NEDD4

关注小药说药，一起成长！ 前言 基于T细胞的免疫疗法的出现显著改变了癌症患者的治疗模式。尽管取得了成功，但目前批准的免疫治疗方案仍然存在局限性。因此，需要对T细胞活化和抑制的分子机制有更深入的了解，以合理地扩大改善免疫治疗的靶点和可能性。 免疫信号通路下游的蛋白质泛素化对于几乎所有免疫反应，特别是T细胞激活的正调节和负调节至关重要。大量研究表明，泛素化通过控制蛋白质的功能、定位和稳定性发挥多种细胞和分子作用，对泛素依赖性通路的调节可以显著改变T细胞的活化并增强抗肿瘤反应。因此，人们正在积极开发有选择性地利用泛素相关酶用于癌症治疗的技术，靶向泛素化为推进T细胞免疫治疗提供了巨大的可能性。 蛋白质泛素化 泛素化是一种翻译后修饰，泛素是一种由76个氨基酸组成的小蛋白质，通常由一条泛素链与底物蛋白质内的赖氨酸残基共价连接。泛素化通过各种方式影响蛋白质功能，例如通过影响蛋白质稳定性、周转率、细胞定位，以及诱导影响与其他蛋白质相互作用的构象变化。 该过程由E1泛素激活酶启动，该酶使用ATP激活，然后将泛素单体转移到E2泛素结合酶。泛素最终在E3泛素连接酶的作用下从E2转移到底物。 泛素化是多方面的，底物蛋白可以仅用一个泛素（单泛素化）、多个单泛素（多个单泛素化）或多泛素链（多泛素化）标记。由于泛素本身有七个赖氨酸（Lys6、Lys11、Lys27、Lys29、Lys33、Lys48和Lys63）和一个N端甲硫氨酸残基（M1），可以进行泛素化，因此可以形成几种结构不同的同质/同型、混合/异型和分支多泛素链。 泛素化除了是通过蛋白质体降解蛋白质的主要调节器外，实际上是几乎所有细胞信号级联的多功能调节器。泛素化蛋白质的命运取决于添加的泛素数量和形成泛素连接的泛素氨基酸。通过这种方式，并且由于拓扑结构不同链的多种可能性，泛素构成了一种高度通用的信号。 单泛素化和多泛素化参与膜受体的内吞作用，以及蛋白质降解、定位和蛋白质-蛋白质相互作用，这些类型的链也与TGF-β信号传导有关。在同型多泛素链中， Lys48和Lys63连接的链是最丰富，它们分别驱动蛋白酶体降解和调节多种细胞信号事件。Lys11连接链调节细胞周期和线粒体自噬，M1连接链对炎症固有反应至关重要，特别是调节NF-κB信号。 由Lys6-、Lys27-、Lys29-、Lys33泛素连接链调节的细胞过程仍然不太清楚。Lys27连接链似乎对调节先天免疫、细胞周期和线粒体功能非常重要。Lys6链似乎参与DNA修复和线粒体自噬，而Lys29链与Wnt信号以及蛋白毒性应激和细胞周期相关。Lys33链在高尔基体后转运和T细胞受体（TCR）调节中起着关键作用。 此外，非常重要的是，泛素在底物上的组装可以通过去泛素化酶（DUB）的作用逆转，去泛素化酶水解并从底物上去除泛素，使泛素化成为一种瞬时修饰，DUB对于维持生理性泛素平衡是必不可少的。这种平衡的失调与人类疾病的发病机制有关，特别是癌症、感染、神经退行性变和免疫紊乱，因此，DUB已开始作为基于抑制剂的治疗成为有吸引力的药物靶点。 TCR/CD3激活中的泛素途径 E3连接酶 E3泛素连接酶Casitas B系淋巴瘤（Cbl-B）是最具特征的E3连接酶，是T细胞活化的主要参与者。在T细胞激活时，它在免疫突触处被招募到TCR中，在TCR下游发挥多种抑制机制。 Cbl-b通过其多个蛋白质相互作用结构域与关键TCR信号体分子（如LCK、SLP76、ZAP70、Vav1、PKCθ和PI3K）相互作用。Cbl-b与E3连接酶Itch协同作用，能够介导TCR-ζ的Lys33连接的多泛素化，其不针对TCR受体进行降解或内吞，而是阻止其磷酸化并进一步与下游ZAP70激酶结合。通过这些相互作用，以及一些信号体成分的泛素化，Cbl-b强烈抑制T细胞活化。Cbl-b敲除小鼠具有过度活跃的T细胞，其激活不需要CD28，此外，Cbl-b基因敲除小鼠中从未描述过自身免疫损伤。因此，Cbl-b具有多个检查点抑制作用和极小的自身免疫毒性，是未来靶向癌症免疫治疗的有力候选。 与淋巴细胞无能相关的基因（GRAIL）是一种跨膜E3连接酶，定位于内体，也对T细胞活化起负调节作用。TCR介导的T细胞活化促进GRAIL的表达，而GRAIL反过来又阻碍T细胞活化。机制上，GRAIL通过非降解泛素链稳定和激活Rho-鸟嘌呤解离抑制剂（RhoGDI），导致细胞骨架重排和IL-2分泌缺陷。 NRDP1是另一种损害TCR信号的E3连接酶。T细胞激活后，NRDP1将Lys33多聚泛素非降解链添加到ZAP70激酶。Lys33连接的泛素链有助于招募Sts1和Sts2磷酸酶，最终使ZAP70去磷酸化和失活。 除了作用于近端信号体外，E3连接酶还通过进一步作用于下游抑制T细胞活化，控制导致T细胞活化转录因子核易位的关键转导事件。例如，在TCR/CD28连接后，E3连接酶Pellino1（PELI1）通过用Lys48多泛素链标记c-Rel来阻止NF-κB通路，导致其蛋白酶体降解。 DUBs 去泛素化酶A20和CYLD，在调节天然免疫细胞中的NF-κB信号中具有重要作用，也能显著改变T细胞功能。外周T细胞中A20的条件性缺失导致CD8+T细胞具有增强的NF-κB信号，即使在低抗原剂量下也能更有效地被激活，以产生更高水平的IL-2和IFN-γ。 CYLD可以通过NF-κB损害T细胞活化，它是通过将CBM复合物下游TAK1激酶的Lys63泛素链进行去泛素化。CYLD缺陷小鼠出现结肠炎，T细胞频率和活化增加。 使用类似的作用机制，去泛素酶USP18对TAK1的去泛素化抑制TCR。USP18的基因缺失导致T细胞中NF-κB和NFAT的过度激活和IL-2的过度产生。相反，去泛素酶USP9X和USP12通过从BCL10中去除抑制性泛素链来积极调节NF-κB通路，从而阻断CBM信号复合物的组装。因此，缺乏USP9X或USP12的T细胞在TCR激活时表现出较低水平的NF-κB激活，以及增殖和细胞因子生成减少。 TCR内化 TCR信号幅度和持续时间由细胞膜受体的内化、再循环和降解的平衡决定。在抗原刺激下，TCR/CD3复合物是泛素化的，而泛素化对于表面受体的内化至关重要。据报道，Cbl-b可单独或与E3连接酶c-Cbl联合促进TCR的内化，Cbl-b还干扰激活和聚集，从而破坏免疫突触的稳定性，进一步减弱TCR信号。 类似地，E3连接酶GRAIL可以通过蛋白酶体多泛素化和降解CD3ζ分子来下调表面TCR/CD3复合物的表达。最近的研究表明，用于CAR-T治疗的CAR受体的表面表达也受到泛素介导的内吞和降解的影响。注入患者体内的CAR-T细胞持续性差是这种肿瘤免疫疗法的主要限制。最近的一项研究能够通过对细胞质结构域的所有赖氨酸残基进行突变来提高CAR的稳定性，这有效地绕过了CARs的泛素化依赖性溶酶体降解，因此，这些CAR-T细胞改善了CAR的持久性和来自内体的信号传导，同时增强了效应器功能，从而在小鼠模型中产生持久的抗肿瘤免疫反应。 共刺激受体下游的泛素途径 CD28 E3连接酶Cbl-b是CD28介导的信号传导的主要抑制剂，从机制上讲，E3连接酶Cbl-b通过结合和泛素化PI3K的p85β亚单位来抑制CD28依赖的PI3K途径。 E3连接酶不仅能阻碍CD28信号传导，而且能促进CD28信号传导。例如，TCR/CD28激活NFAT涉及E3连接酶TRAF6。TRAF6被招募到免疫突触与支架蛋白LAT相互作用，并通过Lys63泛素化增强LAT磷酸化和TCR信号。 为了充分激活T细胞，CD28共受体必须克服Cbl-b抑制。CD28信号通过触发Cbl-b的翻译后修饰来阻断Cbl-b抑制途径，最终导致其蛋白酶体降解。其中E3连接酶NEDD4发挥着重要作用，据报道NEDD4在CD28共刺激下结合并泛素化Cbl-b进行蛋白酶体降解。 其他共刺激受体 与CD28类似，肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族成员的共刺激受体4-1BB、CD40L、OX40和GITR与TCR协同促进T细胞活化，尤其是增殖和细胞因子的产生。作为TNFRs，它们缺乏内在的酶功能，依赖于几种E3连接酶，包括TRAF（TRAF1/2/3）、cIAP1/2和LUBAC，在导致NF-κB活化的信号转导级联中引导大量Lys63、Lys48和线性泛素化事件。去泛素酶A20、CYLD和OTULIN可以清除这些泛素化事件以阻止NF-κB的活化。 抑制性受体下游泛素途径 CTLA-4 到目前为止，没有任何E3直接泛素化CTLA-4的报道，也没有CTLA-4中泛素化位点的记录。然而，CTLA-4缺陷型T细胞的泛素修饰总体上显著减少，这有力地表明了泛素化事件在CTLA-4途径中的重要性。此外，实验证据表明，主要CTLA-4抑制功能由关键的T细胞抑制性E3连接酶介导，该连接酶也调节T细胞活化，即Cbl-b、ITCH和GRAIL。 此外，Cbl-b、ITCH和GRAIL是T细胞无能的基本驱动因素，而且这三种E3连接酶还通过调节Treg的发育和功能发挥重要的免疫抑制作用。Cbl-b和ITCH参与TGF-β介导的Foxp3调节，缺乏这两种E3连接酶都会损害TGF-β诱导的Foxp3+Tregs（iTreg）的发育，导致iTreg低表达，功能缺陷。 PD-1 与CTLA-4不同，一些报告强调了泛素化在PD-1/PD-L1系统中的关键作用。对于T细胞上的PD-1受体，Cbl-b也作为PD-1抑制途径的关键介质显著参与，缺乏Cbl-b的T细胞对PD-1抑制具有抵抗力。没有Cbl-b，PD-1在抑制IFN-γ产生或诱导T细胞活化后的细胞死亡方面效率低下。 另一种Cbl E3连接酶c-Cbl也影响PD-1，但与Cbl-b相反，它是一种负性调节因子。c-Cbl与PD-1的胞质尾部结合，并作为E3连接酶，泛素化PD-1进行蛋白酶体降解。因此，c-Cbl减少提高了CD8+T细胞和巨噬细胞中PD-1的表达。 同样，E3连接酶FBXO38通过介导PD-1降解来控制T细胞抗肿瘤反应。从机理上讲，FBXO38通过在Lys233处添加Lys48多聚泛素链来标记PD-1进行降解。缺乏FBXO38的黑色素瘤和结直肠癌小鼠模型具有更高的肿瘤负荷，这与肿瘤浸润性T细胞中PD-1的高表达有关。 PD-L1 PD-L1的肿瘤水平是肿瘤免疫的重要决定因素。几项研究已确定癌细胞利用EGFR信号稳定PD-L1表达以逃避T细胞免疫。E3连接酶识别并泛素标记PD-L1进行蛋白水解，主要依赖于糖原合成酶激酶3（GSK3α/β）。GSK3β磷酸化PD-L1的C端结构域，以招募E3连接酶β-TrCP用于PD-L1泛素依赖性降解。而EGFR信号通过诱导GSK3β磷酸化位点附近的PD-L1大量糖基化来对抗GSK3β/β-TrCP/PD-L1降解途径。 另一项研究进一步表明GSK3α/ARIH1是另一种诱导PD-L1蛋白水解的激酶/E3连接酶对。E3连接酶ARIH1识别S279/S283处PD-L1的GSK3α依赖性磷酸化，随后PD-L1 Lys48泛素化和降解。最近，还发现EGFR通过额外干扰膜结合MARCH8 E3连接酶增加PD-L1水平，该连接酶也以PD-L1为降解靶点。最后，c-Cbl过表达，单独或与Cbl-b联合，也可以降低STAT3/AKT/ERK磷酸化，从而下调PD-L1表达并增加抗肿瘤反应。 Cullin3 SPOP和TRIM21E3连接酶通过泛素化依赖性降解进一步破坏PD-L1的稳定性，它们的作用再次依赖于激酶，特别是细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4和CDK5。然而，CDK4通过稳定Cullin3 SPOP协助PD-L1降解，而CDK5则消极干扰TRIM21对PD-L1的作用。 此外，PD-L1也因其他几种去泛素化酶而稳定，即OTUB1、USP9X、USP7。这些研究具有潜在的治疗意义，因为它们证明，抑制或清除这些DUB中的任何一种都可以重新激发小鼠的抗肿瘤反应，并使癌细胞对T细胞杀伤敏感。 泛素依赖途径肿瘤药物的开发 到目前为止，针对泛素依赖的途径主要是基于小分子抑制剂，这些小分子可以通过直接结合或变构作用阻断泛素相关酶的催化结构域，或阻止其与底物或其他调节蛋白结合。目前，已经开发了200多种化合物，其中许多化合物正在进行癌症治疗的临床前和临床试验。 大多数基于泛素的小分子化合物被设计成靶向癌细胞中必需的泛素途径。随着以T细胞为基础的肿瘤免疫治疗的出现，针对选择性E3和DUB的靶向抑制已有研究，其中关键的细胞内检查点T细胞抑制剂Cbl-b具有巨大的潜力。已有研究利用RNA干扰成功地下调了T细胞中的Cbl-b水平，这在不同的过继性T细胞转移肿瘤模型中产生了出色的体外和临床前结果，并且癌症患者对其耐受性良好，目前已进入临床试验（NCT02166255和NCT03087591）。此外，针对IAPs、MDM2和USP7的小分子已经进行了临床前试验，并证明单独使用或联合使用时，至少部分增强体内抗肿瘤免疫。 调节癌细胞中PD-L1降解的泛素化依赖途径也正在进行测试。例如，一种竞争性棕榈酰化抑制剂（CPP-S1），以防止PD-L1棕榈酰化，进而促进PD-L1泛素介导的降解。控制PD-L1泛素化和降解的EGFR信号通路也通过不同的方式在体内被有效阻断，包括EGFR小分子抑制剂、铜螯合剂和靶向CSN5的小分子，都显著增强T细胞抗肿瘤反应。 基于邻近性的治疗方法，包括PROTAC或分子胶技术，也正在迅速发展，以针对几种特定肿瘤蛋白质的蛋白酶体降解，目前有十几项临床试验正在验证这些基于泛素化技术的治疗潜力。 小结 数据表明，调节几种泛素依赖性途径，特别是所涉及的泛素依赖性酶，可以释放强烈、持久和靶向的抗肿瘤反应。目前，泛素领域也取得了巨大进展，开发出了多种新技术和新方法，可以专门针对几乎所有泛素依赖的酶，或者利用它们针对感兴趣的底物蛋白，包括肿瘤蛋白。展望未来，相信这些重要的泛素依赖途径的调节很快将成为改善靶向肿瘤免疫治疗的可行替代方案。 参考文献： 1.Ubiquitination in T-Cell Activation andCheckpoint Inhibition: New Avenues for Targeted Cancer Immunotherapy. Int J MolSci. 2021 Oct; 22(19): 10800. 公众号内回复“疫苗篇”或扫描下方图片中的二维码免费下载《小药说药疫苗篇》的PDF格式电子书！ 公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。

在癌症研究的浩瀚领域中，乳腺癌一直是备受关注的焦点。据统计，2022年乳腺癌在女性中的发病率和死亡率均位居前列，无论是在发达国家还是发展中国家，其发病率都远超其他许多癌症，这无疑凸显了寻找有效防治手段的紧迫性。 传统的癌症治疗方法各有优劣，靶向治疗作为一种新兴的治疗方式，虽然具有特异性高和毒性低的优点，但也存在一些问题，比如可能会阻断靶器官外的正常信号通路以及产生脱靶效应，进而导致不良反应，影响患者的治疗时长和生存预后。因此，开发新的靶向治疗药物，避免对正常信号通路的干扰，解决脱靶问题，成为了乳腺癌治疗研究的重要方向。 在此背景下，天然化合物因其来源广泛且可能具有独特的作用机制而受到关注。青蒿烯（Artemisitene，ATT）就是这样一种具有多种生物活性的天然化合物，它是青蒿素的一种衍生物。此前的研究已经发现ATT对乳腺癌具有一定的治疗作用，然而，其直接作用靶点以及在乳腺癌细胞中诱导凋亡的上游机制尚不明确，同时其临床疗效也未得到充分验证，这些问题成为了影响ATT进一步开发和临床应用的关键瓶颈。 近日，北京大学深圳医院研究团队在Phytomedicine发表了题为Artemisitene induces apoptosis of breast cancer cells by targeting FDFT1 and inhibits the growth of breast cancer patient-derived organoids的研究论文。结果表明青蒿烯（ATT）与乳腺癌细胞中的FDFT1相互作用，通过调节TNFR1/NF-κB/NEDD4途径诱导细胞凋亡，并抑制乳腺癌患者来源类器官（PDOs）生长。该研究确定了ATT的抗乳腺癌靶点和机制，评估了其临床疗效，为乳腺癌治疗提供了新的潜在药物候选。 研究方法与结果 研究人员使用相似集成方法（SEA, Similarity Ensemble Approach）预测ATT的潜在靶点，结果显示包括FDFT1在内的8种人类基因可能是ATT的靶点。分子对接结果显示，ATT与FDFT1的CDOCKER相互作用能为-39.9019 kcal/mol，在最佳对接构象中，ATT与FDFT1蛋白的特定残基形成氢键和Pi相互作用，表明ATT与FDFT1具有良好的结合能力。 分子动力学模拟显示，在100 ns的模拟过程中，ATT在结合系统中保持相对稳定的构象，其RMSD波动范围在0.3-0.5 nm之间，证明ATT与FDFT1的结合稳定。蛋白残基的RMSF值大多在0.02左右，进一步证实了结合的稳定性。此外，计算得到的蛋白结构Rg值和复合物总能量也表明复合物结构稳定，能量始终保持稳定。 SPR（Surface Plasmon Resonance, 表面等离子体共振）和CETSA（Cellular Thermal Shift Assay, 细胞热位移分析）实验进一步证实了ATT与FDFT1在乳腺癌细胞中的相互作用。SPR结果显示Kd值为165 μM，CETSA结果表明ATT可使FDFT1发生显著的热稳定。 图 1. ATT与乳腺癌细胞中的FDFT1相互作用 ATT靶向FDFT1通过调节TNFR1/NF-κB/NEDD4途径诱导乳腺癌细胞凋亡 先前研究发现ATT可通过调节c-Myc/topoisomerase途径上调NEDD4表达诱导乳腺癌细胞凋亡，而本研究发现敲低FDFT1可诱导NEDD4表达和细胞凋亡。通过对乳腺癌样本表达谱数据的分析及相关实验，发现FDFT1参与TNF和NF-κB信号通路的调节，干扰FDFT1表达会下调细胞膜上的TNFR1和细胞核中的RelA水平。 进一步研究表明TNF/NF-κB信号通路可调节NEDD4表达，且p65可调节NEDD4转录。沉默TNFR1可使细胞核中p-p65水平下调同时诱导NEDD4表达，ATT刺激也有相同效果，而过表达FDFT1可逆转这种情况，这些结果支持ATT通过调节TNFR1/NF-κB/NEDD4途径诱导乳腺癌细胞凋亡。 图 2. 敲除FDFT1诱导乳腺癌细胞中NEDD4的表达和细胞凋亡 图 3. ATT靶向FDFT1通过调节TNFR1/NF-κB/NEDD4通路诱导乳腺癌细胞凋亡 乳腺癌PDOs的建立和组织学特征 从12名乳腺癌患者的手术标本中成功建立了乳腺癌PDOs，对其进行组织病理学染色和免疫荧光分析。结果显示不同患者来源的PDOs具有不同的形态、大小和组织学特征，但在组织学特征、激素受体状态和HER2表达模式上与原肿瘤一致，可准确模拟原始肿瘤组织，是一种高度准确的模型。 ATT展示出更广泛的抗乳腺癌疗效和良好的安全性 用不同浓度的ATT处理不同亚型的乳腺癌PDOs，结果显示随着治疗浓度的增加，PDOs的生长受到显著抑制。在最高治疗浓度（20μM）下，出现结构解体和边界不清等表型变化，视为ATT诱导细胞死亡的迹象。与常用的化疗药物（如紫杉醇、阿霉素盐酸盐和多西他赛）相比，ATT和化疗药物对PDOs都有良好的治疗效果，但ATT对不同个体来源的PDOs生长抑制具有广谱性，而化疗药物在不同个体上的疗效存在差异。 通过对来自组织学正常的预防性乳房切除术样本的正常乳腺类器官进行药物安全性测试，结果显示与化疗药物相比，在1 μM和5 μM浓度下，ATT对正常乳腺类器官造成的损伤更小，表明ATT具有良好的安全性。 ATT抑制乳腺癌PDOs的增殖 采用Calcein-AM/PI荧光双染色检测ATT对不同亚型（如管腔型、HER2+型和三阴性型）患者来源的PDOs的细胞毒性作用。结果显示，经5 μM的ATT处理5天，与对照组相比，不同亚型的PDOs出现不同的特征，如不同程度的细胞死亡。 细胞增殖实验结果表明，对照组PDOs中EdU-阳性细胞较多，表明其处于活跃增殖状态。而经ATT处理的PDOs中，EdU标记的细胞数量显著减少，表明ATT可有效抑制PDOs的细胞活力和增殖。化疗药物也表现出类似的抑制作用，但ATT的效果与化疗药物相当或更强。 图 4. ATT对PDO细胞活力和增殖的影响 综上所述，本研究结果表明ATT与乳腺癌细胞中的FDFT1相互作用，且通过调节TNFR1/NF-κB/NEDD4途径诱导细胞凋亡。成功建立乳腺癌患者来源类器官（PDOs），并证实ATT对不同病理亚型的PDOs生长有广谱抑制作用，且安全性优于常规化疗药物。这些研究结果意义重大，不仅明确了ATT的抗乳腺癌作用靶点和机制，为进一步理解乳腺癌的发病机制和治疗策略提供了理论依据，还通过PDOs评估了ATT的临床疗效，展示其作为乳腺癌治疗药物的潜力，为乳腺癌治疗带来新的希望和方向，有望为乳腺癌患者提供更有效、更安全的治疗选择。 参考文献： Chen D, Li G, Luo L, et al. Artemisitene induces apoptosis of breast cancer cells by targeting FDFT1 and inhibits the growth of breast cancer patient-derived organoids. Phytomedicine. Published online October 18, 2024. doi:10.1016/j.phymed.2024.156155 本文仅用于学术分享，转载请注明出处。若有侵权，请联系微信：bioonSir 删除或修改！ 点击下方「阅读原文」，前往生物谷官网查询更多生物相关资讯~

来源：药渡 撰文：balabala     编辑：维他命 9月20日，英国邓迪大学Alessio Ciulli教授团队在《Science》杂志上发表了重磅成果，其研究开发了一种可以对17种常见KRAS突变体中的13种实现有效降解的泛KRAS降解剂——ACBI13，泛KRAS降解剂的出现标志着对KRAS蛋白降解药物的研究进入新阶段。 在抗癌的漫长征途中，Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（KRAS）蛋白一直是一个难以逾越的高峰。它在多种癌症中频繁出现突变，且长期以来缺乏有效的治疗手段。 KRAS蛋白是一种在细胞内传递生长信号的蛋白质，一旦发生突变，就如同打开了细胞无序生长的开关，导致肿瘤的形成。尽管科学家们已经尝试了多种方法来抑制KRAS的活性，但成效有限。原因在于KRAS蛋白的结构特点使得传统的药物难以与之有效结合。 靶蛋白降解技术的出现正在改变肿瘤药物开发，目前已有超过25种降解剂药物进入临床试验。近年来，科学家们将靶蛋白降解技术应用于KRAS蛋白，致力于开发出有效降解KRAS蛋白的降解剂，为癌症治疗带来新的希望。 1 KRASG12C靶向降解策略的探索 2020年1月，哈佛医学院的Nathanael S. Gray教授团队在《Cell Chemical Biology》上发表了一项研究，他们针对KRASG12C这一常见于胰腺癌等恶性肿瘤的突变类型，开发了一种新型的PROTACs降解剂。 尽管KRAS蛋白因缺乏有效的药物结合位点而难以成药，Gray团队通过共价修饰KRASG12C的Cys12残基，成功设计了一系列降解剂，这些降解剂基于喹唑啉骨架，通过连接子与CRBN招募基团IMiDs相连，形成了能够诱导KRASG12C和CRBN三元复合物的分子。 在实验中，团队采用了GFP-KRASG12C报告基因系统来筛选有效的降解剂，最终发现化合物XY-4-88具有显著的降解效果。尽管XY-4-88在体外实验中表现出色，但在降解内源性KRASG12C时却遇到了难题。研究表明，XY-4-88虽然能够与CRBN和KRASG12C结合，诱导二者形成二聚体，但并未实现对内源性KRASG12C的降解。这一结果暗示了在蛋白降解过程中，可能存在亚细胞定位的障碍，CRBN主要定位于细胞质和核中，而KRASG12C则主要定位于细胞膜上。 尽管如此，这项研究也为KRASG12C的靶向降解提供了有价值的策略，并为未来的研究指明了方向。Gray团队的发现表明，通过调整降解剂的结构，特别是warhead部分，有可能克服现有的障碍，实现对KRASG12C的有效降解（图1）。 图1. XY-4-88对GFP-KRASG12C的外源性降解依赖于CRBN 2 VHL机制下的 KRASG12C靶向降解剂的研究 2020年7月，耶鲁大学的Craig M. Crews教授团队在《ACS Central Science》杂志上发表了一篇题为“Targeted Degradation of Oncogenic KRASG12C by VHL-Recruiting PROTACs”的文章。 在这项研究中，他们开发了一种名为LC-2的PROTAC化合物，专门针对KRASG12C这一在多种癌症中常见的突变形式。LC-2通过招募VHL E3泛素连接酶，诱导KRASG12C的泛素化和随后的蛋白酶体降解，从而有效抑制了MAPK信号通路的激活。 LC-2的设计基于一种已在临床试验中显示出潜力的KRASG12C共价抑制剂MRTX849，Crews团队通过在MRTX849的分子结构上添加linker，连接至VHL配体，成功构建了LC-2。 在细胞实验中，LC-2展现了快速的KRASG12C结合能力，并在数小时内诱导了显著的蛋白降解（图2）。这种降解效果在多种KRASG12C突变的癌细胞系中得到了验证，并且降解效果可持续72小时以上。尽管LC-2在体外实验中表现出了优异的降解效果，但其共价结合的特性可能限制了其在体内环境中的效价，因为它不能参与催化降解的循环。 图2. VHL机制下的LC-2对KRASG12C-GDP的降解 此外，LC-2对细胞活力的影响可能有限，这表明需要开发更有效的PROTACs来增强KRAS降解的疗效。总之，LC-2的开发代表了KRAS降解剂的又一进展，为开发可逆的PROTACs奠定了基础。 3 降解KRAS突变体的 分子胶降解剂的发现 2024年4月，厦门大学生命科学学院的王洪睿教授和医学院的邓贤明教授团队在预印本网站bioRxiv上发表了一篇名为“Targeting oncogenic K-Ras mutants with a small-molecule degrader through Nedd4-1”的文章，报道了一种新的分子胶降解剂XMU-MP-9，能够特异性地促进泛素连接酶Nedd4-1对KRAS各种致癌突变体的泛素化和降解，有效抑制了携带KRAS突变的癌细胞的增殖和肿瘤发展。 在这项工作中，研究人员利用了一个包含4480种小分子的内部化合物库进行高通量筛选，最终鉴定出先导化合物XMU-MP-9。这种分子胶可以促进Nedd4-1泛素化和降解KRAS突变体，并且其降解过程主要通过溶酶体途径进行。通过体外实验，研究人员证明了XMU-MP-9能够通过Nedd4-1和溶酶体依赖的方式，降解不同的KRAS蛋白（图3）。 此外，在癌症细胞系中，XMU-MP-9的处理降低了内源性KRAS突变蛋白水平，并减弱了B-Raf和MEK的磷酸化水平，从而抑制了癌细胞的生长。在体内，XMU-MP-9同样展现出了对肿瘤生长的抑制效果，减少了肿瘤组织中KRASG12V的蛋白水平，并降低了B-Raf和MEK的磷酸化。 这项研究基于Nedd4-1和KRASG12V的蛋白相互作用，通过建库筛选的方法开发出了诱导其相互作用的分子胶，不仅揭示了分子胶技术独特的作用机制，还展现了其在癌症治疗中的潜在应用价值。 图3. XMU-MP-9诱导Nedd4 -1依赖性KRASG12V降解 4 降解KRAS突变体的 LYMTAC的开发 2024年9月，安进（Amgen）公司的研究人员在预印本网站bioRxiv上发表了一篇名为“LYMTACs: Chimeric Small Molecules Repurpose Lysosomal Membrane Proteins for Target Protein Relocalization and Degradation”的文章，研究人员设计并合成了一种能够与KRASG12D突变体结合的LYMTAC分子。 研究数据表明，lyMtacs可以与KRASG12D和RNF152形成有效的三元配合物，促进KRASG12D泛素化，并诱导KRASG12D的溶酶体依赖性清除（图4）。这项研究为通过LYMTAC技术降解KRAS提供了概念验证，为KRAS蛋白降解提供了新的技术手段。 图4. LYMTAC分子成功降解KRASG12D突变体 5 泛KRAS降解剂问世 9月19日，英国邓迪大学Alessio Ciulli教授团队在《Science》杂志上发表了题为“Targeting cancer with small molecule pan-KRAS degraders”的文章，介绍了一种针对13种常见KRAS突变的单一小分子降解剂ACBI3的临床前验证。该研究利用结构导向设计方法，通过分析KRAS与高亲和力配体的晶体结构，成功设计并识别了能够体内降解致癌KRAS的ACBI3，实现了持久的信号通路调节和肿瘤缩小。 研究人员首先设计了化合物2，通过诱导VCB:PROTAC:KRASG12D三元复合物的形成，显示出高亲和力，并在细胞实验中有效降解KRASG12D和KRASG12V。进一步优化得到了化合物3和化合物4，显著提高了降解效能。化合物4在癌细胞系中选择性地抑制了KRAS依赖性细胞系的致癌信号和增殖，降解效能超过传统抑制方法。 尽管化合物4的药代动力学分析显示暴露不足，但通过化学优化得到的ACBI3在小鼠肿瘤模型中显示出显著的抗肿瘤效果（图5），该研究开发了一种可以对17种常见KRAS突变体中的13种实现有效降解的泛KRAS降解剂——ACBI13，泛KRAS降解剂的出现标志着对KRAS蛋白降解药物的研究进入新阶段。 图5. ACBI3降解KRASG12D和KRASG12V的体内疗效 结 语 靶蛋白降解技术通过诱导细胞内的蛋白降解机制，有望克服传统抑制剂的耐药性问题。但要将这种小分子降解剂转化为实际的药物，还需要克服许多挑战，包括提高稳定性、优化递送方式以及进行大规模的临床试验。 KRAS蛋白的降解为癌症治疗带来了新的曙光，随着研究的深入和技术的进步，我们有理由相信，未来将有更多患者能够从这种创新疗法中获益。 参考文献： [1]Zeng M, Xiong Y, Safaee N, Nowak RP, Donovan KA, Yuan CJ, Nabet B, Gero TW, Feru F, Li L, Gondi S, Ombelets LJ, Quan C, Jänne PA, Kostic M, Scott DA, Westover KD, Fischer ES, Gray NS. Exploring Targeted Degradation Strategy for Oncogenic KRASG12C. Cell Chem Biol. 2020 Jan 16;27(1):19-31.e6. doi: 10.1016/j.chembiol.2019.12.006. [2]Bond MJ, Chu L, Nalawansha DA, Li K, Crews CM. Targeted Degradation of Oncogenic KRASG12C by VHL-Recruiting PROTACs. ACS Cent Sci. 2020 Aug 26;6(8):1367-1375. doi: 10.1021/acscentsci.0c00411. [3]Taoling Zeng et al., (2024). Targeting oncogenic K-Ras mutants with a small-molecule degrader through Nedd4-1.bioRxiv, https://doi.org/10.1101/2024.04.26.591418 [4]Nalawansha et al., (2024). LYMTACs: Chimeric Small Molecules Repurpose Lysosomal Membrane Proteins for Target Protein Relocalization and Degradation. bioRxiv, https://doi.org/10.1101/2024.09.08.611923 [5]Johannes Popow et al. ,Targeting cancer with small-molecule pan-KRAS degraders.Science385,1338-1347(2024).DOI:10.1126/science.adm8684 *声明：本文仅是介绍医药疾病领域研究进展或简述研究概况或分享医药相关讯息，并非也不会进行治疗或诊断方案推荐，也不对相关投资构成任何建议。内容如有疏漏，欢迎沟通指出！ K药抗癌版图再下一城，一线联合治疗恶性胸膜间皮瘤获FDA批准 这三款重磅药物，Q4有望获FDA批准！ 「度伐利尤单抗」两连胜，阿斯利康重磅免疫疗法再添新筹码