HPRT1

摘要：中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是生物制药领域最核心的 “细胞工厂”，承担了 89% 哺乳动物来源生物药的生产任务。传统随机转基因整合（RTI）技术虽沿用 40 余年，但因克隆异质性高、稳定性差等问题，成为制约行业效率的瓶颈。近年来，转座酶介导的半靶向整合（STI）和CRISPR/Cas9、重组酶等靶向整合技术的突破，将细胞系开发带入精准调控时代。本文深度解析技术原理、行业应用及未来趋势。一、传统技术困境：随机整合的 “黑箱” 模式1. 随机整合（RTI）的核心缺陷 克隆异质性：线性化质粒随机插入基因组，导致克隆间产量差异可达 10 倍以上，仅 1-2% 的克隆符合工业标准（图 2）。 图 2：RTI 工作流程：展示线性化质粒转染→MTX/GS 筛选→单克隆筛选的全流程。 稳定性风险： 串联重复（Concatemers）：易引发基因重排或沉默，导致 30% 以上克隆在传代中丧失高产特性。 表观遗传调控：启动子甲基化（如 H3K9me3 修饰）直接抑制基因表达，成为克隆淘汰的主因。 开发周期冗长：需经历 “转染→扩增→单克隆筛选” 三阶段，典型周期长达 30 周，且需筛选数千克隆（表 1）。 2. 筛选技术的迭代升级 预测性筛选工具： 线粒体膜电位检测：通过 JC-1 染色评估细胞代谢活性，与产量相关性达 0.85。 细胞表面抗体展示：利用 “冷捕获” 技术在 4℃下富集高产克隆，筛选效率提升 5 倍。 高通量平台： 纳米液滴技术：单芯片可处理 5,000 + 克隆，实现 72 小时内完成池筛选（表 1）。二、技术革新：精准整合的 “三大武器”1. 转座酶介导的半靶向整合（STI） 作用机制： 转座酶 - 转座子系统：如 PiggyBac 识别 TTAA 序列，将基因盒插入转录活跃区（图 4）。 图 4：STI 机制：PiggyBac 转座酶识别 ITR 序列，实现基因盒跳跃式整合。 超活性改造：通过氨基酸突变（如 PiggyBac 的 7 位点突变），整合效率提升 17 倍。 技术优势： 产量提升：稳定池产量达 5-7.6g/L，克隆产量比 RTI 高 2-3 倍（表 3）。 开发加速：从转染到临床材料仅需 3 个月，新冠抗体生产中已验证可行性。2. 靶向整合（SSI）：从 “定点” 到 “精准” 重组酶系统： Cre-loxP：在 Hprt1 位点实现多拷贝整合，单克隆产量达 1.5g/L。 Flp-FRT：结合 “矩阵附着区”（MAR）元件，提升基因表达稳定性。 CRISPR-PITCh 技术： 双切口策略：通过 HDR 途径将基因盒插入安全位点（如 C12orf35），整合效率提升至 20%（图 6）。 图 6：CRISPR-PITCh 技术：通过同源臂引导实现 Hprt1 位点的精准整合 多基因共表达：在 GRIK1 位点同时整合轻链 / 重链基因，实现双特异性抗体生产。3. 技术对比与选择 技术优势局限性适用场景RTI无需基因编辑工具异质性高、周期长传统单抗生产STI池产量高、开发快拷贝数不可控紧急药物（如新冠抗体）SSI稳定性最佳需预筛选安全位点复杂分子（如双抗）三、行业影响与未来方向1. 成本与效率革命 时间压缩：STI 技术使临床候选克隆筛选周期缩短 40%，从 7-9 个月降至 4-5 个月。 质量提升：靶向整合克隆的糖基化一致性提升 15%，电荷异质性降低 10%。2. 技术融合趋势 CRISPR - 转座酶联用：利用 dCas9 引导转座酶至特定区域，实现 “靶向半整合”（图 7）。 图 7：核酸酶介导的位点特异性整合机制 表观遗传调控：结合组蛋白修饰（如 H3K27ac）筛选安全位点，提升整合效率。3. 监管与伦理挑战 稳定池应用：需解决 “多克隆混合生产” 的监管接受度问题，新冠案例推动政策讨论。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观不本站。

摘要：在生物医药研究、诊断和不同疗法中使用的重组蛋白大多是在制药工业中的中国仓鼠卵巢细胞中生产的。这些生物治疗药物，特别是单克隆抗体，在过去几十年中显示出显著的市场增长。对大量生物制剂日益增长的需求要求不断优化和改进生产技术。研究旨在发现更好的手段和方法以达到更高的体积容量，同时保持稳定的产品质量。越来越多的复杂新型蛋白治疗药物，如病毒抗原、疫苗、双特异性和三特异性单克隆抗体，目前正进入工业生产管线。这些生物分子在许多情况下难以表达，需要针对产品特定的解决方案来改善它们的瞬时或稳定生产。所有这些要求推动了更高效表达优化系统和高通量筛选平台的发展，以促进产品特定的细胞系工程和生产策略的设计。在这篇简评中，我们提供了关于CHO细胞系开发、靶向基因操作技术、选择系统和目前在重组蛋白生产中使用的筛选方法的最新进展的概述。 1.介绍 生物治疗药物和诊断（治疗诊断学）是制药市场中迅速增长的产品。它们包括各种单克隆抗体（mAbs）、疫苗、激素和其他蛋白质，所有这些都有广泛的应用。自2002年以来，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准了300多种生物制药，并且这一数字还在增长，因为生物制剂（蛋白质、核酸、糖及其复合物）正在进入诊断和治疗的越来越多的领域。满足这些产品日益增长的需求仍然是一个挑战，并推动了制造过程中的不断创新。策略旨在优化蛋白质表达，以实现更高的体积生产率，同时保持稳定的产品质量和较低的制造成本，并缩短时间。可用的生物制剂中很大一部分是重组蛋白，其中大多数是在哺乳动物表达平台中生产的。在这篇综述中，我们专注于这个表达系统，尽管还有其他系统可用于生产活性重组蛋白，并正在评估其在制药工业中的潜在应用。哺乳动物细胞倾向于成为工业生物制药生产的主导宿主，主要是因为它们能够产生多样化、正确折叠和糖基化的蛋白质。在过去十年中，翻译后修饰的重要性，特别是糖基化，以及它们如何影响重组蛋白的不同属性的问题，引起了广泛关注。广泛的研究导致发现，为了潜在的治疗用途，大型和复杂的蛋白质需要具有类似人类的翻译后修饰，才能具有功能性和非免疫原性。不同小组的几项研究表明，适当的糖基化轮廓促进生物活性和稳定性，增加半衰期并减少蛋白质治疗药物的免疫原性。 2.用于制药重组蛋白表达的CHO表达平台 基于哺乳动物表达的系统涉及各种不同来源的细胞系，包括仓鼠（CHO, BHK）、人类（HEK293, HT-1080, PER.C6, CAP, HKB-11, Huh-7）和小鼠（NS0, Sp2/0）。然而，70%的生物制剂，几乎所有的单克隆抗体，都是在仓鼠卵巢（CHO）细胞中生产的，作为生物制药蛋白生产的最常用和首选宿主。它们的流行在于它们能够高生产率（批培养中0.1–1 g/L，在补料批培养中1–10 g/L），表现出一致的良好生长表型，适合大规模工业培养，可以轻松适应各种化学定义的培养基，对人类病毒的感染不太敏感，并且能够进行与人类兼容的糖基化。CHO ori细胞系是由Theodore Puck在1956年分离和永生化的。然后通过引入突变或适应不同的培养条件进一步开发亚克隆。与亲本细胞系相比，CHO ori衍生的细胞系具有特定的属性，更有利于高效蛋白质生产或生产者细胞系的建立。CHO DXB11 (dhfr+/), CHO DG44 (dhfr/) 和 CHO-GS-/- (CHO-K1SV)宿主已经生成，通过利用代谢标记，即二氢叶酸还原酶介导的甲氨蝶呤（MTX）基础和谷氨酰胺合成酶介导的甲硫氨酸亚砜胺（MSX）基础选择系统，使克隆选择更容易和更快。同时，MTX选择也作为一种基因扩增系统，允许高产品产量。CHO-S及其衍生细胞系已经适应悬浮培养，目的是通过增加生产者细胞密度来实现更高的体积生产。尽管共享相同的共同祖先，不同的CHO谱系由于广泛的诱变和克隆选择表现出显著的遗传异质性。这些遗传差异，也影响核型和表观遗传变异，解释了最广泛使用的CHO细胞系（主要是CHO-K1, CHO DXB11, CHO-S和CHO DG44）之间的宿主细胞特异性差异。因此，CHO表达平台为宿主细胞选择和蛋白质生产优化提供了广泛的选择。不同小组的比较研究提供了大量关于不同重组CHO细胞系对各种生物制剂的细胞特异性生长和产品形成的数据。在一个代表性例子中，Reinhart等人已经表明，CHO-K1细胞更倾向于细胞特异性生产力（7–16 pg/cell/day），而CHO-S更倾向于生物质生产，但单克隆抗体表达较低（2–6 pg/cell/day），这与CHO DG44细胞相似（在相同的实验设置中为2–4 pg/cell/day）。该小组还研究了CHO宿主对不同培养条件（批培养、补料批培养、半连续灌注培养）和化学定义培养基的偏好。研究得出结论，观察到的表达差异与宿主细胞特异性表型和代谢有关，并与培养方法或细胞培养培养基没有很强的相关性。 3.CHO细胞系优化——历史视角 数十年来，世界各地的研究团队都投入了巨大努力，试图提高生产者CHO细胞系的性能。这些细胞系操作的尝试旨在实现更高的生产力和产品产量，并利用了关于转录、翻译、细胞代谢、信号通路和分泌机制的现有知识。宿主细胞工程的主要策略是基于过表达有利于细胞增殖、长寿、应激和凋亡抵抗、蛋白质生产和分泌的基因。众多研究表明，瞬时或稳定过表达参与细胞代谢、蛋白质生物合成和糖基化的关键基因可分别提高生长速率、生产力，并获得更好的产品质量。通过过表达各种转录因子、抗凋亡（例如BCL2、XIAP、AVEN、MCL1）和促增殖基因，也已证明细胞活力和培养性能得到改善。蛋白质组学的进步也为宿主细胞的合理工程做出了贡献。蛋白质组学数据的分析被用来识别基因操作的潜在靶点，以提高产品产量，如谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚单位的报道。与有益基因的强制表达相反，其他细胞系优化方法侧重于通过基因组敲除或通过RNAi介导的基因沉默来消除或抑制“不利”基因。破坏基因功能或消除基因产物有不同方式：i）通过靶向基因组操作部分或完全删除特定基因，ii）通过突变“关闭”基因功能，iii）siRNA介导的基因沉默。微RNA（miRNA），已知在哺乳动物细胞的转录组调控中起着关键作用，在过去十年中也已深入研究其在CHO细胞工程中的潜力。越来越多的证据表明，miRNA对诸如转录、翻译、核糖体生物合成、分泌、细胞周期、代谢和细胞死亡等多个细胞功能有影响。因此，利用miRNA调控系统代表了一种高效分子工具，可用于整个细胞途径的工程。miRNA过表达（例如miR-2861、miR-23、miR-17）或通过抗miRNA、病毒载体、海绵和tough decoy载体（例如miR-7、miR-106b、miR-14等许多其他）敲低，已在CHO细胞系优化中成功使用，以使细胞适应应激环境、温度变化并增强蛋白质生产。最近一项研究报道了使用CRISPR/Cas9基因组编辑系统删除miR-744，目的是提高CHO生物过程性能。操纵miRNA介导的调控也已应用于提高人工设计的难以表达的新生物治疗剂的生产。历史上，基因消减研究针对的是代谢（例如LDHA）、促凋亡（BAX、BAK）和抗增殖基因，以及细胞周期检查点激酶（ATR）。正如预期的那样，这些选定基因的消除或沉默导致培养性能改善、凋亡抵抗增强和产品产量提高。参与染色质重塑（例如HDACs）和糖基化（例如FUT8、SLC35C1）的基因也成为敲除研究的靶点，以更好地了解如何操纵细胞系以表达具有定制翻译后修饰谱的重组蛋白。所有这些宿主细胞工程的成就都被视为成功故事，因为它们导致了CHO宿主衍生物的产生，这些衍生物在生长、应激抵抗和生产力方面超过了它们的亲本细胞系。工程生产细胞系已被证明能够实现创纪录的高3–7 g/L体积生产力。然而，监测工业制造中生产效率的数据表明，在许多情况下，不可能从高滴度生产过程的生物反应器中回收全部产品。由于这个下游处理瓶颈，产品似乎并未从非常高滴度中受益，进一步提高滴度的努力可能带来收益递减。此外，在许多情况下，观察到重组细胞系在长期培养过程中活力和生产力下降，从而使工业界面临进一步挑战。 4.工业细胞系开发的新焦点领域 在2010年之前，许多生物制药公司遵循开发自己的生产细胞系的政策，但过去十年中这种方法发生了变化。现在公司倾向于使用相同的宿主细胞系进行生产和初期临床试验，因为他们意识到这种策略简化了细胞系开发周期，并优化了通往临床的道路。此外，它降低了产品可比性问题的风险，并帮助制造商满足产品质量要求和一致性预期。这些变化的优先事项促成了CHO表达平台创新的新方向。工业细胞系开发的焦点已转向宿主细胞系稳定性问题，以确保稳定的长期生产，使用靶向整合技术进行表达优化，特别是对于复杂的工程重组治疗剂，以及开发选择和筛选系统，以实现更快、更有效的克隆选择（图1）。 图1. 工业细胞系开发中创新研究的当前重点领域。 4.1.CHO细胞系不稳定性 在制药行业中使用的CHO细胞，以良好的适应遗传操作和改变培养条件的能力而著称。这一特点源于这些细胞系本身具有可塑性的基因组，这使得它们适合于大规模工业生产。然而，不利的是，这种细胞可塑性使得CHO细胞更容易发生基因组重排（缺失、易位），并在生物生产过程中成为细胞系不稳定的源头。生产细胞面临着高基因组和代谢需求，可能导致基因组和表观遗传变化，从而导致生产力和产品质量下降。尽管如此，CHO细胞系提供的众多优势使它们成为重组蛋白生产的理想宿主，因此，科学和工业界在近期内不太可能放弃这一表达系统。因此，最近已投入大量努力来理解CHO细胞系不稳定的这一现象。研究重点是寻找解决方案，以克服制造过程中表型不稳定的难题，确保长期稳定的生产、过程一致性，并确保产品质量可接受。与所有其他快速生长的永生化细胞一样，CHO宿主细胞系在基因组上不稳定且克隆内异质，这赋予了系统鲁棒性和灵活性，但导致生产稳定性问题。为了更好地理解CHO细胞的异质性，Borth及其团队在一系列实验中研究了在亚克隆和克隆选择用于生产细胞系生成过程中，异质性是如何传递的。他们发现，亚克隆本身并没有导致亚克隆与原始细胞池相比（无论是宿主细胞系还是重组细胞系）遗传和表型异质性的减少。相反，选择特定的细胞特性导致了核型同质性和染色体稳定性增加。Baik和Lee也研究了CHO细胞系不稳定性、核型变异和生产不稳定之间的联系。他们提出了一个生产不稳定的机制模型，其中随机的染色体重排与生长优势和非生产或低生产克隆相关。同时，针对特定表型/基因型的MTX选择降低了生长速率，但提高了产品产量。在稳定重组细胞系的开发过程中，一个重要的问题是生成和识别高产克隆，这些克隆不会随时间失去表达能力。（克隆性在治疗蛋白生产中被认为是关键的，因为克隆系被认为能提供稳定和一致的产品质量特性。）然后需要在长期培养中评估选定克隆的生产情况，这是一个劳动密集型且耗时的过程。然而，目前在CHO细胞系上迅速积累的转录组数据为功能分析开辟了道路，以识别高生产和克隆稳定性的调节因子和生物标志物。按照这种方法，Ritter及其同事分析了低产和高产CHO克隆的基因表达谱，以寻找细胞工程的潜在目标，使克隆选择更快、更有效。他们发现，大多数稳定的高产克隆都标记为染色体8的端粒区域缺失。建立的实验模型结果证实，与对照CHO-K1细胞相比，CHO-C8DEL细胞（染色体8的端粒区域缺失）表现出更高的体积生产率，并产生了更稳定的生产克隆。进一步地，该团队进行了一系列敲除和敲低研究，并在选定的端粒区域内确定了两个特定目标，Fam60A和C12orf35，它们在创造CHO-C8DEL细胞观察到的表型中起作用。据报道，这些基因的缺失或表达减少与更高的生产率和更快地从选择中恢复相关。 4.2.靶向基因组操作技术 在重组细胞系生成中，最密集的研究方向集中在使用靶向基因组整合技术进行表达优化。对于建立稳定和克隆（同源）生产者细胞系，转基因需要整合到宿主基因组中。传统方法依赖于表达载体的随机整合，随后从具有异质转基因插入的重组细胞池中耗时筛选合适的细胞。这种方法有两个主要缺点：整合效率低和整合位点的位置效应。为克服这些问题，人们做出了不同的尝试。借助不同的转座子系统（Sleeping Beauty、Leap-in、PiggyBac、Tol2），成功提高了整合效率。据报道，使用转座子介导的基因整合仅在2-3周内生成的重组CHO池能够实现异常高的产品滴度（>7 g/L），因此可用于快速生产大量蛋白质。借助转座子系统的基因整合仍然是一个感兴趣领域，并正在评估其在生物医学研究不同领域的潜在用途。过去十年中，几个研究小组也解决了由于随机整合导致的“位置效应”问题。Neville等人综述的普遍染色质开放元件（UCOEs）以及其他在高生产细胞基因组中识别的调控基序已被应用于防止基因沉默并维持高水平表达。细菌人工染色体（BACs）也是一种流行且广泛使用的方法，用于确保整合转基因的位点独立、稳定和高水平表达（例如，在实验室规模的生物反应器中为选定抗体达到0.75 g/L，在摇瓶中达到1.12 g/L）。 靶向基因组操作技术使得重组蛋白编码基因能够敲入到定义良好且转录活跃的基因组位点中。与随机整合相比，这是一种建立生产克隆的更快且更高效的方法。靶向细胞基因组修饰得益于目标特异性基因编辑工具的出现，例如锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应核酸酶（TALENs）、成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）-CRISPR相关蛋白9（Cas9）RNA引导的核酸酶。其中，CRISPR/Cas9系统因其易用性（与ZFNs和TALENs相比）、高编辑效率和低成本而成为最受欢迎的选择。可编程核酸酶产生双链断裂，这些断裂在哺乳动物细胞中通过内源性DNA修复机制解决。这些机制包括不同的途径：i）非同源末端连接（NHEJ），ii）同源定向修复（HR）和iii）微同源介导的末端连接（MMEJ）。靶向基因组编辑工具的主要应用涉及在细胞或生物体的基因组中敲除或敲入感兴趣的基因。 近年来，人们投入了大量努力来识别宿主细胞基因组中的转录“热点”。靶位点的选择基于先前的经验数据、转录组数据分析或借助慢病毒筛选。不同研究小组最近使用的位点包括Fer1L4、Rosa26、Hprt、Hipp11、C12orf35和GS。如今，最先进的技术是整合不仅单个转基因，还有复杂的盒式结构，称为“着陆垫”，以生成主宿主细胞系。着陆垫包含选择标记和重组酶或整合酶的识别位点，允许精确插入任何种类和任何数量的表达盒到已建立的位点。有许多系统已有效用于在哺乳动物细胞中通过位点特异性重组介导表达盒交换，例如Cre-loxP、Flp-FRT、BxB1重组酶、PhiC31整合酶（见表1）。 最近的一项研究报道了多着陆垫DNA整合平台的开发，该平台在不同的基因组热点插入了3-4个着陆垫，用于先进的细胞工程。其他小组生成了替代版本，允许累积整合相同基因的多个拷贝或不同基因。然而，这种构建可能会带来重复介导的基因沉默问题（也影响多顺反子构建和彼此接近的基因），但有各种方法可用（例如使用表观遗传修饰元素，如绝缘子、UCOEs）来防止CHO细胞中转基因的沉默。上述讨论的平台已开发用于促进制药行业中重组生产细胞系的生成。它们也是表达优化新型复杂蛋白治疗药物的有价值且有前景的工具，并且可能应用于合成生物学。 4.3.关于产品质量和数量的难以表达的重组蛋白治疗药物的表达优化 目前，大量经过工程改造的复杂重组蛋白正在填充工业生产管线。尽管使用了先进的CHO细胞表达平台，这些蛋白在许多情况下被证明是“难以表达”的（DTE）。制药行业的一个主要创新研究领域集中在提高这些生物产品的可制造性。最近，不同研究小组进行了多次尝试，试图理解生产瓶颈的原因，并寻求这些问题的解决方案。 首先需要解决的关键问题是转录水平的表达优化，这涉及表达构建设计、基因组整合方法以及与整合位点的基因组环境的相互作用。即使在定义良好的整合位点，重组蛋白的转录水平也受到整合位点与表达盒组件之间相互作用的影响。对这一现象的研究对于可编程细胞工程至关重要，以便能够预测多个组件如何贡献于插入转基因的最终净表达。为解决这一问题，Kildegaard及其同事开发了一个分子工具箱，用于系统评估产品和位点特异性重组基因表达。利用CRISPR/Cas9技术，他们构建了一系列具有针对着陆垫的靶向整合位点的CHO-S模型细胞系，其中重组基因在定义的50近端调控元件下。他们表明，不同的调控元件在定义的整合位点产生了强大的重组基因表达模式，具有广泛的转录输出。Cartwright及其同事报道了开发高通量微型平台用于多并行测试不同遗传组件，并系统评估它们对DTE蛋白生产的影响。该小组旨在优化细胞工程解决方案，用于模型DTE IgG的稳定和瞬时生产。他们得出结论，最佳方法是产品和遗传背景特异性的，并且稳定和瞬时生产之间存在显著差异。Tadauchi等人进行了一项系统调查，旨在了解是什么使得抗体表达困难。他们构建了具有定义基因组整合位点的着陆垫的模型细胞系，其中插入的转基因在（Tet/Dox）诱导型启动子的控制下。该系统使得能够表征可能具有毒性或因任何原因难以表达的蛋白的表达。其他工作集中在转录调控上，例如在miRNA介导（miR-557）的宿主细胞工程中，已被证明有助于增强DTE蛋白表达。 分泌缺陷是复杂治疗药物，特别是DTE单克隆抗体（如英夫利昔单抗）的另一个主要关注领域。针对这一问题，不同研究团队采用了多种方法。在最近的研究中，Hussein等人描述了一种新的蛋白质工程策略，以绕过分泌瓶颈，从而提高DTE蛋白的生产。该团队进行了逐步分析，以了解限制选定重组蛋白TIMP-3和TIMP-4生产的分子机制，并确定翻译后处理阻滞是蛋白表达的限制步骤。为克服这一限制，他们构建了一个融合蛋白，其中包含一个分泌生长因子的短前序列，该序列具有蛋白酶furin的天然切割位点。同时，在同一实验细胞系中过度表达furin。这种策略已成功用于提高原本分泌不佳的TIMP家族两个成员的蛋白生产。在该研究之后，应用计算工具分析TIMP-3编码核苷酸序列，以识别导致分泌不佳的序列特征。根据获得的数据，该团队构建了一个用于DTE重组靶标的蛋白质嵌合体设计模型。Otte及其团队报告了建立一种基于自动化共聚焦显微镜的方法，用于研究细胞内DTE蛋白表达，以探索生产瓶颈的原因。在代表性研究中，Mathias等人追踪了选定重组DTE蛋白在细胞合成过程中的处理，并调查了它们在分泌途径相应细胞器中的分布。他们发现，在选定抗体的情况下，错误折叠是限制速率的步骤，也是阻碍分泌的原因，因为它导致了分子的内质网相关降解。 除了体积生产率外，产品质量对于生物治疗蛋白生产也至关重要，并且一直是工业技术开发努力的焦点。糖蛋白是生物治疗药物中增长最快的类别。正确的翻译后修饰，特别是糖链结构，对于这些生物制剂的效力以及药代动力学和药效学特性的控制至关重要。此外，不仅糖基化（唾液酸化、岩藻糖化）的性质和数量重要，N-糖链的异质性也可能是一个问题。这种异质性，由于N-糖链处理的变异性而产生，可能会损害糖治疗药物的活性和安全性。Yang及其同事描述了如何通过遗传工程改造CHO细胞，以近乎均质的形式生产糖蛋白。他们对CHO糖基转移酶进行了敲除筛选，以识别控制N-连接糖基化关键步骤的关键基因，并表明CHO细胞能够耐受糖工程改造而不会发生补偿性变化。根据他们的结果，他们提供了一种在模型细胞系中重建更均质糖基化能力的策略。 4.4.高通量筛选和选择系统的最新进展 选择系统在几十年间已经标准化，然而，不同选择系统的优缺点仍然是一个争论的话题，特别是在MTX选择系统的情况下。几项研究表明，由MTX选择导致的基因扩增是重组细胞系生产不稳定性的一个主要原因。此外，多轮MTX选择需要更长的时间来生成细胞系。最近，Yeo等人也发表了一项大规模的比较研究，探讨不同类型的标记基因如何影响不同CHO细胞系的生产稳定性。他们的结果表明，需要针对不同类型的CHO细胞优化选择标记基因的表达，以提高对最佳生产者克隆的选择严格性。 随着市场对生物治疗产品需求的增长，时间和成本成为了制造过程中的重要因素。在过程设计和优化中，更多地关注如何减少新生物产品重组细胞系生成所需的时间和成本。这推动了高通量克隆筛选和表征的新方法和技术的发展。许多改进工作集中在单克隆上，因为这是生产者细胞系建立过程中最耗时的环节。现在已有几种新技术可用于更有效地分离单细胞，取代传统的“限制稀释”方法。现代克隆方法使用专门的仪器来确保单个细胞被播种到微量滴定板孔中。荧光激活细胞分选（FACS）已成功用于根据特定细胞属性（表明高生产性）对单细胞进行分选。Solentim开发的VIPS（原位验证板播种）以及Cytena单细胞打印机仪器结合了细胞播种与显微镜成像，以确保单细胞沉积，从而保证衍生克隆的单细胞起源。Berkeley Lights的Beacon平台利用微流体和光电子定位技术，通过软件控制操作，在单芯片上并行培养、操纵和表征数千个细胞。ClonePX FL提供了一种基于表达的方法，在半固体培养基上，用于高效高生产者克隆/菌落的选择和分离。 许多这些技术发展和现代仪器为高通量自动化过程提供了可能，已经在制药行业成功引入，并现在应用于工业重组蛋白生产。 4.5.“组学”技术——系统生物学方法 自2010年代以来，“组学”方法和“组学”技术的出现促进了对细胞特征和身份特征的深入理解，这些特征表明了最佳生产状态。在基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、脂质组学和糖组学领域，现在有大量的数据（并且每天都在增加），这些数据提供了对特定时刻细胞状态和特征的系统级洞察。Stolfa等人发表了关于CHO的可用资源和数据库的全面总结。与此同时，生物信息学中计算方法和算法的不断发展使得这些“组学”数据能够被转化为与细胞机制和功能相关的生物学信息。这些信息与计算建模一起被用于CHO研究的所有领域：用于预测细胞行为，探索重组细胞系中不同生产效率背后的转录组水平克隆变异，或识别操纵生产者细胞系应激反应和敏感性的新靶点。在最近的一项研究中，Kol等人进行了多重分泌组分析，以研究宿主细胞蛋白对重组蛋白生产的影响。通过系统的计算机（计算筛选）和体外分析，Nguyen等人从CHO细胞中识别出内源性启动子和增强子元素，这些元素可用于转基因表达优化的潜在用途。Brown及其同事进行了基于转录组的分析，以识别用于qPCR数据标准化的最佳参考CHO基因。该研究结果已适应于制药行业常规用于生产者细胞系稳定性表征。随着“组学”技术的进步，糖基化谱的系统分析为CHO细胞的糖基化网络提供了新的见解，并有助于开发新的糖工程策略，旨在产生更有效的疗法，减少副作用——正如Tejwani等人在一篇全面的综述中总结的那样。Stach等人描述了一种将系统级动力学模型与合成生物学相结合的方法，以研究N-糖基化的本质，并测试遗传扰动对产生IgG的半乳糖化行为的协同作用。 5.未来展望 系统生物学方法为增强基于CHO的生物生产开辟了新的维度。“组学”技术提供了更好地表征和理解复杂细胞功能的新机会，从而为机制驱动的细胞系优化创造了基础，而不是操纵几个关键基因。然而，一个主要问题是这些现代技术需要特殊的仪器、材料和先进的信息技术设施，因此它们仍然过于复杂和昂贵，无法在工业制造中常规使用。另一方面，迄今为止不同“组学”技术提供的数据还无法整合到一个通用的数学模型中，这将有助于在实验过程设计中转移和应用这些信息。如何将这些知识适应并整合到关于重组蛋白生产的工业生物过程优化和开发中仍然是一个挑战，需要在未来解决。 识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 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摘要：早期的基因治疗研究对于遗传性疾病的治愈抱有巨大希望，但各种基因毒性事件的发生导致临床试验暂停，对进展采取了更加谨慎的态度。遗传工程技术的最新进展重新点燃了人们的兴趣，导致2017年首个针对遗传突变的基因治疗产品获得批准。基因治疗（GT）可以在体内或体外进行。体外基因治疗方法具有优势，因为它允许在患者使用前对基因修饰细胞进行表征，并选择所需的特性。在此过程中还可以使用自体细胞，这消除了免疫排斥的可能性。本综述重点介绍了体外基因治疗的各个阶段、当前研究进展，这些进展提高了这一过程的效率和安全性，以及对人类免疫缺陷病毒（HIV）基因治疗研究的全面总结，其中大多数采用了体外方法。 1.引言 人类基因组的成功测序加深了我们对遗传性疾病和导致慢性及暂时性疾病状况的病理过程的理解。目前有超过5000种基因治疗产品正在针对各种遗传性、慢性和传染性疾病进行试验（https://clinicaltrials.gov/, 访问日期为2023年10月30日）。在开发基因治疗候选药物时，考虑一种有效的递送方法很重要，这将允许感兴趣的基因进行准确处理，在特定作用部位有足够表达，并持续预期的治疗效果，随后降解递送载体而不引起任何不良影响。由于存在引起严重不良反应的潜在危险，如肿瘤形成甚至基因修饰的生殖系传递，开发基因治疗产品（GTP）的过程非常严格，比其他治疗剂需要更长的时间。补充表S1总结了不同监管机构迄今为止批准的基因和细胞产品。最近发表了一篇综述，讨论了其中一些产品的发展。递送感兴趣基因的方法有两种：体内和体外（图1）。体内方法涉及将遗传物质直接递送到患者体内，可以是裸露的基因或封装在颗粒中。另一方面，体外方法涉及从患者或正常供体分离感兴趣的细胞，对它们进行遗传修饰，在某些情况下进行扩增，然后将它们给患者。因此，患者没有直接接触到转移载体。选择，即确保修饰的细胞相对于自然发生的缺陷细胞更优先植入患者体内，可以在给患者施用感兴趣基因之前或之后进行。最近发表了一些综述，强调了基因治疗在各个领域的应用：使用造血干/祖细胞（HSPCs）治疗造血障碍、遗传性皮肤病、神经系统疾病或中枢神经系统遗传性疾病和骨科疾病等。 图1. 体外递送感兴趣基因。使用Biorender.com创建。2.HIV基因治疗的治愈方法 由于存在对当前治疗有抵抗力的潜伏病毒库，因此获得HIV的治愈一直具有挑战性。这些病毒在转录上是不活跃的，但很大一部分具有复制能力。抗逆转录病毒治疗(ART)可能在潜伏病毒藏身的组织中吸收相对较差，如肠相关淋巴组织(GALT)和中枢神经系统(CNS)，这可能有助于这些部位病毒的持续存在。在停止ART后的几周到几个月内观察到病毒反弹。治愈的另一个挑战是HIV对免疫系统的影响：对HIV的体液反应差，中和抗体的产生不足，这通常在感染几个月后才会发生。此外，也有重建HIV特异性CD4+ T细胞的相对失败，这反过来又导致CD8+细胞毒性T细胞功能的降低。 因此，可以合理假设有效的治愈将旨在使潜伏病毒失活或移除，并重建免疫系统。基因修饰的细胞也应该能够抵抗持续的感染，治疗本身不应该引起严重的不良事件。为了重建或增强免疫系统的功能，已经在B细胞和T细胞的遗传工程方面取得了几项进展，包括嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞治疗。图2提供了HIV治愈策略的总结。 国际艾滋病学会的多方利益相关者协商就HIV治愈目标产品的最低标准达成一致。临床疗效定义如下：维持病毒载量低于传播阈值(<200 HIV RNA拷贝/mL)，在研究的20%或更多人群中有效，平均每年复发率低于10%，缓解期超过2年，并且严重不良事件的可能性极小，如果有的话，即研究人群的不到1%。可能的治愈也可能需要结合不同的方法。 图2. HIV治愈策略。CRISPR—成簇规则间隔短回文重复序列；ZFN—锌指核酸酶；TALEN—转录激活因子样效应子核酸酶。使用Biorender创建。 为了实现对HIV的可能治愈，已经采用了四种策略。 第一种方法是干细胞移植，到目前为止已经治愈了六名患者：柏林患者、伦敦患者、纽约患者、“希望之城患者”、杜塞尔多夫患者和日内瓦患者。这些患者接受了造血干细胞移植以治疗恶性肿瘤。除了日内瓦患者外，所有患者都接受了与人类白细胞抗原（HLA）匹配的供体的干细胞移植，这些供体对于CCR5等位基因中的32个碱基对缺失（CCR5∆32）是纯合子。由于治疗的侵袭性、成本、发病率和死亡率，以及缺乏具有CCR5∆32的匹配无关供体，这种方法无法扩大到更广泛的人群，因此作为一种普遍适用的方法是不可行的。 第二种方法旨在从细胞库中移除所有活性潜伏病毒，实现无需ART即可检测到的血浆载量，因此提供一种无菌治愈。这种策略被称为“休克和杀死”方法，并已在早期阶段试验中进行了广泛研究。尽管目前这种治愈方法的形式并未采用基因治疗，但它已被包括在本综述中，以涵盖所有当前的HIV治愈方法。“休克和杀死”旨在使用潜伏期逆转剂激活潜伏病毒库中的病毒，这些逆转剂激活病毒转录，通过使用并行的ART阻止新细胞的感染，然后通过诱导凋亡、CD8+介导的溶解或通过体液免疫反应来根除感染的细胞。嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）细胞也可以被用来增强杀死感染细胞。 第三种策略旨在通过基因编辑根除整合病毒，使用基于核酸酶的工具或工程重组酶。基于核酸酶的工具包括CRISPR（成簇规则间隔短回文重复序列）、TALEN（转录激活因子样效应子核酸酶）和ZFN（锌指核酸酶）。也可以使用这些基于核酸酶的工具针对CCR5，使CD4+细胞对感染产生抵抗力，以及使用短干扰或短发夹RNA（siRNA或shRNA）沉默CCR5。基因编辑也可以通过工程重组酶进行，特别是针对HIV特异性长末端重复序列（LTR）的重组酶酶（TRE）重组酶。这是一种工程形式的Cre重组酶，针对5′LTR内的34个碱基对区域（称为loxLTR），从而在表达这种酶的感染细胞中去除整合的前病毒DNA。 第四种策略是“阻断和锁定”方法，旨在实现功能性治愈，即在不根除潜伏病毒的情况下保持其处于非活动状态，使血浆病毒载量保持在可检测水平以下。这是通过使用潜伏期促进剂永久沉默或编辑潜伏病毒库来实现的，这些潜伏期促进剂通过病毒启动子的抑制性表观遗传修饰“阻断”病毒转录并“锁定”病毒处于潜伏状态。 大多数HIV基因治疗研究使用体外方法。本综述将重点介绍体外基因治疗的各个阶段，并提供当前采用体外或体内基因治疗方法的HIV临床试验的总结。 3.体外基因治疗  在体外基因治疗研究中需要考虑的一个重要因素是将被修改以纠正特定疾病状况或遗传疾病的细胞来源。这些细胞可以是自体的，从患者自身获得，或同种异体的，从匹配的供体获得。自体来源是有利的，因为没有移植物抗宿主病的危险；然而，这可能不适合老年患者或严重疾病状况（例如，HIV，因为细胞可能是新感染的来源）。由于其自我更新和分化成几个谱系的能力，同种异体干细胞来源最近引起了更大的兴趣，尽管它们的使用存在局限性，如排斥、移植物抗宿主病和长期免疫缺陷。在临床前基因治疗研究中，可以从出生组织中获得干细胞，例如脐带血和胎盘。也可以从胚胎组织中获得干细胞，尽管这引发了伦理问题，或从诱导多能干细胞中获得。在临床研究中，可以根据患者的疾病状况从个体患者中获得细胞，或从与患者组织免疫兼容的供体中获得，或从其他细胞来源中获得，这些来源的细胞不太可能引发免疫反应，如由于缺乏或低表达HLA类I和II抗原而具有低免疫原性的胎盘细胞。体外基因治疗的过程包括获得这些感兴趣的细胞，对它们进行修改，并将它们给患者。为了确保修改后的细胞的有效和优先植入，使用各种调节和选择方法。 3.1.造血干细胞的来源 造血干细胞在单基因疾病和免疫系统疾病的基因治疗中很有用。造血干细胞（HSCs）和造血祖细胞（HPCs）负责产生成人血细胞，并以特定标记为特征（图3）。CD34抗原，一种细胞表面粘附跨膜糖蛋白分子，长期以来一直被用作HSCs的标记，以及其他功能，如增强细胞增殖、阻止分化、改善HSCs和HPCs的迁移以及促进淋巴细胞在淋巴组织中与血管内皮的粘附。这些细胞能够分化成各种谱系的功能性血细胞，并且具有自我更新的能力；即，它们可以在不分化的情况下产生女儿HSCs（图1）。 图3. 造血干细胞发展的层级结构。NK-自然杀伤细胞；DC-树突细胞。使用BioRender.com创建。3.1.1.骨髓来源的造血干细胞 基因治疗应用中常用的造血干细胞(HSCs)来源包括骨髓、脐带血、外周血，以及最近的胎盘。在骨髓中，成骨细胞影响造血的平衡。原始人类成骨细胞对骨髓来源的CD34+ HSCs的存活至关重要，因为成骨细胞恒定地表达粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。同样，HSCs调节成骨细胞分泌IL-6、巨噬细胞炎症蛋白-1α和其他因素，以创造有利于造血的环境。基质衍生因子-1(SDF-1)及其受体C-X-C趋化因子受体4(CXCR4)是建立骨髓的重要决定因素。Tie2，一种受体酪氨酸激酶，也被发现在维持成年骨髓中的HSCs方面不可或缺。CD34抗原具有多个磷酸化位点，其中有两处是蛋白激酶C的位点，一处是酪氨酸磷酸化位点。 Panch等人的文章总结了从骨髓、外周血和脐带血中采集HSCs的方法。简而言之，从骨髓中采集HSCs通常在全身麻醉下进行，大约每公斤体重收集20 mL，且不超过1.5 L的骨髓抽吸液，从髂后或髂前缘收集。在进行该程序之前，可能会从患者身上采集血液，以便在抽吸过程中失去的血液可以重新注入。 3.1.2.外周血来源的造血干细胞 从外周血采集造血干细胞的过程需要几天时间。早期动员方案使用了细胞毒性药物，如环磷酰胺、伊达比星、依托泊苷、铂类和表柔比星；然而，这些药物的使用现在仅限于接受移植治疗恶性肿瘤的患者。目前，在移植患者中，粒细胞集落刺激因子（G-CSF）用于将CD34+细胞动员到外周血中，剂量为5-10 mg/kg/天，持续5至7天，目标是通过白细胞去除术采集至少2×106 CD34+细胞/kg体重。在G-CSF给药期间，血液中HSCs的浓度在3天后增加，大约在第5或6天达到峰值，然后在7天后开始下降。G-CSF的剂量由外周白细胞计数决定，外周CD34+计数是HSCs产量的良好预测指标。产量还取决于年龄、性别、基础条件和G-CSF剂量。G-CSF治疗并非没有挑战，患者可能会经历包括骨痛、头痛、疲劳、肌痛在内的副作用，以及在高风险个体中可能出现心肌梗塞和脑缺血。为了增强G-CSF的动员效果，可以使用AMD3100（Plerixafor，一种可逆的CXCR4拮抗剂）。CXCR4是基质衍生因子1（SDF-1）的受体，具有包括使HSC长期维持静止状态在内的多种功能。Plerixafor以240 µg/kg的剂量给药，在白细胞去除术前4至6小时，发现它可以改善CD34+细胞的采集，尤其是与G-CSF联合使用时。其他HSC动员剂目前正在开发中。 3.1.3.脐带血来源的造血干细胞 从脐带采集细胞涉及切断的脐带静脉穿刺，将血液排入含有抗凝剂的无菌袋中。通常，在过程中收集大约80至160 mL的脐带血（UCB）。CD34+细胞的产量范围为2至7×106/mL UCB，可能受到出生顺序（第一胎>第二胎>第三胎等）、出生体重甚至早期夹闭的影响。这种相对较低的产量限制了它们的应用。 3.1.4.胎盘来源的造血干细胞 人类胎盘最近作为干细胞来源而受到欢迎，因为胎盘干细胞抗原性低，没有伦理限制，并且是多能的。人类胎盘是生殖过程中首先发育的器官，有两个组成部分，胎儿部分（羊膜和绒毛膜）和母体部分（蜕膜）。从受精后6-7天出现到足月的胎盘发育已被详细描述。胎盘的作用是为发育中的胎儿提供营养物质并排除废物，具有各种分泌和免疫调节作用。它可以被划分为以下四个区域：羊膜上皮、羊膜间充质、绒毛间充质和绒毛滋养外胚层。胎盘有多种类型的干细胞，可以分化为造血和间充质组织（脂肪生成、软骨生成、成骨、肝脏、胰腺、肌肉、血管生成和神经生成），表达各种细胞标记，包括OCT4、SOX2和c-KIT等，这些标记也存在于胚胎干细胞中。胎盘HSCs缺乏或表达非常低的HLA类I抗原（HLA-A、HLA-B、HLA-C）和没有HLA类II抗原（HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR），这使它们适用于再生医学以及自体和同种异体移植。与骨髓细胞相比，这些细胞的免疫排斥机会较低，对凋亡有抵抗力，具有增强的细胞增殖和伤口愈合特性，并抑制如TGFβ等促纤维化因子。人类胎盘HSCs是胎儿来源（非母体），并且是CD34+和CD45-dim。用AMD3100（Plerixafor）以300 ug/L的浓度灌注人类胎盘，结果在灌注液中采集到的HSCs数量增加了六倍以上，这些细胞具有集落形成特性，缺乏内皮标记。间充质基质细胞是骨髓造血环境的重要组成部分，与HSCs共培养已被发现可以增强HSCs的增殖，特别是原始的CD34+和CD38-。 已使用脐带血和胎盘来源干细胞的混合物进行造血干细胞移植。已开发出各种协议来分离羊膜上皮细胞、间充质基质细胞和造血干细胞。所有协议都必须克服的一个主要障碍是生产大量具有所需细胞群高度纯度的细胞。 3.2.造血干细胞的分离、纯化和富集 为了确保基因校正细胞的优先植入，重要的是要富集具有构建体的细胞群，并对其进行纯化，以避免在培养过程中使用的蛋白质或其他分子的污染。已使用几种方法来富集HSCs。目前最常见的柱分离技术是德国科隆Milteny Biotech的磁激活细胞分选（MACS®）微珠分离技术（https://www.miltenyibiotec.com/ 于2023年6月4日访问）。在这种封闭系统技术中，微珠（超顺磁性氧化铁纳米颗粒）与CD34抗体偶联，用于磁性标记表达CD34+的细胞。将无菌细胞悬浮液装入MACS®（铁磁性）分离柱中，该柱放置在MACS®分离器的磁场中。在正选择技术中，标记的细胞被保留在柱中，而其他细胞则流过。然后可以从柱中洗脱CD34+细胞，一旦它被从由分离器产生的磁场中移除，就可以用于任何下游应用。也有用于分离CD133+细胞群和CD34+和CD38−细胞的微珠。Baldwin及其同事使用免疫磁珠富集CD34+细胞，然后用荧光激活细胞分选（FACS）对其进行分馏，以富集CD34+和CD38−细胞；另一方面，Radtke及其同事使用FACS分离CD34+、CD90+和CD45RA−细胞，发现这组细胞在表型上是HSC基因治疗的最明确目标，因为这些细胞推动了短期和长期的多谱系植入。他们使用GMP（良好生产规范）级流分选协议来分离这些细胞。这大大增加了所需的复杂性、成本和专业知识。在其他体外研究中，Kays及其同事使用MACS对细胞进行排序，这些细胞除了表达CD34+外，还表达CD105，即转化生长因子-β（TGF-β）受体复合体的组成部分，发现这些细胞富集了具有高植入和重聚能力的早期HSCs，即使在慢病毒转导后也是如此。Laje及其同事用信号淋巴细胞激活分子（SLAM）家族受体分子富集了注定要进行慢病毒转导的HSCs，发现这些细胞被有效转导并且与非转导细胞相比是稳定的。 研究表明，培养造血干细胞(HSCs)超过48小时会降低它们长期植入的能力，建议培养时间不应超过36小时，24小时是一个安全的时间段。Chen及其同事的一项研究发现，使用细胞因子（SCF、TPO和Flt3L）进行体外培养会导致线粒体氧化应激，从而导致丧失干细胞特性，并且CD34+/CD133+中的粘附GPCR G1阳性（ADGRG1+）群体可以在体外培养期间的氧化应激下富集功能性HSCs。 还努力减少培养过程中可能的污染源。重组人血清白蛋白（HSA），是从酵母中产生并用作GMP级组织培养基的组分，可能是其他不直接与白蛋白相互作用的蛋白质甚至色素和小分子的污染源。Wilkinson及其同事最近使用体外和体内小鼠模型发现，聚乙烯醇（PVA）可以作为HSA在培养小鼠和人类HSCs中的替代品，因为它支持HSCs的存活和生长，同时保持表型HSCs特征。PVA培养基中分泌因子的浓度较低，衰老相关基因表达较少，尽管PVA用于人类基因治疗的效果还有待评估。 3.3.使用感兴趣基因修饰造血干细胞 在考虑适当的载体进行基因传递时，需要检查要转导的细胞的特性和载体的特性；是否需要短暂或稳定表达基因修饰；以及在传递到组织时可能导致的“脱靶”效应。这些脱靶效应可能包括宿主-免疫反应和载体本身引起的免疫反应。用感兴趣基因修饰目标细胞可能面临各种挑战。例如，腺相关病毒载体由于阻碍核输入、解壳和第二链合成，因此不能有效转导HSCs。用VSV-G包膜伪装的慢病毒载体具有广泛的细胞嗜性，尽管由于缺乏或表达不足的LDLR受体（它通过该受体进入细胞），原始人类静息T细胞和CD34+细胞不能有效转导。另一方面，T细胞的激活提高了转导效率。在体内使用病毒载体进行基因治疗的情况下，对病毒的预先存在的免疫力可能导致基因修饰细胞数量的减少，这反过来又会限制体内重新填充的速率。转导和重新给药基因修饰细胞之间的时间间隔也至关重要，特别是对于可能分化并限制返回目标部位的干细胞。 为了保护它们的基因组结构，真核细胞具有防御机制，导致外来可移动元素或逆转录病毒的沉默，因此存在诱导沉默机制的可能性，这可能由于缺乏表达而使治疗基因失效。 4.通过病毒载体进行HIV基因治疗传递  用于体外基因传递的最常见病毒载体是慢病毒载体，因为它能够转导分裂和不分裂的细胞。最初，γ-逆转录病毒载体被用于基因传递；然而，它们靠近原癌基因整合并引起插入性突变的潜力变得明显。从那时起，已经多次尝试使病毒载体更安全、更有效地进行基因传递。选择病毒载体由要转导的细胞类型、病毒载体特性、感兴趣基因（转基因）的大小和期望的效果决定。下表1总结了不同病毒载体的载货量（插入大小）。 4.1.在HIV基因治疗中使用γ-逆转录病毒载体：并发症和提高安全性的方法 γ-逆转录病毒载体是最早用于有效基因治疗的病毒载体之一。这些载体以依赖细胞周期的方式转导活跃分裂的细胞，因此不转导静止的细胞。逆转录病毒最初是首选的载体，因为它们的使用导致转基因稳定地整合到宿主基因组中。然而，这一好处受到大约10%的患者观察到的一系列基因毒性事件的限制，表现为各种形式的白血病。例如小鼠白血病病毒，γ-逆转录病毒更倾向于靠近强增强子区域、转录起始位点、CpG岛和DNase-I高敏位点整合，并可能在靠近原癌基因时引起插入性突变。这些安全问题导致这些临床试验的暂停，因此，已经尝试提高它们的安全档案。现在已知，在逆转录病毒生命周期中，前整合复合体（PIC）与各种宿主转录因子相互作用，特别是溴结构域和外部末端家族蛋白（BET蛋白）和整合酶，导致整合到宿主基因组中。BET蛋白通过将病毒PIC系在宿主染色质上发挥作用，因此，开发不依赖BET的载体可以改变它们的整合档案。事实上，几个小组已经在细胞系和小鼠模型中证明了这种方法的有效性。另一种方法可能是修改整合酶，使其远离靠近原癌基因的整合。与慢病毒载体相比，创建自失活的RV载体的尝试不太成功，因为它们仍然保留着激活癌基因的能力。 4.2.慢病毒载体用于稳定基因表达：挑战和减轻这些挑战的策略 慢病毒是一类逆转录病毒，除了结构基因env、pol和gag外，还有辅助基因，如vpr、vpu、nef和vif，以及调节基因，如tat和rev。最著名的慢病毒是人类免疫缺陷病毒（HIV）。 工程化的慢病毒被认为是适合基因转移的，因为它们可以稳定地转导分裂和不分裂的细胞。与其他逆转录病毒的不同之处在于，大多数逆转录病毒的PIC需要核膜的破裂（在有丝分裂期间），以便允许进入细胞核，而慢病毒PIC通过核孔蛋白和importins的主动运输进入细胞核。PIC是病毒cDNA的组装，一些来自逆转录复合体的病毒蛋白和宿主细胞蛋白。逆转录后病毒DNA的整合是由整合酶和PIC介导的。一项研究发现，PIC更倾向于靶向靠近核孔的开放染色质区域，排除核内部区域和核纤层的周边区域。核周边的转录活跃基因与核孔复合体（NPC）相关，这影响了HIV-1基因表达。慢病毒更倾向于与积极转录的基因整合，整合模式得到目标细胞转录程序的支持。宿主细胞蛋白，晶状体上皮衍生生长因子（LEDGF/p75）直接与病毒整合酶相互作用，没有它，整合酶无法进入细胞核。现在已知LEDGF/p75将整合酶连接到染色质上。 4.2.1.慢病毒载体的演变 自从作为基因治疗载体被发现以来，慢病毒载体(LVs)经历了几次修改（见图4）。第一代LVs包括转基因构建、包膜构建和一个包含gag、pol和所有调节和辅助基因的包装构建。从HIV env改为VSV-G env或任何其他合适的病毒包膜（称为伪型化），允许有效转导多种细胞，尽管VSV-G导致静息淋巴细胞和HSCs的转导效率低下。第二代LVs包括转基因构建、表达VSV-G的包膜构建，以及包含gag、pol和调节基因tat和rev的包装构建。移除了所有辅助基因。第三代LVs在转基因构建中的病毒启动子中进行了修改，其中U3区域通过删除-418至-18的序列部分进行了修改，仅留下18 bp（移除了400 bp），因此创建了自失活(SIN)载体。因此，5′LTR具有18 bp U3、R和U5区域和一个PolyA尾。这使得载体仍然能够携带转基因盒，同时保持转录不活跃。U3被删除的部分被异源启动子替换，通常是巨细胞病毒（CMV）启动子或细胞启动子，如延伸因子1α（EF1α）。3′ LTR、U3区域也被删除，以防止在转染293T细胞过程中通过同源重组与5′LTR重组成完整病毒。载体构建还包含非编码域cPPT（中央多嘌呤区），这提高了RNA被包装进衣壳的效率，以及WPRE（Woodchuck肝炎病毒转录后调控元件），这增强了转基因的转录后处理。包装构建被分割成gag-pol构建和rev构建，删除了tat，因为它的转录激活环已从5′LTR中移除。因此，第三代系统由四个质粒构建组成，如图4所示。三个单独的包装构建降低了在质粒扩增和病毒载体生产过程中形成复制能力慢病毒的重组机会，并减少了启动子干扰相关问题的机会。第三代慢病毒构建通过修改携带转基因的质粒进一步重新设计，可以被认为是第四代慢病毒载体。在这个系统中，称为LTR1或PBS1（引物结合位点1），5′LTR已被移除，RNA信号（PBS-Y-RRE）被放置在3′LTR的下游。因此，这些信号在载体生产过程中存在，但在逆转录过程中丢失，并且不与转导的转基因一起复制，从而进一步提高了安全性。 图4. 慢病毒载体生成的进步。第一代构建包括转基因构建、伪型包膜（通常是VSV-G）和包含gag、pol和所有调节及辅助基因的包装构建。第二代载体与第一代载体类似，只是去除了辅助基因。第三代载体是自失活慢病毒载体，在U3区域有400 bp的缺失。第四代慢病毒载体去除了5' LTR，并将RNA信号(PBS-Y-RRE)放置在3' LTR的下游。RRE：Rev反应元件；PM：细胞来源或其他启动子；cPPT：中央多嘌呤区；VSV-G：泡状口炎病毒G型；WPRE：Woodchuck肝炎病毒转录后调控元件；Y：包装信号。Ch5'：嵌合5' LTR；PAS：引物激活信号。 4.2.2.优化慢病毒转导 有效的慢病毒转导人类细胞可能受到人类细胞产生的限制因子的限制，这些限制因子限制了慢病毒感染，如三部分基序蛋白5α(TRIM5α)、tetherin和载脂蛋白B信使RNA编辑酶催化多肽样3(APOBEC3)。其中一个被证明导致慢病毒基因传递到静息记忆T细胞效率低下的因素是限制因子SAMHD1（含α motif和组氨酸-天冬氨酸(HD)结构域蛋白1）。SAMHD1是一种细胞脱氧核苷酸三磷酸水解酶，阻止逆转录。HIV-2编码的vpx基因被发现可以抵消SAMHD1的限制能力。事实上，一项研究发现vpx在他们测试的所有条件下都增加了基因治疗传递，但当基因治疗针对逆转录前的步骤时效果最大。 优化体外培养条件是提高基因转移速率的有用方法。使用Polybrene、鱼精蛋白硫酸盐、Retronectin、热带增敏受体增强子、如Lenti-X accelerator的磁珠、Vectofusin-1、LentiBOOST和Staurosporine等试剂已被发现可以增强转导过程。使用胎牛血清(FBS)在用慢病毒载体转导CD34细胞时并不令人满意，因为它导致祖细胞的转导增加，但HSCs的转导减少。此外，由于对其异种成分产生抗体，存在免疫风险的担忧。已经开发了各种无血清培养基，适用于不同类型干细胞的转导，例如，加拿大温哥华干细胞技术公司的StemSpan无血清扩增培养基(SFEM)。将敲除血清替代品(KSR)培养基添加到StemSpan培养基中，已被发现可以提高原代CD34+细胞和外周血单个核细胞(PBMCs)的转导效率。 4.2.3.慢病毒载体沉默 像γ-逆转录病毒载体一样，尽管程度较轻，慢病毒载体也容易受到转基因沉默和转基因效率变异的影响，这是由于转基因与宿主基因组（染色体位置效应）中其直接基因组邻域的相互作用。一些宿主和载体特征被假设可以引起这种效应，包括DNA甲基化和组蛋白修饰，包括由多梳家族蛋白介导的修饰。可以隔离转基因免受沉默的策略包括使用更强的增强子启动子、脚手架/基质附着区域(S/MARS)，这些可以保护增强子免受DNA甲基化，和染色质域隔离子，这些可以抑制抑制性位置效应。 4.2.4.减少插入性突变的策略 已经尝试了各种方法来减少插入性突变的机会。一种策略是将整合导向远离原癌基因的“安全基因组港湾位点”。Schenkwein等人使用I-PpoI，一种来自黏菌Physarum polycephalum的二聚体18-20 KDa同源性内切核酸酶，将整合导向一个高度保守的位点，28S核糖体RNA。这是通过识别该区域的15 bp位点来实现的。另一种策略是通过改变整合酶核心结构域(D64、D116和E152)的催化三联体来生产非整合慢病毒载体。虽然消除了插入性突变的风险，但这些载体只能用于瞬时基因表达。基因表达也低于整合慢病毒载体。修改LEDGF/p75的功能，其功能是指导慢病毒整合，可以允许整合到更安全的区域或更随机的整合，从而减少靠近原癌基因的整合机会。 4.3.腺相关病毒载体(AAVs)：限制其使用的挑战 重组腺相关病毒是在临床应用中首选的载体，当需要短暂表达转基因（根据感染细胞的周转时间，从几个月到几年不等）时。这些载体不含病毒DNA，而是基于蛋白质的纳米颗粒，被设计为穿越细胞膜并将DNA送入细胞核。这些载体非常稳定，能够承受操作过程中出现的物理或化学挑战。病毒基因组也容易操纵，并且具有良好的安全档案。AAVs可以携带高达4.5 kb的转基因盒。然而，AAVs的主要挑战是它们在自然界中广泛存在，因此抗AAV免疫很高，12种已知血清型的中和抗体的流行率在某些人群中从20%到100%不等。这些载体的给药也可能引发治疗后的体液反应。正在应用各种策略来克服衣壳免疫、补体固定和AAV基因组感知。一种策略是通过合理设计、随机突变和衣壳重组来工程化衣壳，以防止衣壳中和。另一种策略是免疫抑制，即阻断涉及B细胞激活的经典途径，从而抑制体液反应，尽管体外基因治疗的体液反应可能有限。为了减少AAV基因组感知，可以通过耗尽载体基因组中的CpG二核苷酸来阻止TLR信号传导。腺相关载体可以用来转导多种细胞，包括间充质基质细胞、神经细胞等，尽管它们不适合造血细胞。 许多研究小组正在研究使用AAVs将广泛中和抗体送入骨骼肌，以提供针对HIV的持久效果，无论是作为预防还是治疗，或两者兼有。最近一篇综述文章分析了它们在HIV感染中的使用，以及当前挑战和可以采用的策略来克服其有效性的障碍。 4.4.体外细胞选择和扩增 根据转导的细胞类型、载体类型、感染倍增性(MOI)和使用的转导技术，转导的细胞数量通常低于理论上的预期。因此，转导过程不是100%有效。然而，有几种方法可以最大化转导效率。除了第4.2.2节中提供的例子外，使用高MOI可以产生更高的载体拷贝数(VCN)，尽管这增加了异常剪接事件的风险。通过色谱法纯化载体颗粒也可以增加转导效率。转导后，选择携带转基因的细胞并扩增这些细胞以增强它们在体内的植入是有益的。这可以通过细胞表面标记或设计载体表达抗生素抗性基因来实现，然后在应用适当的抗生素时，将允许优先选择携带转基因的细胞。 转导HSC的扩增目标是在保留“干细胞特性”的同时增加数量。通常支持分化为成熟谱系的传统培养基导致自我更新能力的丧失。体外基因治疗的体液反应可能有限。为了限制污染的可能性，最好使用无血清培养基进行HSC扩增。Tajer等人最近的文章总结了添加到培养基中以增强扩增的因素。已经使用了几种细胞因子和生长因子，包括SCF、FLt3配体、TPO（血小板生成素）、IL-3和IL-6，尽管由于IL-3刺激祖细胞的扩增而不是HSCs，它并不包括在某些培养基中。还发现其他化合物也很有用。这些包括前列腺素E2 (PGE2)，它通过改善HSCs的归巢和自我更新能力来增强HSCs的植入，和Stem Regenin 1 (SR1)，一种芳香烃受体拮抗剂，用于扩增人类和小鼠CD34+，尽管它也被发现更有利于多能祖细胞而不是长期重聚干细胞。这与UM171形成对比，UM171是一种嘧啶哌啶衍生物，它支持干细胞的扩增而不是多能祖细胞。因此，它们可以组合使用，以促进两种谱系的扩增。其他使用小鼠模型的研究表明，可以调节调节干细胞归巢和分化的信号通路。这些包括Notch信号通路、Homeobox基因、Wnt等。锌指转录因子Sall4的过表达导致HSCs（CD34+细胞）在体外和小鼠模型中迅速有效扩增（增加50倍）。 5.基因修饰造血干细胞的给药：增强基因修饰细胞的优先植入  HSC输注后造血重建的第一阶段（最多6个月）是由于承诺的祖细胞（短期HSCs），它们具有有限的自我更新能力。大约6个月后，CD34+克隆减少，第一波克隆重建耗尽，长期HSC逐渐接管重建，它们能够自我更新，其效果甚至在基因治疗后3年仍然存在。因此，短期HSC在早期阶段活跃，而长期HSC在这一阶段进入静止状态，并在短期HSC耗尽时激活。 5.1.清空造血干细胞壁龛的调理方案 在用于造血障碍的自体基因治疗中，目标是用宿主细胞替代有特定遗传缺陷的细胞。在HIV基因治疗中，目标是用有抗性的细胞替代易感染的细胞，或能够对抗病毒的细胞。干细胞壁龛允许维持干细胞并调节其功能；HSC壁龛位于骨髓和脾脏的血管周围。清除用于转导HSCs吸收和消除未转导细胞的壁龛的过程，也称为调理，传统上一直使用化疗和放疗进行，这对目标器官没有特异性。进行调理是为了耗尽壁龛中的造血干和祖细胞，以减少同种异体移植的免疫排斥机会，在恶性疾病的病例中治疗任何恶性肿瘤。调理方案可以分为清髓性调理（MAC）、非清髓性调理（NMA）和减低强度调理（RIC）。清髓性方案由烷化剂组成，有或没有全身照射（TBI），导致全血细胞减少症和1-3周内造血耗尽，不允许自体血液学恢复。因此，为了生存，需要干细胞支持。MAC方案与毒性有关，有时甚至死亡，特别是如果植入出现问题。毒性迹象包括器官衰竭、粘膜炎、骨髓抑制、继发性恶性肿瘤、肌肉骨骼疾病和心脏、肺、生殖和内分泌异常。接受MAC治疗的人群的长期死亡率也高于普通人群。 由于这些不希望的副作用，开发了较低强度的方案。较低的强度意味着可逆的骨髓毒性，与MAC诱导的不可逆骨髓毒性相比。这些方案是NMA和RIC。非清髓性方案引起最小的细胞减少症，不需要干细胞支持。另一方面，减量调理涉及将MAC方案的剂量至少减少30%，虽然它不会导致干细胞的消融，但仍然需要干细胞支持才能在临床上实用。这些调理方案的细节已经回顾过。尽管RIC毒性较小，但发现它对基因治疗的效率较低，因为它导致外周血细胞中基因标记较少，这可能是由于壁龛清除效率低下或对转基因的免疫耐受性诱导不充分。在基因治疗中，辐射或化疗药物的剂量由正在治疗的疾病状况和患者特征决定，包括年龄和性别。欧洲骨髓移植组（EMBT）风险评分是一个用于评估癌症患者移植风险的工具，也可以扩展到任何需要移植的患者。它基于五个因素：患者年龄、疾病阶段、诊断到移植的时间间隔、供体类型（就HLA分型而言）和供体-受体性别组合。通常，30岁以后使用MAC方案死亡率增加，50岁以后不推荐使用。如果供体和受体不是同一性别，也有更高的排斥风险。 5.2.基因修正造血干细胞的体内选择 为了改进携带转基因细胞的选择，在动物模型的体内研究中采用了体内化学选择技术。使用药物抗性基因进行体内选择转基因需要药物抗性基因在转导细胞中高度表达，在非转导HSCs中根本不表达或表达水平低；选择药物应该耗尽大多数非转导细胞，对非造血毒性很小，并且在非恶性条件下不具有遗传毒性。在动物模型中用于选择的基因，特别是在小鼠中，包括多药抗性基因(MDR1)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、乙醛脱氢酶(ALDH)、胞嘧啶脱氨酶(CDD)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)。 一项研究使用了O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)的突变体，这是一种DNA烷基化修复酶。突变体MGMTP140K在非人灵长类动物中显示出稳定和有效的HSCs选择，尽管使用(Carmustine-BCNU，例如)的烷基化剂的致癌性质是一个缺点。另一项研究使用短发夹RNA(shRNA)敲除次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)，在这些小鼠模型暴露于6-硫鸟嘌呤(6 TG)时实现HSCs的选择。使用这种方法很有吸引力，因为它允许转导的HSCs自我更新、增殖和分化，该方法用于清除壁龛并使携带转基因的细胞优先植入。诱导药物抗性的shRNA仅长48 bp，用于化学选择的6 TG量低，尽管6 TG可能诱发白血性。该组使用MOI为1，在两轮连续病毒暴露后，未用生长因子预刺激以保持“干细胞特性”，实现了20-30%的慢病毒转导效率。 5.3.清除壁龛的最新发展 提高壁龛清除和促进转导细胞植入的最新发展是使用与能够清除壁龛的药物结合的单克隆抗体。这些方法允许针对性地清除HSC壁龛，因此减少了上述调理方案非特异性相关的副作用，并使携带转基因的细胞优先植入。例如，为了改进HSCs的选择，最初的小鼠研究使用了CD45-抗体药物偶联物(CD45-ADCs)，但很快意识到这些对HSCs并不特定，并导致淋巴细胞耗尽，因为CD45也存在于淋巴细胞和其他白细胞表面。使用CD117-抗体药物偶联物(CD117-ADC)，可以更具体地针对HSCs，在小鼠模型中使内源性HSCs耗尽超过99%。2019年报道这种技术效果的第一组使用链霉亲和素连接子将CD117与毒蛋白连接起来，并测试了其对NOD SCID Gamma(NSG)小鼠和非人灵长类动物的效果。另一组使用了抗人CD117 IgG1单克隆抗体偶联物AMG 191，发现其在非人灵长类动物中有效，目前正在进行1/2期临床试验。另一组将CD117+与鹅膏毒素(MGTA-117)偶联，发现其在患有急性髓细胞性白血病(AML)的小鼠模型中非常有效（耗尽了超过95%的HSPCs）。CD117在AML细胞中高度表达，这种方案被发现可以减少这些小鼠的肿瘤负担。 6.基于体外HIV基因治疗的临床试验  如前所述，HIV的基因治疗努力集中在使免疫系统更擅长履行其功能，或旨在沉默或编辑整合的原病毒，使其复制能力不足或使细胞对感染有抵抗力。已经进行了几项临床试验，旨在检查HIV基因和细胞治疗产品的效用和安全性。 6.1.基于细胞治疗的HIV临床试验 最早的细胞治疗研究之一创建了嵌合T细胞受体：CD4-Zeta基因修饰T细胞。这项早期临床研究（NCT01013415）的结果发现，尽管病毒库在各组之间没有差异，但在接受了基因修饰细胞的组中，HIV负担从基线有所下降，并且复发性病毒血症的患者趋势减少。AGT103-T是一种产品，可以恢复慢性HIV病患者的gag特异性CD4+ T细胞反应。最初的1期临床试验结果（NCT03215004）显示了一些有希望的结果。对参加研究的患者进行了白细胞去除术。一旦细胞被基因修饰并通过了质量控制测试，患者在基因治疗产品输注前一周用环磷酰胺进行了非清髓性调理，剂量为1 g/m2。AGT103-T修饰细胞以每公斤体重2到2100万细胞的剂量输注。即使在基因治疗产品输注后6个月，也可以观察到细胞的基因标记。没有记录到严重不良事件。 SB-728是一种锌指核酸酶(ZFN)介导的，CCR5修饰的，自体CD4+ T细胞产品。这项研究的各种版本发现，即使在重复剂量给药后，也没有发现严重不良事件。当使用环磷酰胺进行调理时，植入效果更好。其中一项研究发现，尽管病毒反弹有延迟，并且CD8+ T细胞反应改善了6个月以上，但对潜伏病毒库没有长期影响。另一项研究，NCT03617198，将CAR-T细胞治疗与ZFN CCR5修饰相结合，作为一种双重治疗方法，确保CD4+细胞对感染有抵抗力，并且同时能够检测和清除HIV感染的细胞。最后，NCT04648046使用了编码双特异性抗gp120 CAR分子的慢病毒载体(LVgp120duoCAR-T)来针对表达HIV gp-120的细胞。 6.2.基于通过逆转录病毒载体进行基因传递的临床试验 早期直接针对HIV的研究使用了逆转录病毒载体来传递抗HIV基因。在一项研究中，使用了同种基因T细胞（来自同卵双胞胎），使用逆转录病毒载体传递了细菌基因NeoR（NCT00001353）。这项研究的目的是证明，通过基因转导的同种基因细胞实际上可以通过成熟细胞的分裂，而不是前胸腺干细胞的分裂，持续数周至数月。在涉及双胞胎的一项研究中（NCT00001535），从血清阴性的双胞胎中获得了同种基因CD4+淋巴细胞，并用携带反义TAR或反义Tat/Rev RNA，反式优势Rev蛋白或两者结合的逆转录病毒载体转导。临床前研究表明，所有使用的抗HIV载体都抑制了HIV，反式优势Rev蛋白显示出更大的抑制作用。尚未发布临床试验的结果。涉及双胞胎的所有研究的长期随访（Gemini Study—NCT04799483）目前正在进行中。另一项使用逆转录病毒载体的研究，NCT00002221，从计划进行自体骨髓移植的非霍奇金淋巴瘤HIV阳性患者中获得了外周血CD34+细胞，并将这些细胞分成三个池。一个细胞池用含有两个核糖酶序列“L-TR/Tat-neo”的逆转录病毒载体转导，第二个池用对照载体‘LN’转导，第三个池保持未修饰细胞。然后将这些细胞重新输注回患者体内。尚未发布这项研究的结果。除了逆转录病毒载体观察到的插入性突变风险外，这项后续研究的成功也可能因携带治疗基因的细胞比例低而受到阻碍。 RevM10是HIV-1 Rev基因的优势负性突变体。使用逆转录病毒载体将这个基因转导入CD4+ T细胞，结果抑制了HIV复制，并持续了6个月。尚未发布在造血干细胞中研究RevM10的结果（NCT00003942）。逆转录病毒载体也用于传递MazF，一种Tat依赖性内切核酸酶基因，在1期研究中评估其安全性、耐受性和免疫原性。MazF源自大肠杆菌，选择性地切割mRNA中的ACA序列，这些序列在HIV中很常见。这项研究发现，单次静脉注射用MazF转导的自体CD4+ T细胞导致CD4+和CD8+细胞增加，这种效果至少持续了6个月。 核酸酶是催化RNA分子，可以针对任何具有NUX切割位点的RNA序列，其中N是任何核苷酸，X是A、C或U中的任何一个。在一项概念验证的1期研究中，Rz2，一种针对tat基因起始密码子附近GUA序列的核酸酶，通过逆转录病毒载体传递到同种基因外周血单个核细胞(PBMCs)中，这些细胞是从血清阴性双胞胎的基因修饰细胞中获得的，然后输注到血清阳性双胞胎体内。共有4名患者参加了这项研究，该研究表明基因标记细胞的持续存在，无论是短期（24周）还是长期（44个月），在此期间没有观察到严重副作用。在一项相关的2期基因治疗试验中，通过逆转录病毒载体将一种抗HIV核酸酶转导到自体CD34+细胞中，患者接受了tat–vpr–特异性抗HIV核酸酶（OZ1）或安慰剂。没有与OZ1相关的不良事件。尽管在主要终点（大约48周）时OZ1和安慰剂组之间的病毒载量没有统计学上的显著差异，但在40周时观察到了显著差异，并且直到100周，OZ1组的CD4+ T细胞高于安慰剂组。在长期随访研究中，NCT01177059，最初入组的68人中有18人完成了研究，其中7人有严重不良事件，包括各种类型的肿瘤（例如，基底细胞癌、霍奇金病、卡波西肉瘤、乳头状甲状腺癌、皮肤癌），这些最有可能是由逆转录病毒载体引起的。 6.3.基于慢病毒载体的HIV研究 在VRX496（Lexgenleucel-T）研究中，使用携带针对HIV包膜的抗HIV反义基因的基于HIV的慢病毒载体修饰自体T细胞。安全性和耐受性研究，NCT00295477，发现血液中的植入半衰期为5周。一些患者的基因标记细胞甚至在5年后还存在。这项研究表明，基因修饰细胞可以对HIV施加遗传压力。 另一项使用慢病毒载体传递抗HIV基因的研究结合了针对CCR5的短发夹RNA（shRNA），它阻止病毒进入，人/恒河猴嵌合TRIM5α，一种在进入细胞质时破坏病毒衣壳解壳的天然分子，因此抑制HIV感染，以及转录激活反应（TAR）诱饵，它通过结合病毒Tat并将其隔离，因此阻止其介导前病毒DNA的有效转录。这项临床试验的结果尚未发布。 在一组研究中，接受自体移植治疗淋巴瘤的患者被输注了用含有tat-rev shRNA、TAR诱饵和CCR5核糖酶（LV Rhiv7-shITAR-CCR5RZ）的慢病毒构建体修饰的CD34+造血干细胞。四名患者的早期结果表明，基因修饰细胞在输注后第11天植入，并且即使在24个月时，载体仍然存在，并且在病毒血症后选择基因修饰细胞。尚未发布各个研究的结果。 Cal-1是一种双重抗HIV基因转移慢病毒构建体，它传递一种沉默CCR5的shRNA（sh5），并在不同的启动子下，编码一种小肽抑制剂的序列，这种抑制剂可以防止HIV包膜与宿主CD4+细胞的融合（C46）。已在不同地点对Cal-1进行了几项研究。在NCT01734850中，对13名患者进行了Cal-1治疗，并评估了该治疗的安全性。Cal-1的临床前研究表明，该治疗有效且安全。在临床试验中，使用白消安调理来清除壁龛，以允许基因修饰细胞的植入。在两个接受白消安调理的治疗组中观察到严重和危及生命的不良事件，与单剂量白消安相比，双剂量白消安的副作用更严重。未接受调理的组没有严重不良事件。患者目前正在进行长期随访研究（NCT02390297）。与调理相关的毒性是成功传递基因治疗的常见挑战，因此开发更安全、更有效的方法来清除壁龛，以实现成功和稳定的植入是值得的。 这些临床研究表明，在实现足够植入的足够清除壁龛、使基因修饰细胞的生产和由于调理导致的骨髓毒性之间存在微妙的平衡。 为了帮助推进HIV治愈方法的临床前研究，例如使用si/shRNA的“阻断和锁定”方法的研究报告，解决这些挑战至关重要。这组临床前小鼠研究已经报告了通过si/shRNA成功沉默HIV，尤其是shPromA，它针对病毒启动子中的串联NF-KB转录因子位点，以诱导下游病毒基因表达的转录基因沉默和抑制性表观遗传修饰（见图2）。结合含有CCR5 shRNA的Cal-1载体，目前正在研究针对启动子的si/shRNA PromA，以开发针对宿主CCR5和病毒启动子靶标的组合HIV基因治疗。 7.基于体内传递的HIV基因治疗临床试验  采用体内方法治疗HIV的研究主要处于临床前阶段。体内方法涉及直接将基因治疗产品通过病毒载体（如腺病毒载体、腺相关病毒载体或非整合慢病毒载体）或非病毒方法（如纳米粒子）引入患者体内。体内方法可能无法提供持久的治愈，因为没有转基因与宿主遗传物质的稳定整合，并且需要优化特定细胞的传递，以减少脱靶效应的机会。通过重组酶或核酸酶系统的基因编辑，或使用RNA干扰或可能的CRISPR干扰的沉默机制，可以使用体内方法。 目前的临床试验包括使用leronlimab的研究，leronlimab是一种抗CCR5人源化IgG4抗体，通过与CCR5相同的附着位点（细胞外环2和N-末端结构域）结合，竞争性地抑制HIV env附着到CCR5。这种药物通过皮下给药，该组目前正在使用合成AAV载体进行传递。这项研究的几个版本—NCT00642707、NCT02175680、NCT02355184、NCT02483078、NCT02990858、NCT03902522、NCT02859961和NCT05271370—证明了产品的安全性和有效性，患者大多经历了轻微的副作用，并且在较高剂量的525 mg和700 mg时观察到效果。 CRISPR-Cas9技术用于HIV治愈 CRISPR及其CRISPR相关核酸酶9（Cas9）系统是一种基因编辑系统，通过导向RNA介导的基因组区域的双链断裂，然后通过非同源末端连接途径进行修复。最近发表了几篇描述HIV临床前研究的综述文章[222,223]。最近使用CRISPR-Cas9治疗HIV的临床试验是NCT03164135，该试验使用这项技术在进行异体干细胞移植治疗血液恶性肿瘤的患者中敲除HSCs中的CCR5基因。一名急性淋巴细胞性白血病患者的初步结果显示，完全供体嵌合体的缓解，并且敲除CCR5的供体细胞持续了19个月，没有基因编辑不良事件。然而，携带修改的淋巴细胞的百分比仅为5%，团队正在研究如何使过程更有效。另一种基于CRISPR-Cas9的HIV基因治疗产品是EBT-101（NCT05144386）。这种基因治疗作为单次静脉注射给药，并通过使用两个导向RNA靶向整合原病毒的三个位置的AAV传递。最近有三名患者参加了1期临床试验，该公司（Excision Bio Therapeutics, San Francisco, CA, USA）在2023年10月的欧洲基因和细胞治疗年会上提出的初步结果显示，没有剂量限制毒性或严重不良事件。 CRISPR-Cas 9可以用来靶向HIV-5′LTR，这是启动子区域，因此可以阻止潜伏病毒的复制或激活；CCR5或CXCR4区域，使细胞对感染有抵抗力；或促进HIV复制的限制因子，阻断它们的活性。虽然目前还没有CRISPR-Cas9基因治疗被批准作为HIV治愈方法，但FDA最近批准了第一种用于镰状细胞病的基于CRISPR-Cas9的细胞基因治疗方法，Casgevy（https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-first-gene-therapies-treat-patients-sickle-cell-disease, 访问日期为2024年1月27日），突显了基因治疗的创新进步和CRISPR-Cas9作为HIV治愈方法的潜力。 8.结论  长期或永久表达抗HIV基因和修改CD4+和CD34+细胞以使它们对感染有抵抗力或允许破坏HIV生命周期是实现HIV治愈的重要策略。尽管联合抗逆转录病毒治疗的出现大大改善了患者的治疗结果和HIV感染者的生活质量，但治愈是可取的，特别是对于已经对当前方案产生耐药性的患者。至少提供功能性治愈的产品可能需要多重治疗剂与不同作用模式的组合，以最小化耐药性的机会，并且是长效的，或理想情况下需要单次给药。因此，至关重要的是要利用当前生物技术的进步来增强基因治疗方法，并使基因治疗产品更安全、更经济、更持久。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。