FZD2

▎药明康德内容团队编辑   才刚发Cell，隔天又一篇Science论文上线。CRISPR基因编辑先驱之一、Broad研究所和MIT麦戈文脑科学研究所的张锋教授成为本周生命科学领域的焦点人物。 在两项不同领域的研究中，张锋团队先后解析了真核基因编辑系统Fanzor的结构、发现细菌用一种颠覆认知的基因编码方式抵抗噬菌体的机制。这两篇论文讲了什么，对生命科学领域将带来怎样的影响？在这篇文章中，我们将为大家解析这两项进展的核心内容。 ▲张锋教授（图片来源：张锋实验室主页/MIT麦戈文脑科学研究所） 真核生物的“CRISPR”——Fanzor蛋白结构 第一篇发表于Cell的论文，要从张锋团队去年的一篇Nature重磅论文说起。我们知道，革命性的基因编辑系统CRISPR/Cas源于古菌和细菌的免疫系统。除了CRISPR，自然界里还有哪些可编程的RNA系统？ 2023年，张锋团队发表了又一项重要突破，他们首次在真核生物中发现了可编程的RNA引导系统，这个真核生物的“CRSIPR”就是Fanzor（Fz）蛋白。 作为一种在真核生物中广泛存在的核酸内切酶，Fanzor蛋白可以在RNA指引下，使用邻近的非编码RNA（ωRNA）靶向剪切DNA的特定位点。由于Fanzor蛋白可通过系统编辑、引入突变组合来大幅提高活性，并且其在剪切目标DNA时不会波及邻近DNA、导致不必要的编辑，因此Fanzor具有成为高效基因编辑工具的潜力。 ▲Fanzor蛋白冷冻电镜结构（图片来源：张锋实验室） 要想进一步改造、优化Fanzor，以提升其基因编辑的效率与准确性，掌握Fanzor的结构是重要前提。在发表于Cell的最新研究中，张锋团队就对3种不同真核生物的Fanzor结构进行了冷冻电镜解析。 这3种Fanzor蛋白分别是：来自藻类Guillardia theta的GtFz1、来自真菌Spizellomyces punctatus的SpuFz1，以及寄生真菌Parasitella parasitica的PpFz1。需要指出的是，Fanzor蛋白分为Fz1和Fz2两个家族，而最新研究解析的3种蛋白都属于Fz1——它们体积要大得多，也可能有着独特的功能与作用机制。 ▲3种生物的Fanzor蛋白结构示意图（图片来源：参考资料[1]） 在获得了不同构象状态的13个Fz1结构后，研究团队从这些结构中发现了它们在与ωRNA和DNA识别方面的保守与独特之处。 具体来说，3个物种的Fz1复合物结构基本相似，并且虽然不同物种的ωRNA长度差异很大，但这3种Fz1有着相似的ωRNA相互作用界面、在关键的ωRNA区域共享折叠模式。这种一致性表明不同Fz1蛋白之间存在保守的RNA引导的DNA靶向机制。 但与此同时，这3种蛋白之间也有着不同的结构特征，突出了Fanzor蛋白家族内的多样性。 一个例子就是来自藻类的GtFz1，它的催化三联体中有一个独特的N残基。与SpuFz1相同位置经典的D残基相比，GtFz1的N残基增强了蛋白的DNA切割活性。此外，寄生真菌的PpFz1有着独特的FRI结构域，这种结构域表明Fz1蛋白可能在寄生真菌的寄生关系中起到重要作用，通过促进转座子介导的基因转移实现对真菌的寄生。 ▲GtFz1的结构特征（图片来源：参考资料[1]） 同时，Fanzor蛋白的DNA识别、切割机制也有了新发现。尽管Fanzor和Cas12都是从TnpB家族进化而来的，但两者的DNA识别、切割机制存在明显差异。研究团队发现，Fz1中额外的REC结构域结构对加载到RuvC结构域上的靶DNA的R-loop稳定有贡献。REC结构域对DNA解旋机制和R-loop调控的适应，可能对Fanzor蛋白在真核细胞复杂染色质环境中的功能至关重要。 总之，这些研究揭示了Fanzor蛋白的作用机制、加深了对这类蛋白的理解，也为开发更强大的基因编辑工具奠定了基础。 基因编码新发现：细菌的“保命”机制 而在日前上线的一篇Science论文中，张锋团队则是挑战了教科书对蛋白质编码基因的传统定义。 在传统观念里，蛋白质编码基因需要沿着DNA序列线性编码。但张锋团队的最新研究以及本月早先时间的另一篇Science论文（通讯作者为哥伦比亚大学Samuel Sternberg教授）共同发现，一些细菌的抗噬菌体蛋白并非通过这种传统方式得到编码。在这些细菌中，DNA首先被转录为非编码RNA，随后通过滚环逆转录反应转换回DNA。接下来，这些新生成的DNA再被转录为编码蛋白的mRNA，生成阻止噬菌体感染的蛋白。 利用RNA模板合成DNA的逆转录酶广泛存在于各种生命领域中。在细菌中，逆转录酶在抗噬菌体防御系统中十分重要，这种防御系统通过逆转录机制，帮助细菌抵御噬菌体感染。 在最新研究中，张锋团队关注的肺炎克雷伯菌有一种含有逆转录酶的防御系统，名为DRT2。这一系统在噬菌体感染期间能够阻止细菌生长，从而阻止噬菌体复制。DRT2系统仅包含逆转录酶和非编码RNA（ncRNA），没有其他已知的蛋白质结构域或因子。那么，这一简约的系统是如何识别感染并导致细菌生长停滞的呢？ ▲DRT2核糖核蛋白复合物结构（图片来源：参考资料[2]） 研究发现，DRT2系统编码了另一种蛋白质，但这个过程依赖于一系列出人意料的复杂事件。首先，逆转录酶利用ncRNA中的约120个碱基序列作为模板来生成互补DNA，但它们不会在一次逆转录后停止，而是跳回到120个碱基序列的起点，就像在循环播放一首歌一样，继续“滚环”反应。 通过这个过程，可以生成包含多个重复模板序列的长互补DNA拷贝。这些重复的DNA序列包含细菌σ70启动子的两个序列基序。通过将连续DNA中的重复片段首尾相连，细菌从两个分离的片段组装出一个有效的启动子，从而驱动mRNA的转录。这个mRNA进一步编码一种被命名为Neo的蛋白质，该蛋白质的独特之处在于其开放阅读框（ORF）几乎没有终止密码子，因此可以生成非常长的蛋白质。 DRT2系统通过产生这种Neo蛋白质来阻止噬菌体感染。感染发生时，DRT2系统会启动第二条互补DNA链的合成，这一过程触发了Neo蛋白质的生产，Neo蛋白质迅速抑制细菌生长，从而阻止噬菌体利用宿主细胞资源进行复制。 尽管目前尚不清楚DRT2如何感知噬菌体的存在，以及如何启动第二条DNA链的合成，但张锋团队的这一发现揭示了逆转录酶在细菌防御系统中的独特作用。这些新发现不仅丰富了我们对细菌防御机制的理解，也为基因编辑和生物技术应用提供了新的可能性。 附：张锋教授近年顶刊成果回顾 1. 发现188个新型CRISPR系统 在2023年的一篇《科学》论文中，张锋合作团队借助其开发的全新算法，从数十亿个蛋白质序列中发现了188个此前未知的新型CRISPR相关系统，并且可能将CRISPR系统的类型拓展至7大类。这一发现进一步证实CRISPR系统的多样性，并且有望带来新型基因编辑工具。 2. 全新蛋白质递送系统诞生 张锋团队在2023年的一项《自然》研究中，以一些细菌天然具有的注射结构“胞外可收缩注射系统”（eCIS）为灵感，开发了一种全新的蛋白质递送系统，利用细菌“注射器”，将蛋白质注射到人类细胞中。这项技术未来有望在基因疗法、癌症治疗等一系列领域发挥作用。 3. 可编程的DNA修饰系统OMEGA 2021年，张锋团队一个月内在《科学》杂志连续发表两篇基因编辑领域的重要突破。在其中一项研究中，团队在细菌中鉴定出一类新的核酸酶，它们由转座子编码的RNA引导到目标位置切割DNA。经过设计，这些核酸酶可以用于在人类细胞中编辑基因。研究团队将这套可编程的DNA修饰系统命名OMEGA。这项突破有望推动基因组编辑技术的下一次革命。 4. 全新的mRNA递送技术 在另一篇《科学》论文中，张锋团队筛选出自带RNA运输功能的PEG10蛋白，其有潜力被改造成运输RNA分子的工具。以PEG10为核心，研究人员们进一步开发了一种叫做SEND的系统，全名是“选择性内源性衣壳化的细胞递送”系统。这项全新的mRNA递送技术，有望给基因疗法领域带来颠覆性的变革。 5. 新一代RNA单碱基编辑工具 在2019年的一篇《科学》论文中，张锋团队介绍了基于CRISPR系统开发出的一种新型RNA编辑工具。在2017年开发的“REPAIR”系统的基础上，张锋团队通过酶进化的方法，使“REPAIR”系统的关键酶ADAR2具有全新的功能——将胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），并且减少了脱靶效应。这项技术能以前所未有的方式，对RNA进行单碱基的编辑。 6. 利用“跳跃基因”精确插入DNA片段 在2019年的另一篇《科学》论文中，张锋团队来了一款全新的CRISPR基因编辑工具，利用“跳跃基因”，让DNA片段插入基因组变得更加容易。大肠杆菌中的实验结果显示成功率达到80%，远高于经典CRISPR系统。通过“改正”的DNA序列来取代含有致病突变的序列，这项技术将为治疗某些遗传疾病提供极大的帮助。 参考资料： [1] Xu et al., Structural insights into the diversity and DNA cleavage mechanism of Fanzor, Cell (2024), https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.07.050 [2] Wilkinson et al., Phage-triggered reverse transcription assembles a toxic repetitive gene from a non-coding RNA, Science (2024), DOI: 10.1126/science.adq3977 [3] Osterman et al., Tricking a phage with reverse transcription, Science (2024), DOI: 10.1126/science.ads3638 本文来自药明康德内容微信团队，欢迎转发到朋友圈，谢绝转载到其他平台。如有开设白名单需求，请在“学术经纬”公众号主页回复“转载”获取转载须知。其他合作需求，请联系wuxi_media@wuxiapptec.com。 免责声明：药明康德内容团队专注介绍全球生物医药健康研究进展。本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表药明康德立场，亦不代表药明康德支持或反对文中观点。本文也不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。

已批准药物的靶标的三分之一是G 蛋白偶联受体 (GPCR，)；然而，这些药物仅针对人类 GPCR 库的大约八分之一。GPCR 调节多种关键生理过程，包括器官发育、心血管功能、情绪、认知、多细胞性、细胞运动、免疫反应以及光感、味觉和气味。然而，许多GPCR表达较低，并且很大一部分具有未知的配体和不清楚的信号通路。由于小分子发现面临诸如成药性、选择性和分布等挑战，GPCR 可能更适合单克隆抗体 (mAb) 的靶向。单克隆抗体在这些方面具有更好的类似药物的特性。在此，回顾了之前发现的针对临床和/或开发中的 GPCR 的单克隆抗体，同时回顾了生物物理学方面的考虑因素，这些因素使得 GPCR 的使用极具挑战性，但也为生物成药性提供了机会。 1、背景介绍 人类基因组包含超过 800 个 GPCR，其中近 400 个是嗅觉受体。虽然嗅觉受体的表达主要限于嗅觉上皮，但一些嗅觉受体在其他组织中表达，针对它们可能具有治疗益处。GPCR 根据其序列同源性和进化的系统发育分析进行分类。A 类或视紫红质样家族包含所有嗅觉受体和许多临床靶向受体，包括趋化因子、胺和肽受体。B1 类受体共享一个大的细胞外 N 末端（ 图1 ) 和 B2 类属于粘附 GPCR 家族。粘附 GPCR 因其独特的延伸胞外结构域而成为特别令人感兴趣的抗体靶点。C 类 GPCR 被认为以二聚体的形式发挥作用，T 类味觉受体也是如此。最后，F 类受体包含 Frizzled 和 Smoothened两个调节生物体发育的 GPCR。 图 1. G 蛋白偶联受体胞外拓扑和配体结合模式。 生物制剂具有许多小分子药物无法实现的独特特性。许多生物制剂利用抗体的特性，特别是可以对 Fc（可结晶片段）区域进行改造，以延长药物半衰期并诱导抗体依赖性细胞毒性（或完全避免细胞毒性）。通常，抗体通过血液、组织间隙和淋巴系统扩散，并被排除在中枢神经系统之外。与小分子不同，抗体不会被肾脏清除，而是通过 Fc 受体介导的内吞作用降解。正如我们将在本次综述中详细介绍的那样，生物制剂的另一个优点是抗体可以融合在一起以创建针对两种不同受体的双特异性分子，或针对同一受体上的两个表位的双互补位分子。最后，由于其生物学性质，可以应用合成生物学方法（例如定向进化）来设计具有所需药物样特性的抗体、抗体片段和肽。 尽管 GPCR 具有新型治疗方式的潜力，但对于生物制剂药物的开发仍然难以捉摸。部分原因在于质膜中 GPCR 的结构。GPCR 的细胞外表面遵循常见的拓扑结构（ 图1A)：一个胞外 N 端结构域和三个胞外环。GPCR 的胞外环往往非常短，但大小变化很大，从 5 个氨基酸到超过 170 个氨基酸不等。正位结合口袋是配体结合的地方，位于跨膜结构域内。大多数细胞外环参与配体结合，尽管对于小分子来说，这些相互作用对配体结合的贡献微弱。视紫质是一种对激活状态进行了高度详细研究的 GPCR，其正位结合袋完全被细胞外环封闭，并且配体（视网膜）通过质膜横向扩散。 通常，GPCR 具有较短的 N 端结构域，但许多 GPCR 也具有具有多种功能的扩展 N 端结构域（ 图1B），包括形成双位和变构配体的第二个结合位点。GPCR 的 N 末端通常很容易生产为可溶性肽，并且这些肽经常被用作抗体发现活动的抗原。然而，此类抗体无法结合细胞外环。基于抗体的 GPCR 生物制剂面临的最大挑战之一是生成能够真正与埋藏在跨膜结构域深处的正位结合袋结合的抗体。 表 1. G 蛋白偶联受体靶向的生物类药物。包括激活剂（激动剂和正变构调节剂）、阻断剂（拮抗剂、反向激动剂和负变构调节剂）以及靶向 GPCR 的下一代分子。只有三种分子获得批准（dulaglutide、erenumab 和 mogamulizumab），只有一个分子在 3 期临床阶段（talquetamab）。 2. 针对G蛋白偶联受体的生物制剂的功能活性2.1. 激活 G 蛋白偶联受体的生物制剂 B1 类GPCR 的促胰液素家族已成为治疗糖尿病和肥胖症的激动剂抗体的靶标。临床批准的胰高血糖素样肽 1 受体 (GLP-1 R) 激动剂度拉鲁肽 (Trulicity) 由礼来公司设计，作为 GLP-1 肽与 IgG4 Fc（片段可结晶区）的融合体。已知 IgG4 与 FcRn 受体结合，通过回收延长抗体半衰期，事实上，度拉鲁肽在人体中的血清半衰期超过 12 小时，而艾塞那肽和其他 GLP-1 肽模拟物 的血清半衰期不到 2-5 小时。重要的是，IgG4 不会激活补体级联，从而导致抗体依赖性补体依赖性细胞毒性 (ADCC)。此外，F234A 和 L235A 突变被引入度拉鲁肽的 IgG4 Fc 区，以减少 ADCC 的可能性。总之，度拉鲁肽是一种独特的肽激动剂，与惰性 Fc 区融合以激活 GLP-1 R。此外，Gmax Biopharm 还开发了 glutazumab，一种 GLP-1 肽与抗 GLP-1R 抗体 轻链的融合物。Glutazumab 目前正在进行治疗糖尿病的临床试验。另一种与 GLP-1 肽融合以产生激动作用的抗 GLP-1 R 抗体 Everestmab 已被描述。Everestmab 是一种介于白蛋白结合域和突变 GLP-1 肽之间的双特异性纳米抗体。 同样，最近描述了 GLP-1 肽与GLP-1 R 抗体轻链的融合，称为 TB-059-002。安进 (Amgen) 最近报道了与葡萄糖依赖性促胰岛素多肽受体 (GIPR) 抗体 AMG-133融合的 GLP-1 肽的阳性数据，该抗体可作为双重 GLP-1 R 激动剂/GIPR 拮抗剂。将 GLP-1 肽与抗 GIPR 抗体连接具有延长 GLP-1 肽半衰期的优点，并且被证明可以增强该分子在胰腺中的定位。AMG-133 作为 GLP-1 R 激动剂/GIPR 拮抗剂，最近有报道显示在肥胖方面显示出有效的 1 期临床数据。 与 GLP-1 R、GIPR 和 PTHR1 一样，许多 GPCR 可以具有大的、扩展的细胞外结构域，通常位于其 N 末端（图1）。一种称为促甲状腺素受体或促甲状腺激素受体 (TSHR)的GPCR，具有大量富含亮氨酸的重复细胞外 N 末端结构域，并且已发现自身抗体可通过与该细胞外结构域结合来激活 TSHR，从而导致格雷夫斯病(又名毒性弥漫性甲状腺肿，是一种自身免疫性疾病)。与 TSHR 一样，C 类代谢型谷氨酸受体 (mGluR) 具有较大的 N 末端结构域，远端具有捕蝇草结构，并且已开发出骆驼单域抗体（纳米抗体）DN10 和 DN13 来激活 mGluR。mGluR 受体家族需要胞外域二聚化，DN10 和 DN13 均识别桥接两个二聚化胞外域的独特表位。有趣的是，DN10 识别 mGluR2 同二聚体，而 DN13 与 mGluR2 同二聚体和 mGluR2/mGluR4 异二聚体发生交叉反应。这种独特的药理学被证明可以有效增强 mGluR2 激动剂对神经元和 DN13 小鼠恐惧调节受损的抑制作用。最近，DN10 和 DN13 还被用于使用标记纳米抗体的时间分辨 FRET 传感器在体内检测 mGluR2 同二聚体和 mGluR2/mGluR4 异二聚体。 虽然这些是通过大的 N 末端胞外结构域激活受体的变构调节抗体的例子，但许多 GPCR 的胞外表面积有限，尤其是 A 类视紫红质样 GPCR 家族(图1A）。一些抗体已被证明可以通过直接结合短胞外环并且有时进入正位配体结合袋来激活 GPCR。安进 (Amgen) 最近报道了一种新型 apelin 受体 (APJR，apelin receptor ) 激动剂纳米抗体的设计。抗体 JN241 被发现可以阻断 APJR 激活，并且 CDR3 延伸到正构结合袋中。作者利用结构分析和构效关系信息设计成激动型抗体，通过在 CDR3 区域引入突变，将 JN241 转化为激动剂。此外，β1-肾上腺素能受体 (β1AR) 抗体被证明是偏向激动剂，可激活 G 蛋白，但不激活作为变构调节剂的 β-arrestin 信号传导。 2.2. 阻断 G 蛋白偶联受体的生物制剂 许多抗体已被描述为 G 蛋白偶联受体拮抗剂。促胰液素家族(B1 亚类)受体具有一个大的 N 末端结构域，可与形成 α 螺旋杆的激动剂结合（图1B）。 最近描述了一种针对 GLP-1 R 的竞争性拮抗抗体TB-001-003，GLP-1 R 是 B1 类或促胰液素家族 GPCR。TB-001-003 能够以与肽拮抗剂 avexitide (exendin-(9-39)) 类似的方式从 GLP-1R 中取代 GLP-1。相比之下，GLP-1 R 拮抗剂抗体 Fab 3F52 是针对 GLP-1R 大 N 末端产生的，X 射线晶体学显示可通过变构抑制机制抑制 GLP-1 结合。与 TB-001-003 类似，一种名为 Gipg013 的 GIPR 拮抗剂抗体被证明可以取代 GIPR N 末端结构域的 α 螺旋 GIP 肽。Regeneron 将 crotedumab （另一种称为胰高血糖素受体 (GCGR) 的促胰液素家族 GPCR 拮抗剂抗体）推进到了针对心脏代谢疾病的 1 期临床试验，但进一步的开发已停止。Crotedumab 是使用 GCGR 的人源化小鼠免疫产生的。 REMD Biotherapeutics 已将另一种 GCGR 拮抗剂抗体 volagidemab 推进到治疗糖尿病的 2 期试验。最后，还开发了针对 GCGR 的纳米抗体拮抗剂。一款称为erenumab，用于治疗偏头痛。Erenumab 与降钙素基因相关肽 1 型受体 (CALRL) 结合，并与受体活性修饰蛋白 1 (RAMP1) 接合。CALRL 和 RAMP1 的复合物称为降钙素基因相关肽受体 (CGRPR)，erenumab 是针对 RAMP1 和 CALRL 胞外结构域的不对称 Fc 融合而产生的。 其他具有大 N 末端结构域的受体已成为抗体拮抗剂的靶标。OncoMed报道 vantictumab可阻断 Frizzled 受体家族 (FZD)，该受体具有 FZD1、FZD2、FZD5、FZD7 和 FZD8 的交叉反应拮抗剂活性，并阻断 Wnt 信号传导以发挥抗肿瘤活性。FZD 受体拥有一个大的 N 末端，其远端含有富含半胱氨酸的结构域。富含亮氨酸的重复 GPCR (LGR) 家族通过 FZD 增强 Wnt 信号传导，具有较大的 N 末端，LGR5 是 Kyowa Kirin 开发的名为 KM4056的拮抗剂抗体的目标。 已经描述了许多针对 A 类视紫红质 GPCR 家族的拮抗剂抗体。FDA 批准了 getagozumab的 IND 许可，getagozumab 是一种内皮素受体 A (ETA) 拮抗剂抗体，另一种名为 AG8的 ETA 拮抗剂抗体最近也得到了表征。MedImmune 描述了 Fpro0165的发现和优化，Fpro0165 是一种甲酰基肽受体 1 (FPR1) 拮抗剂抗体，通过将抗体与受体的结构对接，该抗体被证明可以与受体的细胞外环 2 结合。此外，一系列合成纳米抗体，包括称为 AT118i4 的优化抗体，已被描述为血管紧张素 II 1 型受体 (AT1R) 的拮抗剂。使用胆囊收缩素 B 受体 (CCK-BR) 胞外结构域片段免疫的小鼠文库中的核糖体展示来发现一种有效的拮抗抗体，称为 scFv 77-2。scFv 77-2 在神经性疼痛的临床前模型中有效。 GPCR 拮抗剂抗体已针对趋化因子受体（称为 CCR 和 CXCR）大量开发，以便在不同疾病状态下调节免疫系统。趋化因子受体属于 A 类视紫红质受体家族，具有有限的细胞外表面积。Mogamulizumab 是一种临床批准用于治疗白血病的 CCR4 抗体，但其作用机制是诱导抗原依赖性细胞毒性 (ADCC) 杀死肿瘤细胞，而不是直接拮抗 CCR4。另一种 CCR4 拮抗剂抗体已被描述为阻断 CCR4 功能，随后通过腺相关病毒介导的抗体表达递送至肿瘤。针对 CXC 趋化因子受体 4 (CXCR4) 的抗体拮抗剂已被大力开发用于治疗癌症，其中包括 LY2624587，一种有效的拮抗剂。此外，ulocuplumab 已被开发并被证明是 CXCR4 内源配体 CXCL12 的竞争性拮抗剂。其他 CXCR4 抗体已在正构结合袋和细胞外环 中靶向并显示可竞争 CXCL12。CXCL12 与 CXCR4 以及 CXCR7 结合，已描述了针对 CXCR4 和 CXCR7 的抑制性纳米抗体。CXCR2 是另一种重要的趋化因子受体，在癌症中失调。一种新型双互补位抗体被描述为将两种效力较弱的纳米抗体结合在一起，从而产生一种强反向激动剂分子。此外，已经使用噬菌体展示合成抗体库描述了针对 CXCR2 的单克隆抗体。CCR5 是一种经过充分验证的 HIV-1 侵入共受体，并且已经开发出大量抗体来阻断 CCR5 信号传导和 HIV-1 结合。最后，已经描述了 CCR2、CCR7 和 CCR9的抗体拮抗剂。病毒性 GPCR 也已成为人们感兴趣的治疗靶点，例如由巨细胞病毒编码的病毒趋化因子受体 US28。US28 的过度表达与胶质母细胞瘤有关，并且已经描述了 US28 的拮抗剂抗体可用于胶质母细胞瘤的潜在治疗。 2.3. 靶向 G 蛋白偶联受体的下一代生物制剂 Mogamulizumab 是一种临床批准的治疗白血病的 CCR4 抗体。Kyowa Kirin 首先开发了 mogamulizumab，其作用机制是诱导 ADCC，从而消耗 CCR4 表达细胞。Mogamulizumab 被设计为减少岩藻糖基化，从而增强 ADCC。与 CCR4 类似，CCR8 是 ADCC 耗竭的目标，因为 CCR8 特异性表达于肿瘤微环境中的免疫抑制调节性 T 细胞 (Treg)。一种名为 Nb-Fc1b 的新型四价纳米抗体靶向表达 CCR8 的 Tregs 并抑制肿瘤生长。吉利德已将 GS-1811 推进到实体瘤的 1 期试验，以在表达 CCR8 的 Tregs 中触发 ADCC。同样，百时美施贵宝 (Bristol-Myers Squibb) 有一种名为 BMS-986340 的抗 CCR8 抗体，处于实体瘤的 1 期试验中。然而，正如 CCR8 敲除小鼠中所证明的那样，CCR8 的靶向需要 ADCC 来消除 Tregs，因为阻断 CCR8 信号传导对 Treg 介导的免疫抑制没有影响。 许多分子利用双特异性结合，其中抗体的每个臂结合不同的抗原。最近通过筛选源自患者的类器官中的双特异性抗体库，发现了一种名为 MCLA-158 的 LGR5 和 EGFR 双特异性抗体。BsNb PX4 是一种双特异性抗体，由两种纳米抗体组成，一种靶向 CXCR4，另一种靶向 PD-L1。在对 PD-L1 抑制具有抗性的肿瘤类型中，BsNb PX4 比单独使用每个纳米抗体治疗小鼠模型更有效。Talquetamab 是一种双特异性抗体，处于多发性骨髓瘤 3 期临床试验中，靶向 CD3 和 GPRC5D，该靶点在多发性骨髓瘤细胞上高度表达。此外，还描述了 CXCR5 和 CD3 双特异性抗体。 抗体药物偶联物 (ADC) 已针对许多 GPCR 靶标开发。对于 CXCR4，使用非天然氨基酸掺入将表面残基引入抗 CXCR4 抗体中，从而可以与 auristatin（一种用于治疗癌症的抗有丝分裂剂）结合。后来，针对称为 ADC 713 的抗体，通过增加药物与抗体比率 (DAR) 改进了该策略，从而降低了毒性。此外，一种名为达沙替尼的 Lck 抑制剂与 CXCR4 抗体偶联，以抑制自身免疫性疾病中的 T 细胞功能（因为 Lck 表达仅限于 T 细胞）。最后，描述了一种名为 4M5.3X4 的分子，它是一种针对 HIV 蛋白的小干扰 RNA，与 CXCR4 纳米抗体缀合，可抑制 CXCR4 阳性 T 淋巴细胞中的 HIV 复制。 CAR T 细胞疗法是细胞重编程的一种高级形式，可将免疫细胞靶向肿瘤以治疗癌症。孤儿 GPRC5D 已被证明在骨髓瘤癌细胞中过度表达，并已成为称为 MCARH109 的嵌合抗原 T (CAR-T) 细胞疗法的靶标。溶瘤疱疹病毒 (oHSV) 被设计为通过将病毒与称为 oHSV/Nb-gD 的 CXCR4 纳米抗体融合来靶向 CXCR4+ 胶质母细胞瘤细胞。oHSV/Nb-gD 还可以诱导 TRAIL 的表达，TRAIL 是一种 TNF 家族配体，可诱导 CXCR4 阳性胶质母细胞瘤细胞凋亡，从而减少肿瘤生长。 3. G蛋白偶联受体生物制剂发现的机遇与挑战3.1. 许多 G 蛋白偶联受体都是孤儿 约 400 个非嗅觉 GPCR 中大约有 30% 是孤儿，没有已知的配体，信号转导特性知之甚少。如上所述，许多针对 GPCR 的抗体起到变构或正构激活剂的作用。因此，抗体配体可用于去孤儿化 GPCR 信号通路，使用诸如 TRUPATH、APEX或 PRESTO-TANGO等技术。例如，许多分子针对 CAR T 细胞的 GPRC5D，因为 GPRC5D 在骨髓瘤癌细胞中高表达。然而，目前对 GPRC5D 的配体或信号转导机制知之甚少。因此，GPRC5D 抗体可用于通过 APEX 标记来分析信号传导，从而为内源配体的去孤儿化提供筛选平台。3.2. 如何实现 G 蛋白偶联受体偏向性的激动 GPCR 能够通过各种 G 蛋白家族成员和 β-arrestins 传递多效性信号，在这种情况下，有可能使用所谓的偏向激动剂来靶向有益途径。正如 APJR 抗体 JN241-9 所证明的那样，可以通过进行点突变来改变抗体配体的功能特征（在这种情况下拮抗剂转变为激动剂）。因此，诱变可以用作生物制剂基于结构的药物发现的平台。此外，通过对每个 GPCR 信号通路进行并行测试，有可能捕获通过治疗有益的通路发出信号的偏向抗体配体，并避免副作用。DNA 的快速且可扩展的合成使得强大且多样化的抗体库的开发成为可能，这使得能够发现能够与 GPCR 中的神秘位点结合的抗体，例如正构配体结合口袋（ 图2A）。DNA 合成还允许对正配体结合抗体进行大规模诱变，这将是设计针对 GPCR 的偏向激动剂抗体的策略。此外，与受体胞内侧结合的纳米抗体可用于稳定不同的受体构象，从而加速药物发现策略。 图 2. G 蛋白偶联受体生物制剂发现的机遇和挑战。A. 抗体可以靶向配体结合（正构）位点或 GPCR 的其他变构区域。 B. 抗体可以稳定 GPCR 构象，从而实现复杂的药理学（正负调节剂、反向激动剂等） C. 抗体可以激活 GPCR 下游的多种信号，并被设计为选择性激活某些途径。 D. 抗体可以破坏同一细胞（反式）或顺式（不同细胞中）的蛋白质相互作用，包括阻止更高级 GPCR 寡聚物的形成。 这里详细介绍了一些抗体影响 GPCR 信号传导的分子机制，并将它们分为两大类：正构或变构结合剂（图2A）。此外，这些抗体能够稳定 GPCR 构象（图2B），这是驱动受体下游功能选择性的一种方法（图2C)。3.3. G 蛋白偶联受体的细胞类型特异性表达 作为药物，抗体具有细胞类型特异性靶向的独特特性。抗体不是全身作用并立即代谢，而是倾向于在具有高浓度抗原的组织中积累。GPCR 通常在特定组织类型中以非常低的水平表达。大规模数据集，例如人类蛋白质图谱 和人类细胞图谱正在阐明受体特异性表达谱。最近一个特别令人兴奋的例子是趋化因子受体 CCR8，它在肿瘤微环境中的 Tregs 中表达受限。因此，利用高亲和力抗体，可以特异性地消除肿瘤微环境中的免疫抑制性 CCR8 阳性 Tregs。这是将 GPCR 独特的表达谱与抗体疗法的特性相结合的一个例子。3.4. 细胞外 G 蛋白偶联受体相互作用 最后，由于其高亲和力、通过亲合力结合和大尺寸，抗体疗法特别适合破坏蛋白质/蛋白质相互作用。最近，人类基因组中的一些细胞外蛋白质的细胞外蛋白质/蛋白质相互作用图谱（相互作用组学）受到关注。检查点抑制剂疗法会破坏细胞外蛋白质/蛋白质相互作用，而 GPCR 的细胞外相互作用才刚刚开始被绘制出来。调节细胞外与抗体的相互作用将为进一步了解 GPCR 的生物学及其广泛的 N 末端结构域和其他蛋白质之间涉及的各种相互作用提供信息。 10.1080/17460441.2023.2193389 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

RNA引导系统是一种在原核生物和真核生物的生物过程中都起着核心作用的机制。其中，原核生物中的CRISPR-Cas系统通过RNA引导的核酸酶活性对外来遗传元件提供适应性免疫反应。例如，美国布罗德研究所以及麻省理工学院麦戈文大脑研究所的张峰团队前期发现的CRISPR相关蛋白酶，可以通过编程RNA激活的内肽酶活性对抗sigma因子抑制剂，以调节转录反应1。而在真核生物中，虽然目前已经研究了一些RNA引导系统，如RNA干扰和核糖体RNA修饰，但是否有RNA引导的内切酶仍不清楚。在张峰团队最新的关于原核生物RNA引导系统(称为OMEGA)中，发现包含一个RNA引导的内切酶蛋白(即TnpB IscB,IsrB)和一个从转座子端区转录的非编码RNA（ncRNA）(称为ωRNA)2。OMEGA系统是CRISPR-Cas系统的祖先，效应物TnpB被认为是Cas12的始祖，具有RNA引导的内切酶活性。而TnpB与Fanzor(Fz)蛋白具有同源性，这提高了真核生物也具有CRISPR-Cas或OMEGA系统的可能性。最近，张锋团队对这一可能性进行了验证，研究成果发表在Nature，题为“Fanzor is a eukaryotic programmable RNA-guided endonuclease”。该研究报道了一种由RNA引导的DNA内切酶Fz，可以被重新编程用于人类基因组工程应用3。证实了Fz是真核生物的OMEGA系统，表明RNA引导的内切酶存在于生命的所有领域。https://doi.org/10.1038/s41586-023-06356-2该研究首先评估了Fz的多样性，在数据库中搜索到来自TnpBs的两个不同分支的Fz1和Fz2，其可能是由两种不同的TnpBs转移到两个真核宿主而产生的，表明了Fz可能在真核物种之间转移。接下来比较了两种来源的TnpB，两种来源的Fz1和两种来源的Fz2结构。虽然它们在序列和大小上有很大的差异，但是它们具有相似的核心域架构，并且保守的核心区域和预测的活性催化位点表明，Fz可能能够执行RNA引导的命令。Fanzor的系统发育分析https://doi.org/10.1038/s41586-023-06356-2进一步，为了测试Fz的RNA引导内切酶活性，通过系统基因组学确定了多个Fz位点，并且观察到与原生生物中相同的ncRNA种类，这表明Fz与转录的ncRNA结合，是一种ωRNA。证实了Fz与ncRNA之间的相互作用，并且在10种生物的20个Fz位点的ωRNA表达中得到了确认。基于Fz与TnpB和Cas12的结构相似性，研究者假设Fz可以执行DNA切割，并且ωRNA将Fz引导到其靶点。通过采用先前开发OMEGA系统使用的靶邻近基序(TAM)鉴定试验，以及对产物进行测序验证。结果表明Fz1和Fz2都是ωRNA引导的内切酶。并且通过酿酒酵母重组表征，证实了TAM序列中的任何碱基突变都会完全消除切割，这也表明RNA引导的DNA内切酶活性强烈依赖于TAM。接下来，研究者还测试了Fz-OMEGA系统是否可以用于人类细胞基因组中，实现RNA引导的DNA切割。结果显示Fz在人类细胞中也具有活性，且经过改造突变后，具有更高的基因编辑效率。这也证明了Fz在人类基因组工程应用中的巨大潜力。最后，为了了解Fzl的DNA切割机制，通过低温电镜在2.7 Å的分辨率下确定了Fz与ωRNA等的结构。表明了Fz的双叶结构，Fz-TAM的识别机制，以及ωRNA在该蛋白的催化功能中的作用。在此之前，该团队也对原核生物中脱硫弧菌IsrB与ωRNA和靶DNA的复合体结构进行分析，突出了蛋白质和RNA之间功能的相互作用2。SpuFanzor1结构https://doi.org/10.1038/s41586-023-06356-2除此之外，在近几年，张峰团队在遗传调控方面取得了许多重大研究成果。首先，为了全面了解转录因子及其控制的程序，张峰团队创建了一个包含所有注释的人类转录因子剪接异构体的条形码库(>3500)，并开发了一个筛选平台，构建包含100万个细胞的转录因子图谱，绘制了每个转录因子的人类胚胎干细胞表达谱4。为系统阐明转录因子的基因程序、全面理解控制细胞状态的GRN提供了有价值的资源。另外，他们还报道了Bombyx mori R2 non-LTR逆转录转座子在其核糖体DNA靶点处启动TPRT的冷冻电子显微镜结构。表明目标DNA序列在插入位点被解开，并被上游基序识别。逆转录酶(RT)结构域的延伸识别逆转录转座子RNA，并引导3'端进入RT活性位点以模板逆转录5。该研究使用Cas9在体外将R2重定向到非原生序列，这表明未来可以作为一种基于可重编程RNA的基因插入工具。总之，这些研究都促进了我们对这些不同系统的生物学和进化的理解，也对人类基因组工程提供了很多有利的技术支持和工具。参考文献1. RNA-activated protein cleavage with a CRISPR-associated endopeptidase2. Structure of the OMEGA nickase IsrB in complex with ωRNA and target DNA3. Fanzor is a eukaryotic programmable RNA-guided endonuclease4. A transcription factor atlas of directed differentiation5. Structure of the R2 non-LTR retrotransposon initiating target-primed reverse transcription撰文 | 娜娜山编辑 | 小白活动推荐精彩推荐：1、别宅了去Social吧！Nature子刊：我国科学家超200万人荟萃分析，孤独会缩短寿命！2、柳叶刀子刊：新冠感染后使用二甲双胍或可将患新冠后遗症的风险降低40%！3、馋是种“工伤”？Neuron最新研究：长期压力大影响大脑反应，导致进食更多体重猛涨！4、警惕！BMJ研究8万多年轻人数据，即使是肾功能适度下降20-30%，死亡风险也会增加1.4倍！5、Cell子刊：这种饮食方式能抗癌，但不可随意用，必须与药物搭配！