RBM20

— Received Rare Pediatric Disease and Orphan Drug Designation for Duchenne muscular dystrophy (Duchenne) gene therapy candidate SGT-003 with patient dosing in Phase 1/2 trial expected Q2 2024 — — Company entered into non-exclusive licensing agreement for use of its proprietary, muscle- targeted AAV-SLB101 capsid — — Company ends first quarter 2024 with approximately $206.1 million in cash and investments. Solid has anticipated cash runway into 2026 — CHARLESTOWN, Mass., May 15, 2024 (GLOBE NEWSWIRE) -- Solid Biosciences Inc. (Nasdaq: SLDB), a life sciences company developing precision genetic medicines for neuromuscular and cardiac diseases, today reported financial results for the first quarter ended March 31, 2024, and provided a business update. “In the first quarter of 2024, we continued our focus on executing across our pipeline and we remain on track to initiate patient dosing in our SGT-003 trial in the second quarter of 2024. We anticipate providing a topline readout of safety, microdystrophin expression and functional benefit by year end,” said Bo Cumbo, President and CEO, Solid Biosciences. “Supported by the $108.9 million capital raise completed in January 2024, our strong cash position of $206.1 million provides us with both anticipated runway into 2026 and the resources to execute across our portfolio, including bringing SGT-003 for Duchenne muscular dystrophy into the clinic, advancing SGT-501 for catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) towards IND submission and continuing to progress the rest of our diversified pipeline of neuromuscular and cardiac gene therapy candidates.” Company Updates Solid expects to initiate dosing in the Phase 1/2 trial of SGT-003 in pediatric patients with Duchenne in the second quarter of 2024. Initial safety, microdystrophin expression and functional benefit data from the first 3-4 patients enrolled in the trial is expected by the fourth quarter of 2024. Solid expects to Investigational New Drug Application (IND) for its first cardiac gene therapy candidate, SGT-501 for the treatment of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT), in the first quarter of 2025. Solid continues to advance the rest of its therapeutics portfolio with ongoing preclinical studies in BAG3, mouse studies in TNNT2 and preclinical work in RBM20. Platform enabling work in both capsids (NHP, mouse and pig studies) and portfolio wide CMC process development work is ongoing. Recent Company Highlights On April 1, 2024, Solid announced that the FDA granted Rare Pediatric Disease Designation for its Duchenne gene therapy candidate SGT-003. This designation encourages development of new drugs for the prevention and treatment of rare pediatric diseases. If a new biologics license application (BLA) is approved for SGT-003, the Company may be eligible to receive a priority review voucher. This voucher could be redeemed to obtain priority review for any subsequent marketing application for a different product and may be sold or transferred. On March 7, 2024, Solid announced that it entered into a non-exclusive licensing agreement for use of its proprietary, muscle-targeted AAV-SLB101 capsid in the development of an RNAi therapy to treat FSHD (Facioscapulohumeral muscular dystrophy). The Company aims to license AAV-SLB101 broadly to both companies and academic institutions pursuing treatments for rare diseases. On January 16, 2024, Solid announced that the FDA granted Orphan Drug Designation for SGT-003. This designation provides certain benefits, including specified financial incentives, to support clinical development and the potential for up to seven years of market exclusivity in the U.S. upon regulatory approval. On January 8, 2024, Solid announced a $108.9 million private placement with new and existing investors. The Company expects to use net proceeds of approximately $103.7 million from the private placement to fund ongoing pipeline development programs, business development activities, working capital and other general corporate purposes. First Quarter 2024 Financial Highlights There were no collaboration revenues for the first quarters of 2024 or 2023. Research and development expenses for the three months ended March 31, 2024, were $18.9 million, compared to $24.6 million for the three months ended March 31, 2023. The decrease of $5.8 million in research and development expenses was primarily due to a $7.2 million decrease in manufacturing and research related costs for SGT-003 and $2.3 million decrease in costs for SGT-001 primarily related to our decision to prioritize SGT-003, partially offset by a $3.8 million increase in manufacturing and research related costs for SGT-501. General and administrative expenses for the three months ended March 31, 2024, were $8.0 million, compared to $7.4 million for the three months ended March 31, 2023. The increase of $0.6 million was primarily related to a $0.4 million increase in legal fees, and a $0.2 million increase in corporate and business development costs. Net loss for the first quarter of 2024 was $24.3 million, compared to $30.1 million for the first quarter of 2023. The decrease in net loss was the result of lower research and development costs and an increase in yields on cash, cash equivalents, and available-for-sale securities. Solid had $206.1 million in cash, cash equivalents, and available-for-sale securities as of March 31, 2024, compared to $123.6 million as of December 31, 2023. The Company expects that its cash, cash equivalents, and available-for-sale securities as of March 31, 2024, will enable it to fund key strategic priorities into 2026. About Solid Biosciences Solid Biosciences is a life sciences company focused on advancing a portfolio of gene therapy candidates including SGT-003 for the treatment of Duchenne muscular dystrophy (Duchenne), SGT-501 for the treatment of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT), AVB-401 for the treatment of BAG3-mediated dilated cardiomyopathy, and additional assets for the treatment of fatal cardiac diseases. Solid is advancing its diverse pipeline across rare neuromuscular and cardiac diseases, bringing together experts in science, technology, disease management, and care. Patient-focused and founded by those directly impacted, Solid’s mandate is to improve the daily lives of patients living with these devastating diseases. For more information, please visit . Forward-Looking Statements This press release contains “forward-looking statements” within the meaning of the Private Securities Litigation Reform Act of 1995, including statements regarding future expectations, plans and prospects for the company; the ability to successfully achieve and execute on the company’s priorities and achieve key clinical milestones; the company’s SGT-003 program, including expectations for initiating dosing and availability of clinical trial data; the company’s expectations for submission of an IND for SGT-501; Solid’s plans to license AAV-SLB101 broadly to both companies and academic institutions; the anticipated use of proceeds from the January 2024 private placement; the potential benefits of Rare Pediatric Disease Designation and Orphan Drug Designation; the cash runway of the company and the sufficiency of the Company’s cash, cash equivalents, and available-for-sale securities to fund its operations; and other statements containing the words “anticipate,” “believe,” “continue,” “could,” “estimate,” “expect,” “intend,” “may,” “plan,” “potential,” “predict,” “project,” “should,” “target,” “would,” “working” and similar expressions. Any forward-looking statements are based on management’s current expectations of future events and are subject to a number of risks and uncertainties that could cause actual results to differ materially and adversely from those set forth in, or implied by, such forward-looking statements. These risks and uncertainties include, but are not limited to, risks associated with the ability to recognize the anticipated benefits of Solid’s acquisition of AavantiBio; the company’s ability to advance SGT-003, SGT-501, AVB-401 and other preclinical programs and capsid libraries on the timelines expected or at all; obtain and maintain necessary approvals from the FDA and other regulatory authorities; replicate in clinical trials positive results found in preclinical studies of the company’s product candidates; obtain, maintain or protect intellectual property rights related to its product candidates; compete successfully with other companies that are seeking to develop Duchenne and other neuromuscular and cardiac treatments and gene therapies; manage expenses; and raise the substantial additional capital needed, on the timeline necessary, to continue development of SGT-003, SGT-501, AVB-401 and other candidates, achieve its other business objectives and continue as a going concern. For a discussion of other risks and uncertainties, and other important factors, any of which could cause the company’s actual results to differ from those contained in the forward-looking statements, see the “Risk Factors” section, as well as discussions of potential risks, uncertainties and other important factors, in the company’s most recent filings with the Securities and Exchange Commission. In addition, the forward-looking statements included in this press release represent the company’s views as of the date hereof and should not be relied upon as representing the company’s views as of any date subsequent to the date hereof. The company anticipates that subsequent events and developments will cause the company's views to change. However, while the company may elect to update these forward-looking statements at some point in the future, the company specifically disclaims any obligation to do so. Solid Biosciences Investor Contact: investors@solidbio.com Media Contact: Glenn Silver FINN Partners glenn.silver@finnpartners.com

近年来，包括信使RNA（mRNA）、小干扰RNA（siRNA）和微小RNA（miRNA）在内的核糖核酸（RNA）治疗已经迅速发展为现代医学的一个新支柱。其中，基于mRNA制备而成的新冠疫苗更是在抗击引起严重急性呼吸道综合症的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）方面发挥了巨大作用，其超快的序列设计速度和易于大规模生产的特性为应对紧急和不断变化的医疗危机提供了新的可能。在如今mRNA药物获得成功的大背景下，将线性mRNA进一步通过首位连接合成环状RNA（circular RNA, circRNA）来提高mRNA的稳定性并延长蛋白质的翻译时间又成为了mRNA治疗领域的新热点。简单来说，环状RNA是一种首尾共价连接的闭合单链RNA，它无需mRNA中常见的5’帽子和3’-poly(A)尾巴就可以保持稳定的状态，这是由于其共价闭合的结构本身就可以阻止核酸酶的降解。生物体内天然形成的环状RNA大多由mRNA前体（pre-mRNA）通过反向剪接（back-splicing）形成，并分布于细胞质中，其半衰期从18.8小时到23.7小时不等，而其同源的线性RNA半衰期仅有4.0~7.4小时。虽然大多数天然的环状RNA是非编码RNA，即不能翻译成蛋白质的RNA，但有研究证明人工合成带有IRES（内部核糖体进入位点）序列的环状RNA是可以在体内和体外进行翻译的。因此，近年来有越来越多的国内外研究人员和生物公司在研究环状RNA在体内外翻译机制，同时研发出多种体内外合成环状RNA的技术，这些技术也极大地促进了环状RNA治疗领域的发展。基于以上背景，本文将从体外合成环状RNA、体内合成环状RNA以及国内外各大环状RNA公司采用的合成方法这三个方面进行阐述，期望提高人们对环状RNA治疗领域的了解。 体外合成环状RNA的技术方法1.1 化学合成环状RNA目前环状RNA的化学合成技术主要以磷酰胺（phosphoramidite）化学和固相合成为基础，并以天然的核苷三磷酸酯衍生物为原材料来进行制备的。这些衍生物采用非活性保护基团取代天然核苷三磷酸酯中的反应性氨基和羟基，能够实现3’-5’磷酸二酯连接并去除保护性基团，同时能最大程度避免2’-5’磷酸二酯键的形成及其它副反应的发生。后续经过合成后的处理和纯化，就可以生成高纯度的寡核苷酸。然而，目前的环状RNA化学合成技术只能合成少于70~80个核苷酸（nt）长度的环状RNA（图1）。图1：体外化学合成环状RNA1.2 酶促连接合成环状RNA酶促连接合成通常通过体外转录（IVT）反应实现，该反应需要DNA模板、反应缓冲液和噬菌体RNA聚合酶。噬菌体RNA聚合酶通常来源于T7、SP6或T3噬菌体，其中较常见的是T7 RNA聚合酶。IVT反应允许以较低的成本进行更长的环状RNA合成，因此酶促合成是目前主流的环状RNA合成方法。但需注意的是，野生型噬菌体聚合酶自带的run-off性质可能导致合成不完整的RNA序列，因此有些研究通过突变野生型噬菌体RNA聚合酶来改善体外转录的质量，减少副反应的发生。由于酶促连接是现阶段使用较多的体外合成环状RNA的方法，因此下文将对酶促合成进行重点介绍，而酶促连接又可进一步分为T4连接酶连接和核酶连接两种。1.2.1 T4连接酶合成环状RNA来源于噬菌体T4的多种连接酶都可以催化RNA连接反应，这其中包括T4 DNA连接酶（T4 Dnl）、T4 RNA连接酶1（T4 Rnl 1）和T4 RNA连接酶2（T4 Rnl 2）。当然，这种连接需要线性RNA前体上的受体区域（acceptor substrate）有3’-OH，且供体区域（donor substrate）有5’单磷酸才能进行。1) T4 Dnl连接T4 Dnl可以连接双链DNA或DNA/RNA杂交链（图2A），该方法通常需要利用一个与连接处互补的DNA（cDNA）模板或cDNA“桥”（bridge）来实现。这种方法的优点是连接的准确性较高，但是它要求线性RNA前体在连接处没有明显的RNA二级结构，且在双链区不能有高比例的尿嘧啶（U）。此外，T4 Dnl针对DNA/RNA杂交链的连接效率低于双链DNA（dsDNA）连接，因此实际上只有少数研究会使用该方法进行RNA连接。2) T4 Rnl 1连接T4 Rnl 1是一种比较常见的单链RNA（ssRNA）连接酶，它可催化单链RNA末端的3’-OH对活性的5’端进行亲核攻击，形成共价的3’-5’-磷酸二酯键，进而形成环状RNA（图2B）。有些研究也会在此过程中使用cDNA“桥”来防止线性RNA前体折叠成不必要的二级结构。值得注意的是，T4 Rnl 1对5’末端和3’末端的核苷酸明显偏好性：其对3’末端的核苷酸偏好为A>G≥C>U，而对5’末端核苷酸偏好则为pC>pU>pA>pG。该连接方法的优点是仅可以合成极短的环状RNA（短至6~8 nt），但对于较大的RNA分子的连接效率会显著降低。与T4 Dnl类似，线性RNA前体末端若具有明显的RNA二级结构会大大降低T4 Rnl 1的连接效率。此外，该反应还存在分子间末端连接（低聚物）的严重副反应，该副反应会随着线性RNA前体浓度的增加而增加，并会限制环状RNA的产量。3) T4 Rnl 2连接T4 Rnl 2与T4 Rnl 1相似，它也可催化RNA末端的3’-OH与5’末端形成共价的3’-5’-磷酸二酯键。不过T4 Rnl 2在连接双链RNA（dsRNA）时要比连接单链RNA厉害得多（图2C）。基于这一特点，当线性RNA前体折叠成二级结构，即接头区域为双链结构时，T4 Rnl 2的连接效率要比T4 Rnl 1高得多；而且利用外源RNA“夹板”序列（RNA splint），T4 Rnl 2还能实现对单链RNA末端的连接。不过此方法不能用于连接较短的RNA前体，这是因为当线性RNA前体的长度短于30 nt时，其连接处形成的复合物是不稳定的。与T4 Rnl 1一样，T4 Rnl 2也存在对大片段RNA分子连接效率低和副反应多的问题。综上，T4 Dnl和T4 Rnl 1适用于没有复杂二级结构的RNA环化；而T4 Rnl 2更适用于接头区域为双链的线性RNA前体，因此在实际操作中需要根据线性RNA前体的二级结构来选择不同的T4连接酶。需注意的是，所有这些连接酶合成方法都不能实现大片段RNA分子的环化，也不能完全避免分子间末端连接的副反应。图2：T4连接酶合成环状RNA的策略1.2.2 核酶合成环状RNA1） I型内含子自剪接系统（Group I intron self-splicing system）1982年，科学家在四膜虫（Tetrahymena thermophila）的rRNA转录本中首次发现了I型内含子，它同时也是第一个被发现的核酶——无需任何蛋白质的帮助就可以帮助初级转录本RNA进行自我剪接（self-splicing）。自那以后，在许多生物和病毒基因组的tRNA、mRNA和rRNA中也陆续发现了很多能够自我剪接的I型内含子。尽管这些I型内含子来源于完全不同的初级转录本，但它们的催化中心结构却惊人得相似。根据二级结构可将I型内含子划分为10个结构域，并分别命名为P1~P10，其催化中心位于P4-P6（P4, P5, P6）和P3-P9（P3, P7, P8, P9）结构域的交界处，P1和P10则分别为5’和3’剪接位点（splice site），而其他围绕着保守的催化中心的序列则负责维持核酶的稳定性和正确折叠（图3）。图3：Tetrahymena thermophila I型内含子的二级结构示意图利用I型内含子自剪接的特点进行改造的体外合成环状RNA系统正是目前最为常见的体外合成环状RNA的技术，该技术也被称为PIE法（permuted introns and exons），只需GTP和Mg2+就能实现RNA的连接（图4）。图4：PIE法制备环状RNA的原理用于PIE合成的体外转录模板通常采用来自Anabaena tRNALeu基因或T4噬菌体的胸苷酸合成酶（thymidylate synthase, td）基因上的I型内含子序列，这两种I型内含子都已被证实可以高效促进RNA的环化。以td基因内含子改造的PIE系统为例（图5），它主要包含td内含子的5’端内含子序列（5H）、3’端内含子序列（3H）、相邻外显子序列（E1和E2）、内部引导序列（internal guide sequence, IG）、待环化的RNA（RC）以及为促进折叠和稳定内含子而添加的末端同源臂序列。RNA的环化过程大致如下：（1）一个鸟苷亲核物插入RC-5H交界处（5’ SS）并置换RC的3’末端；（2）该鸟苷继续进一步插入3H-RC交界处(3’ SS)，在与RC 5’末端连接时取代3H的3’末端，从而形成环状RNA。由于该催化反应的关键是E1和E2与内含子序列发生碱基互补配对，因此E1和E2序列也都会被纳入新生的环状RNA中。图5：I型内含子PIE系统的二级结构示意图与化学连接和酶促连接相比，PIE方法可用于较大片段的线性RNA前体环化，而且其反应条件和纯化方法也比较简单。现有的研究已经可以通过设计特定的PIE转录模板对几乎任何序列的线性RNA前体进行高效的环状RNA合成。基于以上优势，PIE法是目前研究最多和使用最广泛的RNA连接方法。然而PIE方法仍存在明显缺陷：1. 由于RNA二级结构的复杂性，不同的RNA序列会导致最终形成的环状RNA结构存在巨大差异；2. 此外，由于外源外显子序列的引入，最终形成的环状RNA序列将与原始的线性RNA前体序列不同，这可能会对环状RNA的功能验证产生负面的影响。2） II型内含子自剪接系统（Group II intron self-splicing system）:II型内含子（Group II introns）是一类发现于细菌和细胞器基因组中的可移动遗传物质，它们被认为是真核生物中剪接体内含子和逆转录转座子的祖先，其包含一个具有催化活性的内含子RNA（“核酶”）和一个内含子编码蛋白（intron-encoded protein，IEP），两者共同介导内含子在基因组内进行增殖。II型内含子RNA通过与剪接体内含子类似的转酯反应催化其自身的剪接，产生拼接的外显子和一个切下来的内含子套索RNA（lariat RNA）。IEP是一种多功能的逆转录酶（reverse transcriptase, RT），它能通过稳定具有催化活性的RNA结构来协助剪接。在剪接后，IEP还会与切除的内含子RNA相连，组成一种可以入侵基因组DNA的核糖核蛋白（Ribonucleoprotein, RNP）（图6A）。II型内含子RNA同样具有保守的二级结构，其长度为400~800 nt，大致可分为六个区域DI-DVI（也可称为D1-D6），它们从结构上来看就像一个“车轮”（图6B）。其中DV是活性位点的核心，包含所谓的催化三碱基（catalytic triad）“AGC”和一个“AY”（Y代表碱基C或T）凸起，这两者都能结合具有重要催化作用的Mg2+离子；而DVI包含一个隆起的腺苷作为分支位点（branching site），其2’-OH基团用于亲核攻击内含子5’剪接位点上的磷酸基团，起始剪接反应并形成套索RNA。DI是最大的结构域，包含上下两半部分，其中的EBS1可以与5’剪接位点交界处的内含子结合位点（IBS1）配对，以确定剪接的确切位置；DII和III是两个较小的结构域，对组装活性内含子结构和激活剪接反应方面起着关键作用，其中DIII还可作为“催化效应器”来加速催化反应；DIV是一个茎环（stem-loop）结构，其loop序列上包含maturase（成熟酶）的ORF，靠近其5’端的亚结构域DIVa含有一个对IEP具有高亲和力结合位点（图6B）。II型内含子RNA还具有保守的5’和3’端序列，分别是GUGYG和AY，其与剪接体内含子的保守序列相似（即GU. . . AG）。图6：II型内含子的工作原理及二级结构示意图II型内含子序列上的一系列保守结构域（包括由希腊字母命名的结构域、外显子结合位点EBS和内含子结合位点IBS）还能通过远距离的三级相互作用形成保守的三级结构，进而将相距甚远的序列凝聚在一起形成新的活性部位，该活性部位会结合剪接位点和分支点（branch-point）的核苷酸残基，然后在Mg2+的帮助下来催化连接反应。科学家们基于II型内含子的自催化特性开发出了另一种体外合成环状RNA的PIE技术——利用反向剪接反应（inverse splicing）将一段RNA末端的5’剪接位点与该RNA的3’剪接位点连接起来形成环状RNA（图7）。图7：II型内含子PIE系统的原理图中科院上海营养与健康研究所的王泽峰研究员课题组及其创立的环码生物医药公司在基于II型内含子环化特性开发的体外环化技术以及环状RNA的体外翻译机制领域就取得了较大突破。他们于2022年发表了一个基于II型内含子环化且适用于大规模生产的体外RNA环化新技术，该技术可以实现高效共转录环化RNA的同时又能避免掺入无关序列，而且该环状RNA可以在细胞和小鼠体内进行高效翻译的同时又不会引起严重的先天性免疫反应。具体来说，他们是对来自破伤风杆菌表层蛋白（surface layer protein of Clostridium tetani, ctSLP）的一个II型内含子上的某个loop区域进行了切割，构建了一种分裂的内含子（split-intron）环化系统，然后将需要环化的序列插入到两段内含子中间，该环化序列两端还分别包含两个6 nt的短序列IBS3和IBS1。在体外转录时，RNA前体会通过II型内含子介导的自我剪接反应产生一个包含目的序列的环状RNA和一个分支状内含子RNA（branched intron RNA），该系统也被他们命名为“CirCode”，可以作为一个通用的平台来生产任何指定序列的环状RNA并用于蛋白质翻译（图8）。图8：环码生物体外环化技术CirCode系统的工作原理示意图3） 发夹状核酶（Hairpin ribozyme, HPR）HPR可以单链环状DNA为模板通过滚环（rolling circle）反应和自剪接反应产生环状RNA。带有HPR的线性RNA前体会折叠成两种具有切割活性的构象以暴露出3’端和5’端，进而通过自发连接成环状RNA（图9）。这种方法可以高效生产较短的环状RNA，但它的劣势在于由HPR催化的裂解和连接是一种动态平衡，这会导致形成的环状RNA并不稳定；此外，生成的环状RNA中会包含HPR序列，可能对环状RNA的功能产生不利影响。图9：核酶合成环状RNA的策略综合来看，在以上所有酶促连接合成环状RNA的方法中，PIE法显示出较明显的优势，并且被广泛用于基础研究和工业生产中（表1）。但值得注意的是，不同环化策略合成的环状RNA所触发的人体细胞免疫反应程度存在较大差异：中国科学院分子细胞科学卓越创新中心的陈玲玲团队于2021年报道，由I型内含子自剪接系统合成的环状RNA会分别引入~74 nt（td）或~186 nt（Anabaena）的外源序列，这些外源序列会触发较强的先天性免疫反应；相比之下，由T4 RNA连接酶合成的无外源序列掺入的环状RNA表现出最小的免疫原性。表1体外合成环状RNA的方法对比体内合成环状RNA的技术方法与体外合成环状RNA不同，体内合成环状RNA主要采用在活细胞中过表达促进环化的迷你基因序列的质粒载体来实现，待环化的序列会在转录后通过反向剪接反应自然环化。大多数体内RNA环化的迷你基因中包含至少一个待环化的外显子序列以及含有剪接元件的5’和3’端的内含子顺式元件。通过使用不同组合的内含子顺式元件，该技术几乎可以环化任何长度的序列（100 nt到5 kb），内含子顺式元件大致分为四种：(1)具有互补序列的内含子；(2)含有特定蛋白质结合位点的内含子；(3)具有核酶活性的内含子；(4)来自后生动物tRNA的内含子（图10）。2.1 内含子互补序列（intronic complementary sequences, ICS）合成环状RNA根据现有的全转录组高通量测序结果可知，大多数内源性环状RNA的两侧内含子上富含能够反向互补的序列，这些反向互补的侧翼内含子序列通过互补配对拉近待环化序列的上游受体和下游供体剪接位点在空间上的距离，进而促进反向剪接反应的发生。内含子互补序列（ICS）绝大部分来自生物内源基因上的重复片段或非重复片段，也有少量ICS是通过计算机模拟设计出来的，目前科学家们已经能够利用这种内源性的环状RNA形成机制将指定的RNA序列制备成环状RNA。2.1.1 重复性ICS在人类和灵长类动物中最常见的重复序列是Alu元件，它是约300 nt长的富含腺嘌呤（A）的保守序列，由一类短间隔重复元件（short interspersed repeat elements, SINEs）的逆转录元件进化而来。据估计，Alu元件约占人类基因组的11%，尤其在蛋白质编码基因的内含子中大量存在。除了使用灵长类动物内源基因上的Alu元件，还可以使用非灵长动物中能促进环化的内源基因内含子序列，例如来自Zkscan1、Hipk3和Laccase2等基因的内含子（图10）。2.1.2 非重复性ICS非重复性的内源性ICS包括所有跨越侧翼内含子的反向互补序列，例如在小鼠中能产生大量环状RNA的Y染色体性别决定区基因（sex-determining region-Y, Sry）就是一个含有非重复互补序列内含子的典型案例。通过RNA-seq可知在人体内源性环状RNA两侧的内含子中也存在大量的非重复性ICS序列，它们即使只有30~40 nt长也足以进行环化（图10）。2.2 特定蛋白质结合位点合成环状RNA研究表明多种RNA结合蛋白（RNA binding proteins, RBP）在生物体内有促进反向剪接的功能，因此我们可以将这类蛋白的结合位点整合到过表达环化载体中以介导目的RNA的环化。2.2.1 Musclebind (MBL)在果蝇和人类中，RBP蛋白Muscleblind（MBL）可与基因组上特定的保守位点结合促进这些基因座的RNA反向剪接。2014年就有研究人员将MBL结合位点应用到环状RNA的体内合成技术当中，并成功地在果蝇体内和人类细胞中实现高效的环状RNA表达（图10）。2.2.2 Quaking (QKI)RBP蛋白Quaking是另一个能促进反向剪接的反式作用因子，它首次在小干扰RNA（siRNA）的筛选中被发现，并被证明可以调控环状和线性RNA剪接产物的比例。后续研究发现它的作用机制与MBL蛋白大致相同，将QKI结合位点（ACTAACN1-20TAAC）引入到环化序列两侧内含子上就可以促进RNA的体内环化（图10）。除了上述介绍的RBP，还有NF90/110、RBM20、Fus、DHX9等蛋白可以调控环状RNA的体内合成。然而，目前对于这种将RBP结合位点引入到环化载体上的设计是否会存在不利的影响还不太清楚，后续还需要更深入的研究来了解RBP介导的环化反应机制。图10：体内合成环状RNA的方案2.3 使用tRNA内含子合成环状RNA在2015年一项针对果蝇的RNA-Seq分析结果显示，有一类含量丰富的tRNA内含子环状RNA（tRNA intron circular RNAs, tricRNAs）可以既不依赖剪接复合物（spliceosome）也不依赖自催化剪接反应独立产生。它们主要是由一组高度保守的宿主酶对含有内含子的tRNA前体进行切割后，由宿主连接酶RctB对切除的内含子进行分子内连接产生的。该系统已被证明能够在人类和果蝇细胞系中合成长度在75到800 nt的环状RNA：通过在含有果蝇tRNA基因骨架的内含子切割位点之间插入需要环化的RNA序列，就可以产生想要的环状RNA（图11）。图11：基于tRNA设计的体内合成环状RNA方案2019年有研究人员对该系统进行了优化，他们将一段具有自剪接能力的核酶序列取代了tRNA骨架，进一步提高了环化的效率，这种新的质粒构建被称为“龙卷风（Tornado）”系统，它在高效合成与小分子靶标结合的功能性环状RNA适配体（aptamer）方面具有强大的优势。2.4 使用PIE系统合成环状RNA在前文描述的体外合成环状RNA技术中属PIE法同样可以应用于体内合成环状RNA。假如在质粒载体中插入改造过的I型内含子PIE序列，将其转染到细胞中就可以获得目的序列的环状RNA。与上述体内环化系统不同，含有PIE序列的质粒首先会产生线性转录物，然后通过核酶介导的自剪接反应进行环化。早在90年代就已利用PIE法在大肠杆菌和酵母体内使用改造后的td基因骨架的质粒实现了环状RNA的体内合成。通过替换不同的外显子序列，此方法可以在生物体内（主要是细菌和真菌）稳定地合成各种中短长度的环状RNA（71~1130 nt），这种方式生成的环状RNA类似于从相同PIE序列的IVT反应中获得的剪接产物。但是在2017年的一项研究发现，将含有PIE序列的质粒转染到HeLa细胞中会强烈刺激细胞产生先天性免疫信号，导致转染细胞死亡；然而一个具有相同外显子序列但由ZKSCAN1基因内含子介导体内合成的环状RNA不会导致细胞死亡。造成该现象的原因可能是内含子序列的身份来源影响了环状RNA引起的先天性免疫反应，该发现也提醒我们免疫原性是我们在选择体内还是体外环化系统时必须要考虑的问题，其中体外环化系统可能更适合于没有哺乳动物mRNA剪接和先天性免疫信号系统的非后生动物，关于体内合成环状RNA方法的优劣势对比可参见下表（表2）。表2体内合成环状RNA的方法对比国内外各大环状RNA公司所采用的合成方法因为环状mRNA治疗是近几年才兴起的生物医药领域，所以开发环状RNA治疗的公司相对较少并且都很年轻。在国际上主要以ORNA Therapeutics和Laronde为代表，前者于2022年8月16日刚刚完成2.21亿美元的B轮融资，并且还与默沙东（MSD）公司达成一项总额高达36.5亿美元的合作协议；后者则获得了曾孵化Moderna公司的Flagship的4.4亿美元B轮融资。3.1 Orna Therapeutics该公司于2021年由来自麻省理工学院（MIT）的纳米治疗领域的顶级学者Daniel G. Anderson教授创办，它致力于开发一种完全工程化的环状RNA——oRNA疗法，用以治疗各种疾病，包括癌症、自身免疫性疾病和遗传性疾病。值得一提的是，Anderson实验室正是最早改造鱼腥藻（Anabaena）I型内含子实现体外合成长编码环状RNA的团队，因此Orna公司的环状RNA合成技术也主要采用了I型内含子自剪接系统（图3）。图12：oRNA合成策略Orna公司目前最为领先的项目是原位嵌合抗原受体（CAR）疗法（isCARTM，一种抗CD19的CAR），该疗法结合了oRNA和定制化的脂质纳米颗粒（LNP），可在患者体内制造出改良的免疫细胞用于治疗癌症。为此该公司还开发了一个专有的FoRCE筛选平台用于筛选新的IRES元件，新型IRES能够显著促进oRNA的表达水平（图13）。图13：FoRCE 筛选平台（来源：Orna）Orna在2020年5月后已申请了至少六项与环状mRNA组成和技术相关的专利，所有这些专利申请都披露了环状RNA的结构（包括IRES元件、间隔序列、序列修饰、稳定性）、环状RNA-LNP配方和CAR疗法的传递效率等实验数据。3.2 LARONDELARONDE公司由Flagship Pioneering公司于2021年5月成立，它致力于开发一种名为Endless RNATM（eRNA）的工程化环状RNA，用以表达治疗性蛋白质。LARONDE的知识产权由Flagship Pioneering公司拥有，其申请的专利涵盖了从环状RNA结构、疫苗接种、异源蛋白表达和治疗用途等应用的各个方面，目前已提交了至少12项专利，这其中也包含针对SARS-CoV-2的环状RNA疫苗。尽管LARONDE官网并没有太多它所使用的环状RNA技术的信息，但从其提交的专利来看，该公司主要采用的是T4 Dnl/Rnl连接的方式进行RNA环化。国内环状RNA治疗的生物公司呈现百花齐放百家争鸣的发展趋势，各个环状RNA公司的RNA环化技术各具特色，同时基于环状RNA的递送技术平台、肿瘤免疫、传染病治疗和基因治疗等项目上也在迅速推进。3.3 北京圆因生物（THERORNA）圆因生物于2021年4月由北京大学生命科学学院魏文胜教授创立，魏文胜教授也是基因编辑公司博雅辑因的科学创始人。圆因生物在2022年6月完成近3亿元的A轮融资，专注于利用其专有的环状RNA技术平台来开发下一代疫苗和创新疗法，特别是针对SARS-CoV-2的疫苗。他们在2022年5月发表的Cell文章中报道了编码SARS-CoV-2 spike三聚体RBD抗原的环状RNA疫苗能够在小鼠和猕猴体内引起有效的中和抗体和T细胞反应，且针对SARS-CoV-2野生型及突变株设计的不同环状RNA疫苗均能给提供有力的免疫保护（图14）。他们已于2021年8月提交了相关专利。从专利和文献中可以看出，圆因生物公司主要采用的是与ORNA公司类似的Anabaena I型内含子自剪接系统进行环状RNA的体外合成（图14）。图14：基于I型内含子自剪接的CircRNARBD环化示意图3.4 苏州科锐迈德（Curemed）苏州科锐迈德于2021年8月成立，尽管这是一个相当年轻的公司，但他们已发表了至少四篇基于环状RNA制备、肿瘤治疗和递送的论文，展示出其在环状RNA领域的巨大潜能。科锐迈德目前主要的研究成果包括：1）研发了一种针对新冠病毒的环状mRNA疫苗-cmRNA-1130，该环状mRNA疫苗可在小鼠体内诱导强大的免疫激活以及CD4+ T和CD8+ T细胞；2）在小鼠模型上首次证实了直接肿瘤内注射环状 mRNA 编码的细胞因子混合物，能够调节瘤内系统性抗肿瘤免疫反应，并增强抗 PD-1 单抗的肿瘤抑制效果；3）开发了基于环状mRNA的新型靶蛋白降解平台，利用环状mRNA编码bioPROTAC分子来降解靶蛋白，并将其命名为RiboPROTAC。在环化技术上，科锐迈德还建立了一套基于T4 td基因I型内含子自剪接的剪接位点自动化筛选优化系统，该系统可以找到最优成环位点，然后通过蛋白编码区或IRES连接成环实现无外源序列引入的环状RNA，且成环效率超过90%，该新型环状RNA体外合成技术被命名为“Clean-PIE”（图15）。据悉该成环系统已申请专利，在核酸疫苗、蛋白替代、基因治疗等领域具有良好的应用前景。图15：基于I型内含子自剪接系统开发的Clean-PIE系统3.5 环码生物（Circode Bio）环码生物成立于2018年，由在RNA领域深耕多年的中科院上海营养与健康研究所的王泽峰研究员和杨赟副研究员联合创立。王泽峰团队在2014年发现环状RNA可在人细胞内翻译生成不同功能的蛋白，颠覆了环状RNA是非编码RNA的认知，并开创了环状RNA作为一种新型mRNA疗法的应用。该公司已于2021年完成天使轮和Pre-A轮融资。环码生物拥有自主研发的体外环化专利，该环化技术利用了II型内含子自剪接核酶的活性可在体外环化任意长度的RNA（2~10 kb），该技术具有无外源序列残留、环化产物均一、环化效率高（60%~90%）、反应条件温和等特点，适合于工业化放大（图8）。此外，环码生物也非常注重对序列元件的系统性优化，他们建立了一套基于环状RNA的高通量筛选系统，用于高效筛选翻译起始元件，目前已完成数百万条序列的筛选并获得了大量翻译起始元件。在此基础上，还利用计算生物学的方法建立了针对环状RNA的序列设计优化平台，该平台可以设计优化翻译起始元件及编码区序列从而实现环状RNA的高效翻译。3.6 启环生物苏州启环生物医药成立于2022年3月，其首席科学家是在circRNA领域有着十余年研究积累的中国科学技术大学生命科学与医学部单革教授。启环生物专注环状RNA在生物预防和治疗方向的研发与应用，成立之初就不断探寻新的体外剪接成环方式，结合经典I型和II型内含子结构研究，进而建立了独创的结构组件和环化系统。目前已在IRES、体外环化和circRNA纯化技术方面突破国际专利壁垒，实现体外合成circRNA在生物治疗产业的技术革新，并提交多项国内外专利。启环公司利用自主研发的成环系统结合高效IRES翻译起始元件，已与国内外相关企业合作，在多条基于circRNA表达和调控的生物疗法管线进行布局。3.7 吉赛生物吉赛生物成立于2010年6月，是国内最早（2014年）布局环状RNA领域的公司，拥有深厚的原创技术积淀，已获得环状RNA领域国家发明专利12项。目前拥有全球独有的环化核心专利技术，已完成环状RNA制备整套生产工艺体系开发，建立了四大技术平台：环状RNA序列设计优化平台、环状RNA生产制备平台、环状RNA纯化平台、核心原料酶生产平台，可为全球环状RNA药物研发企业提供CRO服务和原料酶产品。从已申请的专利来看，吉赛生物主要采用T4 Rnl2连接进行环状RNA的体外合成。此外吉赛生物生信部还联合多伦多大学创建了专门的circBank数据库（网址：http://www.circbank.cn/），为环状RNA研究者提供最全面的人类环状RNA注释、circRNA-miRNA调控、翻译潜能预测、疾病突变位点、m6A修饰和环状RNA结构可视化等信息。总结与展望环状RNA因其卓越的稳定性有可能成为一个有效和安全的新一代疫苗接种平台。此前人工合成环状RNA大多是依靠以生物化学为基础的体外策略，但近年来出现了一些基于分子生物学的新方法，使得环状RNA可以直接在活细胞中产生。可以想象在未来将会诞生更多优良和标准化的人工环状RNA制备方法，而这些先进的环状RNA制备方法也必将大幅推进环状RNA生物学功能和分子机制的研究进程。参考资料[1] Chen R, Wang S K, Belk J A, et al. 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「  本文共：15条资讯，阅读时长约：3分钟 」今日头条君实CGRP单抗报偏头痛IND。君实生物CGRP单抗JS010获国家药监局临床试验默示许可，拟用于预防成人偏头痛。临床前研究显示，JS010能够有效结合α-CGRP或 β-CGRP多肽，阻断其与受体结合，从而抑制细胞内cAMP信号通路，进而发挥预防偏头痛的作用；而且研究期间动物对JS010的耐受性良好。该新药也是国产首款进入临床阶段的CGRP靶向药物。国内药讯1.默沙东新冠口服药在华获附条件批准。国家药监局附条件批准默沙东小分子新冠药莫诺拉韦胶囊（商品名称：利卓瑞/LAGEVRIO）的进口注册。这是一款强力核糖核苷类似物，用于治疗重症高风险的轻中度新冠病毒感染(COVID-19)成人患者，例如伴有高龄、肥胖或超重、慢性肾脏疾病、糖尿病、严重心血管疾病、慢性阻塞性肺疾病、活动性癌症等重症高风险因素的患者。国药集团拥有该新药的国内独家授权。2.艾司奥美拉唑镁在华获批用于12岁以上人群。阿斯利康艾司奥美拉唑镁（耐信）获国家药监局批准新适应症，用于12岁及以上青少年胃食管反流病（GERD）的治疗。艾司奥美拉唑镁是阿斯利康原研的一款质子泵抑制剂，通过与胃壁细胞上的H+-K+-ATP酶（俗称质子泵）不可逆性结合，从而发挥抑酸作用。这款原研药已于2002年获批进入国内，用于治疗胃食管反流性疾病、糜烂性反流性食管炎等。3.传奇生物BCMA靶向CAR-T国内报产。传奇生物靶向BCMA的CAR-T疗法西达基奥仑赛注射液（Cilta-cel）上市申请获CDE受理，拟用于治疗复发/难治性多发性骨髓瘤（r/r MM）患者。在2022 ASH年会上公布的II期（CARTIFAN-1）临床数据显示，在以往接受过三线以上治疗的r/r MM患者中，ORR达到89.6%，77.1%达到CR，18个月PFS和OS分别为66.8%和78.7%。该产品已获得FDA、EMA以及日本厚生劳动省的上市许可。4.百济神州PD-1单抗报肝癌NDA。百济神州PD-1替雷利珠单抗（百泽安）新适应症上市申请获国家药监局受理，用于治疗一线不可切除或转移性肝细胞癌（HCC）。公布于ESMO大会上的最新RATIONALE 301研究数据显示，替雷利珠单抗与对照药相比达到总生存期（OS）非劣效性的治疗效果（中位OS：15.9个月vs14.1个月）。这也是该产品在国内申报上市的第12项适应症。5.荣昌c-Met靶向ADC在美获批临床。荣昌生物新型ADC注射用RC108获FDA临床许可，拟用于治疗c-Met表达阳性的实体瘤患者。RC108是由c-Met靶向抗体、连接子以及小分子细胞毒素组成，可通过靶向结合c-Met阳性的肿瘤细胞，介导抗体的内吞，从而有效地将细胞毒素定向传递给癌细胞，实现较好的肿瘤杀灭效果。该新药目前正在国内开展针对c-Met阳性晚期实体瘤的I期临床。6.赛岚表观遗传学新药获批临床。赛岚医药1类化药CTS2016胶囊获国家药监局临床试验许可，拟用于治疗复发/难治性急性髓系白血病（AML）或中高危骨髓增生异常综合征。CTS2016是一款靶向肿瘤关键通路的特异性抑制剂，尤其对于恶性血液肿瘤的各种复发难治耐药突变也有出色的抑制效果；单药或联合治疗均展示出对AML细胞增殖、周期、凋亡等方面的抗肿瘤药效。赛岚医药计划尽快开展这项Ⅰ期临床。7.安徽安科长效生长激素获批临床。安科生物1类生物制品AK2017注射液获国家药监局临床试验默示许可。这是一款重组人生长激素-Fc 融合蛋白注射液，其N端的氨基酸序列与人生长激素的氨基酸序列完全相同，C端的Fc能够延长半衰期，能够减少给药频次并提高患者用药依从性。该新药为首次获批临床，拟开发用于因内源性生长激素缺乏所引起的儿童生长缓慢。‍‍‍‍国‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍际‍‍‍‍药‍讯‍‍1.FDA批准烧伤去焦痂新药上市。MediWound公司植物来源的蛋白水解酶非手术局部疗法NexoBrid（anacaulase）获FDA批准上市，用于严重烧伤患者，移除其深度部分皮层烧伤和/或全皮层烧伤的焦痂。临床汇总数据显示，与标准护理相比，NexoBrid可以达到95%及以上的焦痂移除；而且焦痂移除时间更短、需要手术移除焦痂的比例更低。这也是FDA于2022年批准的第37款创新药。2.心肌病基因编辑疗法临床前研究积极。美国德克萨斯大学西南医学中心开发的CRISPR-Cas9基因编辑疗法在人类细胞和扩张型心肌病（DCM）的小鼠模型中获积极结果。研究显示，经CRISPR-Cas9基因编辑后，携带DCM致病突变RBM20的心肌细胞逐渐失去DCM固有的特征：由RBM20产生的蛋白移到了细胞核中的正常位置，这些细胞开始制造负责心脏泵送作用的健康蛋白。治疗后这些小鼠模型未出现心脏扩大，并有正常的寿命。研究结果发表在Science子刊。3.维生素D可降低新冠感染和死亡风险。约翰·霍普金斯大学的研究人员在 Scientific Reports 期刊发表题为：Association between vitamin D supplementation and COVID-19 infection and mortality 的研究论文。这是一项大规模的药物流行病学研究，评估维生素D3和维生素D2补充与COVID-19感染和感染后30天内死亡风险的关联。结果显示，补充维生素D与新冠感染风险和感染后30天内死亡风险显著降低有关。4.新冠感染后鼻腔抗体可维持9个月。伦敦帝国理工大学与利物浦大学的联合研究团队在评估446例新冠感染者血液和鼻腔样本以了解抗体可持续时间的一项研究成果发表在The Lancet旗下期刊EBiomedicine上。研究发现，人体在感染新冠4周后其鼻腔开始产生抗体，并可持续9个月；血液中的抗体在感染2周后出现，并持续至少一年；疫苗接种可有效增强人体血液中的抗体水平，但并不会显著增加其鼻腔内抗体的水平；针对新冠病毒的鼻腔喷雾或吸入式疫苗为预防二次感染的关键。‍‍‍‍‍‍‍‍医‍‍‍‍‍药‍‍‍‍‍‍‍‍热‍‍‍‍‍点‍‍‍‍‍‍‍‍1.上海已测到XBB毒株。近日，瑞金医院陈赛娟与公卫中心范小红联合团队经过初步分析，监测到上海近期30个奥密克戎主要亚型中，有在欧美广泛流行的BQ.1家族和XBB家族，占比超过1/3。其中25例XBB家族中，有3例XBB.1.5，为境外输入病例，未造成本土传播。美国疾控中心12月30日的数据显示，估计当周美国有40.5%新冠病毒感染病例是“免疫逃逸”能力极高的奥密克戎亚型毒株XBB.1.5毒株引起的。2.上海一线医护收到6000元补贴。上海市卫健委近日发布《关于保障抗疫一线医务人员力量的工作意见》的通知，提出疫情防控面临新形势新任务，广大医务人员承担非常繁重工作任务，要进一步保障抗疫一线医务人员力量。通知要求，在落实绩效激励方面，按要求向市、区两级医疗机构中直接参与新冠病毒感染防疫和救治一线工作的医务人员发放相关补助。补助发放对象包括上海市、区公立医院和急救中心(含急救车的驾驶员、担架员)、社区卫生服务中心等。目前上海一线医务人员已陆续收到6000元的一次性津贴。3.4人被撤销副主任医师资格。日前，科技部网站发布《部分高校医学科研诚信案件调查处理结果公开通报情况汇总（2022年12月26日）》，共通报了18起科研诚信案件调查处理结果。其中大多为论文存在买卖论文数据、不当署名等行为，共处理39人次。其中2人被撤销博士学位，3人被撤销博士学位申请资格，1人被撤销硕士学位，1人留校察看，12人次被撤销研究生招生资格1年-5年，4人被撤销副主任医师资格。‍‍‍‍‍‍评‍‍‍审‍‍动态‍‍‍‍‍‍  1. CDE新药受理情况（01月01日)   2. FDA新药获批情况（北美12月29日）股市资讯上个交易日 A 股医药板块 -0.42%涨幅前三     跌幅前三富祥药业 +9.64%  C 川 宁 -10.14%上海莱士 +6.56%  众生药业 -8.69%葵花药业 +6.43%  海辰药业 -7.42% 【众生药业】控股子公司广东众生睿创生物科技有限公司组织开展的一类创新药物RAV1216片，其用于治疗轻型和普通型SARS-CoV-2感染患者的随机、双盲、安慰剂对照“期临床研究，已完成全部病例数入组。【君实生物】口服核苷类抗SARS-CoV-2药物VV116片已完成一项对比奈玛特韦片/利托那韦片组合药物(PAXLOVID)用于伴有进展为重度包括死亡高风险因素的轻至中度新型冠状病毒感染患者早期治疗的III期临床研究，VV116在持续临床恢复时间方面不劣于PAXLOVID，且安全性问题较少。【科兴制药】全资子公司深圳科兴药业有限公司的新冠小分子口服药SHEN26胶囊"期临床研究成功完成全部受试者入组，研究结果显示，SHEN26胶囊可以缩短轻症、普通型新型冠状病毒感染患者的核酸转阴时间，且安全性良好。- The End -戳“阅读原文”，了解更多医药研发及股市资讯。