BTK x LCK

摘要：过继免疫治疗使用嵌合抗原受体（CAR）重定向的T细胞是一种新的治疗范式，它使用一类新的治疗“药物”在某些迄今为止难以治疗的B细胞恶性肿瘤患者中产生完全且持久的缓解。CAR T细胞源自患者自身的免疫细胞，这些细胞在体外通过基因工程改造，带有能够结合特定目标并在目标结合时传递激活信号的CAR。CAR激活细胞毒性T细胞以有效、重复和持久的方式破坏和消除识别的癌细胞。然而，各种障碍限制了CAR T细胞在其他类型的癌症或其他疾病中的广泛应用。目前的挑战包括设计最优的CAR、积极穿透肿瘤病变，并在不诱导对健康组织产生毒性的情况下维持T细胞的抗肿瘤激活。本章回顾了CAR的代际、增强CAR T细胞效力和选择性的策略，以及为日益增多的患者建立高效的制造流程。 1.原型嵌合抗原受体（CAR，T-Body，免疫受体） 在20世纪80年代中期，Steven A. Rosenberg（美国国立卫生研究院）将从黑色素瘤活检中分离并大量体外扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）重新注入黑色素瘤患者体内时，患者T细胞识别和有效摧毁癌细胞的能力变得显而易见。这些以及随后的发展促使了采用自体免疫细胞治疗肿瘤患者的概念，这些免疫细胞有能力在大量患者中诱导肿瘤退缩和长期缓解。这些扩增的TILs被认为对特定肿瘤抗原具有特异性，并具有迁移能力以进入肿瘤病变；然而，抗原特异性大多仍然未知。 接下来的几年中，为了给患者的T细胞提供明确的靶向特异性，人们付出了巨大的努力；与T细胞受体（TCR）链或重组嵌合抗原受体（CAR）的遗传工程化，证明是成功的策略之一。与TCR不同，CAR是一个复合的、单多肽链跨膜受体，它在目标识别时提供靶向特异性和T细胞激活能力。原型CAR由四个主要结构域模块化组成：在细胞外末端是用于目标识别的单链可变区（scFv）抗体，一个连接到跨膜结构域的间隔区，以及主要来自TCR/CD3ζ或Fcε受体I（FcεRI）的细胞内信号传导结构域，有或没有连接的共刺激结构域（图1）。目标细胞表面的同源抗原的参与启动了CAR工程化免疫细胞的激活，导致持久的T细胞反应。每个CAR结构域都有独特的功能，并对重定向的T细胞激活产生影响；对于每个特定应用，CAR设计需要进行一些调整，以提供优化的靶向和T细胞激活，如下文详细描述。 图1 嵌合抗原受体（CARs）的世界在不断增长。第一代CAR在细胞外域（外域）中拥有抗原结合和间隔基团，在跨膜域中，在细胞内域（内域）中拥有来自CD3ζ或FcεRI γ链的激活基团。第二代CAR除了拥有一个共刺激域之外，第三代CAR在内域中拥有两个共刺激域。第四代CAR（“TRUCK”，“T细胞重定向用于通用细胞因子介导的杀伤”）由第二代或第三代CAR组成，该CAR在CAR信号传导后诱导转基因蛋白的表达。虽然在规范设计中描绘，但已经工程化了大量CAR变体，每种变体都针对不同的应用进行了优化。 原型CAR的基本设计最初由Zelig Eshhar及其同事（魏茨曼科学研究所）提出，他们展示了一个模块化复合受体，最初命名为“T-Body”或“免疫受体”，具有用于结合的抗体衍生结合域和用于T细胞激活的TCR信号域，为工程化T细胞提供了特异性识别和激活。在随后的几年中，引入了许多修改，允许靶向广泛的抗原，并通过各种细胞内结构域发送信号，以启动和重定向定义的免疫细胞功能（表1）。 表 1 CAR构建模块及其替代模块。 EMA（欧洲药品管理局）批准。其他使用其他宿主细胞和不同CAR设计的应用程序也在早期临床试验中越来越多地被研究。 规范的CAR由抗体衍生的结合域、间隔区、跨膜域和细胞内主要及共刺激信号域模块化组成。每个结构域可以通过不同的模块构建，这些模块影响不同的变量，并最终影响T细胞的激活和性能。 CAR工程化的细胞毒性T细胞重定向至癌细胞是该技术研究最多的应用；自体抗CD19 CAR T细胞的过继转移成为美国食品药品监督管理局（FDA）批准的首个基因工程细胞疗法；随后，欧洲药品管理局（EMA）也批准了。使用其他宿主细胞和不同CAR设计的其他应用也越来越多地在早期临床试验中研究。 2.CAR的模块化组成：细胞外CAR结构域 2.1.结合域 抗原结合域传统上由来自小鼠或人类单克隆抗体的单链可变区（scFv）组成。通过短柔性连接子（通常是(Gly4Ser)3肽）将重链（H）和轻链（L）抗体链的可变（V）区域连接起来，形成VH-linker-VL或VL-linker-VH的顺序。甘氨酸残基提供了灵活性，以允许VH和VL正确折叠形成抗原结合口袋，而丝氨酸则为连接子提供了一些溶解性。VH和VL链的空间位置和相互作用可以显著影响亲和力、特异性和溶解性。足够高的结合亲和力对于诱导T细胞激活至关重要；然而，存在一个亲和力上限，超过该上限CAR介导的T细胞激活不会改善，但会导致激活诱导的细胞死亡（AICD）。在CAR的背景下，一些scFvs通过张力信号独立于抗原参与诱导AICD、耗竭和T细胞的终端分化。除了亲和力和细胞表面的抗原密度外，目标表位在抗原内的位置也很重要；通常，靶向膜近端表位比靶向膜远端表位诱导更强的T细胞激活。 通过使用抗体进行靶向，CAR介导的识别是MHC独立的。这在靶向MHC-肽处理和呈递机制有缺陷的肿瘤时是有益的。此外，通过抗体识别目标，还可以识别传统T细胞看不见的抗原，如碳水化合物、脂质或抗原的结构变体。规范的CAR识别目标细胞表面的抗原；也可以通过使用特异性针对定义的MHC-肽复合物的抗体，工程化MHC-肽识别CAR，使其能够感知由MHC呈递的细胞内抗原。例如，一个scFv识别HLA-A2背景下的NY-ESO-1肽的CAR提供了与相应TCR类似的TCR样识别目标。 2.CAR的模块化组成：细胞外CAR结构域 2.2.间隔区 原型CAR经常在抗原结合域和跨膜域之间包含一个“间隔区”，以便接近目标抗原；连接的铰链区提供了一定的灵活性。间隔区的类型和长度对于最佳目标结合和信号传递至关重要。间隔区并非必需，因为有些CAR在scFv直接融合到跨膜域时是活跃的，而其他CAR只有在具有一定长度的间隔区时才活跃。间隔区通常来源于IgG1或IgG4恒定域或来自细胞外CD28、CD4或CD8（图2）。一般的想法是，间隔区在工程化T细胞和相应目标细胞之间提供最佳距离，以允许与目标细胞形成有效的接触区。基于TCR-MHC相互作用的知识，人们普遍认为CAR-目标相互作用需要在T细胞和目标细胞之间创建约15纳米的距离，以最佳形成接触区。因此，针对膜近端表位需要较长的间隔区，而较小的间隔区对更远离膜的表位是最佳选择；通过使用不同长度的间隔区可以轻松调整距离。在这个背景下，IgG衍生的间隔区具有可以通过结合一个、两个或三个CH1-CH2-CH3部分来调整长度的优势。IgG1衍生的间隔区还有利于CAR分子的稳定；然而，它可能与髓系细胞上的Fcγ受体（FcγR）（CD64）结合，介导CAR T细胞和髓系细胞的“非肿瘤”激活。这可以通过删除间隔区内的IgG1 CH2域或通过删除IgG1 Fc受体结合部分内的Asn297糖基化位点来预防。类似的修改也可以引入到IgG4间隔区。 图 2 第二代CAR设计的变体。由于模块化组成，可以使用各种替代域来构建CAR，其中一些示例性地列出。各个组分的变化允许调节CAR的结合和信号传导，最终调节细胞功能、代谢和工程化T细胞的抗肿瘤活性。其他变体旨在提高结合亲和力、目标的可及性、信号强度和细胞膜上的持久性等。最后，安全预防措施导致CAR设计中进一步的修改。 2.3.跨膜区 典型CAR的跨膜区来源于如CD3ζ、CD4、CD8α、CD28或OX40等类型1跨膜蛋白，由20-23个疏水性氨基酸组成，富含亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸（图2）。带有CD3ζ跨膜域的CAR似乎比其他CAR更有效地整合到TCR/CD3复合体中，因此在表达和信号传导方面更为稳健；带有CD28跨膜区域的CAR似乎同样稳定。另一方面，带有CD8α铰链和跨膜域的CAR不易于AICD；然而，它们通过减少促炎细胞因子的释放来介导较少的T细胞激活。 2.4.细胞内信号传导域 “第一代”CAR完全通过主要信号传导域（信号-1）进行信号传导。TCR/CD3ζ细胞内链含有三个免疫受体酪氨酸激活基序（ITAMs），FcεRI γ链含有一个ITAM，这些在磷酸化后作为下游信号蛋白的特定适配器。因此，CAR利用内源性TCR信号机制来启动T细胞激活事件的级联。下游激酶如Lck或Fyn也可以作为CAR介导的T细胞激活的主要信号，等等（图2）。CAR信号传导域本身足以与下游激酶结合并启动有效的激活级联，因为CAR在TCR敲除细胞和非T细胞如NK细胞中也是功能性的。然而，仅有主要信号的CAR不足以激活以允许长期持久；这样的CAR T细胞迅速进入凋亡。根据“双信号假说”，静息T细胞还需要一个共刺激信号以持续激活。这就是将主要信号与共刺激信号（信号-2），如CD28或4-1BB（CD137），结合在“第二代”CAR中的理由。也在临床前和临床上探索带有替代共刺激域的CAR，如OX40、ICOS、CD27、CD40-MyD88、CD2和CD244。为了方便下游激酶的接近，CD28通常位于膜近端位置，随后是远端位置的CD3ζ；OX40和4-1BB在膜远端和近端位置都活跃。与第一代CAR相比，第二代CAR T细胞在细胞因子释放、扩增和抗肿瘤活性方面显示出稳健和持久的反应。 CAR介导的共刺激以不同的方式影响T细胞效应功能、存活、持久性和代谢。例如，4-1BB CAR T细胞在患者血液中的持久性超过6个月，而CD28 CAR T细胞在3个月之后大多无法检测到。经过重复刺激后，CD28 CAR T细胞重新编程为CD45RO+ CCR7−效应记忆细胞，这些细胞随后需要OX40来延长持久性并避免快速耗竭；4-1BB CAR T细胞主要转化为CD45RO+ CCR7+中央记忆细胞，并在外围血液中长期持久。CD28 CAR信号激活PI3K/Akt/mTOR途径，刺激有氧糖酵解，增加葡萄糖摄取和ATP生成，而4-1BB CAR信号激活Wnt/β-catenin途径和脂肪酸氧化，增加代谢和线粒体呼吸链能力。典型的Wnt/β-catenin有利于中央记忆细胞的形成和T细胞的长期存活，而CD28诱导的PI3K/Akt信号维持效应细胞的即时响应。在高剂量下，CD28和4-1BB CAR T细胞都能在临床前模型中根除大型已建立的肿瘤；在低剂量下，CD28 CAR T细胞比4-1BB CAR T细胞表现出更大的耗竭程度，结果是4-1BB CAR T细胞在长期内更有效地根除大型肿瘤负荷。另一方面，带有4-1BB CAR的T细胞仍然对肿瘤介导的通过TGF-β的抑制敏感，这对CD28 CAR T细胞来说较少见。因此，选择CAR设计的标准取决于多个参数，包括T细胞持久性、抗抑制能力、共刺激和共抑制配体的模式、肿瘤细胞上的抗原密度、T细胞上的CAR密度等。 “第三代”CAR结合两个共刺激域以及主要激活信号。联合共刺激的好处只在少数情况下得到证明，例如，通过CAR提供CD28-OX40共刺激对T细胞在终端成熟中的进展有益。 3.TRUCK：“第四代”CAR T细胞 CAR T细胞可以用来按需将转基因蛋白输送到预定的、靶向的组织。因此，CAR T细胞被设计成带有CAR诱导表达盒的额外“有效载荷”。所谓的“第四代”CAR T细胞，即TRUCKs（“T细胞重定向用于通用细胞因子介导的杀伤”），旨在在靶向组织中沉积分泌型转基因蛋白，以实现治疗有效浓度（图3）。“有效载荷”的表达受NFAT6-IL-2最小启动子的控制，该启动子在CAR信号传导时被激活；有效载荷可以是转基因编码的任何蛋白或肽。这种策略特别有趣，因为它结合了重定向CAR T细胞攻击和局部沉积的生物活性蛋白的作用，同时避免了系统毒性。只要CAR T细胞保持激活状态，TRUCKs就会沉积转基因产物，例如，IL-12或IL-18作为转基因免疫调节剂，以特定方式塑造靶向肿瘤环境，而不引起系统毒性。累积的TRUCK产生的IL-12在CAR靶向的肿瘤组织中招募天然免疫细胞，如NK细胞和巨噬细胞，在那里反过来启动二次抗肿瘤免疫反应。IL-12 TRUCKs抵抗Treg细胞的抑制，并显示出增加的细胞因子释放和扩增。当快速进展的肿瘤积累抗原丢失的癌细胞，导致对CAR T细胞不可见的肿瘤复发时，这种策略特别有趣。释放IL-18的TRUCKs将CAR T细胞转化为T-bet高FoxO1低效应细胞，抵抗耗竭并显示出对大型已建立肿瘤的优越细胞毒性。IL-18 CAR T细胞治疗改变了整个肿瘤免疫细胞景观，特别是通过增加CD206− M1型巨噬细胞和NKG2D+ NK细胞的数量，减少抑制细胞如Tregs、抑制性CD103+ DCs和M2型巨噬细胞。其他例子包括释放过氧化氢酶以保护T细胞免受过氧化压力介导的抑制和释放肝素酶以改善T细胞通过肿瘤基质的穿透。 图 3 第四代CAR T细胞（“TRUCKs”）。在抗原结合时，第二代或第三代CAR诱导表达一种转基因蛋白，该蛋白在细胞内作用、整合到膜中或由CAR T细胞释放。释放的转基因蛋白旨在改变肿瘤环境、重塑肿瘤组织或吸引二次免疫反应。CAR T细胞被诱导仅在CAR与其靶标结合时释放蛋白质，从而将“有效载荷”在预定义的交付点作为“TRUCK”进行交付。这种CAR T细胞被理解为“活体工厂”，用于精确和持续地交付治疗性细胞产品。 所谓的“装甲CAR”通过产生4-1BB配体提供增加的共刺激通过刺激4-1BB途径。工程化的T细胞被设计为分泌Toll样受体（TLR）配体，可以刺激T细胞和抗原呈递细胞上的TLR途径，然后可以激活一组T细胞进行广泛的抗肿瘤攻击。靶向Muc16ecto（即黏蛋白-16（CA-125）的膜保留残余物）并分泌IL-12的CAR T细胞正在临床试验中评估（NCT02498912）。IL-15 TRUCK细胞显示出改善的扩增和抗肿瘤活性，但在未受控制的扩增情况下需要自杀基因，由于其白血病潜力。“装甲”CAR通过与CAR共表达IL-7受体-α链来恢复对IL-7的反应性，并促进Th1反应。类似地，在IL-4水平增加的前列腺癌中，共表达IL-4结合/IL-7信号传导受体提高了抗PSCA CAR T细胞的抗肿瘤活性。另一方面，CAR T细胞上共表达的显性负性TGF-β DNRII受体可以在TGF-β存在的情况下与TGF-β竞争，以改善T细胞的抗肿瘤活性。也可以设想提供细胞因子或细胞因子受体之外的应用，如输送可溶性HVEM外域，以靶向肿瘤血管，以维持肿瘤穿透。 4.具有双重特异性、组合抗原识别和条件性CAR的CAR T细胞 原型CAR通过一个scFv将特异性重定向到一个抗原；多种原因要求具有多重特异性的CAR：(1)肿瘤病变在可靶向抗原方面可能是异质的，或在肿瘤进展过程中丢失抗原；(2)靶向癌细胞和肿瘤基质或血管可能有益或需要增加治疗效果。将两种或更多CAR T细胞产品应用于癌症患者基本上是可行的，尽管需要在GMP条件下制造两种细胞产品。例如，通过顺序输注应用CD19和CD22 CAR T细胞目前正在评估治疗难治性B-ALL的试验中（NCT03620058）。或者，T细胞被设计为表达两个CAR，即所谓的双顺反子CAR，每个CAR针对不同的抗原（图4）。通过灵活的连接子将两个scFv相互连接，设计出具有双重特异性的CAR。这种串联排列的双特异性CAR（“串联CAR”，“Tan-CAR”）或环状结构，针对两种不同的抗原，并能够在结合任一抗原时提供T细胞激活（“或”门控）；具有其中一种相应抗原的目标细胞仍然被识别。除了两个连接的scFv外，双抗体、二合一抗体和双变量域抗体也可以用来设计具有两种特异性的CAR。三特异性CAR包含单价和/或多价CAR结构的组合，以针对三种抗原，进一步扩大靶向特异性。一个例子是设计了一种双特异性CAR，将针对CD20和CD19的scFv连接起来，旨在减轻在接受CD19 CAR T细胞治疗后经常发生的B细胞白血病/淋巴瘤的复发。CD19− CD20+白血病细胞的复发旨在通过CD20-CD19双特异性CAR T细胞得到控制。双特异性CAR中scFv的顺序取决于特定抗原中目标表位的空间可及性。CD20-CD19 CAR对CD19和CD20都具有相同的结合能力，并重定向T细胞激活，而CD19-CD20 CAR则效率要低得多。其他双特异性CAR的例子是针对CD19和CD123治疗B-ALL或CD19共靶向CD22、ROR1和免疫球蛋白κ轻链（Igκ）。多特异性CAR T细胞目前正在早期临床试验中评估。通过双顺反子表达盒设计了同时具有CD19和CD22 CAR的T细胞，正在进行治疗高风险B-ALL或干细胞移植后复发的试验（NCT03289455）。具有CD19和CD22特异性的双价CAR正在评估治疗B-ALL或B细胞淋巴瘤（NCT03241940, NCT03233854, NCT03330691, NCT03448393, NCT03019055）。目前正在进行的II期试验中评估了针对BCMA两个表位的双特异性CAR（NCT03758417）。 图4 基于逻辑门控的CAR介导的T细胞激活，以证明在肿瘤靶向中的选择性。共表达两种CAR，每种CAR在与相应的目标抗原结合时都能完全激活T细胞；双特异性CAR（串联CAR，Tan-CAR）也是如此。在这种情况下，通过表达抗原A或B或两者的细胞激活T细胞（"OR"门控）。为了仅通过同时表达A和B抗原的细胞激活CAR T细胞，识别A的CAR仅通过CD3ζ提供基本激活，这不足以实现完全和持续的激活，而识别B的CAR提供共刺激；通过两种CAR的同时信号传导诱导T细胞完全激活（"AND"门控）。识别抗原A的synNotch CAR驱动转录并表达第二种CAR，该CAR在识别抗原B时驱动T细胞完全激活。具有ITIM（免疫受体酪氨酸基抑制基序）的抑制性CAR在其识别的抗原B结合时阻止通过激活CAR的信号传导。当抗原B不存在时，CAR可以在结合抗原A时激活T细胞（"A-not-B"门控）。 当结合两种抗原时，双特异性CAR比单特异性CAR具有更高的亲和力，理论上稳定了突触并改善了T细胞对低抗原水平目标细胞的反应。这种情况可以用来只将CAR T细胞重定向到表达两种抗原而不是一种的细胞（图4）。这种“与”门控的抗原模式旨在提高对癌细胞的靶向选择性，同时保留健康细胞。两个共表达的抗原被两个共表达的CAR识别，每个CAR识别特定的抗原，并分别提供主要或共刺激信号。这样，只有同时结合两种抗原才提供完全T细胞激活所需的两个信号；结合一种抗原是不足够的。组合抗原识别的例子是，通过CD3ζ CAR靶向ErbB2和通过CD28 CAR靶向Muc1，或通过CD3ζ CAR靶向间皮素和通过CD28 CAR靶向叶酸受体-α。靶向CD13和TIM3的双特异性和分裂CAR T细胞在临床前模型中根除患者衍生的急性髓性白血病细胞，减少了对骨髓和外周髓性细胞的毒性。 通过异二聚体化两个多肽链，可以加强两个CAR上的初级和共刺激信号的组合；一个链由细胞外和跨膜以及初级信号传导部分组成，第二个链提供共刺激信号传导部分，并通过添加“二聚体化剂”与第一个链相连。CAR在二聚体化剂允许异二聚体化和功能性CAR形成之前保持沉默。通过滴定二聚体化剂剂量可以微调T细胞活性；撤除二聚体化剂终止CAR信号。只有当每个CAR信号单独不足以驱动T细胞激活时，才能通过组合抗原识别实现清晰的“开-关”T细胞激活。由于预先激活的T细胞中的CD3ζ信号可能重新诱导T细胞反应，因此需要调整信号或降低结合亲和力以实现平衡的激活阈值。 可调CAR的另一种策略基于合成Notch（synNotch）受体。Notch由一个细胞外受体、一个跨膜域和一个细胞内转录调节器组成，激活后介导内部域的蛋白水解，释放细胞内转录调节器。这些特性用于控制与Notch受体不同特异性的真正CAR的转录。优点在于Notch受体的抗原识别基于逻辑“与”门控，并以空间定义的方式控制CAR T细胞功能。在CD19结合后，CD19特异性synNotch受体释放转录效应域Gal4-VP64或TetR-VP64以诱导抗间皮素CAR的表达。只有当在靶向组织中同时识别synNotch配体和CAR配体时，T细胞才被激活。另一个例子是通过CAR靶向ROR1和通过Notch受体靶向EpCAM或B7-H3。虽然CAR的“开开关”决定了靶向癌细胞的选择性，但这种策略可能受到诱导足够水平的CAR表达和在没有Notch信号进一步发生时衰减CAR所需的时间的限制。 工程化T细胞的TCR特异性也可以用来提供更复杂的识别轮廓。带有γδ TCR的T细胞识别肿瘤细胞特有的磷酸化抗原；转基因表达GD2特异性CAR和共刺激域只会在γδ TCR和CAR同时结合它们相应的抗原时提供完全的T细胞激活；由于缺乏γδ TCR激活，不会攻击GD2+的健康细胞。 虽然许多可靶向的抗原既表达于健康细胞也表达于癌细胞，但有些抗原仅由健康细胞表达，而癌细胞缺乏表达。在这种情况下，结合共同抗原“A”但在结合健康细胞上的抗原“B”时阻断，将阻止CAR T细胞激活对抗健康细胞（图4）。带有ITIM（免疫受体酪氨酸基抑制基序）的抑制性CAR只要结合其相应的抗原“B”，就阻止通过激活性CAR的信号传导。结合缺乏抗原“B”的“A”癌细胞允许CAR T细胞激活，因为缺乏通过抑制性CAR的信号传导（“A非B”门控）。 5.具有植入多重抗原特异性的通用CAR 目前，原型CAR具有一个确定的抗原特异性；改变特异性需要用新的CAR工程化T细胞。在这种情况下，开发了一种“通用”CAR，它识别一种抗体，该抗体转而提供癌症特异性（图5）。例如，抗癌抗体的免疫球蛋白Fc区域被具有CD16作为结合域的CAR结合。CD16 CAR T细胞结合抗癌抗体，从而获得对癌细胞的特异性。或者，CAR结合至与抗癌靶向抗体相关联的蛋白质表位。具有荧光素异硫氰酸酯（FITC）特异性CAR的T细胞识别FITC标记的叶酸，该叶酸与叶酸受体阳性癌细胞结合。也可以设想将其他表位与桥接抗体相关联，如亲和素。同时添加不同特异性的抗体，允许将相同的CAR T细胞产品（“UniCAR”）重定向至多种抗原，无需重新制造CAR T细胞。该策略的优点是同时使用不同的抗体靶向广泛的抗原，同时只应用一种制造的CAR T细胞产品。实际的特异性由应用的抗体混合物在治疗足够浓度下定义。随着应用的抗体的短半衰期，此外，意外的不良事件在抗体撤除后很快就会有限。从机制上讲，有效的肿瘤控制需要CAR T细胞和连接抗体都渗透到肿瘤病变中；目前尚不清楚这是否适用于晚期实体瘤。也尚未解决“通用”CAR T细胞是否能够建立对癌症抗原的持久免疫记忆，这被认为是长期控制癌症所需的。 图 5 “通用”CAR的概念。T细胞表达一种特异性针对标签的CAR，该标签与连接分子相连，最好是天然抗体、单链抗体(scFv)或双特异性T细胞导向抗体(BiTE)，这些分子能够识别肿瘤细胞上的目标抗原。通过添加不同的连接分子，无需工程化新的CAR T细胞，就可以为T细胞配备不同的特异性。这被认为在将CAR T细胞应用于患者后也是可行的；注入针对不同肿瘤抗原的抗体，为CAR T细胞提供不同的特异性。 6.转换抑制信号为激活信号的Switch CAR 在肿瘤病变中，重定向的T细胞攻击通常以各种方式受到抑制；抑制性配体如程序性细胞死亡配体-1（PD-L1）和PD-L2与激活的T细胞表达的程序性细胞死亡-1（PD-1）结合。一种结合这种抑制性配体但向工程化T细胞传递激活信号的CAR，不仅可以与抑制性受体竞争结合，还可以通过提供激活信号克服抑制（图6a）。理想情况下，PD-L1:CD28 “开关”CAR在工程化T细胞中克服PD-1介导的抑制信号。特别是，一个具有PD-1细胞外域结合PD-L1和CD28细胞内信号传导域的CAR，将抑制信号转换为激活信号，导致ERK磷酸化增加，促炎细胞因子释放，T细胞扩增和目标细胞的细胞溶解。由TIGIT（具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体）的外域与CD28共刺激域融合而成的嵌合受体，在结合TIGIT配体CD155时增强T细胞功能。鉴于肿瘤组织提供的大量抑制信号，确定需要克服的“关键”抑制因素以维持有效的T细胞反应仍然是一个挑战。 图 6 开关CAR和抑制性CAR（iCAR）。(a) 开关CAR与生理性T细胞抑制性受体的配体结合，但为工程化T细胞提供激活信号。(b) 抑制性CAR在与抗原结合后，通过ITIM信号向工程化T细胞提供负信号。抑制信号压倒了通过TCR或共表达的激活CAR的激活。 7.抑制性CAR：iCARs 虽然原型CAR向工程化T细胞提供激活信号，但具有抑制信号的CAR旨在在结合健康细胞时抑制CAR T细胞激活。理想情况下，抑制性CAR通过在面对健康组织时覆盖激活CAR信号来减轻非肿瘤毒性。与激活性、肿瘤特异性CAR共表达的具有优势抑制信号的CAR，识别健康细胞；从而CAR T细胞只在结合癌细胞时激活，抑制性CAR不结合健康细胞（图6b）。这种抑制性CAR提供PD-1或CTLA-4信号，并覆盖癌症特异性CAR的激活信号。 8.异体CAR T细胞和CAR NK细胞 到目前为止，CAR T细胞治疗是一种通过体外制造患者自己的T细胞的个性化治疗。这不仅繁琐、成本密集和耗时，而且在患者晚期疾病无法提供足够或足够活跃的T细胞进行CAR工程化时通常也不适用。在这种情况下，异体“现成的”CAR T细胞将为广泛的患者群体带来好处。为了避免移植物抗宿主病（GvHD），需要删除内源性的αβ TCR和HLA分子，这可以通过锌指核酸酶或CRISPR/Cas技术实现。随后清除剩余的TCRαβ T细胞，通过污染的异体TCR+细胞降低GvHD风险。T细胞通过转录激活样效应核酸酶（TALENs）技术在TCRα和CD52位点进行基因编辑，用于治疗无法生产自体CAR T细胞的患者的儿童CD19+ ALL。CD52存在于患者的恶性B细胞上，需要从CAR T细胞中删除，以允许消除恶性淋巴细胞，同时保留注入的CD52阴性CAR T细胞。对于工程化异体CAR T细胞，CRISPR导向RNA和Cas9目前由病毒载体编码以实现组成性表达；当前的研究旨在短暂提供基因编辑工具，而不持久的载体，以最小化非目标编辑。 针对BCMA治疗多发性骨髓瘤的异体CAR T细胞，通过BCMA CAR和基因编辑技术进行了改造，以限制TCR介导的免疫反应。通过将CD20模拟表位整合到CAR的细胞外域，使CAR T细胞能够通过利妥昔单抗消除，从而提供了异体BCMA CAR T细胞的安全性。 关于使用异体效应细胞，NK细胞也可以用于诱导有效的抗肿瘤反应，因为它们具有细胞毒性潜力和分泌促炎细胞因子。除了使用异体细胞，使用NK细胞进行癌症的过继细胞治疗有很强的生物学理由；NK细胞表现出广泛的抑制性和激活性受体库，以识别外来、感染或恶性细胞。两种信号的平衡最终诱导或阻断细胞毒性CD56dim NK细胞释放细胞毒性颗粒以杀死目标细胞。虽然可能存在广泛的NK细胞亚群多样性，基于激活和抑制受体的库，但通过CAR工程化NK细胞将为特定癌细胞提供预定的特异性。原型CAR具有CD28-CD3ζ信号也在NK细胞中活跃；具有NK细胞2DS2和DAP12信号蛋白的CAR产生了更强的抗肿瘤活性。为NK细胞工程化的CAR通常包含DAP10或DAP12用于激活，单独或与CD3ζ一起。具有NKG2D作为结合物和DAP10-CD3ζ用于激活的CAR有效地激活了小鼠模型中针对骨肉瘤的原代NK细胞。CD3ζ在NK细胞中作为激活域优于DAP10，而DAP12优于CD3ζ。 9.制造CAR T细胞用于临床应用 对于临床应用，CAR T细胞产品是根据良好生产规范（GMP）规则，使用预期接受患者的自体T细胞制造的（图7）。在大多数情况下，通过白细胞分离术收集血液，分离T细胞，通过病毒感染或电穿孔进行基因工程改造，并扩增到临床相关的数量。大多数临床试验使用通过γ-逆转录病毒或慢病毒基因转移修饰的T细胞；基于转座子的载体，如Sleeping Beauty和PiggyBac，越来越多地应用于临床，其好处是避免了成本和时间密集型的病毒生产。病毒和转座子介导的基因转移程序旨在永久性地修改患者的T细胞以表达CAR；一些试验使用通过RNA电穿孔修饰的T细胞进行短暂的CAR表达。在永久性基因改造后，插入突变和随后成熟T细胞的致癌转化的风险似乎很低，到目前为止在这方面还没有报告致癌事件。一个需要注意的问题是，通过慢病毒转移，CAR基因插入到Tet2位点导致T细胞的克隆扩增，然而，它们自发地收缩了。然而，白细胞分离产品中污染的恶性细胞也可能意外地被CAR改造，存在重新输注给患者后通过CAR介导的肿瘤促进的风险。 图7 CAR T细胞制造和患者治疗时间表。(a) 通过白细胞分离术从患者体内收集T细胞，并在体外处理以获得最终的CAR T细胞产品，包括T细胞工程化以携带CAR、扩增至临床相关数量，以及最终的质量控制程序（QC）。在输注CAR T细胞产品之前，患者需接受非清髓性淋巴细胞减少（“预处理”），以促进CAR T细胞的植入和体内扩增。随后需要院内护理以管理潜在的副作用，如CRS或神经毒性。(b) 体外CAR T细胞制造过程通常从白细胞分离产品开始，并涉及多个后续生产步骤，包括T细胞分离和激活、基因工程、CAR T细胞扩增、制剂、CAR T细胞产品的冷冻保存，以及最终的质量控制以供释放。整个过程可以手动运行，或在监督下（半）自动化进行。 经过基因改造后，CAR T细胞在细胞因子存在的情况下在体外广泛扩增到临床相关的细胞数量；目前使用手动处理的摇动反应器或袋子以及完全自动化和监督处理设备。自动化的目标是允许以高再现性和质量进行生产，并从越来越多的患者中并行生产细胞，并缩短静脉到静脉的时间。 最适合CAR治疗的T细胞群体被认为是具有急性炎症特征的原始或年轻中央记忆细胞。在IL-2存在下扩增CAR T细胞优先触发效应T细胞，而IL-7或IL-2加IL-15扩增具有持续细胞因子释放和抗肿瘤活性能力的中央记忆T细胞。添加IL-21使CAR T细胞保持较少分化状态。刺激方式不仅决定了扩增CAR T细胞的产量，还决定了代谢依赖性；IL-15增加氧化代谢以及肉碱棕榈酰转移酶，这是脂肪酸氧化的限速步骤。IL-7通过STAT5和Akt激活增加Glut1，并诱导甘油运输和甘油三酯合成，从而改善T细胞持久性和存活。在体外扩增期间抑制Akt触发具有高水平脂肪酸氧化的中央记忆表型，最终改善CAR T细胞的抗肿瘤活性。CD45RO+ CD62L+记忆CAR T细胞比更高级分化阶段的效应T细胞提供更持久的抗肿瘤反应，使富含CD62L的CAR T细胞成为进一步探索的有吸引力的选择。 因此，中央记忆CAR T细胞在临床应用中似乎更优越，因为响应的患者没有累积具有早期记忆和耗竭特征的T细胞，而非响应的患者则累积了。最终产品中工程化细胞的活性可能影响治疗效果。然而，基于制造的细胞产品的活性对CAR T细胞治疗结果的首次回顾性分析表明，当患者接受70-80%活性的产品与至少80%活性的产品相比，CD19 CAR T细胞扩增或患者存活没有差异的证据。 制造T细胞产品是一种个性化方法，当前程序有一些显著的限制： 一些癌症患者淋巴细胞减少或具有低数量的原始T细胞，导致生产延迟或失败，如在为儿科患者生产时所经历的。 生产过程耗时，这对急性或晚期疾病的患者不利。 由于疾病，患者的T细胞可能功能失调，如CLL和一些实体瘤所报告的，导致产品反应率低。 在某些情况下，工程化异体T细胞可能是另一种策略。在接受造血干细胞移植的患者中，使用移植的异体T细胞制造CAR T细胞产品。这样的异体CD19特异性CAR T细胞诱导了部分和完全缓解；然而，一些患者遭受了GvHD。病毒抗原特异性、部分HLA匹配的供体T细胞缺乏异体反应性，并且通过CAR工程化，显示出抗淋巴瘤活性。NK细胞以其MHC独立活性也是第三方供体细胞CAR工程化的来源；然而，它们在患者中表现出较差的持久性。 10.通过CAR T细胞的过继治疗在血液学恶性肿瘤中诱导持久缓解 过继转移CAR T细胞的治疗效果取决于多个参数，包括CAR设计、CAR信号传导、结合亲和力、目标细胞上的抗原数量、目标抗原表位的空间可及性、T细胞的成熟阶段、CAR T细胞的持久性和扩增、患者免疫系统的预处理等。目前的努力旨在优化特定疾病的状况；一些治疗方案已在CAR T细胞治疗恶性疾病的方面证明成功，特别是B细胞白血病/淋巴瘤；少数试验旨在治疗实体癌。 在迄今为止难以治疗的B细胞白血病和淋巴瘤的治疗中，使用“第二代”抗CD19 CAR T细胞的早期临床试验实现了完全且持久的缓解；使用“第一代”CAR T细胞的治疗大多失败，因为CAR T细胞从循环中迅速清除。目前，近600项早期阶段的CAR T细胞试验正在进行临床探索，主要由学术中心进行（截至2020年初，中国有268项，美国有227项，欧洲有67项）。用于治疗儿童B-ALL（Kymriah™，tisagenlecleucel，诺华）和成人大B细胞淋巴瘤（Yescarta™，axicabtagene ciloleucel，Kite-Gilead）的抗CD19 CAR T细胞已获得FDA和EMA的批准；其他将很快跟进。 CAR T细胞治疗的标准程序从患者的白细胞分离开始，分离T细胞，体外基因工程改造相应的CAR，CAR T细胞扩增，以及在非清髓性淋巴细胞减少和IL-2支持后，通过静脉输注将最终的细胞产品重新给患者（图7）。由于CAR T细胞的持久性对临床效果至关重要，目前在试验中使用的CAR具有一个或两个共刺激内域，其中大多数提供CD28或4-1BB共刺激。在持久性方面，4-1BB共刺激的CAR T细胞似乎优于CD28 CAR T细胞，在循环中持续4年以上，而CD28 CAR T细胞持续30天。由于CD19 CAR T细胞不区分健康和恶性B细胞，只要CD19 CAR T细胞持续存在，患者就会经历持久的B细胞耗竭。尽管B细胞耗竭在临床上是可管理的，但这种情况要求在靶向恶性B细胞时更具选择性。最近，Fcμ（IgM）受体被确定为治疗慢性淋巴细胞白血病（CLL）时可能更具肿瘤选择性的目标，由于目标表达水平较低，因此大多数健康B细胞免于被淘汰。目前也在探索其他替代靶标。 在缓解期间，大多数接受4-1BB CAR T细胞治疗的白血病/淋巴瘤患者没有接受进一步的癌症特异性治疗；接受CD28 CAR治疗的患者经常接受异体干细胞移植，这似乎是有益的，因为CD28 CAR T细胞的持久性不如4-1BB CAR T细胞。需要进一步探索以确定长期内更成功的策略。 迄今为止，患有DLBCL、CLL、B细胞急性淋巴细胞性白血病（B-ALL）和滤泡性淋巴瘤的患者已通过CD19 CAR T细胞成功治疗。值得注意的是，接受CD19 CAR T细胞治疗的多发性骨髓瘤患者也经历了缓解，尽管通过流式细胞术评估，骨髓瘤细胞是CD19low或CD19阴性。目前也在探索用于治疗B细胞恶性肿瘤的其他替代靶标，包括CD20、CD22、Igκ轻链、ROR-1和CD30。 由于缺乏标准化的试验设计、CAR组成、靶向抗原、预处理等方面，很难比较各种试验中CAR T细胞治疗的成功。然而，越来越明显的是，CAR T细胞剂量和淋巴细胞减少的程度或淋巴细胞减少方案对于允许广泛的T细胞扩增、持久性和最终治疗效果至关重要。应用后对CAR T细胞的重复再刺激可能改善它们在长期内的持久性和抗肿瘤效果。这是使用病毒特异性T细胞进行CAR植入的合理性，它们在接触病毒抗原时通过TCR重复再刺激；例如，Epstein-Barr病毒（EBV）特异性T细胞通过CAR工程化，并被EBV感染的细胞触发扩增。事实上，EBV特异性CAR T细胞的表现优于没有病毒特异性的CAR T细胞。 11.治疗实体癌的CAR T细胞面临的挑战 虽然血液学恶性肿瘤的治疗越来越成功，但实体癌的治疗仍然具有挑战性（表2）。作为“活药”的CAR T细胞基本上非常适合治疗实体癌，特别是由于T细胞固有的迁移和组织穿透能力，穿透血脑屏障，并在几乎所有组织中积累，包括睾丸和眼睛等特权组织，因此特别适合消除（微）转移。然而，大多数实体肿瘤具有大量策略，以非常有效的方式对抗CAR T细胞的迁移、渗透和激活。其中，改变的趋化因子环境损害了CAR T细胞向肿瘤的迁移；肿瘤内皮细胞上丢失了一些粘附因子，妨碍了T细胞的渗透。通过局部沉积TNF-α可以对抗后者，它增加了血管粘附分子，如血管细胞粘附蛋白-1和内皮细胞上的细胞间粘附分子-2。靶向血管内皮生长因子（VEGF）受体-2或阻断迁移抑制因子如内皮素B受体也改善了内皮细胞粘附和/或T细胞的跨内皮迁移。在T细胞上下调的趋化因子受体被重新表达，如CXCR2（CXCL1受体），以便于靶向黑色素瘤或CCR2b用于靶向神经母细胞瘤。 表 2 CAR T细胞疗法面临众多挑战。 为了绕过迁移障碍，CAR T细胞被瘤内植入或分别注入胸膜或腹膜以治疗间皮瘤和卵巢癌。通过内窥镜将抗CEA CAR T细胞应用于肝转移；抗c-Met CAR T细胞被注入乳腺癌转移。一旦进入肿瘤病变，CAR T细胞需要突破基质细胞和细胞外基质的障碍，才能接近癌细胞以执行它们的细胞毒性攻击。通过基因工程释放的肝素酶在基质中降解肝素硫酸蛋白多糖，改善T细胞的渗透；需要高水平的IFN-γ来消除基质细胞并根除大型已建立的肿瘤病变。通过直接针对基质细胞的CAR T细胞特异性针对成纤维细胞激活蛋白（FAP），一种参与细胞外基质重塑的丝氨酸蛋白酶，整体抗肿瘤活性得到改善。 许多过程使肿瘤病变对重定向的CAR T细胞产生敌意，使它们变成耗竭状态或进入凋亡。调节性T（Treg）细胞、髓源性抑制细胞（MDSCs）和肿瘤相关M2型巨噬细胞释放抑制性细胞因子，如IL-4、IL-10、白血病抑制因子（LIF）和TGF-β。MDSCs和巨噬细胞降低肿瘤内色氨酸水平；基质细胞释放吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）和犬尿氨酸，抑制T细胞效应功能并剥夺组织中的葡萄糖和其他营养物质。严重的酸中毒也对抗肿瘤活性的CAR T细胞产生反作用。由于MDSCs释放的精氨酸酶，低精氨酸水平抑制CD3ζ表达和TCR信号传导。 12.CAR T细胞治疗与毒性相关 作为“活药”的CAR T细胞治疗在一些试验中取得了显著的治疗效果；然而，CAR T细胞在初始应用后的几天甚至几周内可能导致严重的副作用，需要重症监护干预，甚至可能致命。大多数毒性是由于CAR T细胞的特殊生物学特性，其他与CAR T细胞相关的毒性目前尚未完全理解。从机制上讲，主要毒性是(1)由于大量T细胞激活、细胞因子释放和肿瘤溶解引起的全身毒性，以及(2)由于CAR T细胞与健康组织相互作用引起的特异性毒性（“靶上非肿瘤”毒性）。 12.1.系统性毒性 细胞因子释放综合征（CRS）：大量CAR T细胞与目标细胞的结合导致大量细胞因子释放，血清中促炎细胞因子（包括IFN-γ和TNF-α、IL-10和IL-6）的水平异常高，这本身会导致其他免疫细胞的交叉激活，以及进一步的细胞因子释放，直至达到有毒水平。这些毒性被称为细胞因子释放综合征（CRS），临床上伴有高烧、不适、疲劳、肌肉痛、恶心、厌食、心动过速、低血压、毛细血管渗漏、心脏功能障碍、肾功能损害、肝功能衰竭和弥散性血管内凝血。CRS常与血管渗漏综合征（VLS）一起出现，与巨噬细胞激活综合征（MAS）和巨噬细胞激活密切相关，临床上类似于噬血细胞性淋巴组织细胞增多症（HLH）。CRS的风险与T细胞激活和扩增有关，这可能与总体肿瘤负荷相关，但并非绝对。为了避免CRS，需要在肿瘤负荷高的患者中使用较低剂量的CAR T细胞，这是一个需要通过精确定义治疗窗口来解决的悖论，通过调整T细胞激活、细胞因子释放和抗肿瘤活性。 CRS的早期诊断和临床管理通过新建立的评分系统和治疗指南得到便利。C反应蛋白，即由肝细胞在IL-6水平增加时释放的蛋白质，目前作为CRS发作和严重程度的实验室标志物；成人的预测标志物还包括可溶性gp130（sgp130）、IFN-γ和IL-1Rα的增加，在儿科患者中，IFN-γ、IL-13和MIP1α的增加。目前CRS的治疗基于阻断IL-6/IL-6受体信号轴，通过阻断抗体如抗IL-6受体抗体tocilizumab或抗IL-6抗体siltuximab，这似乎不会干扰CAR T细胞的疗效。短期系统性皮质类固醇治疗也能迅速逆转CRS，且不影响最初的抗肿瘤反应；然而，它可能在长期内损害CAR T细胞反应。在CRS期间中和促炎细胞因子有助于减轻CRS的严重程度。在CRS期间，活化的单核细胞和/或巨噬细胞释放高水平的IL-1；通过IL-1受体拮抗剂中和可以改善临床模型中的CRS和神经毒性。通过给予lenzilumab抗体中和巨噬细胞-单核细胞激活细胞因子GM-CSF，降低了CRS的风险。通过阻断酪氨酸羟化酶减少儿茶酚胺，降低了小鼠模型中的细胞因子水平，暗示了临床干预的途径。 与CAR T细胞相关的HLH/MAS通常与CRS症状一起出现，伴有铁蛋白和肝酶血清水平升高、噬血细胞现象、细胞减少、肺水肿、脾肿大、肾功能衰竭和NK细胞丢失。治疗包括使用依托泊苷或阿糖胞苷进行系统性化疗，如果与神经毒性相关，也可以鞘内应用；在这种情况下，IL-6/IL-6R阻断大多无效。 神经毒性（ICANS）：CAR T细胞治疗相关的神经毒性现在被称为免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）。神经系统效应包括失语症、幻觉、混乱、谵妄、表达性失语症、肌阵挛、谵妄、癫痫发作和脑水肿。这种神经毒性发生在大约40%的患者中，是可逆的，并且在CD19 CAR T细胞治疗期间频繁发生；其他CAR T细胞也可以引起神经毒性，指向由于活化CAR T细胞的浸润导致的弥漫性但暂时性脑病。神经毒性的机制尚不清楚，但与破坏血脑屏障和脑脊液中细胞因子水平增加有关。如果与CRS一起治疗，用IL-6阻断和类固醇治疗可以成功。 12.2.“靶上非肿瘤”毒性 由于大多数靶向抗原也由健康细胞表达，CAR T细胞治疗与攻击健康组织的风险相关，导致巨大的“靶上非肿瘤”毒性。治疗B细胞白血病的CD19靶向CAR T细胞也消除了健康的B细胞；持久的B细胞耗竭需要免疫球蛋白替代和抗生素及抗真菌保护，这在临床上是可管理的。当目标抗原由重要组织表达时，毒性更严重。在一项针对肾癌患者的碳酸酐酶IX特异性CAR T细胞治疗试验中，患者由于胆管上皮细胞上碳酸酐酶IX水平较低而出现肝毒性；通过预先给予阻断抗体，可以减少“非肿瘤”毒性的严重程度。避免“靶上非肿瘤”毒性的策略目前旨在增加肿瘤选择性，并以空间和时间的方式限制CAR活性。T细胞给药的替代途径可能是避免通过血液系统分布大量CAR T细胞的选项。通过内窥镜或胸膜内或腹膜内应用局部CAR T细胞给药，在肿瘤部位提供高剂量的CAR T细胞，并在一定程度上避免了非肿瘤毒性。然而，这种应用是有限的，因为在大多数情况下，肿瘤病变无法接触或肿瘤广泛扩散。 12.3.“靶外非肿瘤”毒性 大多数过去工程化的CAR在细胞外部分包含IgG1 CH2CH3结构域作为间隔区，这可能会与Fcγ受体（FcγR）（CD64）结合，从而激活NK细胞和巨噬细胞等先天细胞。尽管到目前为止在临床上并不突出，但理论上可以通过删除IgG1 CH2结构域或突变FcγR结合位点内的Asn297来减少风险。替代间隔区包括IgG4 Fc结构域或细胞外CD8结构域。 第三代曲妥珠单抗衍生的CAR T细胞靶向ErB2导致可能由于急性呼吸窘迫综合征和CRS导致的致命的心肺衰竭。同样，在用EGFR变体3特异性CAR T细胞和CEA特异性CAR T细胞治疗时记录了肺水肿，而没有直接证据表明CAR T细胞攻击肺上皮。由于使用针对同一目标的不同表位或传递不同信号的CAR可能产生显著不同的毒性，因此毒性概况更加复杂，例如，使用来自FRP5抗体的第二代ErB2 CAR的T细胞在肉瘤患者中并未诱导靶外非肿瘤毒性。 12.4.改善CRS的策略 基本上，当CRS在临床上显著时，需要对CAR T细胞进行下调或去激活；瞬时CAR表达、“关闭开关”和“自杀开关”是常用工具。 当存在严重CAR T细胞相关毒性的重大风险时，瞬时CAR表达可能有益。RNA转移产生瞬时表达的CAR。CAR在T细胞表面存在数天，并在目标细胞结合时介导有效的T细胞激活，然而，随着RNA降解和T细胞扩增时RNA稀释，CAR表达会下降。这种RNA修饰的T细胞在试验中显示出一些虽短暂但有效的效果。然而，由于CAR T细胞迅速清除，其缺点是短期效果。 然而，永久性修改的CAR T细胞需要在毒性不受控制的情况下主动消除这些细胞的策略。大剂量脉冲治疗类固醇在应用碳酸酐酶IX特异性CAR T细胞后停止了自身免疫。虽然这是非选择性地清除激活的T细胞，但可以通过特定靶向更有选择性地消除CAR T细胞。CAR结合域基本上也可以通过抗独特型抗体进行靶向，以诱导CAR T细胞的溶解性消除。通过给予识别细胞外CAR结构域中整合的表位的消耗性、FDA批准的抗体，也可以实现CAR T细胞的消耗。例子包括使用利妥昔单抗来消耗具有CD20表位或模拟表位的CAR T细胞，或使用西妥昔单抗来消耗具有EGFR表位的CAR T细胞。是否能够迅速实现足够的CAR T细胞清除以逆转正在进行的CRS，还有待在临床情况下证明。 诱导凋亡的CAR T细胞消除似乎是这种情况下更快速的解决方案。转基因脲酶-9（Cas9）与FKBP1A相连，在系统应用原本惰性的小分子AP1903后，会在工程化CAR T细胞中诱导凋亡，该分子促进二聚体化和激活诱导性Cas9（iCas9）。这种策略是有效的，因为供体T细胞介导的GvHD可以在实验系统中通过iCas9介导的T细胞凋亡在一小时内停止。 与其消除CAR T细胞，不如通过整合模块控制细胞表面的CAR。CAR被设计为融合蛋白，整合了一个自切割降解结构域，该结构域被可以被特定蛋白酶抑制剂特异性阻断的蛋白酶反向调节。在蛋白酶存在的情况下，产生的CAR融合蛋白从连接的降解结构域分离并表达在细胞表面；抑制蛋白酶导致CAR降解和缺乏表面表达。 CAR也可以通过添加酪氨酸激酶抑制剂dasatinib来降低其表达或调节其信号强度，该抑制剂可以迅速且可逆地阻断Lck激活；从而在小鼠模型中减少CRS的严重程度。该策略的好处是，只要存在dasatinib，CAR T细胞的信号强度就会减弱，但不会被清除；然而，该策略仍需临床验证。 需要进一步开发以降低细胞因子介导毒性风险的CAR。调节信号强度的一个关键是CAR共刺激。CD28-ζ CAR更快地诱导T细胞激活，并诱导更高的细胞因子释放、扩增和随后的耗竭，而4-1BB-ζ CAR则驱动较少的急性扩增，但具有较低的细胞因子水平，因此与严重CRS的风险较低。因此，4-1BB-ζ CAR可能更适用于肿瘤负荷和抗原密度高的患者，而CD28-ζ CAR可能需要用于肿瘤负荷低的情况。 降低CAR介导的T细胞激活的其他策略，例如，修改CD8跨膜和铰链区域，从而降低ICANS或高于1级CRS的风险。作为一种替代策略，“通用”CAR允许通过调整将CAR T细胞与目标细胞链接的适配器分子来动态控制T细胞激活。 13.CAR T细胞治疗的挑战 在过去的几年里，临床试验正致力于将CAR T细胞治疗确立为治疗几种类型的B细胞白血病和淋巴瘤；然而，在治疗其他恶性疾病的方面，仍然存在重大障碍。 13.1.如何选择最佳的肿瘤选择性抗原作为靶标？ 在CAR T细胞治疗中，肿瘤靶向的选择性对于长期兼容性至关重要。大多数可靶向的肿瘤相关抗原并不具有肿瘤选择性，这增加了CAR T细胞疗法中诱导靶上非肿瘤毒性的风险。肿瘤特异性的表面蛋白突变或肿瘤相关糖基化变体如Muc1或Muc16是罕见的。然而，有些抗原虽然由健康组织表达，但似乎是安全的靶标。例如，癌胚抗原（CEA，CD66e）严格表达在胃肠道和肺部健康上皮的腔面，而在癌细胞上以去极化方式表达。系统性应用CEA特异性CAR T细胞（NCT01212887, NCT02349724）和通过肝动脉输注局部给药的抗CEA CAR T细胞（NCT01373047）在减缓肿瘤进展的同时，并未诱发治疗相关结肠炎。其他如ErB2等抗原可能在高表达ErB2的肿瘤细胞被选择性靶向时是合适的靶标，同时保留中低表达的健康细胞。 为了增加肿瘤选择性，优先考虑靶向一组抗原模式而不是单一特定抗原。技术上，在同一T细胞中共表达两种具有不同特异性的CAR，以在两种CAR同时结合它们相应的抗原时仅诱导完全的T细胞激活；一种CAR提供主要信号，另一种CAR提供共刺激信号，从而仅在存在两种抗原的情况下补充完全T细胞激活所需的信号。该策略需要一个弱的主要信号，以避免在存在一种抗原的情况下进行一些基本的CAR T细胞激活，以及一个强的共刺激信号以驱动完全的T细胞激活。 为了在结合健康细胞时阻断CAR T细胞激活，与激活性CAR共表达具有细胞内PD-1或CTLA-4信号传导的抑制性CAR（iCAR）。iCAR识别健康细胞上存在但在癌细胞上不存在的抗原。因此，仅在结合缺乏iCAR识别的抗原的目标细胞时才发生CAR T细胞激活。 有些抗原在癌细胞上的表达水平高于健康细胞；“亲和力调节”CAR结合域可能有助于区分这两种组织。虽然在临床前模型中证明了可行性，但癌细胞可能通过下调相应抗原来逃避监视。亲和力调节的治疗窗口狭窄，因为增加亲和力可能导致识别健康细胞，如GD2特异性CAR在实验模型中诱发致命性脑炎。 13.2.如何优化CAR结构？ 目前临床评估中的大多数CAR基于近二十年前设计的原型CAR结构。临床前研究表明，对于每种抗原，特定CAR需要针对目标抗原表位、结合亲和力、间隔区长度以及信号传导和跨膜结构域等进行优化。由于各组分之间复杂的依赖性，目前无法预测特定抗原的最佳CAR组成。例如，结合亲和力和目标表位的位置为靶向高抗原负载的癌细胞同时保留低抗原负载的健康细胞提供了狭窄的亲和力窗口。 13.3.如何在CAR T细胞治疗后建立长期癌症控制？ 尽管在儿童B-ALL中可以高频率诱导完全缓解，但约40%的白血病患者在持续存在CAR T细胞的情况下仍然复发。多种原因导致复发频率高，包括整个CD19分子的丢失或表达缺乏目标外显子2的CD19异构体，从而使其对CAR T细胞不可见。在CD19 CAR治疗后，B-ALL的两个案例中通过转换为CD19阴性的髓系谱系丢失CD19。在这种情况下，靶向对癌细胞存活至关重要的抗原将是一个理想的策略。由于这样的抗原通常不可用，通过双特异性CAR共靶向第二种抗原（例如CD20或CD22）可能会增加对白血病细胞的治疗压力。在实体瘤中这种情况更为重要，因为它们在抗原表达上通常表现出深刻的异质性；在初始肿瘤消退后的早期肿瘤复发可能是由于选择抗原丢失的癌细胞。这些癌细胞可能以抗原非依赖性方式被先天免疫细胞反应识别和消除。为了吸引和激活先天细胞并启动更广泛的免疫反应，CAR T细胞在实验模型中被赋予了诱导释放转基因IL-12的能力，使抗肿瘤攻击更有效。有一些迹象表明，结合抗原依赖性和非依赖性免疫反应可能在长期内控制肿瘤。 13.4.哪种T细胞亚群提供长期肿瘤控制？ 临床前模型表明，具有增强扩增能力和长期持久性的原始或早期中央记忆T细胞是过继治疗最合适的细胞。沿着这条线，CD62L+记忆T细胞似乎表现出优越的性能。发现中央记忆干细胞（TSCMs），这是CD62L+中央记忆T细胞库的一部分，具有非凡的扩增潜力，激发了对这些细胞进行过继细胞治疗的探索。人们对识别和调节干细胞样T细胞形成和维持的因素和调控网络越来越感兴趣，因为这些细胞在过继转移到患者后似乎对长期治疗效果至关重要。另一种策略是基于预测性地诱导T细胞成熟。例如，4-1BB共刺激在年轻T细胞中启动中央记忆T细胞反应，这与CD28 CAR T细胞表现出更短暂的效应细胞反应形成对比。另一方面，更成熟的阶段的细胞在大多数肿瘤所在的外围显示出优先积累。然而，这些细胞需要不同的共刺激信号，即优先迁移到外围的CCR7− T细胞从联合CD28-OX40共刺激中受益。特定T细胞亚群的功能能力也可以通过与激酶抑制剂的联合治疗来调节；ibrutinib，一种布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）抑制剂，降低了PD-1和CAR T细胞的耗竭，从而增加了持久性和抗肿瘤活性。 13.5.如何使CAR T细胞制造适应日益增长的患者数量？ 目前，大多数CAR T细胞由专门的GMP设施生产，冷冻并运送到患者的医院。生产越来越多的细胞产品将使当前程序达到极限，特别是当及时需要数千个自体细胞产品时。在医院内（半）自动化、完全控制和完全封闭系统的分散制造是解决这种情况的首选概念之一。这也将需要在制造过程中高度标准化，并避免血液和细胞产品运输中的复杂物流。作为另一种概念，一个高度专业化的、集中的生产设施，具有多个并行的自动化制造过程，可能作为患者细胞产品的区域供应商。 另一个限制是由患者自体T细胞治疗的需要设定的；对于每位患者来说，“通用”供体将使治疗在多个方面更容易。一个包含不同工程化CAR的“通用”供体T细胞产品库将在临床应用中提供更大的灵活性，根据患者的具体情况。此外，扩大生产规模将使更多的患者能够使用CAR T细胞产品。正在努力生成可以应用于众多患者的这种“通用”T细胞。这需要使CAR T细胞对宿主免疫细胞“隐形”，缺乏对患者健康组织的异体反应性，同时保留CAR介导的抗肿瘤活性。在这种情况下，通过基因组编辑技术获得的MHC缺陷、CAR修饰的病毒特异性T细胞和TCRα敲除T细胞，目前正在开发作为“现成的”或“第三方”细胞产品，GvHD风险低。CAR基因插入TCRα位点一步实现CAR的遗传工程和TCR表达的废除。编辑MHC I类以防止宿主识别和排斥供体T细胞可能通过NK细胞诱导消除，并不防止MHC II类介导的排斥。然而，目前探索的所有基因编辑程序在某种程度上都容易受到非目标修饰的影响，因此与意外的突变风险相关。该领域发展迅速，首次使用异体CAR T细胞治疗B细胞恶性肿瘤和实体瘤的试验已经启动。 13.6.如何平衡CAR T细胞的疗效和副作用？ 目前，一些CAR T细胞治疗与高风险的严重副作用相关，可能需要重症监护住院治疗。尽管各种CAR T细胞协议和治疗程序不同，并且没有在比较性的临床环境中进行评估，但一些临床管理规则变得明显。例如，CRS的早期诊断、分级和临床管理将标准化，建立共识的治疗方案。在毒性不受控制的情况下，可以通过各种手段选择性地和迅速地消除CAR T细胞。通过添加二聚体化剂AP1903二聚体化转基因诱导的脲酶-9（iCasp9），在30分钟内消除超过90%的T细胞。或者，通过给予针对CAR结构域或共表达表位的抗体，诱导抗体依赖性细胞毒性（ADCC）清除循环中的CAR T细胞。免疫介导的CAR T细胞消除的缺陷仍然是，癌症患者的潜在功能障碍免疫系统可能通过ADCC消除CAR T细胞的能力有限。 13.7.我们是否需要针对每种癌症类型的特定预处理？ 在大多数试验中，患者在过继T细胞治疗前接受非清髓性淋巴细胞减少，使用氟达拉滨和环磷酰胺；这种预处理的理由是暂时提供“空间”和细胞因子，以实现转移的CAR T细胞在体内的充分扩增。淋巴细胞减少还通过免疫调节提供抗肿瘤效果，因为它耗尽抑制细胞，并在肿瘤破坏时释放肿瘤相关抗原到免疫系统。尽管目前的预处理方案基本上是有效的，但基本方案可能需要针对每种癌症实体进行调整。例如，用于治疗Her2+肿瘤的调节方案通过应用nab-紫杉醇来耗尽间质性基质，并促进Her2呈递，并通过应用环磷酰胺耗尽Treg和MDSC，用于胆道和胰腺癌的修改。另一方面，预处理在CAR T细胞治疗的背景下可能具有高度毒性，通过诱导脑水肿和神经系统毒性，特别是在最近的一项试验（NCT02535364）中观察到的氟达拉滨治疗后。 13.8.如何激活免疫网络以诱导广泛的炎症性抗肿瘤反应？ CAR T细胞作为“活药”，越来越成为在目标器官产生和释放生物活性化合物的“活工厂”。使用CAR T细胞作为工厂的合理性基于实验肿瘤模型的证据，即宿主免疫系统在肿瘤排斥中起着重要且必要的作用，这使得在目标肿瘤组织内产生免疫刺激性条件成为必要。释放IL-12的CAR T细胞（IL-12 TRUCKs）可以通过吸引和激活M1型巨噬细胞来在肿瘤组织中诱发免疫反应，这些巨噬细胞可以消除CAR T细胞未能识别的癌细胞。其他具有特定影响局部免疫环境的细胞因子也可以使用；释放IL-18的CAR T细胞增加了肿瘤相关CD206+ M1型巨噬细胞和NKG2D+ NK细胞的数量，并减少了如Treg细胞、CD103+树突细胞和M2型巨噬细胞等抑制细胞。目前正在试验中探索使用靶向PD-1的检查点阻断，以激活CAR T细胞和浸润性淋巴细胞（NCT02650999）；其他检查点的阻断或组合，以重新激活肿瘤内源性免疫细胞，同样值得进行临床探索。 14.CAR T细胞用于其他疾病的治疗 将T细胞激活重定向的CAR不仅限于靶向癌细胞，还可以用于靶向任何由目标抗原定义的细胞。通过抗Dsg3 CAR靶向记忆B细胞的CAR T细胞被设计用来消除导致天疱疮病理的细胞。通过识别MHC呈递的自身抗原的CAR T细胞靶向自反应性T细胞。CAR被工程化以靶向病毒感染的细胞，如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、巨细胞病毒和HIV感染的细胞。源自Dectin-1的CAR T细胞被用于破坏真菌Aspergillus的发芽。实验模型暗示，CAR重定向的Treg细胞可用于促进自身免疫疾病如结肠炎、过敏性哮喘和移植物抗宿主病的免疫耐受治疗，通过靶向HLA。最近，通过识别心脏成纤维细胞激活蛋白（FAP）的CAR T细胞靶向心脏纤维化，该蛋白在心肌损伤重塑时由心脏成纤维细胞高度表达。采用FAP特异性CAR的T细胞过继转移减少了心脏纤维化并恢复了小鼠的损伤后功能。该报告暗示CAR T细胞作为“活药”，在治疗目前疗法非常有限的心脏病中消除激活的心脏成纤维细胞。CAR T细胞用于治疗非恶性疾病其他应用的临床前开发正在进行中。 要点 采用嵌合抗原受体（CAR）重定向的T细胞的过继细胞治疗在某些血液学恶性肿瘤中取得了显著的治疗效果；然而，在其他疾病中的治疗效力仍然有限。 CAR是由结合域、跨膜域和细胞内信号传导域组成的模块化、重组的跨膜分子，用以激活工程化细胞。最佳分子设计需要通过变化组成域在每种情况下探索。 原型CAR设计可以通过使用各种靶向和信号传导元件进行修改，使CAR更加通用。此外，各种免疫细胞可以通过CAR重定向，提供方便的治疗细胞。 CAR T细胞治疗经常与毒性相关，这些毒性可以通过同时进行的治疗、改变CAR设计和靶向替代抗原来减少靶上非肿瘤毒性来减轻。 通过共同激活广泛的免疫反应、共同靶向肿瘤基质、癌症干细胞和其他与肿瘤相关的结构，可以提高CAR工程化免疫细胞的抗肿瘤效力。 生产CAR T细胞产品仍然具有挑战性，为所有患者提供个性化治疗；正在努力为广泛的患者群体制造异体细胞产品“现成”。 下章预告：抗体关键特性的改进 往期内容： 第二章：抗体：发现及特性的历史 第三章：单克隆抗体和杂交瘤细胞 第四章：抗体展示系统 第五章：转基因动物用于产生人类抗体 第六章：抗体在治疗、诊断和科学中的应用 第七章：双特异性抗体 第八章：抗体偶联药物 第九章：替代性结合框架：用于基础研究和治疗应用的多功能结合剂 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 时间：2024年10月16-17日 地点：上海张江（酒店定向通知） 规模：600-800人 主办单位：生物制品圈、抗体圈 演讲支持：Entegris、瑞孚迪、AS ONE CORPORATION 会议费用：免费FREE!（仅收取100元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），先到先得，报完即止！ 报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！ 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 日程安排 更多嘉宾正在邀请中 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

关注并星标CPHI制药在线 近日，第一三共宣布FDA已批准Vanflyta(quizartinib）联合标准阿糖胞苷和蒽环类诱导化疗，以及标准阿糖胞苷巩固化疗，以及作为维持单药治疗，用于治疗新诊断的FLT3-ITD突变阳性的急性髓性白血病(AML)。       Vanflyta是一种高效、选择性第二代II型FMS样酪氨酸激酶3（FLT3）抑制剂，最早于2019年6月在日本被批准作为单药疗法，治疗成人复发性/难治性FLT3-ITD急性髓性白血病（AML）。2023年5月，Vanflyta在日本获批新适应症，联合标准阿糖胞苷和蒽环类诱导化疗，以及标准阿糖胞苷巩固化疗，以及作为维持单药治疗，用于治疗新诊断的FLT3-ITD突变阳性急性髓性白血病(AML)。       值得一提的是，Vanflyta在欧美的上市之路并不顺，2019年6月和10月先后遭FDA和EMA拒批。此次Vanflyta在美国获批是基于临床试验QuANTUM-First的积极结果。该试验一项随机、双盲、安慰剂对照3期试验，旨在评估Vanflyta联合标准化疗在新诊断的FLT3-ITD AML患者的疗效和安全性。试验中，539例FLT3-ITD突变AML患者被随机分配至Vanflyta组（n=268）和安慰剂组（n=271）。       试验数据显示：截止2021年8月13日，中位随访时间约为39个月，与单用标准诱导和巩固治疗相比，加用Vanflyta对OS有临床意义和统计学意义的改善（Vanflyta组的中位OS为31.9个月，安慰剂组为15.1个月）。两组的完全缓解（CR）率相似，但Vanflyta组的CR持续时间为38.6个月，安慰剂组为12.4个月。       安全性方面，265名接受Vanflyta治疗的患者最常见的不良反应是中性粒细胞减少症（25.0%）、血小板减少症（22.7%）、恶心（20.6%）和心电图QT间期延长（19.3%）。       不过，与安慰剂组相比，Vanflyta组QT间期延长的发生比安慰剂组更频繁，但大多数病例为轻度或中度，可通过调整Vanflyta剂量和纠正其他危险因素进行控制。       FLT3与急性髓系白血病（AML）       急性白血病是起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，白血病细胞出现增殖失控、分化障碍、凋亡受阻，大量蓄积于骨髓和其他造血组织，从而抑制骨髓正常造血，导致正常血细胞功能障碍。急性髓系白血病（AML）是成人最常见的急性白血病类型，起病急骤凶险，如果不及时治疗，会迅速恶化，生存期仅数月。       FLT3（FMS样酪氨酸激酶3）是一种通常由造血干细胞表达的跨膜受体酪氨酸激酶蛋白，通过各种信号通路促进细胞存活、生长和分化，在细胞发育中发挥重要作用。FLT3基因突变可驱动致癌信号，是AML最常见的基因异常改变之一，约30%的AML患者发生FLT3基因突变。研究发现，活化后的FLT3通过PI3K，RAS和STAT5信号通路促进AML细胞的增殖和分化。       野生型FLT3的结构和活化       FLT3突变主要有两种类型，即膜旁结构域的内部串联重复突变（FLT3-ITD）和酪氨酸激酶结构域的点突变（FLT3-TKD）或缺失，这两种突变的FLT3分子都可以非配体依赖的二聚和反式磷酸化被激活的。其中FLT3-ITD是最常见的FLT3突变，影响约25%的AML患者。与未携带FLT3-ITD突变的AML患者相比，FLT3-ITD AML患者总体预后更差，包括复发率增加、复发后死亡风险增加、造血干细胞移植后复发的可能性更高。       FLT3抑制剂研究进展       FLT3抑制剂是AML治疗的研究热点。目前全球已批准10余款FLT3抑制剂,但仅Vanflyta(quizartinib）、Xospata（gilteritinib，吉瑞替尼）和 Rydapt(midostaurin，米哚妥林)三款FLT3抑制剂被批准用于治疗AML。其中吉瑞替尼是安斯泰来与与日本寿制药株式会社合作发现的一款第二代FLT3抑制剂，对FLT3-ITD和FLT3-TKD两种不同的突变具有抑制作用，最早于2018年10月在日本被批准用于治疗FLT3突变阳性的复发或难治性AML成人患者。       米哚妥林是诺华开发的一种口服多靶点激酶抑制剂，能抑制FLT3与KIT等在细胞生长过程中的多种关键酶，干扰癌细胞生长与增殖。2017年4月，该药被FDA批准联合化疗，用于新确诊的FLT3阳性的AML患者。       此外，目前全球还有多款在研FLT3抑制剂被开发用于治疗AML，详见下表。在研FLT3抑制剂靶点多样，药物类型多为化药。研发进度上，在研FLT3抑制剂即将迎来收获期，多款进入3期临床上。值得一提的是，我国药企如东阳光药业、以岭药业、再极医药等也积极布局FLT3抑制剂领域，且部分企业在研药物进展较快，已进入3期临床。         •  Crenolanib最初作为PDGFR抑制剂研发，但之后的研究表明在体外结合研究、细胞株及小鼠白血病模型和人原代AML细胞中，其对FLT3-ITD 和FLT3-TKD突变亚型均有较好活性。此外，Crenolanib 对D835突变的AML也表现出较好的活性。       2022 ASCO年会上公布的Crenolanib联合疗法治疗新诊断FLT3突变AML的2期临床试验数结果显示：28例患者接受DNR（阿糖胞苷100mg/m2/d持续7天联合柔红霉素持续3天）/Crenolanib治疗，16例患者接受IDA（阿糖胞苷100mg/m2/d持续7天联合去甲氧柔红霉素持续3天）/Crenolanib治疗。一个诱导周期后，总复合完全缓解（CRc；完全缓解[CR]+血液学不完全恢复的CR[CRi]）率为73%（32/44）；经过两个周期治疗后，总CRc率为86%（38/44）。         •  克立福替尼是一款新一代、高特异性FLT3抑制剂，在体外和体内均表现出对FLT3-ITD突变的人类细胞系的有效活性。2022年10月，该药在国内启动3期临床，旨在评估其治疗FLT3-ITD突变的复发/难治AML患者的疗效和安全性。       2022 EHA上公布的评估克立福替尼治疗中国复发难治性（R/R）FLT3突变AML患者的1期临床试验结果显示：在53名FLT3-ITD阳性、可评估的患者中，CR/CRh率为17.0%（9/53），CRc率为45.3%（24/53）。在每天服用Clifutinib 40mg的患者中，CR/CRh率为18.2%（6/33），其中3名患者达到CR，CR/CRh患者的中位DOR为5.7个月，CRc率为48.5%（16/33），中位OS为7.4个月。在仅接受过一种既往方案的患者中，40mg剂量组患者的CR/CRh率为25%（4/16），CRc率为50%（8/16），中位OS为13.0个月。         •  SKLB-1028是四川大学杨胜勇设计的多靶点酪氨酸激酶抑制剂，SKLB-1028主要作用靶点包括FLT3、EGFR、Abl、Fyn、Hck、Lck、Lyn、Ret等，后来以2000万人民币的价格转让给石药集团。临床前研究显示，SKLB-1028对白血病、非小细胞肺癌等多种肿瘤，尤其是对FLT3-ITD突变的AML具有很好的抑制作用，以及良好的耐受性。         •  XY0206是以舒尼替尼为先导化合物，在其骨架结构基础上进行优化改造而得到的2-吲哚酮类多靶点酪氨酸激酶抑制剂。与舒尼替尼相比，XY0206有相似的抑酶谱，可抑制FLT3、c-Kit、PDGFRβ、RET和VEGFR2等RTKs；对FLT3的抑制活性更强，对FLT3-ITD及FLT3-TKD具有双重抑制活性，可克服Ⅱ型酪氨酸激酶抑制剂耐药性；更具选择性；有更大的安全治疗窗口，更好的代谢稳定性，并且无组织蓄积性。2023年4月，XY0206用于治疗FLT3-ITD突变的复发/难治性AML的3期临床试验方案完成CDE药物临床试验登记与信息公示平台的登记与公示，可以启动3期临床试验工作。         •  MAX-40279是一款作用于FLT3/FGFR双靶点的小分子酪氨酸激酶抑制剂。在澳大利亚和中国开展治疗AML的1期临床试验中，MAX-40279对FLT3野生型AML末线治疗病人的应答率（ORR）达到36%，优于吉瑞替尼（12%）。         •  SEL24/MEN1703是同类首创的口服双PIM/FLT3抑制剂，由Menarini从Ryvu Therapeutics获得内部许可，2022年10月被FDA授予治疗AML的孤儿药资格。       2022 ASCO上公布的评估SEL24治疗IDH1/2突变的AML的1/2期临床研究结果显示：截至2022年1月10日，14例患者入组IDHm队列，在完成≥1个治疗周期且有≥1次基线后评估或明确疾病进展的7例患者中，ORR为28.6%。其余7例患者中，3例在完成C1前停药，无进展或缓解，4例患者正在进行中，尚未进行任何基线后评估。         •  EP0042是Ellipses Pharma开发的一种FLT3和Aurora激酶双重抑制剂，旨在成为已对FLT3抑制剂产生耐药性的AML患者的新疗法。2022 ASH年会上，Ellipses公司公布的1/2期临床试验初步数据表明：EP0042具有可接受的安全性和耐受性，并且有证据显示，许多已接受过多线治疗的患者的疾病控制（DC）时间得到了延长。2023年3月，该药被FDA授予孤儿药资格。         •  FF-10101是富士胶片株式会社开发的一种高选择性、不可逆的FLT3抑制剂，针对FLT3突变AML细胞具有强大体外活性，对不同类型的FLT3突变均具有很高的活性。2021 ASCO年会上公布的1期临床试验数据显示：FF-10101在复发/难治AML患者中耐受性良好，有持续的FLT3抑制作用。         •  HM43239是一种口服、每日一次、高效的髓系激酶抑制剂（MKI），对FLT3野生型、ITD、TKD和ITD/TKD突变体具有亚纳摩尔级的结合亲和力。在早期的临床前研究中，HM43239在体内、体外均表现出对FLT3的ITD突变、D835抗性获得，以及门控（F691）TKD突变的AML耐药具有强大的活性。此外，HM43239抑制SYK的磷酸化，SYK在AML中高度激活，并与FLT3靶向治疗的耐药性相关。         •  MRX2843是拥有全新化学结构的Mer酪氨酸激酶(MerTK)和FLT3双重抑制剂，拟用于治疗MerTK和FLT3通路异变的血液系统肿瘤和实体瘤。2017年7月，贝达药业与Meryx签订合作协议，支付Meryx200万美元获得MRX-2843在大中华区（包括中国台湾、中国香港和中国澳门）的独家开发和商业化许可。         •  HYML-122由中国科学院合肥物质科学研究院强磁场科学中心刘青松药物学团队研发，是一种新型结构的具有自主知识产权的高选择性高活性FLT3激酶小分子抑制剂，能够在FLT3和cKIT激酶之间取得高选择性，从理论上避免了可能的骨髓抑制毒性等副作用。       在临床前动物模型上，HYML-122表现出良好的抗肿瘤效果和用药安全窗口，该成果于2015年12月2日在Journal of Medicinal Chemistry(《药物化学杂志》)上发表。已公布的1期临床试验结果展示：HYML-122在AML患者中具有良好的耐受性和药代动力学特征。         •  Luxeptinib是一种口服FLT3和BTK激酶抑制剂，对野生型和所有突变形式的 FLT3表现出有效的抑制作用，且在小鼠白血病模型中没有毒 性的情况下治愈 AML动物。同时，luxeptinib 对BTK酶的野生型和Cys481Ser(C481S)突变体形式以及其他在 B 细胞恶性肿瘤中起作用的致癌激酶途径表现出有效的非共价抑制，这表明luxeptinib可用于各种 B 细胞恶性肿瘤患者对共价或其他非共价 BTK 抑制剂具有耐药性/难治性/不耐受性。         •  BMF-500是Biomea Fusion基于其专有的FUSION系统开发的一种新型、口服、高效、选择性FLT3共价小分子抑制剂，用于复发或难治性急性白血病成年患者。此前研究表明，BMF-500潜在的脱靶风险较小，对活化的FLT3突变（包括FLT3-ITD和各种酪氨酸激酶结构域突变）具有皮摩尔级的亲和力。在携带FLT3-ITD突变的AML小鼠模型中，BMF-500使小鼠的肿瘤完全消退，且不需要持续暴露即可维持疗效。2023年5月，该药在美国获批临床。         •  NMS-03592088是一种新型、强效FLT3、KIT和CSF1R抑制剂，2023 AACR年会上公布的1期临床数据显示：该药在FLT3+ R/R AML患者中显示出临床疗效，包括既往FLT3抑制剂治疗失败的患者。         •  CLN-049和Emirodatamab均是CD3/FLT3靶向双抗，目前处于1期临床试验阶段。       总   结       FLT3作为急性髓系白血病（AML）药物研发的热门靶点，目前已有3款药物被批准用于治疗AML，此外至少有15款进入临床试验阶段。我国药企也积极布局FLT3靶点，且取得不错的成绩，其中东阳光药业的克立福替尼（Clifutinib）、石药集团的SKLB-1028和以岭药业的XY0206已进入3期临床，预计近几年有望获批上市。期待未来有更多的FLT3抑制剂获批上市，造福众多AML患者。       参考资料：       1.《聚焦药靶：挑战恶性血癌，靶向FLT3药物的最新进展》. 凯莱英药闻.2021-07-25       2.《新型急性髓系白血病治疗药物——FLT3靶向抑制剂概览》.制药在线.2023-03-24       3.《FLT3抑制剂的管线及专利调研报告》.智慧芽新药情报库. 2023-07-17智药研习社近期课程报名来源：CPHI制药在线声明：本文仅代表作者观点，并不代表制药在线立场。本网站内容仅出于传递更多信息之目的。如需转载，请务必注明文章来源和作者。投稿邮箱：Kelly.Xiao@imsinoexpo.com▼更多制药资讯，请关注CPHI制药在线▼点击阅读原文，进入智药研习社~

点击上方的 行舟Drug ▲ 添加关注小分子药物目前仍是治疗的主流，特异性治疗的生物药日益显示其优势，构成了对小分子药物创制和应用的挑战。小分子药物的优势是方便口服，患者依从性好。构建小分子药物的难点，是将药效、药代、选择性和安全性都融于化学结构之中。由于尺寸小，表面积不大，小分子药物就会对众多蛋白有不同程度的适配性结合，导致脱靶引起不良反应，在这个意义上选择性作用是首要的。在以靶标为核心构建和优化分子结构，又需要全盘顾及各个属性的要求，往往顾此失彼，达到全维度的优化实在勉为其难。本世纪的药物创制，广泛注入了分子生物学和结构生物学元素，涌现了新的策略和技术，并获得了成功，满足了患者的需求。例如共价结合药物，是在结构生物学指引下，将适度的“亲电弹头”连接在分子的恰当位置，在分子互补性的结合中，加以共价键不可逆锁定。分子生物学直接应用于抗体偶联药物（ADC）的研制中，抗体（A）作为载体和导向（药代），将毒性分子（D）传输到癌性细胞内，发挥杀伤作用（药效）。隔离的药效和药代分子实体靠连接基偶联（C）成ADC分子。PROTAC也是双功能分子，招募靶蛋白和泛素连接酶E3，形成三元复合物，犹如催化剂，使靶蛋白发生泛素化，导致被蛋白酶体降解。此外，近年来药物固定的配伍应用，在提高选择性、安全性、长效性和治疗效果方面也有长足进步，可视作不拘一格的物理合用的创新策略。本文列举一些成功实例，从药物化学和治疗应用的视角，简要讨论上述内容。关键词共价结合药物；抗体偶联药物；PROTAC；药物组合在药物治疗领域里，现今虽然仍以小分子药物为主流，但以特异性治疗为特征的生物大分子药物之崛起，日益显示其优势所在，构成了对小分子药物创制和应用的挑战。以方便口服而应用的小分子药物，集药效、药代、选择性和依从性等多种属性于化学结构之中，是其特点，也是难点。在以靶标为核心构建分子结构，需全盘顾及各个属性的要求，但往往顾此失彼，达到全维度的优化状态实在勉为其难。这其中最难驾驭的是由于脱靶作用而引起的不良反应，限制了治疗窗口，选择性作用显得格外重要。其实，过分拘泥于传统新药物分子实体（NME）的整合性创制理念，往往会削足适履而达不到目的，也延误患者之急需，在COVID-19的3年疫情中尤显迫切。本世纪出现的一些平台技术就是突破了传统的创制理念，将整合于一个结构之中的诸多属性，从结构或组成上作分割或分散性处理，整合为一个大分子或组方，已成为行之有效的策略。本文就某些成功上市的新药为例，简述为提高小分子药物的活性和选择性而采用的一些方法。1精准调节的共价结合基团既往的共价结合药物，大多是在小分子上连接亲电性较强的原子或基团，例如氮芥连接在L-苯丙氨酸的美法仑(1, melphalan)，以提高肿瘤组织摄入药物，其实并未达到对肿瘤组织是选择性摄入。至于至今应用的治疗睾丸精原细胞瘤的氮甲，即N-甲酰溶肉瘤素(2, N-formylsarcolysin)，只是偶然幸运发现而已。从生化上讲，人体布满了亲核性基团，不允许有强亲电的“虎狼基团”存在，避免受到共价键结合的化学侵害。因而长时间来，药物学家除抗肿瘤药物外避开共价结合药物的研究。分子和结构生物学的发展，为研制特异性共价键结合药物提供了结构依据，近些年来上市了不少高选择性共价结合药物。这类药物的共同特点是，基于设定靶标的结合腔或裂隙，设计或筛选出形状互补、电性（静电、氢键）互补、发生疏水-疏水结合的分子或片段，形成较强结合，在此基础上基于结构生物学提供的结合腔中重要亲核性基团的空间位置和性质，在配体分子的适当位置连接足以形成共价结合的相匹配基团，选择的亲电性无过无不及，是精准设计提高选择性的关键。1EGFR激酶抑制剂共价结合药物的研制特征 非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶发生变异，位点是L858R，导致癌细胞对这个信号通路的依赖而发展。对此单变异型激酶，第一代EGFR酪氨酸激酶抑制剂如吉非替尼（3，gefitinib）和厄洛替尼（4，erlotinib）成为治疗NSCLC一线治疗药。N1和N3分别与激酶发生氢键结合，C4连接的苯氨基结合于疏水腔，喹唑啉的6/7位处于酶开口处，用来修饰溶解性。但用药一段时间后60%患者出现耐药，是由于激酶的ATP结合位点的门户残基（gatekeeper）发生了T790M突变，突变逃逸了3和4的抑制作用。还由于3和4对野生型的EGFR激酶也有抑制作用，不能加大剂量。为克服耐药性研制了第二代“替尼”，是共价结合药物，为不可逆抑制剂，例如阿法替尼（5, afatinib）和达可替尼（6, dacomitinib）。化学结构类型基本不变，以适配于ATP结合腔，但在6位引入了有弱亲电性的不饱和酰胺，后者由于靠近激酶开口处的残基Cys797，从而在烯碳与巯基间发生麦克尔加成，共价键结合导致不可逆抑制。5和6提高了抑制双突变激酶的活性，因而对第一代药物发生耐药的患者有效。然而由于包括野生型在内的所有EGFR激酶开口处都有Cys797，降低了选择性作用，呈现不良反应。AstraZeneca公司为克服上两代“替尼”的耐药性，设定的目标是①对L858R和T790M双突变型的EGFR激酶(DM)选择性抑制；②不抑制野生型(WT) EGFR激酶；③不抑制胰岛素生长因子1受体（IGF1R）。为此，必需针对突变后生成的Met790的结构特征，使化合物强效结合ATP结构域，“超过”因T790M变异提高的与ATP结合力，所以，目标的本质是提高选择性：对双突变激酶高活性，对野生型激酶和IGF1R无或低活性。该公司完全摆脱了上两代的结构类型，普筛出化合物7对双突变激酶活性强于野生型近百倍（IC50(DM酶)=0.009μmol·L-1），然而对双突变细胞的活性降低了90倍（IC50(DM细胞)=0.77μmol·L-1），可能难以摄入细胞内，进而优化对DM细胞的活性，而且，7中加入亲电性基团，以期与酶开口处的Cys797发生共价结合（相同于第二代抑制剂）。经分子模拟，将亲电性基团丙烯酰胺连接在苯胺的间位，这是易于同Cys797的巯基发生共价结合的位置。合成的化合物8在细胞水平上对单突变（AM）和双突变（DM）的活性都强于野生型（WT）。化合物8与EGFR激酶结合的复合物晶体证明丙烯酰胺确实与Cys797形成了共价键结合。为改善物化性质对吲哚和对麦可尔基团作构效关系变换，优化出化合物9, 后者对双突变细胞的活性为IC50(DM细胞)=0.096μmol·L-1，对野生细胞活性很弱IC50(WT细胞)=23μmol·L-1，选择性高达240倍。为了提高共价结合的效率，将碱性和麦可尔基团分散在苯环的不同位置，化合物10对双突变细胞的活性为IC50(DM细胞)=0.0006μmol·L-1，对野生细胞活性IC50(WT细胞)=0.145μmol·L-1，溶解性为222μmol·L-1。然而10对胰岛素生长因子受体1有较高抑制活性，有潜在引起高胰岛素血症等不良反应。该脱靶作用的原因是IGF1R激酶的ATP结合域的门户氨基酸是甲硫氨酸，与耐药（双突变）EGFR激酶的门户氨基酸相同。这个脱靶作用对治疗剂量是个限制因素。从而对嘧啶环的4和5位取代基作进一步SAR优化，最终得到化合物11，对双突变细胞的活性为IC50(DM细胞)=0.015μmol·L-1，对野生细胞活性IC50(WT细胞)=0.480μmol·L-1，对IGF1R激酶IC50=2.9μmol·L-1，对hERGs钾通道的抑制作用很弱，IC50=16.3μmol·L-1)。化合物11确定为候选化合物，定名奥希替尼（osimertinib），经临床前和临床研究，证明对晚期非小细胞肺癌、特别是用一线替尼类药物治疗后疾病恶化的患者有效，于2015年11月美国FDA批准上市。2BTK激酶抑制剂共价结合药物的研制特征 在B细胞抗原受体的信号通路中，Bruton酪氨酸激酶（BTK）起着重要作用。BTK是Tec激酶家族的成员，为非受体型胞浆酪氨酸激酶，主要表达于造血细胞。与BTK同属于Src激酶家族的另一激酶，称作淋巴细胞特异性蛋白激酶（LCK），主要表达于T淋巴细胞，功能是调节免疫应答。BTK和LCK激酶的ATP结合域具有相似性，分子模拟表明结合位点大同小异，但BTK的残基为Cys481，LCK为Ser481，半胱氨酸巯基的亲核性强于丝氨酸的羟基，研制者基于这个差异用于设计并抑制出BTK选择性不可逆抑制剂伊布替尼（12, ibrutinib），于2013年经FDA批准上市。分子的主要骨架异嘌呤二苯醚定位于BTK激酶的AYP结合腔中，弱亲电性基团丙烯酰胺靠近Cys481，与巯基发生麦可尔加成反应。伊布替尼是治疗与B淋巴细胞相关的套细胞白血病的一线用药。AstraZeneca于2017年上市阿可替尼(13, acalabrutinib)是第二代BTK不可逆抑制剂。与伊布替尼相比，阿可替尼更具有选择性作用，是在结构优化中注重了降低对野生型 EGFR、Tec 的结合，避免了对正常激酶的脱靶，提高了靶标特异性并增强了 BTK 的效力，从而减少不良反应。阿可替尼用丁炔酰胺作为共价结合基团与 Cys481 的反应具有更高的选择性和体内靶标覆盖率，包括抑制 ERK、IKB 和 AKT 下游靶标的酪氨酸磷酸化，但不抑制正常EGFR、ITK 和 Tec 活性。 我国百济神州公司针对伊布替尼的口服生物利用度低(F<10%)，剂量大，治疗窗口较窄的缺点，而且对野生型表皮生长因子受体(EGFR)呈现抑制，引起皮疹和腹泻等不良反应，研制高选择性抑制剂。理念也是以竞争激酶 ATP 结合腔为作用模式，抑制剂模拟 ATP 腺嘌呤环，并变换杂环的结构骨架，设计了氨基吡唑酰胺类化合物，酰胺是为了形成分子内氢键，用假杂环模拟平面性稠合的嘧啶环[8]。在适宜的位置连接麦克尔加成基团，以实现不可逆抑制。经过数轮的 SAR 研究，研制出 BTK 新一代不可逆抑制剂泽布替尼(14, zanubrutinib)，于 2019 年经 FDA 批准在美国上市，成为治疗套细胞淋巴瘤和慢性淋巴性白血病/小淋巴细胞淋巴瘤的第三个有效药物。 泽布替尼与 BTK 激酶共晶结构显示，分子定位于 ATP 结合腔，酰胺基与铰链上 Glu475和 Met477 形成氢键网络，哌啶的氮原子也与 Met477 发生氢键结合，吡唑的氮原子经水分子(氢键)介导与 Lys430 的侧链氨基形成氢键，二苯醚的末端苯环与 Phe540 发生 T-型 π-π 相互作用，麦克尔基团与 Cys481 巯基的距离 2.9 Å，处于有利发生共价结合的范围。此外，酰胺基与哌啶氮的分子内氢键(图 1 中未示)也验证了最初模拟嘧啶酮结构的设想[9]。3含共价结合基团酮基酰胺的NS3蛋白酶抑制剂 丙肝病毒（HCV）是正链单链RNA病毒，其中NS3蛋白酶对丙肝病毒的生长和增殖具有重要作用，成为研制丙肝药物的靶标。NS3酶的水解机制是由三元体构成：N端的His57和Asp81，以及C端的Ser139。图2是Asp-His-Ser三元体催化水解肽键过程的示意图。三元体与底物形成氢键，提高了肽键羰基的亲电性，丝氨酸的羟基向羰基作亲核进攻，促进了肽键水解。设想抑制NS3蛋白酶的一个重要反应位点，是与该三元体结合，尤其希望与Ser139发生共价键结合。由于NS3水解多肽的活性中心表浅而无特征，为寻找先导化合物，将某些亲电性基团连接到长肽链中，例如醛、酮、三氟甲基酮和α酮基酰胺等，以得到有较强结合作用拟肽类先导物，然后简化和修饰成小分子化合物。发现十一肽化合物15的活性Ki=1.9nmol·L-1，亲电性基团酮基酰胺在十一肽的P1和P1′之间，这个位置很重要。15的相对分子质量为1265，距离口服吸收的物化和药代要求甚远，结构需要简化。化合物15的高活性，在于它与NS3活性中心的结构匹配，以及酮基酰胺的亲电性和所处的适宜位置并与丝氨酸残基发生形成共价结合而使复合物稳定化，如图3所示。将化合物15的C端4个氨基酸Met-Ser-Tyr-Ser-NH2切除，得到临近端点含有酮基酰胺的七肽酰胺（16），活性Ki=43nmol·L-1, 虽然下降25倍，但相对分子质量降低到796。16作结构简化，于P1′处引入一个苯基甘氨酸以增加P2′的疏水性，删除P4~P6的三个氨基酸残基，成为五肽的化合物17，Ki=98nmol·L-1, 活性低于16一倍，但相对分子质量又减少了100余。X-射线晶体学分析表明，P2的侧链接近酶的Arg155，后者应带有正电荷。但在抑制剂中引入羧基并未形成盐键，没有提高活性。设想P2可能与Arg155的亚烷基链发生疏水性结合。变换不同的烷基发现P2为较小的环丙基有利于结合，进而将P1′的烷基也变换成环丙基，得到化合物18，活性明显提高，Ki=15nmol·L-1，但对感染细胞未见活性，EC90>5μmol·L-1，原因可能是游离羧基的存在不利于进入细胞膜。进一步经过多位点变换，发现P2为二甲基环丙基并脯氨酸、P3为叔丁基甘氨酸并且氨基用叔丁氧羰基修饰，P2′的羧基制备成二甲酰胺以消除负离子和有利于穿越细胞膜，得到化合物19，活性为Ki=5nmol·L-1，对感染细胞的EC90=0.1μmol·L-119活性有明显提高，但药代性质不佳，生物利用度F=4%，达不到临床前最低要求（AUC≥1.0μmol·L-1·h，生物利用度F≥10%）这是因为分子仍然偏大，MW=725，仍需结构小型化。根据前面述及的去除P1′和P2′的甘氨酰苯基甘氨酸仍保持活性，将化合物19的这两个氨基酸删除，使α-酮基酰胺处于端点，并将一个叔丁基改为环己基，化合物20的活性Ki=25nmol·L-1，对感染细胞的EC90=0.4μmol·L-1，虽活性有所减弱，但分子尺寸显著减小，MW=532。对20的环丙基用其他脂环替换，发现环丁甲基活性最高，再扩环活性下降，提示对P1体积的恰当容纳度。P2处的偕二甲基环丙基并脯氨酸片段已优化为最佳状态。P3处的氨基变换为烷基、芳烷基、酰胺基、氨甲酰基、脲基、磺酰胺基或磺酰脲基，发现用脲基代替氨甲酰氧连接基，活性和其他性质最佳，遂将这些优化因素综合成化合物21。21的体外活性Ki=14nmol·L-1，对感染细胞的EC90=0.35μmol·L-1，MW=519，对HCV的NS3抑制活性强于人嗜中性弹性酶2200倍，有很高的选择性。21与NS3复合物单晶结构表明，两个叔丁基分别和S4与S3疏水腔发生疏水相互作用，P2的二甲基环丙基并脯氨酸片段采取弯曲构象，与酶的Ala156、His57和Arg155侧链发生最大程度的疏水性交盖，环丁基占据了S1腔，酮基酰胺的羰基与Ser139形成可逆的共价结合。定名化合物21为波普瑞韦（boceprevir），经3期临床研究证明对丙肝患者有显著治疗作用，于2011年经FDA批准上市。由Vertex和强生公司研制的替拉瑞韦(22, telaprevir)是与波普瑞韦同时研制的丙肝治疗药，于波普瑞韦批准10天后被批准上市，替拉瑞韦的作用靶标也是NS3蛋白酶，其研发策略也是以酶底物NS5A-5B为出发点，筛选出十肽类似物，后以含醛基的四肽作为先导物，由于醛基的亲电性过强，后演变成酮基酰胺的拟肽，作用机制与波普瑞韦相同，同酶的催化中心Asp139也发生可逆性的共价键结合。4含有机硼酸基团的蛋白酶体抑制剂硼替佐米 蛋白酶体(proteasome)与细胞内NF-κB讯号传导途径密切相关，由于NF-κB在炎症过程和肿瘤细胞的发生发展扮演重要角色，干扰NF-κB活化过程，可间接或直接地阻断炎症和促成肿瘤细胞凋亡。所以蛋白酶体是研发抗炎和抗肿瘤药物的靶标。哈佛大学的Goldberg在研究蛋白酶体抑制剂对细胞生长和增殖以确定其催化功能的过程中，发现三肽化合物苄氧羰酰-亮氨酰-亮氨酰-亮氨醛（23，MG-132）有抑制活性，Ki=4nmol·L-1。化合物23与蛋白酶体的复合物单晶结构分析表明，它连接在活性中心β亚基的N端，醛基与苏氨酸残基的羟基发生亲电加成，生成具有共价键结合的半缩醛，虽然是可逆性结合，但酶的活性受到强效抑制。化合物23的结构域P1、P2和P3都是异丁基，变换这些疏水片段以优化活性，发现P1位置仍以异丁基最佳，P2和P3变换为萘基，增强了活性，例如化合物24的Ki=0.24nmol·L-1，25的Ki=0.015nmol·L-1，提示增加P2和P3的疏水性有利于提高活性。然而醛基的化学性质活泼，可与多种亲核基团发生加成反应，选择性不高，例如对组织蛋白B（cathepsin B）和钙蛋白酶（calpain）也有抑制作用。为此，用其他亲电性基团，例如氯甲基酮和三氟甲基酮替换醛基，但未显示出活性。苯并噁唑酮（26, Ki=214nmol·L-1）和二酮酯（27, Ki=45nmol·L-1），活性显著低于化合物23。用硼酸置换醛基得到的化合物28，活性显著提高，Ki=0.03nmol·L-1强于先导物23大约100倍。硼元素处于周期表第3族，外层电子有一p空轨道，可与O和N的未偶电子对形成配位键。化合物27与蛋白酶体的活性中心N端的苏氨酸侧链的羟基发生的特异性配位结合，而抑制组织蛋白酶B的活性很低，Ki=6100nmol·L-1，弱于蛋白酶体20万倍硼酸。这是因为硼酸难于与半胱氨酸蛋白酶的巯基结合，因为B←S配位键是不稳定的。三肽硼酸28抑制蛋白酶体的活性达到10-11mol·L-1浓度，这样高的活性意味着为改善成药性而变换结构可有较大的余地，例如降低三肽的分子尺寸。其实，减少一个氨基酸残基成二肽醛（29）仍有抑制蛋白酶体活性，Ki=1600nmol·L-1，而且对丝氨酸蛋白酶不显示活性，提示二肽醛仍具有选择性作用，尤其是当P2结构域为萘环时，含硼酸基化合物30的活性提高，Ki=97nmol·L-1，选择性显著提高，化合物31的Ki值为0.62nmol·L-1。由三肽28（MW=491）简化为二肽31（MW=384），分子量降低了107，活性虽然有所降低，仍在高活性范围，而且对人的其他蛋白酶如白细胞弹性酶、凝血酶和组织蛋白酶等活性很低，表明对蛋白酶体具有高选择性抑制作用。由于化合物31具有优良的活性和成药性，确定为候选化合物，定名为硼替佐米（bortezomib），经临床前和临床研究，硼替佐米于2003年FDA批准上市治疗多发性骨髓瘤。5铁螯合物改变头孢药物的抗菌谱 革兰阳性致病菌由一层细胞膜构成，而阴性菌由外膜和内膜双层结构构成，阴性菌更难以摄入药物，因而抗革兰阴性菌的药物较少。日本盐野义公司基于细菌增殖生长需要从宿主细胞摄取铁离子，是靠细胞壁上的载铁蛋白转运摄入菌体内。Ito等利用该蛋白的嗜铁属性，合成了含有儿茶酚和噻唑结构的头孢菌素，研发出头孢德罗(32, cefiderocol)。分子低能构象儿茶酚和噻唑环在空间上的靠近容易螯合铁离子成33，33被载铁蛋白结合经主动转运摄入，就这样携带着抗菌的头孢进入菌体内，后者与青霉素结合蛋白作用，阻断细胞壁的合成而杀死细菌。32对多种有氧阴性菌（包括多药耐药菌）抑制活性MIC50<2μg·mL-1，具有可克服碳青霉烯类抗药性3种主要机制（孔蛋白通道改变、β-内酰胺酶失活、外排泵高量产生）的独特能力。临床显示对复杂尿路感染以及难治的肠道感染疗效显著，头孢德罗于2019年经FDA批准上市。2变构抑制剂1变构调节 变构调节(allosteric modulation)是指小分子化合物与酶蛋白分子活性中心以外的某一部位特异结合，引起酶蛋白分子构象变化、从而改变酶的活性。经变构结合而激活酶活性的称为正向调节，即激动剂，比如酶的辅因子；抑制酶活性的负向调节即变构抑制剂(allosteric inhibitor)。变构位点与酶活性中心的位点相隔离，之间没有竞争性结合，所以变构抑制剂对活性中心发生变异的蛋白仍然有疗效，也为联合用药提供了选择。变构抑制剂作为药物的最大优势是提高选择性，酶或受体多存在同工酶和亚型，结构和功能的差异较小，导致结合于活性中心的化合物(正构药物)而缺乏选择性作用，变构结合腔则各有不同，避免了脱靶作用。2KRAS突变在实体瘤的变构药物 RAS基因家族编码的鸟苷三磷酸酶(GTPase)包括NRAS、HRAS和KRAS，对细胞生长和增殖扮演重要角色。KRAS是最常见的肿瘤驱动基因之一，在人癌的突变率占30%, 最常发生的是G12C-KRASG12C变异。虽然以RAS为靶标的药物研究已30多年，但因该蛋白缺乏适宜的结合腔穴而成效甚微，被认为是非成药性靶标。该KRASG12C隐藏在变构腔穴中。2.1 利用变异的半胱氨酸的亲核性垂钓先导化合物Patricelli等用带有弱亲电基团的化合物探索与隐藏的Cys12发生共价结合，以发现与变构位点有结合力的苗头和先导物，发现Cys12隐藏于H95/Y96/Q99构成的结合腔内（图4）。苗头化合物经过优化得到化合物ARS-1620(34)，p-ERK-IC50=0.831μmol·L-1(p-ERK指细胞外调节蛋白激酶的磷酸化，是将信号从表面受体传导至细胞核的关键步骤)。安进公司也以同样的策略优化出化合物35，p-ERK-IC50=0.220μmol·L-1。2.2 先导物优化和索托拉西布的成功35的口服生物利用度低，而体内清除率很高，安进公司比较了34和35的结合模式发现34的喹唑啉环结合于H95的隐性腔内，从而设计了通式为36化合物系列，Y处引入疏水性片段是34所没有的，根据是利用结构生物学提供的信息。用生化和细胞活性评价化合物的活性，发现37活性最强，酶-IC50=0.101μmol·L-1, 细胞p-ERK-IC50=0.335μmol·L-1。分析37与KRASG12C复合物晶体结构（图5），发现喹唑啉酮、7位连接的取代苯和哌嗪的2位还有可优化的空间，从而变换了这些位置的原子或基团，例如7位连接不同取代基的苯环，萘环苯并咪唑杂环，喹唑啉酮8位的氮杂，哌嗪2位的甲基取代等，在不同的组合中，对化合物在酶、细胞、选择性、过膜性(MDCK)、溶解性、小鼠的生物利用度、清除率、分布容积和半衰期等多参数进行比较，优选出38的R-异构体。38产生光学异构的原因是喹唑啉酮与异丙基苯的单键旋转受到阻碍，R和S活性有较大差异。然而克服阻转的活化能并不很高，ΔG‡=26kcal·moL-1，25℃半衰期(t1/2)=8天，说明不能得到稳定的纯优映体。为解决这个阻转异构，采用的策略是提高旋转异构的能垒，使ΔG⧧>30kcal·moL-1，以得到稳定的立体异构体；或降低旋转异构的能垒ΔG⧧<20kcal·moL-1，成为可以自由旋转的混合物，或者设计没有手性轴的分子。研制者设计了两种方法测定化合物的阻转异构问题：用变温核磁（VT-NMR）测定快速旋转异构的化合物；用时间过程1H-NMR的变化测定慢速旋转异构的化合物。在系列变换异丙基苯中发现4个化合物有较强的活性和稳定的阻转异构体，结构与数据列于表1中。动物实验表明R-39的药效和药代性质优胜，但在解决多晶性时发现晶型比原先用的无定形粉末的生物利用度降低了10%，这对于控制血药浓度是不利的。为解决R-39的这个问题，再做结构优化：通过降低喹唑啉酮环上亲脂性和提高R-39的极性表面积，例如用吡啶代替苯环等，最终发现了化合物44，其R-构型活性显著强于S型，二者的阻转异构的自由能垒ΔG⧧>31kcal·moL-1, 25℃下t1/2>180年，提示R-44是非常稳定的优映体。图6是R-44与KRASG12C的结合图。R-44定名为索托雷塞(sotorasib)，临床研究表明治疗小细胞肺癌有很高的应答率。2021年FDA批准为首款治疗KRAS变异的靶向药物。Figure 6 Binding diagram of R-44 to GDP-KRASG12C3变构抑制剂阿思尼布的研制 慢性粒细胞白血病(CML)是血液干细胞过度增殖发生的，由于第22号和第9号染色体交互易位，导致22号染色体变短（被称作费城染色体），成为人类癌症与基因变异之间关系的最早的证据。染色体易位的分子基础是Bcr–Abl编码的蛋白酪氨酸激酶过于活化所致。所以，抑制Abl酪氨酸激酶的活性，阻止ATP对蛋白的磷酸化治疗CML。伊马替尼成为最早以分子靶向为目标的抗癌药物。在这以后上市了不少针对Bcr–Abl发生变异的CMC药物，但都是以抑制ATP结合为特征，因而发生普遍的耐药性问题。诺华公司基于Abl激酶C端半段处存在变构区域，天然变构底物是正十四烷酸(豆蔻酸)，为正向调节剂，参与酶功能的自调节作用。诺华公司根据伊马替尼-Abl1晶体结构的特征，用核磁共振15N, 1NH-HSQC分析了化合物与激酶变构区的信号，测定C端螺旋-1的构象，特别是Val525的信号变化，以评价化合物的结合状态，通过基于片段的分子筛选发现了与豆蔻酸竞争结合变构位点的两个苗头物45和46，但都没有抑酶活性。去除影响45和46结合的酯基和正己基（在变构腔中会与螺旋-1发生碰撞），通过基团的变换连接45和46，得到化合物47虽然有结合作用但仍没有活性（没有影响螺旋-1中Val525的信号变化），将二氯换成三氟甲氧基化合物48，根据是借用了化合物GNF2含有的OCF3基团（GNF2对BL SH3/2/1的活性很高，IC50=0.009μmol·L-1），拉电子的OCF3基团将螺旋-1诱导成非活性构象，48呈现出细胞活性（GI50=8μmol·L-1），核磁共振的Val525信号明显降低。进而对中间的苯基取代基和哌嗪环变换，49的结合与抑制细胞活性明显提高。48的结合模式显示吗啉环电荷密度分散，影响结合作用，从而变换为芳香环提高疏水结合作用。化合物50通过嘧啶环和3-羟基吡咯烷基的引入。活性大幅提升(Kd=0.023μmol·L-1；GI50=0.017μmol·L-1)。与变构区的晶体结构显示，CF3中的一个氟原子（对称的三氟之一）与变构区的亮氨酸L359的羰基发生不利的正交极性相互作用，从而用氯原子取代OCF3中的一个氟原子实现了活性的进一步提升，再用吡唑环代替嘧啶环降低了与hERG钾通道的结合，最终研制出ABL1变构抑制剂51，定名为阿思尼布(asciminib)。51对重组BCR-Abl1的Luc-Ba/F3细胞生长半数抑制率(IC50)野生型和T315I突变型分别为1和25nmol·L-1，临床结果表明对既往接受治疗费城染色体阳性慢性髓系白血病(Ph+CML)的耐药患者有治疗效果，于2021年获FDA批准。图7显示了变构药物阿思尼布和正构药物尼罗替尼(nilotinib)与BCR-Abl1结合位点的区别，前者结合于变构区，后者占据ATP结合区。4氘可来昔替尼的研制 4.1 TYK-2激酶的JH2结构域是变构位点Janus激酶家族是非受体型酪氨酸激酶，包含JAK-1、JAK-2、JAK3和TYK-2等4个亚型，分别结合于膜上细胞因子受体的胞内域，导致Janus激酶催化转录蛋白的信号转换因子和激活因子发生磷酸化，再经二聚化转移至核内。其中TYK-2与JAK-2二聚化调节白介素IL-12和IL-23信号通路，是炎症和免疫性疾病重要蛋白靶标。抑制TYK-2激酶对某些自身免疫性疾病有治疗作用，例如多发性骨髓瘤、溃疡性结直肠炎和牛皮癣等。该靶标重要之处还在于抑制TYK-2不影响免疫系统，不增加真菌感染的风险，这与JAK-1和JAK-2抑制剂因免疫力下降而发生真菌感染有明显区别。由于JAK家族的催化结构域（JH1）的高同源性，以此作靶标难以实现选择性作用。而TYK2存在有与JH1结构域相邻但无催化活性的假激酶结构域（JH2），成为实现选择性的突破口。Tyk2JH2与Tyk2JH1非常相似，但两个结构域的结合腔有差异。Tyk2JH2与ATP的结合非常弱，Kd=24μmol·L-1。4.2 已上市的Janus激酶抑制剂药物自2011年首创的泛JAK激酶抑制剂问世以来，在本品之前已有8个药物上市，表2列出的52~59都是JAK-1/-2/-3单一或组合靶标的抑制剂，对TYK-2没有或弱活性。这些药物有引起免疫力下降的不良反应。4.3 变构位点的抑制剂TYK2蛋白质具有多个结构域参与分子间和分子内的相互作用，其功能是介导受体的催化结构域的激活。TYK2中存在一个伪激酶结构域JH-2，本身没有催化活性，但通过自抑制作用，在调节受体介导的邻近催化结构域JH1的激活中却发挥关键作用。此外，自然杀伤(NK)细胞对肿瘤的监测也需要TYK2，但无需TYK2的激酶活性。若小分子将TYK2伪激酶结构域JH-2的构象稳定在阻止与激酶结构域JH-1之间的自抑制相互作用，就可阻断受体介导的激活和催化结构域的活性。这种稳定化作用导致下游信号转导被阻断。4.4 研制过程BMS对公司化合物库做高通量筛选，发现化合物60对TYK-2JH2有一定的活性和选择性，用人和小鼠肝微粒体温孵有较高的代谢稳定性，作为苗头化合物，首先对C3的酰胺基作变换。酰胺的单甲基化物61的活性虽然略有下降，但对TYK-2JH2选择性提高了。61与TYK-2JH2复合物单晶结构显示经氢键网络固定在JH2铰链处，C3酰胺上的甲基适配于邻近Ala671形成的“丙氨酸腔”。由于多数激酶此处的氨基酸尺寸都大于丙氨酸（数百个激酶中只有9个是Ala），这就解释了为什么60对JAK1/2也呈现结合，而61明显降低了。下一步优化61，考察母核C4经NH连接的苯甲酰胺的变换对活性的影响，化合物62对TYK-2JH2和细胞活性，都显著强于61，62的过膜性和对人和小鼠肝微粒体的稳定高于61。62曾作为高活性分子，进行了深入研究，发现肝微粒体对其有较强的代谢作用，证明是母核3-甲氨基酰基被氧化代谢失去甲基，预示该代谢产物因选择性降低而脱靶。为证明这个推断，合成62的N-氘代甲基化合物提高代谢稳定性。这个同位素效应用在了以后的优化上。在优化61时发现了63活性和选择性进一步提高，一是4′′位引入甲基消除抑制c-Kit作用；另一是2′-甲氧基-3′-取代的酰氨基片段，对TYK-2JH2的IC50为0.3nmol·L-1。化合物63与TYK2JH2复合物单晶衍射分析表明，3′的酰基氧原子与Arg738侧链的H-N形成氢键(3.1Å)，酰胺的N-H与2′-OCH3的氧原子形成分子内氢键，赋予N-吡啶甲基处于开阔的腔穴中。为了克服酰胺的代谢或化学的不稳定性或构象的异变性，63的C3′连接的酰胺片段用芳杂环置换。在药物化学中，常常用五元芳杂环对酰胺片段作骨架迁越，并确保N或O或NH作为氢键的接受体或给体的存在。SAR研究发现1-甲基-1, 2, 4-三唑化合物64对IFNα细胞活性高(IC50=4nmol·L-1)。此外对小鼠肝微粒体的代谢稳定性也很高，选择性作用也很强，64对260种激酶的抑制活性很低，低于对TYK-2JH2活性的1000倍，其中包括JAK-1/-2/-3酶的JH-1结构域的活性。然而64对hERG钾通道有一定的抑制作用，IC50=31μmol·L-1，仍需继续优化。下一步的结构改造是保持活性和选择性，改善过膜吸收和代谢稳定性，经过多轮优化，母核吡啶换成哒嗪环，6位的氨基芳杂环换成环丙基甲酰胺基，3位的甲胺酰基换成三氘代甲基，得到的化合物65过膜性强，保持了酶和细胞的高抑制活性，代谢稳定性高，半衰期可达120min，对hERG钾通道没有抑制作用，65作为候选物定名为氘可来昔替尼(deucravacitinib)，经临床研究证明口服治疗中/重型斑块状银屑病，于2022年FDA批准上市，成为首创的作用于TYK2的口服治疗银屑病的新药。图8是氘可来昔替尼与TYK2JH2蛋白复合物晶体结构，哒嗪环连接的C6胺基和C3酰甲胺基与酶的JH2域的铰链区形成三重氢键结合，环丙基在铰链区的延伸处，氘代甲基结合于TYK2JH2特有的丙氨酸腔穴中（Ala671），三唑与Arg736直接氢键结合。C2′的甲氧基与Lys642氢键结合，并处于蛋白C端的表浅的疏水槽内。3抗体偶联药物1组成 抗体偶联药物(ADC)是由单克隆抗体(mAb)和毒物（payload，本文称药物）经连接基（linker）共价结合为单一分子。设计ADC策略是基于单抗的高特异性靶向能力并作为运载体，将本来缺乏靶向能力的强效杀伤药物，经连接基成为单一分子。ADC靶向靶细胞，内化进入肿瘤细胞，溶酶体将药物释放，与靶标（蛋白或核酸）强效结合，实现了对癌细胞的高效精准杀伤。所以，ADC是利用单抗对携带有相应抗原的肿瘤细胞的选择性，利用药物对肿瘤靶标强效的杀伤性，在靶细胞内利用生化或化学反应释放出强效药物而杀伤，所以ADC也可认为是潜伏化的大尺寸前药（prodrug），实现选择性。自第一个ADC药物Mylotarg®（gemtuzumab ozogamicin，奥加米星吉妥组单抗）于2000年获得FDA批准以来，截至2022年全球共有11款ADC药物获批，用于血液系统恶性肿瘤和实体瘤，此外，目前还有100多个ADC候选物处于临床试验的不同阶段。图9是ADC作用机制的示意图。表3中列出了经FDA批准上市的ADC药物，为了叙述药物的结构特征，将ADC“还原分解”成三部分：单抗（antibody）、连接基（linker）和药物（payload）。以示连接的方式，读者也容易连接成ADC。表中DAR(drug-antibody ratio)代表每个单抗分子缀合药物分子的平均值，是ADC效率的一种量度。奥加米星吉妥组单抗：ADC内化后，腙键可以在内涵体酸性环境中水解，释放出卡奇霉素的前体，然后被谷胱甘肽还原为游离的活性卡奇霉素。后者与DNA小沟结合，并经过Bergman环化作用，从而产生高反应性双自由基，引起序列选择性的DNA双链断裂。维布妥昔单抗：连接基可裂解。ADC结合CD30后内化，转运到溶酶体。溶酶体中蛋白酶裂解出药物释放到胞浆中将细胞杀伤。恩特曲妥珠单抗：连接基是不可裂解的。4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(MCC)连接于单抗的Lys上。溶酶体内的蛋白酶只逐步将抗体水解，遗留下Lys-MCC-美坦新(Lys-MCC-DM)，美坦新带着连接基与微管蛋白结合，抑制微管的正常组装。伊组单抗奥加米星：连接基含有腙片段，在偏酸性癌细胞中裂解，释放出卡奇霉素，后者在亲核基团作用下，烯二炔电荷转移环合，生成1, 4失氢双自由基，与DNA共价嵌合，抑制细胞周期。维泊妥组单抗：蛋白酶可裂解二肽连接基缬氨酸-瓜氨酸，后者又分解出对氨基苄醇，与微管抑制剂单甲基auristatin E（MMAE）共价结合的氨基甲酸酯对酸也敏感。维恩妥人单抗：连接基可酶解断裂。马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸(MC-Val-Cit)连接在抗体的半胱氨酸残基上，内吞后经溶酶体的蛋白酶水解，释放出药物MMAE。德曲妥珠单抗：连接基可裂解。四肽GGFG溶解性较好，与药物连接点为氮杂缩甲醛，在偏酸性的癌细胞中容易分解，释放出药物。戈沙妥珠单抗：Trop2是肿瘤相关钙信号转导2受体，该受体在三阴性乳腺癌中高表达。药物是喜树碱类拓扑异构酶I抑制剂SN-38，与连接基结合位点是敏感的C16羟基，经碳酸酯连接，对酸性是敏感的。玛贝妥单抗：BCMA单抗为无岩藻糖基化单克隆抗体，抗体的半胱氨酸残基连接马来酰亚胺己酰基，连接基与MMAF偶联。与抗原结合后在Fc区被岩藻糖基化，增强了内化后的细胞毒性。替朗妥昔单抗：连接基为酶可裂解的缬氨酸-丙氨酸和增加水溶性和稳定性的聚乙二醇，连接的药物是非对称的吡咯并苯并二氮杂卓（PBD）二聚体。释放出的二聚体与DNA嵌合。维替索妥人单抗：组织因子(TF)是参与肿瘤信号传导和血管生成的蛋白质，多数实体肿瘤中TF高表达，所以是ADC药物的理想靶标。连接基可裂解，连接药物单甲基奥瑞他汀E（monomethyl auristatin E），本品用于治疗宫颈癌，有望治疗多种实体瘤。索米妥昔单抗：FAα在卵巢中高表达，内化后连接基被裂解，释放出的药物美登素(ravtansine, DM4)阻断胞内微管网络形成，抑制细胞增殖。2连接基的设计是药物化学的主要任务 研制ADC旨在满足临床需求。选定病种，确定变异的抗原，选择已经批准的相应单克隆抗体，这是研制ADC的切入点。例如针对高表达叶酸α受体的卵巢癌，Mirvetuximabsoravtansine公司确定了叶酸α受体单抗为载体，研制成功了继PARP抑制剂奥拉帕尼等靶向药物后的首个治疗抗耐铂类药物的卵巢癌药物索米妥昔单抗(77)。日本第一/三共制药基于多种实体瘤高表达HER2蛋白，因而选择HER2为靶标的单抗，研制成功的德曲妥珠单抗(72)，已经批准数个实体瘤适应症（乳腺癌、胃癌、结直肠癌和非小细胞肺癌等）。选定靶标和单抗主要是临床医生和分子生物学家的任务。在药物(payload)方面，上市的ADC都是本身难以成药的细胞毒物，在基因水平上摧毁细胞增殖的毒性分子，ADC的单抗赋予了这些毒物以选择性—主要对癌细胞的DNA/RNA的复制或表达，终止了细胞周期。因而，构建连接基(linker)在一定意义上成为研制ADC的药物化学重点。内容包括：①ADC分子中药物-抗体比值(DAR)，即每个单抗连接的药物分子数，已上市的DAR=2~8。DAR值过低作用强度不够，过大有失稳定性风险；②稳定性，是连接基的最重要使命。要求在到达靶组织之前的循环血中ADC保持化学结构稳定不变，不得有游离药物的泄露，避免毒副作用；③释放性，要求ADC内化癌细胞后连接基迅速裂解（酶或化学分解），癌细胞浆偏酸性，是含有腙基(66、67、69)、对氨基苄醇酯片段(70、71、73、75、76)和氮杂缩甲醛(72)容易裂解的位点，蛋白酶可水解含有缬-瓜二肽(70、71)和甘-甘-苯丙-甘四肽(72)片段，肽结构还有助于水溶性。含有聚乙二醇的73和75更有利于溶解性。68的连接基是不可裂解的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(MCC)与单抗的单抗的Lys连接，溶酶体内的蛋白酶只逐步将抗体水解，留下Lys-MCC-美坦新(Lys-MCC-DM)，后者与微管蛋白结合，抑制微管的正常组装。4特异性降解靶标蛋白的蛋白水解靶向嵌合体1原理 上一节讨论的ADC是类双功能分子：单抗是导向载体，药物杀伤靶标和细胞。本节讨论的蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）也是双功能分子, 也是由三部分组成：靶蛋白配体、E3泛素连接酶配体和连接基组成，但属于小分子范畴。PROTAC能特异性结合靶蛋白，同时募集并结合E3泛素连接酶，后者催化靶蛋白多聚泛素化、被泛素化的靶蛋白通过被蛋白酶体系降解成氨基酸和寡肽。简言之，PROTAC将靶蛋白和E3连接酶（E3ligase）结合成三元复合物：靶蛋白-PROTAC-E3连接酶，此时E3连接酶介导E2泛素结合酶将靶蛋白泛素化。三元复合物解离，PROTAC复原，被泛素化的靶蛋白被输送到蛋白酶体中降解，降低了靶蛋白水平。复原的PROTAC分子作新一轮的催化结合，循环多次，理论上没有消耗。PROTAC是小分子化合物，可以口服是一大长处。而又不是一般药物靠占据/结合靶标活性（或变构）位点作“消耗性”起效，而是在借助双配体的介导，靠蛋白酶体发生降解靶标蛋白的事件，这个过程即使PROTAC结合靶蛋白/E3酶的作用较弱，或浓度较低也同样能够发挥作用，加之其“催化”的特性，是通常药物所不及的。当然，活性强是获得最大降解水平(Dmax)（>90%）和低半数降解浓度(DC50)。为此，两种配体对靶蛋白和E3酶的强效亲和力是产生高Dmax结构基础。通过微调配体的结构、连接基的组成、长度和刚性以优化摄入细胞改善DC50。2现状 PROTAC在全球药企和大学研制的很多，但迄今还没有被批准上市的药物。目前处于临床研究的共24个，6个在II期和I/II期的列于表4。本文仅以PROTAC技术发明人Crews创始的Arvinas公司研制的ARV471（78）和ARV110（79）为例简述PROTACD的化学特征，这是目前已经完成II期临床研究处于领先的项目。两个候选物分别是雌激素受体降解剂（SERD）和雄激素受体降解剂（SARD）。分子的左侧（红色）是结合雌/雄激素受体的配体。两个配体（片段）分别借鉴雌/雄受体调节剂（SERM/SARM）的结构优化或简化而来，例如78与他莫昔芬（84, tamoxifen）骨架79与比卡鲁胺（85, bicalutamide）骨架具有结构相似性。目前研制PROTAC的靶蛋白配体的结构大都源自于已有的药物或活性物。与E3连接酶结合的配体是免疫调节酰亚胺药物(IMiDs)，分别是泊马度胺和来那度胺的类似物。它们高选择性地结合于E3连接酶CRBN，促进靶蛋白的多聚泛素化。PROTAC连接基与ADC不同，是稳固的共价结合片段，确保化合物的稳定性。为了保障良好的物理化学性质，连接基多为亲水性片段，78和79是哌啶甲基哌嗪。ARV-471的II期临床表明单药治疗ER+/HER2-乳腺癌患者显示良好的耐受性和38%的临床获益率（完全缓解率、部分缓解率或疾病稳定率>24周），优于氟维司群效果，达到了试验的主要终点。ARV110（79）的I期和II期临床试验结果显示, 在治疗携带AR T878X/H875Y（T878X=T878A或T878S）突变的转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）患者中表现出强力抗癌活性。在安全性上II期临床试验推荐剂量表现出可控的耐受性。5非药化途径提高药物选择性小分子药物集活性、选择性、合理药代和安全性于化学结构之中，实在勉为其难。即使多轮结构优化，也未必体现了全优属性，顾此失彼和退而求其次的通融倒是常态。但即便如此，还存在难以消除的缺点，在难以从结构层面上克服时，用另一药物消除、缓解和抵消不利因素，提升治疗效果也是一种策略。1熟知的药物配伍 现已应用较少的磺胺类抗菌药主要从尿中排出，但由于磺胺的偏酸性在尿液中溶解度低，容易发生结晶尿和在肾脏沉积，造成肾脏损伤，因此磺胺药同时服用碳酸氢钠，提高尿液pH值，增加在尿液中的溶解，这是改善药物排泄的历史悠久的例子。另一与磺胺配伍应用的是磺胺增效剂，例如甲氧苄啶（trimethoprim）是叶酸合成酶抑制剂。人体的叶酸是作为维生素从膳食中获得，而细菌的叶酸需从对氨基苯甲酸（PABA）和谷氨酸合成，磺胺的抑菌作用是PABA的抗代谢物；甲氧苄啶抑制叶酸的合成，所以同时服用磺胺和甲氧苄啶是从两个环节抗菌的。甲氧苄啶虽称作增效剂，也可作为抗菌药单独应用。久用β-内酰胺类抗生素引起的耐药菌的因素之一是细菌产生β-内酰胺酶，催化水解β-内酰胺环使药物失效。同时服用β-内酰胺酶抑制剂可维持抗生素的抗菌作用。克拉维酸（86，clavulanic acid）与阿莫西林或替卡西林的复方、舒巴坦（87, sulbactam）与头孢哌酮的合用，他唑巴坦（88, tazobactam）与哌拉西林的配伍都是常用的抗菌复方。2新的范例 Covid-19引发的全球3年疫情催生了辉瑞公司抗新冠病毒药物帕克洛维（Paxlovid）的研制，美国FDA于2021年12月批准上市。帕克洛维是一款固定剂量组合的复方制剂，它含有两种活性物质奈玛特韦(89, nirmatrelvir)和利托那韦(90, ritonavir)，两药各司其职，主药奈玛特韦抑制新冠病毒增殖（药效），辅药利托那韦延长主药的作用时间（药代）。冠状病毒普遍存在3C样半胱氨酸蛋白酶(3CLpro)，功能是整合和处理众多的原蛋白，是病毒增殖的重要酶系。辉瑞公司筛选出苗头化合物并改构得到含酮基的二肽，酮基作为亲电基团可与3CLpro的Cys145发生共价结合而抑制3CLpro。经多轮优化最终研制出89，是含有脂肪氰基的拟二肽，氰基可与Cys145共价结合成硫代亚胺酸酯，强效抑制酶活性和病毒复制。然而奈玛特韦在体内迅速被细胞色素CYP3A4代谢失活，研制者选用已上市的CYP3A4强效抑制剂利托那韦辅助用药，可将奈玛特韦的体内半衰期延长到6h，因而规定帕克洛维每隔12h服用一剂，两药分别履行药效与药代，共同维持治疗效果。3治疗心衰的双分子结合药物Entresto 2015年7月美国FDA批准诺华公司的复方制剂心衰药物Entresto上市（中文商品名诺欣妥），治疗慢性心力衰竭，这个复方制剂是以多种方式作用于心脏的神经内分泌系统，治疗效果与标准疗法比较，显著地降低心衰患者的死亡率，被认为是20多年来心衰治疗药的重大突破。Entresto是由沙库巴曲（91, sacubitril, 49mg）和缬沙坦（92, valsartan, 51mg）组成。沙库巴曲的作用靶标是抑制一种中性内切酶（neprilysin），后者是降解血浆中心房利钠肽（artrial natriuretic factor, ANF）的水解酶，因而沙库巴曲使内源性ANF肽维持在一定的水平，保护心脏的神经内分泌系统，有利于心衰患者；缬沙坦是血管紧张素I受体阻断剂，抑制AngⅡ的升压作用，阻断患者的过于活跃的肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）。复方制剂Entresto中的沙库巴曲是以新分子实体（NME）首次上市的，就与1996年就已上市的缬沙坦配伍，两个都是主成分，不同的药理作用的各司其职的互补性，使得Entresto在治疗心衰患者成为划时代的突破。Entresto在剂量设计和分子结构上也很有特色：两个成分的治疗剂量恰好是等分子比量；与钠离子形成配位键结合以及分子内和水分子间的氢键网络，构成了稳定的超分子结合的共晶结构。图10是共晶复合物结构。每个共晶体由6个沙库巴曲负离子，6个缬沙坦负离子，18个钠离子和15个水分子构成，分子式为C288H330N36Na18O48·15H2O，分子量为5748.03，为白色六边形片状结晶形粉末，熔点138℃。复合物在固态和pH5~7的水溶液是稳定的。4治疗成人重度抑郁症的Auvelity 2022年08月FDA批准了Axsome Therapeutics公司研制的复方缓释片剂Auvelity，用于治疗成人重度抑郁症，这是60多年来首款具有新作用机制的抑郁症口服药，提供了起效迅速的新疗法。在用药1周之后，抑郁症状就得到显著改善；2周以后，每个阶段的缓解率都显著更高，实现了快速、持久且显著改善抑郁症状。这个划时代成功制剂却是由两个已知药物组成的：右美沙芬（93, dextromethorphan HBr, 45mg）和安非他酮（94, bupropion HCl, 105mg），竟成为唯一被批准用于重度抑郁症的口服速效N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂，全新的作用机制。Auvelity治疗作用的确切机制有待深入解析。这个组合中，右美沙芬是非竞争性NMDA受体拮抗剂，同时也是阿片σ受体激动剂，可调节谷氨酸能神经传递。安非他酮是去甲肾上腺素和多巴胺再摄取抑制剂，还竞争性抑制细胞色素CYP2D6，后者阻断了右美沙芬的体内代谢降解，因而提高了生物利用度。研究表明Auvelity的血液水平是由两个药物之间独特的药代动力学相互作用决定的，在稳态时发现这种相互作用是非线性的。5消除抗精神病药物的不良反应 现有抗精神病药最常见的不良反应为引发锥体外症状，代谢紊乱和增重等，患者的依从性较差。Karuna Therapeutics公司研制了口服新型组合药物KarXT，是由呫诺美林（95, xanomeline）和曲司氯铵（96, trospium chloride）组成，呫诺美林是毒蕈碱受体激动剂，曲司氯铵是毒蕈碱受体拮抗剂。这种配伍旨在激活大脑中的毒蕈碱型乙酰胆碱受体的同时，减少对外周毒蕈碱型乙酰胆碱受体的作用。呫诺美林是毒蕈碱M1/M4受体选择性激动剂，对M2、M3、M5受体作用较弱，由于容易透过血脑屏障，皮质和纹状体的摄取率较高，是目前选择性很高的M1/M4受体激动剂。但因有外周作用引起胃肠和心血管系统不良反应。曲司氯铵为毒蕈碱全M受体拮抗剂, 属于抗胆碱能类化合物, 可松弛膀胱平滑肌，单独应用治疗膀胱过度活动症和急迫性尿失禁。由于结构中存在季铵离子难以穿越血脑屏障和进入中枢神经系统，所以只是外周毒蕈碱受体拮抗剂，因而服用KarXT不影响呫诺美林的药效，反而降低了对外周的不良反应。III期临床表明，口服KarXT可治疗精神和神经系统疾病，包括精神分裂症和阿尔茨海默症中的精神症状，由于减轻了不良反应，患者对KarXT的依从性也较好，有望成为50年来首个具有新颖且独特的双重机制的药物组合，通过不依赖多巴胺能或血清素能途径来治疗严重精神疾病的症状的药物。— 小结 —  提高创制药物的活性和选择性，无论是首创性或跟随性创新，都是以满足患者需求为前提、以靶标为核心的科技实践，它是由众多环节构成的价值链组成，这其中隐含着3个要素，即确证致病的分子机制、把握疾病的微观特征、阐明药物作用的分子机制，体现了生物学驱动研制的内涵。这3个要素的共同特征是把宏观的表象转化为微观的分子特征及其变化。始于设定并确定靶标分子是致病的根源，终于药物呈现的疗效是干预致病靶标的结果。靶标是致病分子机制的核心。然而将一种疾病“提炼”或归结成一个靶标蛋白或网络通路的关键节点，这个由繁至简的过程需要反复的验证，证明疾病与靶标不只有相关性，更需要有因果关系的证据。疾病的宏观表象和微观特征的关联，在发病和实验治疗中从微观分子水平进行分析，例如检测基因缺失与变异，应用蛋白质组学、转录组学、表观遗传等技术，分析患者的临床表现，经数据挖掘，归纳出基因-蛋白(酶、受体、通道、信号分子等)与疾病的关系，从而对创制新药和治疗方法提供新的科学依据。人工智能（AI）晚近有巨足的进展。阐明药物的作用机制是对致病分子机制的验证，也是创制过程的终点与归宿，这样，在微观的分子层面上完整地阐明了药物剂量-疗效-不良反应的内在关系。阐明药物的作用机制得以深化对疾病和治疗的认识，也有助于扩展和指导新一代药物的研制。本文是从实用角度例解提高药物活性和选择性的策略方法，读者也可从生物学层面分析这3个要素的内涵。文章信息源于公众号精准药物，登载该文章目的为更广泛的传递行业信息，不代表赞同其观点或对其真实性负责。文章版权归原作者及原出处所有，文章内容仅供参考。本网拥有对此声明的最终解释权，若无意侵犯版权，请联系小编删除。学如逆水行舟，不进则退；心似平原走马，易放难收。行舟Drug每日更新 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