其原理是将空间条形码寡核苷酸引物固定在载玻片上，然后将组织贴于载玻片实现组织内转录组序列的捕获与检测。随着10x Genomics的空间Visium技术的登场和不断更新加强，单细胞联合空间转录组的研究如火如荼的开展，遍布了遗传、发育、肿瘤、免疫等多个生物科研和医学热门领域。 一、研究目的 1.某肿瘤中，整体的细胞图谱、空间图谱及细胞间机制探索。 2.某肿瘤中，不同进展期（病变期）、不同亚型、特殊基因表达或原发灶与转移灶样本之间差异机制探索。 3.某肿瘤中，肿瘤对治疗方案的疗效应答中的差异机制探索。 二、样本选择 1. 某癌种中，根据其样本类型的特殊性，选择一定数量的样本，包括新鲜组织、冰冻组织或石蜡样本。 2. 某癌种中，根据原发灶和转移灶、免疫类型（浸润型、沙漠型、排斥型）、基因表达（阴/阳）或不同病理亚型的分组取样。 3. 某癌种中，根据PD1免疫药物治疗/靶向药物治疗/常规放化疗等治疗药物，新辅助、转化治疗等方案，选取应答/无应答、治疗前/治疗后的样本分组取样检测。 三、研究方法 1.主要研究方法：主要应用在发现探索阶段的方法,一般包括流式细胞技术(Facs)、单细胞组学（scRNA-seq）、空间转录组(visium HD)、多重免疫荧光染色(mIF)、探针原位杂交（Xenium）等； 2.其他辅助方法：辅助研究方法应用在机制验证方面，会根据验证模型的不同水平，比如细胞水平、动物模型、人源组织、类器官、网络数据库等等，对应各种生物检测分析方法并没有固定的思路。 四、分析思路 1.单细胞图谱：细胞类型的空间分布特征，亚群的图谱分类； 2.空间图谱绘制：细胞类型的空间分布特征，亚群的定位； 3.各个亚群细胞中的特征，寻找对比差异显著的细胞亚群，从剖析细胞/基因功能空间动态变化、空间细胞分化规律（拟时序）去分析细胞发生的机制和可能作用； 4.各类细胞亚群的相关性，通过细胞通讯、ST定位以及IHC或mIF等图像直观证明细胞亚群间特异的互动关系； 5.实验验证靶点和机制：细胞水平、类器官水平、动物模型水平做敲除干预治疗等验证。 五、文献分享 案例1 《单细胞和空间转录组分析揭示了肝转移性结直肠癌的细胞异质性》 发表期刊：Cell，影响因子：11.5 研究背景：结直肠癌(CRC)是世界上第三大最常见的恶性肿瘤，而转移性 CRC 的生存率很低。CRC转移过程是一个多步骤的过程，包含了癌细胞和基质细胞之间的交流通过分泌细胞因子、生长因子和蛋白酶来促进转移性扩散，从而重塑肿瘤微环境。TME 的细胞组成非常复杂，包括多种成纤维细胞和免疫细胞，它们在癌症逃避、转移和治疗反应中发挥着重要作用。癌症相关成纤维细胞（CAF）是许多类型恶性肿瘤（包括 CRC、乳腺癌和胰腺癌）的主要基质细胞成分。为了全面绘制结直肠癌和匹配的肝转移的细胞景观，研究人员使用scRNA-seq结合空间转录组(ST)和免疫组织化学(IHC)染色以及流式细胞术生成了高分辨率的细胞图谱。 检测技术组合：流式细胞术、单细胞转录组、空间转录组 样本类型：1. 6例CRC患者的27份样本，包括原发性结直肠癌(CC)、邻近正常结直肠粘膜(CN)、肝转移(LM)、邻近正常肝组织(LN)和外周血(PB)五种组织类型用于单细胞转录组检测。 2. 6例CRC患者，包含4例CRC原发性肿瘤（C1至C4）和2例肝转移性肿瘤（L1和L2）采用空间转录组。 主要结果： 1.根据免疫和非免疫细胞群，分别展示了CRC原发肿瘤和CRC肝转移性肿瘤的单细胞转录组图基本分类，以及原发和转移的差异。 Fig.1.CRC原发及肝转移中的全球细胞景观 2.CRC原发性肿瘤和CRC源性肝转移性肿瘤的空间分布 在ST组织中鉴定出B细胞、 T细胞、 NK细胞、浆细胞、髓样细胞、肿瘤细胞、成纤维细胞和内皮细胞。这些细胞簇的比例和分数在每个地区都不同。与C1、C3和C4的肿瘤旁组织相比，肿瘤组织中浆细胞的比率降低。 Fig.2.空间转录组样本的细胞鉴定 3.原发性肿瘤和肝转移性肿瘤之间肿瘤细胞的转录组异质性 亚聚类分析揭示了肿瘤细胞的不同分化谱系。在各群中鉴定出簇状细胞的分化标志基因。肿瘤细胞群的异质性表明肿瘤细胞的分化潜力。 为了进一步研究不同肿瘤细胞簇的功能通路和转录程序，进行了基因集变异分析（GSVA）和转录因子（TF）分析。结果显示，表明CA2可能是TME中的干细胞亚群。 Fig.3.原发性和转移性肿瘤细胞的转录组特征和异质性 4.TME重塑髓系细胞的组成 鉴定出三种髓系细胞：单核细胞/巨噬细胞、树突状细胞和肥大细胞。使用亚聚类分析确定了8个单核细胞/巨噬细胞簇和3个常规DC（cDC）簇，GSVA分析显示，Mac_SPP1亚群参与了与炎症反应相关的通路。拟时序显示Mac_CXCL9 和 Mac_SPP1 亚群均发生终末分化，表明它们是肿瘤激活的Mac亚群。cDC_LAMP3 亚群还表现出高水平的成本刺激分子CD40CD80和CD86 表达，它们是DC成熟的标志物。在LM中，cDC_LAMP3亚群的比例显著增加表明肿瘤细胞对TIME的重塑作用。 Fig.4.骨髓细胞的免疫景观 5.CXCL13T 细胞在肝转移性肿瘤中富集 在 T 细胞中，7个CD8 T细胞簇、5个常规CD4 T（cCD4）细胞簇和2个调节T细胞簇被识别。从细胞比例显示，无论是CD8还是CD4的T细胞，LM的CXCL13T细胞子集比例都很高。GSVA分析显示，CD8_CXCL13亚群富含T细胞增殖通路，CD4_CXCL13 亚群富含G细胞+2-M检查点通路。用流式细胞术鉴定了CD69+CD103+CD8+T细胞。CC和LM的CD69+CD103+CD8+T细胞的Ki67表达水平均高于其他CD8+T细胞。然而，来自CN和LN的不同CD8+T细胞亚群的增殖特性几乎相同。 Fig.5.CXCL13+T细胞在肝转移瘤中富集 6.CXCL13 T细胞与CRC患者的良好预后相关 在上图验证CD8_CXCL13细胞可能是肿瘤激活的亚群。进一步对CD8_CXCL13子集的特征做深入研究。与其他亚群相比，在CD8_CXCL13亚群中观察到高水平的耗竭标志物，且耗竭表型表明它们的肿瘤反应性。IHC难以检测组织中的CXCL13，因此选用CD69和CD103标记CXCL13细胞，结果显示该群T细胞比肿瘤组织中的其他CD8 T细胞更接近CK19肿瘤细胞。将基因表达综合（GEO）队列中的CRC患者分为CXCL13+高和CXCL13低组，发现CC中 CXCL13 的较高表达预示着更好的总生存期。 Fig.6. CXCL13+ T细胞的特性及预后影响 7.成纤维细胞的不同亚群存在于 CRC 的原发性和肝脏转移性肿瘤中 在CRC的TME中鉴定出8个具有不同基因表达模式的成纤维细胞簇，然后研究人员对各类成纤维细胞分别做了转录组数据比较、IHC组化、拟时序分析、以及ST分析，在CRC原发性和肝转移性肿瘤之间观察到不同的表型谱和成纤维细胞的高度可变频率，这表明在不同癌症环境中TME内的细胞异质性。 Fig.7. 原发性和转移性肿瘤中成纤维细胞的转录组特征和异质性 8.在原发性肿瘤中富集的 F3 表达成纤维细胞亚群分泌促肿瘤因子，并与 CRC 患者的不良预后相关 为了研究富含CC和LM的不同成纤维细胞对TME 的重塑，研究人员分析了F2_MCAM和F4_F3的特征。通过差异基因富集以及F4_F3细胞与肿瘤细胞之间揭示了通过NRG1和Erb-B2受体酪氨酸激酶3 （ERBB3）通路进行串扰。在ST中发现了两类细胞 F3与NRG1的共定位并通过transwell细胞实验迁移证明。最后在预后数据中发现F3和NRG1 高表达水平的CRC患者总生存期较差。 Fig.8. F3+成纤维细胞的特性及预后影响 9. LM的TME中表达MCAM的成纤维细胞通过Notch 信号通路调节CD8_CXCL13细胞的产生 之前发现RBPJ在LM中的表达与CXCL13和ITGAE呈正相关。为了进一步了解两个亚群受到什么类型的细胞调节Notch信号，采用cellphoneDB分析，在内皮细胞中E2_DLL4亚群与CXCL13+ T细胞的相互作用最强，在成纤维细胞中F2_MCAM簇通JAG1-NOTCH1与CD8_CXCL13和CD4_CXCL13亚群相互作用。由于TME中成纤维细胞的分散分布模式，推测F2_MCAM亚群有助于CXCL13+ T细胞中Notch信号的激活。此外根据LM中F2_MCAM的比例高低，发现F2_MCAM高组患者LM中CD8_CXCL13亚群的浸润评分更高，并在ST中得到了验证，使用JASPAR预测表明RBPJ可能作TF影响CXCL13的表达。 Fig.9. TME中的NOTCH信号调节CD8_CXCL13细胞的生成 10.ST组织中的细胞间相互作用网络 原发性肿瘤和肝转移性肿瘤ST中不同簇之间的细胞相互作用，表明ERBB3-NRG1相互作用在原发性肿瘤发生和转移中的潜在作用，发现在CRC原发肿瘤中富集的F3成纤维细胞可以通过产生各种促肿瘤因子（包括 NRG1）来调节发展和/或迁移，这些因子与肿瘤细胞上表达的ERBB3相互作用以发挥其促肿瘤功能。 Fig.10. ST组织中的细胞配体和受体相互作用 案例2 《空间和单细胞转录组学揭示了HNSCC中与癌症相关的成纤维细胞亚群限制了CD8+ T细胞的浸润和抗肿瘤活性》 发表期刊：Cancer Research，影响因子：12.5 样本类型：5例头颈部鳞状细胞癌HNSCC癌和癌旁组织； 技术组合：单细胞RNA转录组、空间转录组、免疫组化、免疫荧光、其他等等； 研究背景：免疫治疗可以延长一些HNSCC患者的生存期，但应答率仍然很低。阐明肿瘤微环境中cd8+t细胞浸润和功能障碍的关键机制有助于最大限度地发挥免疫治疗HNSCC的益处。CD8+T细胞与包括CAFs在内的其他类型细胞之间的相互作用决定了CD8+T细胞如何在这一动态TME中发挥作用，本研究对五对肿瘤和邻近组织的不同免疫浸润和单细胞RNA测序的HNSCC标本进行了空间转录组学分析，揭示了与cd8 + t细胞浸润限制和功能障碍相关的特定癌症相关成纤维细胞(CAF)亚群。 技术路线： 主要结果： 1. HNSCC肿瘤组织对CD8+T细胞具有招募趋化作用，CD8+T细胞存在于肿瘤基质中，且免疫排斥型的HNSCC中CD8a+被受限无法浸润到肿瘤巢中； Fig 1.CD8+T细胞在不同HNSCC肿瘤亚型中的分布 2.MHC-IhiCAFs（5亚群）是肿瘤组织中区别于癌旁组织的最主要的CAFs亚群，高表达CXCLs和MHC-I增强了CAFs与CD8+T的结合，且可通过限制CD8+T细胞的抗肿瘤能力造成预后不良； Fig 2.HNSCC肿瘤及邻近组织成纤维细胞的整体分析 3. MHC-IhiCAFs中存在LGALS9（编码galectin-9蛋白）的富集，大部分HNSCC肿瘤基质中均存在galectin-9蛋白的表达；MHC-IhiCAFs中galectin-9蛋白的表达依赖于干扰素信号； Fig3. TCF1 ~ GZMK ~ CD8 + T细胞与galectin-9的CAF细胞呈负相关 4.在CAFs中敲减LGALS9表达会降低CD8+T表达免疫检查点分子，同时促进干性和细胞毒性分子的表达，且动物实验证明Gal-9+CAFs促进干细胞样CD8+T细胞耗竭转化。 图4. 动物实验验证MHC I类的高表达限制了cd8+T细胞的抗肿瘤功能 案例3 《上皮细胞激活成纤维细胞促进食管癌的发展》 发表期刊：Cancer cell，影响因子：48.8 样本类型：29例ESCC患者79个多期食管病变的正常上皮、癌前病变和癌组织； 技术组合：单细胞RNA转录组、空间转录组、免疫组化、免疫荧光、其他等等； 研究背景：食管鳞状细胞癌(ESCC)的发展经历了多阶段上皮癌的形成，即从正常上皮、低级别和高级别上皮内瘤变到浸润性癌。然而，癌前病变如何发展为癌机制尚未可知。 主要结果： 1.ESCC多阶段肿瘤发生过程各种细胞类型图谱分析 Fig 1.单细胞转录组学分析揭示了ESCC多阶段肿瘤发生过程中的各种细胞类型 2.上皮细胞中ANXA1的功能失调可能是ESCC肿瘤发生中至关重要的事件； Fig 2.上皮细胞在ESCC肿瘤发生过程中逐渐抑制ANXA1表达 3.ESCC肿瘤发生过程中上皮细胞与成纤维细胞的相互作用，食管上皮细胞产生的ANXA1功能的丧失可能导致NF-CAF转化； Fig 3.上皮细胞抑制ANXA1可促进NF向CAFs转化 4.KLF4、KLF5、CEBPB和FOXA1与ANXA1的RNA水平呈正相关，细胞实验发现只有靶向KFL4的SiRNA可显著抑制ANXA1表达，KLF4调节ANXA1转录，促进NFs向myCAF的转化。 图4.在体外和体内，抑制上皮细胞ANXA1可促进myCAF的激活 参考文献： [1]Wang F, Long J, Li L, Wu ZX, Da TT, Wang XQ, Huang C, Jiang YH, Yao XQ, Ma HQ, Lian ZX, Zhao ZB, Cao J. Single-cell and spatial transcriptome analysis reveals the cellular heterogeneity of liver metastatic colorectal cancer. Sci Adv. 2023 Jun 16;9(24):eadf5464. doi: 10.1126/sciadv.adf5464. Epub 2023 Jun 16. PMID: 37327339; PMCID: PMC10275599. [2]Li C, Guo H, Zhai P, Yan M, Liu C, Wang X, Shi C, Li J, Tong T, Zhang Z, Ma H, Zhang J. Spatial and Single-Cell Transcriptomics Reveal a Cancer-Associated Fibroblast Subset in HNSCC That Restricts Infiltration and Antitumor Activity of CD8+ T Cells. Cancer Res. 2024 Jan 16;84(2):258-275. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-23-1448. PMID: 37930937; PMCID: PMC10790129. [3]Chen Y, Zhu S, Liu T, Zhang S, Lu J, Fan W, Lin L, Xiang T, Yang J, Zhao X, Xi Y, Ma Y, Cheng G, Lin D, Wu C. Epithelial cells activate fibroblasts to promote esophageal cancer development. Cancer Cell. 2023 May 8;41(5):903-918.e8. doi: 10.1016/j.ccell.2023.03.001. Epub 2023 Mar 23. PMID: 36963399. 本文由 科研学术部 何鼎 提供

中国苏州，2024年10月21日——基石药业（股票代码：2616.HK），一家专注于抗肿瘤药物研发的创新驱动型生物医药企业，今日宣布，公司自主研发的抗体偶联药物(ADC)CS5006的专利（WO/2024/208354）已于2024年10月10日公开。 CS5006是一款同类首创、具有全新靶点的抗体偶联药物（ADC）——靶向整合素β4 (ITGB4)。ITGB4是一种跨膜蛋白，仅与整合素α6 (ITGA6) 结合形成异二聚体（α6β4），并以层粘连蛋白作为细胞外配体。ITGB4被视为多种肿瘤的标志物，其高表达与肿瘤的侵袭性和不良预后相关。我们通过内部精心构建的生物信息学平台、结合前沿AI算法分析以及综合对比已发表的文献，发现ITGB4在非小细胞肺癌、结直肠癌、食管鳞状细胞癌和头颈部鳞状细胞癌等多种适应症中高度表达，是理想的靶向治疗候选分子。 在CS5006的研发过程中，基石药业将候选单克隆抗体与已在临床验证的连接子及包括GGFG-DXd和VC-MMAE在内的药物载荷相结合，作为模型ADC分子，以支持项目的概念验证研究。体外研究结果表明，CS5006-GGFG-DXd和CS5006-VC-MMAE ADCs在肿瘤细胞内化后，均能高效释放细胞毒素，迅速杀死肿瘤细胞。体内研究结果进一步验证了这两种ADC强大的抗肿瘤活性和符合预期的耐受性，为其下一步临床开发提供了有力的数据支持。目前，CS5006采用了自主知识产权的连接子，已接近完成临床前候选分子（PCC）的筛选，预计将于2025年提交新药临床研究（IND）申请。 基石药业首席执行官、研发总裁、执行董事杨建新博士表示： “CS5006专利的公布，不仅展示了我们在ADC领域的创新成果，更突显了基石药业从研发到商业化的全链条能力。我们对CS5006以及其他创新ADC项目的临床潜力充满期待，希望它们能为全球癌症患者带来突破性的治疗方案。” 此外，基石药业还在积极推进新一代拥有自主知识产权的连接子的开发，以提升当前广泛使用的连接子（如GGFG四肽连接子和VA/C二肽连接子）的亲水性和肿瘤选择性。这些新型连接子将更大限度地保障ADC的安全性和药效表现、大大增加连接子适配靶点和抗体分子的灵活性、并支持基石管线2.0中的多个ADC项目，包括靶向SSTR2的CS5005、靶向ITGB4的CS5006、靶向EGFR/HER3的CS5007等等。 关于基石药业 基石药业（香港联交所代码: 2616）成立于2015年底，是一家专注于抗肿瘤药物研发的创新驱动型生物医药企业，致力于满足中国和全球癌症患者的殷切医疗需求。截至目前，公司已成功上市4款创新药、获批15项新药上市申请（NDA）以及9项适应症。当前研发管线均衡配置了潜在同类首创或同类最佳的抗体偶联药物（ADC）、多特异性抗体、以及免疫疗法和精准治疗药物在内的16款候选药物。同时，基石药业拥有一支资深管理团队，“全链条”覆盖临床前探索、临床转化、临床开发、药物生产、商务拓展、商业运营等关键环节。 如需了解有关基石药业的更多信息，请访问： www.cstonepharma.com。  投资者关系: ir@cstonepharma.com 媒体关系: pr@cstonepharma.com 前瞻性声明 本文所作出的前瞻性陈述仅与本文作出该陈述当日的事件或资料有关。除法律规定外，于作出前瞻性陈述当日之后，无论是否出现新资料、未来事件或其他情况，我们并无责任更新或公开修改任何前瞻性陈述及预料之外的事件。请细阅本文，并理解我们的实际未来业绩或表现可能与预期有重大差异。本文内所有陈述乃本文章刊发日期作出，可能因未来发展而出现变动。 声明：仅供医疗卫生专业人士交流使用。