PVR

摘要:免疫细胞治疗作为一种革命性的治疗方式，显著改变了癌症护理。这是一种专业的免疫疗法，利用活的免疫细胞作为治疗癌症的疗法。与传统药物不同，细胞疗法被认为是“活药”，这些产品目前是定制的，需要先进的制造技术。尽管嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法在治疗血液恶性肿瘤方面受到了行业的极大关注，但其在治疗实体瘤方面的有效性常常受限，导致替代性免疫细胞疗法的出现。肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）细胞疗法、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）细胞疗法、树突状细胞（DC）疫苗和DC/CIK细胞疗法旨在利用身体的自然防御机制来定位和消除癌细胞，通常具有较少的副作用或风险。另一方面，如嵌合抗原受体-T（CAR-T）细胞、T细胞受体（TCR）-T、嵌合抗原受体-自然杀伤细胞（CAR-NK）或CAR-巨噬细胞（CAR-M）等细胞疗法通常使用自体干细胞、同种异体或异种细胞，或基因修饰细胞，需要更高水平的操作，被认为是高风险的。这些高风险细胞疗法通常在肿瘤靶向和信号传导方面具有特殊特性，触发新的抗肿瘤免疫反应。最近，在抗肿瘤机制和细胞疗法产品设计的基本和临床研究以及技术创新方面取得了显著进展。随着技术的迅速整合和高创新格局，关键的未来发展方向已经出现。为了满足细胞疗法技术进步治疗癌症的需求，我们在本研究中全面系统地调查了免疫细胞疗法的技术创新和临床进展。基于免疫细胞疗法的治疗机制和方法学特点，我们分析了这些疗法的主要技术优势和临床转化风险。我们还分析和预测了应用前景，为相关企业提供必要的信息，以便他们做出关于研发方向选择的明智决策。 1.引言 癌症是一种利用多种逃逸机制来躲避抗癌免疫的全身性疾病，并且显著改变整个免疫系统的功能和组成。抗癌治疗的演变跨越了一百多年，其效果和特异性不断提高，旨在消除癌细胞的同时尽量减少对健康组织的损害。为了实现这一目标，免疫细胞治疗在现有方法中脱颖而出，成为了一种改变游戏规则的解决方案。2017年，食品药品监督管理局（FDA）批准了两种嵌合抗原受体-T（CAR-T）细胞疗法，即Kite Pharm的axicabtagene ciloleucel（Yescarta）和Novartis的tisagenlecleucel（Kymriah），用于治疗淋巴瘤。这些批准标志着抗癌治疗加速发展的一个重大里程碑。免疫细胞治疗的基本概念是通过外部供应具有所需功能的细胞来增强免疫反应，以帮助患者对抗癌症。它不仅重新激活了现有的免疫反应，还推动了新的免疫反应加入到抗肿瘤努力中。免疫细胞治疗的反应通常涉及多种免疫细胞类型的激活和协作，包括抗原呈递细胞，如树突状细胞（DCs）和巨噬细胞，T淋巴细胞（T细胞）和自然杀伤（NK）细胞。肿瘤负担的免疫系统不仅在免疫细胞数量上失衡，而且在调节抗癌免疫反应的分子和信号通路上也表现出功能异常。因此，精确施用适当的治疗策略是必要的，以防止免疫细胞治疗的效果不佳。 根据癌症类型及其机制，免疫过程的各个领域为治疗干预提供了途径。方法包括，例如，提取和扩增具有预先癌症识别能力的免疫细胞（例如，肿瘤浸润性免疫细胞），外部分化有效的细胞类型[例如，细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞]，以及基因修饰细胞以实现特定识别和肿瘤细胞消除[例如，T细胞受体（TCR）工程，嵌合抗原受体（CAR）]。在本综述中，我们将讨论最新的免疫细胞治疗，总结应用于实现和优化这些治疗类别的策略，并提供未来的展望。 2.用低风险免疫细胞治疗癌症 低风险免疫细胞治疗旨在使用患者自己的免疫细胞来消除癌细胞。需要注意的是，“低风险”强调的是细胞治疗领域内某些治疗相对更安全、副作用较少，属于再生医学或先进治疗药物产品（ATMPs）。低风险免疫细胞治疗包括四种关键技术：肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）疗法、CIK细胞疗法、DC疫苗和DC/CIK细胞疗法。为了更全面地理解这些方法，必须深入研究促进这些细胞治疗的基本机制和临床进展。 2.1.TIL细胞治疗 TILs是存在于实体肿瘤微环境（TME）中的天然单核细胞，包括肿瘤内肿瘤浸润性淋巴细胞（iTILs）和基质肿瘤浸润性淋巴细胞（sTILs）。与iTILs相比，sTILs主要是效应记忆T细胞，更容易被检测到。作为一群已经接触过肿瘤组织的异质性淋巴细胞，TILs“预训练”攻击癌细胞，同时留下健康的细胞。在小鼠肿瘤模型中，这些异质细胞已经显示出治疗晚期癌症的潜力，第一个人类TIL治疗导致转移性黑色素瘤显著消退。实体瘤缺乏理想的肿瘤标志物，使得靶向肿瘤相关抗原（TAAs）具有挑战性。TILs作为具有多样化受体的多克隆细胞，为实体瘤提供了独特的治疗选择。与基因修饰的免疫细胞相比，TILs在克服实体瘤的异质性方面表现出优越性，特别是像黑色素瘤这样高度异质性的肿瘤。此外，它们具有注射后迁移至TME的趋化因子受体，并且与CAR-T细胞相比，它们的非靶向毒性较低，这归因于T细胞成熟过程中的负选择。 TILs可以从切除的肿瘤组织中分离出来。鉴于TIL在原始TME中的稀缺性，可供扩增的TIL数量有限，以及阻碍TIL抗肿瘤细胞毒性的额外因素（例如，Treg，肿瘤相关巨噬细胞，髓系抑制细胞和各种免疫抑制分子）。TIL的生产和扩增是TIL治疗成功的至关重要步骤。TIL在体外的扩增涉及快速扩增协议（REP）。在REP前阶段，TILs在高剂量白细胞介素（IL）-2下进行初级扩增。一些方法涉及选择肿瘤特异性TILs进行进一步扩增，而其他方法则扩增大量TILs以保持疗效。在REP阶段，同时给予高剂量IL-2和抗CD3，并使用辐照的同种异体外周血单核细胞（PBMCs）作为饲养细胞，直到获得足够数量的细胞。然后，经过质量控制的扩增细胞产品准备用于患者给药后进行淋巴细胞减少。 自1988年Rosenberg等人成功将TIL治疗应用于转移性黑色素瘤患者以来，一系列临床试验相继出现。1996年，TIL治疗首次被引入用于治疗非小细胞肺癌（NSCLCs），在涉及113名患者的临床研究中。结果显示，TIL与IL-2联合使用对NSCLCs是一种有效的治疗方法，与II期或IIIa期相比，对IIIb期NSCLCs有选择性益处。在初步成功后，TIL治疗的后续发展一直朝着提高治疗其他肿瘤类型的疗效方向发展，包括皮肤、肾脏和胃癌。这些发展中的具体方法旨在阐明TIL细胞类型的组成及其与临床结果的相关性。例如，成功生成的肿瘤浸润性B淋巴细胞（TIBs）已被发现可以预测转移性肾细胞癌（mRCC）患者的临床结果改善。另一项关于胃癌TIL治疗的研究表明，TIL的组织学亚群与不同的存活时间相关。目前，TIL治疗的临床转化仍处于初步阶段，缺乏长期临床观察。然而，初步成功表明有机会开发具有更有效分离和扩增方法的有希望的治疗性TILs，并可能与其他抗肿瘤疗法结合使用。 2.2.CIK细胞疗法 CIK细胞是具有混合T和NK细胞样表型的异质免疫效应细胞。它们是通过将人的PBMC或脐带血单核细胞与干扰素γ（IFN-γ）、抗CD3抗体、重组人IL-1和IL-2一起体外培养产生的。CIK细胞独特地表现出对肿瘤的主要组织相容性复合体（MHC）不受限制的靶向性，减少异体反应性，并能够攻击各种肿瘤类型。在体外培养过程中，CIK细胞分泌各种细胞因子以激活巨噬细胞、NK细胞和CD8+ T细胞的细胞毒性活性，从而直接抑制肿瘤细胞的生长并促进间接杀伤效果。CIK细胞诱导凋亡基因和抗肿瘤基因的表达，进行细胞毒性活动并促进肿瘤细胞凋亡。它们主要通过粘附分子淋巴细胞功能相关抗原-1/认知配体细胞间粘附分子-1（LFA-1/cam-1）与肿瘤细胞上的抗原结合的机制来实现肿瘤杀伤效果。这促进了MHC-I或MHC-II分子的表达，导致增强的呈递、激活、识别和直接杀伤肿瘤细胞。 激活的CIK细胞分泌各种细胞因子，包括IL-2、IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和其他细胞因子，不仅直接增强细胞毒性效果和抑制肿瘤细胞，还通过调节免疫系统间接杀死肿瘤细胞。主要由CIK细胞产生的IFN-γ增强了NK细胞、巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的活性。它还可以促进肿瘤细胞上MHC-I分子的表达，导致CTL杀伤增加。最近的研究指出，CIK细胞分泌的IFN-γ可以促进慢性淋巴细胞性白血病（CLL）细胞上ICAM-1的表达，对细胞毒性效应细胞的凋亡诱导产生积极影响。肿瘤细胞的凋亡基因也可以被CIK细胞激活，因为这些细胞表达FasL，一种属于TNF超家族的Fas配体，它诱导肿瘤细胞凋亡。Verneris指出，某些肿瘤细胞（如黑色素瘤和卵巢癌）通过诱导表达FasL的淋巴细胞凋亡来逃避免疫清除，但它们对CIK细胞敏感。这是因为，在CIK细胞的诱导过程中，Fas敏感或激活的T细胞被IFN-γ等细胞因子的作用或激活诱导的细胞死亡机制选择性地消除。结合CIK细胞中高水平的抗凋亡基因表达，这些因素使CIK细胞能够耐受表达FasL的肿瘤细胞诱导的凋亡。 尽管存在复发和无反应性的担忧，CIK细胞的异质性使它们能够靶向并杀死各种肿瘤细胞。自1991年引入CIK细胞疗法以来，已有超过5,000名患有多种肿瘤类型的患者，包括肺癌、乳腺癌、脑癌和结肠癌等，参与了CIK细胞疗法。全球CIK细胞（或CIK细胞与DC联合）的临床试验已超过80项。CIK细胞的治疗潜力超出了它们与NKG2D的相互作用，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）轴。与其他免疫疗法、常规化疗或放疗一起，CIK疗法表明了协同的抗肿瘤效果，正在发展中，是治疗癌症的一条令人鼓舞的途径。虽然临床前景看好，但一些公开讨论是必要的。与其他免疫细胞相比，CIK细胞输注后的毒性效应、最小化额外的支持性护理、确定与其他免疫疗法的优势、了解与CIK细胞在癌症微环境中的串扰的关键决定因素，以及在多个中心推广这种方法需要探索。 2.3.DC疫苗 操纵患者的自体DCs进行“疫苗接种”以对抗肿瘤组织是一种有前景的方法。DC疫苗涉及用TAAs（如肽、蛋白质、DNA/RNA或病毒）处理体外培养的DCs。DCs将摄取抗原，然后在仔细控制的培养过程中激活。DCs作为强大的抗原呈递细胞，对影响免疫系统起着至关重要的作用。虽然未成熟的DCs处理外来抗原，触发成熟和迁移到淋巴结，成熟的DCs可以在TME内促进肿瘤耐受，可能导致T辅助型2反应。 DC疫苗，通常采用体外成熟的自体单核细胞并用抗原冲击，已在多种肿瘤患者中显示出良好的耐受性和最小的毒性。然而，抗原特异性免疫反应的幅度和持续时间普遍较弱，限制了客观的临床反应。尽管在儿童肿瘤中的反应有限，正在进行的研究集中在增强疫苗生产的每一步上。策略包括扩大DC来源、提高免疫原性、优化抗原选择、开发新的免疫佐剂以及探索同时进行的免疫调节或化疗。 Sipuleucel-T是唯一获得FDA批准的自体DC疫苗，为有效的成人恶性肿瘤治疗提供了希望，特别是对于去势抵抗性前列腺腺癌。通过培养患者的PBMCs与一种由TAA（前列腺酸性磷酸酶（PAP））和GM-CSF组成的重组蛋白（PAP-GM-CSF）来生产。这种开创性的疫苗代表了DC疫苗领域的一个重要进展，展示了在成人和儿童恶性肿瘤中改善结果的潜在途径。在临床试验中，DC主要用于与CIK细胞、免疫检查点抑制剂（ICI）以及化疗和放疗结合的免疫疗法中以改善结果。研究表明DC能够激活自然杀伤T（NKT）细胞，或同时激活CD4+和CD8+ T细胞。 2.4.DC/CIK细胞疗法 当多种低风险的免疫细胞疗法一起使用时，可以实现积极的综合协同效应，特别是在DC和CIK的共同应用中尤为明显，它们是可适应和协同的。这种协同作用旨在增强身体对疾病的免疫反应。CIK细胞以其广谱的肿瘤杀伤效果而闻名，但由于缺乏特定的识别能力而受到限制。DC目前被认为是最有效的抗原呈递细胞，最近的研究表明CIK和DC之间的相互作用会在两个群体内部引起免疫刺激性表面分子表达的变化。实际上，与CIK细胞共同培养DCs发挥了互补作用，相互促进成熟，共同增加抗肿瘤活性，并展现出有希望的协同效应，即使在之前对CIKs有抵抗力且之前未与DCs共同培养的肿瘤细胞系上也是如此。DC分泌的细胞因子，如IL-2、IL-12和IFN-γ增强了CIK细胞的成熟，导致CIK细胞中CD3+、CD8+和CD56+亚群的水平增加。值得注意的是，DCs显著增加的IL-12分泌显著增强了CIKs的细胞溶解功能。此外，这种合作环境还减少了IL-10的分泌和调节性T细胞（CD4+CD25+ Treg细胞）的数量，减弱了它们对肿瘤免疫的抑制作用，并增强了CIK细胞的肿瘤杀伤效果。同时，CIK细胞增强了DCs的抗原呈递特异性和共刺激分子的表达，有助于整体增加抗肿瘤活性。此外，DC和CIK细胞的共同培养抑制了人类端粒酶逆转录酶（hTERT）蛋白的表达，抑制了端粒酶活性，并阻碍了肿瘤细胞的增殖。 基于上述机制，DC-CIK疗法以相互适应和协同为特点，已成为近年来肿瘤治疗领域的研究焦点。基础和临床研究迅速发展，并证明了在显著增强抗肿瘤免疫方面的有效性。尽管存在轻度移植物抗宿主病（GvHD）的担忧，试验经验表明结果是可控的。案例研究已经证明了安全性和提高的疗效。DC/CIK细胞疗法针对免疫系统的多个方面，从而形成了更全面的对抗疾病的方法。这在复杂情况或难治性恶性肿瘤中尤为有益，其中多种免疫功能障碍发挥作用。总的来说，低风险的免疫细胞疗法可以帮助增强免疫系统识别和消除有害实体的能力，从而改善健康结果。这些疗法的协同效应有潜力显著提高基于免疫的治疗的有效性，并为患者提供更好的结果。然而，评估和定制这些疗法的确切组合和剂量以确保其对个体患者的安全性和有效性至关重要。 3.高风险免疫细胞治疗技术的进步 高风险免疫细胞治疗使用自体干细胞、异体或异种细胞，或基因修饰细胞，所有这些细胞都需要进一步的操作和评估。这些治疗的设计非常适合其预期目的。这些治疗刺激针对肿瘤的新免疫反应，通常有潜力重新激活已有的反应。在这里，我们描述了高风险免疫细胞治疗中的特征设计、转染方法、细胞来源，以及克服抑制性肿瘤微环境（TME）的方法，包括CAR-T、T细胞受体-T（TCR-T）、CAR-NK和CAR-巨噬细胞（CAR-M）。此外，我们提供了对未来趋势的见解。 3.1.CAR的设计 CAR是工程受体蛋白，为免疫细胞提供了识别癌细胞表面特定抗原的新能力，从而可能触发免疫细胞消除癌细胞的潜力。当前研究表明，即使是对CAR结构的微小修改也可能会显著影响治疗效果。它通常由三个模块化域组成：细胞外域、跨膜域和细胞内域。 细胞外域：靶向的艺术。细胞外域包括一个用于目标结合的单链可变片段（ScFv）和一个铰链区域，通常在CAR工程细胞中的免疫球蛋白（Ig）样域铰链，并通过跨膜域锚定到细胞膜。通过CAR的细胞外域引入了驱动免疫细胞激活的新功能，包括T细胞、NK细胞和巨噬细胞。CAR工程免疫细胞能够识别癌症特异性靶标表位，不受MHC和共受体的限制，使它们在寻找和杀死癌细胞方面更有效。 CAR工程免疫细胞已经从针对单一抗原发展到针对两种不同抗原，以优化治疗阴性抗原癌细胞逃逸或抗原丢失的复发，并且结合任一抗原都将触发CAR工程免疫细胞的激活。这可以通过几种方式实现（图1A-C），例如将编码两个独立CAR分子的单个双顺反子向量转导到单个细胞中，或将编码双价CAR分子的向量转导到细胞中，或共同给药两种不同的CAR工程免疫细胞产品，或共同转导两个向量到单个免疫细胞中编码不同的CAR。这些方法对于B细胞淋巴性白血病特别有前景，尤其是对于复发或难治性B细胞急性淋巴性白血病（B-ALL），因为临床研究表明CD19/CD22共转导CAR-T细胞具有显著的疗效，以及CD19/CD22双特异性CAR-T细胞。同样，I期临床试验表明，双特异性CD20/CD19 CAR-T也可用于治疗复发和难治性B细胞恶性肿瘤患者，治疗28天后的总体反应率为82%，显示出治疗目的的安全性和有效性。此外，Wang等人表明，CD19/CD22双顺反子CAR-T与单特异性CD19或CD20 CAR-T细胞相比，在体外和体内表现出相当或更好的功能。 除了ScFv的优化，细胞外区域也得到了改进。与传统CAR直接作用于靶细胞不同，研究人员提出了一个新概念：模块化CAR（modCAR）。这种CAR-T（图1D、E）通常与其适配器一起工作，适配器的一端结合到细胞上，另一端用于识别和结合肿瘤表面抗原。适配器分子可以是单克隆抗体、抗体片段（图1D）、小分子或任何结构（图1E），只要能针对至少一个所需的抗原并介导目标与效应细胞之间的交联。它提供了一种高度灵活、可定制和通用的方法，以快速优化效应细胞活性，潜在地实现智能抗原靶向。 图1. CAR的设计策略。针对肿瘤的CAR设计示意图。(A) 通过将编码两个独立CAR分子的双顺反子载体转导到单个细胞中，可以生成双顺反子CAR工程细胞。(B) 通过将编码串联CAR分子的载体转导到细胞中，生成双价CAR。(C) 通过共同给予两种不同的CAR工程免疫细胞产品（上图）或共同转导两种编码不同CAR的载体到免疫细胞中（下图），实现双特异性，但产品将复杂且昂贵。可以使用抗体（D）或其他适配器（E）生成modCAR。(F) 设计装甲CAR以共表达分子，包括细胞因子和/或趋化因子，以增加效果和持久性。(G) SynNotch CAR通过添加分泌蛋白和结合剂，并利用特设计对机制执行AND、NOT和OR布尔逻辑门。这也可以通过特设计的转录因子和转录机制（H）实现。CAR：嵌合抗原受体；modCAR：模块化CAR。 装甲CAR细胞（图1F）旨在分泌细胞因子或其他分子，以帮助抵消肿瘤微环境（TME）的免疫抑制特性，潜在地提高CAR工程细胞的持久性和有效性。有时被称为第四代CAR细胞或TRUCKs（T细胞重定向用于抗原无限制的细胞因子启动的杀伤），它们为CAR靶向组织提供了一种多功能治疗，超越了传统CAR-T细胞的能力。TRUCK概念目前正在通过共表达分子如趋化因子配体或基于第二代或第三代CAR的细胞因子组合进行探索。其中，IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23以及这些分子的各种组合正在早期阶段试验中。值得注意的是，IL-7和IL-15已被发现可以促进CAR-T细胞的增殖，而IL-12和IL-18增强了T细胞的效应能力。此外，表达特定分子的工程CAR-T细胞，如CCL-19或CCL-21，能够趋化其他免疫细胞或CAR-T细胞向附近的癌细胞移动。这增强了免疫细胞的渗透和CAR-T细胞的存活，从而提高了CAR-T细胞的有效性。 CAR设计中的最新发展是合成Notch（SynNotch）受体（图1G，H），它提供了一种精确的靶向策略，允许精确控制CAR工程细胞的激活，同时通过引入可诱导的开关来最小化非靶向效应。一个典型的案例使用了布尔逻辑和逻辑门的原理，当所有条件满足时，通过构象变化激活的共定位依赖的蛋白开关（Co-LOCKR）可以执行AND、NOT和OR布尔逻辑门。在体外已经证明了针对癌细胞的特异性，但在临床应用中仍面临各种挑战。 细胞内域：信号和细胞功能。细胞内域由一系列共刺激域组成，CAR的分类基于共刺激域的数量。第一代CAR仅由CD3ζ组成，而第二代CAR除了CD3ζ外还含有一个共刺激域，第三代CAR则涉及一个以上的共刺激域以及CD3ζ。 在T细胞中，第一代CAR已构建包含编码针对2,4,6-三硝基苯酚（TNP）抗体的可变区域的重组基因片段，这些片段被拼接到α或β T细胞受体（α或β TCR）的C区之一。转导T细胞后，这种结构可以稳定地表达在T细胞表面，并能够识别MHC非限制性的肿瘤细胞，但在临床试验中显示出较弱的抗肿瘤效果。第二代CAR-T利用T细胞激活的经典信号，并增加了一个共刺激分子，如4-1BB（也称为CD137）或CD28，这显著提高了CAR-T细胞的激活水平和增殖能力。临床数据支持接受第二代CAR-T细胞治疗的患者对其肿瘤负担有延长和有效的控制。新发现的共刺激分子包括可诱导的共刺激分子（ICOS）、OX40（也称为CD134）和CD40等。第二代CAR结构在临床实践中最广泛使用。第三代CAR-T细胞包含两个共刺激分子，导致增强的细胞毒性。在临床试验中，当共同给予淋巴瘤患者CD19导向的第二代CAR-T细胞（带有CD28共刺激域）和第三代CAR-T细胞（带有CD28和4-1BB）时，观察到更长的持久性和优越的扩张。然而，目前评估仅第三代CAR-T的临床数据有限。在一个研究者发起的试验中，HD-CAR-1，一种第三代CAR-T治疗，在成人复发/难治性ALL患者中进行了评估。在90天的研究期结束时，80%的患者实现了完全缓解。此外，最近的研究表明，配备有4-1BB和CD28共刺激域的CAR-T细胞增强了T细胞记忆表型，与仅有一种共刺激分子的细胞相比，表现出更好的增殖和细胞因子释放水平。 迄今为止，大多数涉及CAR-NK细胞的研究都使用了最初用于T细胞的CAR构建。已经开发了包含CD28或4-1BB共刺激域的第二代CAR-NK。最近的研究报告称，含有细胞内域的CAR-NK，包含4-1BB和CD3ζ，克服了抑制信号并诱导了NK细胞特异性，导致杀死CD19+ aALL细胞。然而，已经为NK细胞特别创建了新的CAR设计，这些不同的CAR构建对NK细胞的细胞毒性和细胞因子产生有不同的影响。研究表明，包含NK特异性共刺激域2B4（也称为CD244）的CAR-NK细胞对肿瘤细胞有显著增强的细胞毒性活性，诱导快速增殖，增加细胞因子产生，并减少凋亡。这表明，与NK细胞上的常规4-1BB CAR相比，NK细胞特异性激活信号在CAR性能中起着至关重要的作用。此外，利用不同的信号域，如CD3ζ、DAP10和DAP12的CAR构建，在原代NK细胞或NK92细胞系中表现出不同的抗肿瘤活性。具体来说，与包含DAP10域的CAR相比，具有CD3ζ信号域的CAR表现出优越的性能，而使用DAP12域的CAR优于包含CD3ζ域的CAR。 CAR-M细胞与CAR-T细胞具有相同的结构和代级分类，但其细胞内信号域的功能不同，主要是为了增强吞噬作用。CAR-M细胞能够直接利用CD3ζ细胞内域传递吞噬信号。Fc受体（FcRγ）的γ亚基和多个表皮生长因子样域蛋白10（Megf10）也可以作为细胞内信号域。最近的研究结果表明，添加一个串联的PI3K招募域可以增加对癌细胞的吞噬。CAR-M的第一个临床试验产品是第一代产品，包含CD3ζ作为其细胞内域，并且第一阶段的临床试验结果显示了有希望的初步安全性和有效性结果，并获得了FDA的快速通道指定。 4.提高基因转移方法的效率 在免疫疗法中引入核酸，包括基因表达和CRISPR基因编辑，是一个至关重要但具有挑战性的步骤。近年来，非病毒转染技术因其在克服与病毒载体生产相关的劳动密集和昂贵程序以及cGMP合规性方面的经济利益而越来越受欢迎。例如，转座子或移动遗传元素被用来实现高效和持久的转基因表达，在产生稳定的CAR-T细胞方面引起了极大的兴趣。此外，电穿孔或机械穿孔能够使免疫细胞如T细胞短暂表达基因组编辑核酸酶，例如CRISPR-Cas9的表达，并已在基于mRNA的人类T细胞修饰中进行了探索。这些非病毒转染技术在程序简单性、容量和吞吐量以及有利的安全概况方面提供了优势。 与非病毒转染相比，病毒转导方法在临床环境中是主流模式，并被广泛认为是转染困难细胞类型（如免疫细胞）的一种高效方法。常用的病毒载体，如腺相关病毒载体和腺病毒载体，不能整合到宿主基因组中。然而，逆转录病毒载体和慢病毒载体可以整合，并且表现出高传递效率，使它们非常适合转导高度复制的细胞，如免疫细胞。Tecartus和Yescarta都是由Kite Pharma生产，依赖于γ逆转录病毒（GRV）载体将CAR构建体转导到T细胞中，而Kymriah则使用慢病毒（LV）载体进行转导。一般来说，γ逆转录病毒和LV系统经常用于将基因转移到T细胞中，研究表明它们通常可以获得30%-80%的转导效率。然而，安全性、效率和便利性问题是必须考虑的问题。 与T细胞相比，病毒基因传递到原代NK细胞已被证明既具挑战性又效率低下，可能由于NK细胞的固有特性。研究表明，使用逆转录病毒载体成功转染原代扩增的NK细胞，单轮转染效率范围为27%-52%，经过两轮转染后为47%-75.4%。虽然逆转录病毒已被广泛用于最近的临床前和临床研究中生产CAR-NK细胞，但缺乏有效的基因转移方法仍是NK细胞在免疫疗法中使用的主要障碍。此外，与逆转录病毒转染相关的插入性突变和对原代NK细胞活性的有害影响是临床应用中的主要限制。与逆转录病毒载体相比，基于慢病毒的转染具有较低的遗传毒性和插入性突变风险。然而，原代NK细胞在LV转导中的效率很低，需要多轮转染。最近，Bari等人表明，用狒狒包膜糖蛋白变体（BaEV-LV）伪型的LV载体的转导效率比用泡状口炎病毒糖蛋白（VSV-G-LV）伪型的高20倍以上，这是用于伪型LV载体的第一种且仍最广泛使用的糖蛋白。他们通过这种转染方法成功地在约70%的不同供体的原代人类NK细胞中表达了CD19-CAR，这些CD19-CAR NK细胞有效地且特异性地根除了CD19阳性肿瘤细胞。用BaEV-gp伪型的慢病毒带有肿瘤特异性CAR在NK92细胞中的转导率几乎达到100%，在iPSC衍生的NK细胞或激活的原代NK细胞中为50%-80%。因此，它可能是NK细胞CAR基因转移的有希望的载体。此外，用长臂猿白血病病毒（GaLV）包膜蛋白伪型的慢病毒可以有效转导原代NK细胞。电穿孔和脂质体介导的转染方法也用于在NK细胞中传递外源基因。与上述病毒转染相比，这些方法提供了更快的转基因表达、降低的凋亡水平、更小的个体间差异和更高的基因转移效率。然而，外源DNA通常不会整合到目标细胞的基因组中，导致转基因表达在转染后约3-5天内下降。但当与DNA整合技术结合时，这些方法可以产生稳定转染并表达转基因的细胞。DNA转座子是可以通过切割和粘贴机制在载体和染色体之间有效转座的移动DNA元素。PiggyBac（PB）和Sleeping Beauty（SB）是迄今为止最常用的两种转座子系统，与其他系统相比，在哺乳动物细胞中显示出最高的转座活性。通过将含有CAR的质粒和转座酶DNA转染到iPSC中，成功地稳定创建了表达CAR分子的CAR-iPSC-NK细胞。 与病毒载体相比，转座子系统提供了许多好处，例如较低的免疫原性、增加的生物安全性、降低的生产成本，以及能够转移基因片段，其载荷能力接近9-10 kb。这些优势使其成为将CAR整合到NK细胞基因组中以实现持久表达的一个有力选择。然而，要充分利用转座子系统对原代NK细胞进行转染，需要进行优化，例如通过电转染提高转导效率和细胞活性。 巨噬细胞比其他造血系统中的细胞更难转染和抵抗遗传操作，因为它们有能力识别并响应外来核酸。Bobadilla及其同事创建了一种基于HIV-1的慢病毒系统，该系统通过感染时Vpx诱导的SAMHD1降解，已被证明可以有效传递转基因到骨髓细胞。Klichinsky团队使用复制缺陷的嵌合腺病毒载体Ad5F35有效地传递CAR到巨噬细胞，并同时促进M1表型的表达，最终增强了肿瘤杀伤活性。这些结果强调了基因工程巨噬细胞在癌症免疫疗法中的潜力。与生成CAR-NK细胞的方法类似，转座子系统也被用来将感兴趣的基因整合到宿主基因组中。 4.1.新型细胞来源方法推动现成的免疫细胞治疗产品 迄今为止，所有商业批准的癌症免疫细胞疗法都依赖于自体使用，即使用的材料是患者自己的细胞。尽管这种方法已证明有效，但存在一些重要的限制，例如在处理快速癌症进展的患者时制造的不良等待时间，由于患者T细胞功能障碍可能导致的生产失败，与健康淋巴细胞一起提取的恶性白血病细胞污染产品的风险，高生产成本，标准化的复杂性，以及再剂量机会的限制。因此，当前的研究工作集中在开发同种异体疗法上，以克服自体疗法的限制。特别是，CAR-NK是一种有前景的同种异体细胞治疗，对实体瘤和血液系统恶性肿瘤均无重大毒性副作用。它是一种更简单、可再注射、更实惠的通用治疗。 然而，当前的治疗尚未显示出强大的疗效和/或长期持久性，并且NK细胞更难进行工程改造。CAR-NK细胞的研究主要在临床前和早期临床试验阶段，很少有临床试验报告。尽管如此，通用的同种异体CAR-NK细胞在癌症治疗中仍显示出巨大潜力。 目前，CAR-M主要是自体疗法，但“现成的”同种异体CAR-M已经出现并正在进行进一步研究。 在开发同种异体方法时，必须系统地解决最重大的风险：免疫排斥和GvHD（移植物抗宿主病）的发展。免疫排斥可能限制治疗的效力，因为接受者的免疫系统可能会排斥移植物。GvHD可能是致命的，由供体T细胞内源性的αβ TCR复合体识别宿主肽-人类白细胞抗原（HLA）复合体引起，导致组织损伤。为了解决同种异体风险，可以采用两种主要策略。第一种是在供体αβ T细胞上除了引入CAR转基因外，还进行额外的遗传修改。另一种是选择替代的细胞来源或亚群，如诱导多能干细胞（iPSCs）、脐带血（UCB）细胞、γδ T细胞、记忆T细胞亚群、病毒特异性T细胞（VST）等。 为了消除内源性αβ TCR介导的GvHD，最直接的方法是破坏编码T细胞受体恒定（TRAC）α链的基因。Eyquem等人开发了一个案例，通过腺病毒转染和CRISPR-Cas9敲入技术将CAR构建体整合到TRAC位点，同时诱导CAR表达和TCR失活。与随机整合相比，CAR表达可以由内源性TCR启动子调控，并在暴露于抗原时模仿TCR转录，防止恒定的和过度的T细胞激活，这可能导致T细胞分化和耗竭。此外，研究结果表明，这些TRAC-CD19 CAR-T细胞在ALL小鼠模型中显示出比用逆转录病毒编码的CAR的T细胞更大的抗肿瘤效力。 此外，除了CRISPR-Cas9，基因编辑技术，如TALENs和锌指核酸酶（ZFNs），也被发现在消除TCR表达以创建“通用”供体T细胞方面有效。然而，尽管TCR缺失的CAR-T细胞降低了GvHD的风险，但其长期持久性较短，可能是由于免疫排斥。因此，科学家们敲除了β2-微球蛋白（B2M）基因以限制HLA类I分子的表达。这种方法防止了异体CAR-T细胞通过它们的TCR被识别为外来物，但仍然容易受到宿主NK细胞的溶解。因此，一项研究使用突变的B2M融合蛋白来解决这个问题。为了在激活的异体CAR-T细胞生产过程中提高HLA-II消除的效率，一些学者提出抑制CIITA或HLA-DRA、HLA-DQA和HLA-DPA基因。 iPSCs具有无限的增殖和分化潜力，使它们成为创建众多同质HLA组合库的理想资源。通过从库中选择一个HLA匹配的iPSC来源，可以最小化宿主和移植物之间CAR-T细胞的免疫排斥风险，但必须进行严格的质量控制以确保安全，因为未分化的、增殖的iPSCs可能引发不良结果。Wang等人生成了缺乏HLA-I/II、B2M和CD155的低免疫原性iPSC衍生的CAR-T细胞。 研究通过体内发挥效应功能证明了它们抑制肿瘤进展的有效性。此外，iPSCs也为生产满足临床需求的CAR-NK和CAR-M细胞铺平了道路。与分化的NK细胞或巨噬细胞相比，iPSCs可以更有效地被工程化以稳定表达CARs。Li等人通过在培养基中添加各种细胞因子和促分化蛋白来分化CAR转染的iPSCs为CAR-NK细胞。这些iPSC衍生的CAR-NK细胞在体外和体内都显示出强大的抗肿瘤活性。Zhang等人建立了一个骨髓/巨噬细胞分化协议，诱导CAR-iPS向骨髓细胞系分化，成功产生了足够的CAR-iMac细胞（iPSC衍生的CAR-M细胞）。然而，当在小鼠模型中测试时，CAR-iMacs的有效性有限。总的来说，iPSC衍生的工程免疫细胞的发展涉及复杂的生产程序，需要精确的细胞产品制造和质量保证，以支持更广泛的临床应用。 γδ T细胞表达TCRγδ并以HLA独立的方式识别恶性细胞。它不需要消除TCR表达或信号，并且GvHD的风险低或不存在。研究表明，γδ CAR-T细胞显示出与传统的αβ CAR-T细胞相似或更大的细胞毒性效应，并且在体内没有观察到GvHD。然而，它们在体外的细胞毒性能力持续性较差。此外，针对CD20的γδ CAR-T细胞在B细胞淋巴瘤的动物模型中取得了有希望的结果，目前正在进行第一阶段的临床试验。 脐带血（UCB）提供了一个容易获得的NK细胞和同种异体T细胞来源。它们富含γδ T细胞和造血干细胞（HSCs），尽管总细胞数量有限。UCB衍生的CAR-T细胞在体内显示出增强的肿瘤抑制作用，减少了IL-10的分泌，并降低了调节性T细胞（Tregs）的比例，表明了改善的治疗潜力。Van Caeneghem等人从脐带血中分离出CD34+ HSCs，然后生成CAR-T细胞。这些CAR-T细胞具有原始表型（CD45RA+ CD62L+），并且不表达TCRαβ复合体，显著降低了GvHD的风险，并有效地消除肿瘤细胞。 记忆T细胞的特征是CD45RA−CD45RO+表型，它们不太可能发展为GvHD，也不太可能迁移到表现GvHD的器官。研究表明，T记忆干细胞（TSCM）和中央记忆T细胞（Tcm）与它们的分化对应物相比，具有优越的增殖和干细胞潜力，并且在T细胞转移后的临床研究中表现出高扩张和持久性。 VSTs拥有能够识别病毒抗原的TCR，如巨细胞病毒（CMV）、Epstein-Barr病毒（EBV）等。经过CAR改造的VSTs在实体瘤中显示出有希望的结果，但与CARs相比，工程化针对肿瘤的转基因TCR VSTs更具挑战性。在肿瘤细胞中表达EBV相关抗原的霍奇金淋巴瘤患者中，输注CAR-VST细胞取得了良好的耐受性和缓解率。针对HER2的CAR-VST细胞产品在CMV血清阳性和进行性胶质母细胞瘤患者的第一阶段临床试验中显示出既安全又临床有效。值得注意的是，可以建立VST库，以覆盖大多数患者，并促进CAR-T或TCR-T重定向到肿瘤的临床使用。 PBMCs通常来自外周循环或脐带血等。它是临床目的的主要NK细胞来源。PBMC衍生的NK（PB-NK）细胞可以从HLA匹配和不匹配的供体中分离出来，扩大了潜在供体池。通常，它们显示出成熟的表型，增殖能力降低，细胞毒性增加，没有GvHD的风险。Töpfer等人已经证明，表达CAR的NK细胞系YTS以及PB-NK细胞可以成功地重定向针对前列腺干细胞抗原（PSCA）阳性肿瘤，导致大部分治疗小鼠的肿瘤被完全根除。一种短暂表达针对间皮素的mRNA CAR，MCY-M11的CAR-PBMC细胞产品已进入临床试验，它是一种混合产品，包含不同的CAR工程T细胞亚群、单核细胞和B细胞群体，展现出理想的功能和免疫表型特征。 NKT细胞，也称为CD1d限制性T细胞，是一类同时具有T细胞和NK细胞特性的异质性T细胞群。这些细胞主要识别非多态性CD1d分子，这是一种结合自身和外来脂质以及糖脂的抗原呈递分子。I型NKT细胞或称为iNKT细胞不具有HLA限制性，可能作为通用供体细胞发挥作用，但其在体内的持久性尚未知晓。研究表明，CAR19-iNKT细胞表现出抗淋巴瘤活性，并且具有增强的消除脑淋巴瘤的能力。另一种异体NKT细胞，表达带有CD28和IL-15的抗CD19嵌合受体，目前正在进行临床试验，针对复发或难治性B细胞恶性肿瘤患者（NCT03774654）。 4.2.改善肿瘤微环境以增强治疗性免疫细胞的效果 免疫细胞治疗实体瘤的效果受限于低持久性和注入后的不充分增殖，这在很大程度上归因于免疫抑制微环境，它不是被动的旁观者，而是癌症进展的积极推动者。肿瘤细胞居住在这个由浸润和驻留宿主细胞（如T细胞和巨噬细胞）、分泌因子（如IL-10和转化生长因子-β（TGFβ））以及细胞外基质（ECM）组成的异质微环境中。这些组分可以相互作用，为恶性细胞的生长、迁移和转移创造支持性环境，从而逃避免疫系统和肿瘤特异性细胞毒性T细胞。为了根除肿瘤，科学家们开发了几种策略来促进CAR工程或TCR工程治疗性免疫细胞向癌症焦点的迁移和渗透，包括利用趋化因子受体如CCR2、CXCR2、CCR4、CXCR4等。这些研究表明，CAR-T、TCR-T和NK细胞显示出增加的肿瘤渗透率，导致肿瘤退缩和增强的抗肿瘤效果。然而，将基因工程免疫细胞渗透到肿瘤中只是抗癌的第一步。有时，可能需要直接转化方法来修改免疫抑制微环境。使用免疫检查点抑制剂，如抗PD-1、抗PD-L1抗体和抗CTLA4抗体，可以改善免疫抑制肿瘤微环境。然而，它可能导致药物抗性的出现、T细胞耗竭和复发，有时甚至会导致危及生命的毒性。在肿瘤微环境中阻断TGF-β信号是另一种提高检查点抑制剂效果和增强抗肿瘤反应的方法，因为它在肿瘤信号、重塑和代谢中起着至关重要的作用。临床证据也表明TGF-β信号与对检查点阻断剂无反应的患者之间存在相关性。为了解决这个问题，已经开发了双功能抗体-配体陷阱，使用针对CTLA-4或PD-L1的抗体与TGFβ受体II外域（TGFβRIIecd）融合。它可以在肿瘤微环境中隔离TGF-β，耗尽调节性T细胞，并促进CTL共刺激。此外，通过转导优势负性TGFβ受体-II（dnTGFβRII），开发了对TGFβ有抵抗力的肿瘤特异性T细胞，并已在动物模型和临床研究中显示出治疗益处。另一种新策略是利用肿瘤微环境中高浓度的免疫抑制信号分子，通过引入嵌合开关受体（CSR），如PD-1:CD28、TIGIT:CD28、CTLA-4:CD28、TGF-βRII:4-1BB、Fas:4-1BB。CSR由PD-1、CTLA-4或TGF-βRII的细胞外域和CD28或4-1BB的细胞内域组成。T细胞与CSR一起被转导，与CAR或TC共表达，以产生工程化CTL。这些工程化CTL仍然与肿瘤细胞上的免疫抑制分子相互作用，但通过细胞内域传递共刺激信号而不是抑制信号。最近，这一策略已经进行了临床测试。这些工程化细胞被发现能有效克服免疫抑制肿瘤微环境，例如分泌更多的IFN-γ，积聚在肿瘤中，并展现出优越的抗肿瘤功能。细胞外基质为各种抗癌疗法创造了物理屏障。然而，巨噬细胞在调节ECM和展示肿瘤归巢行为方面发挥着关键作用。CAR工程巨噬细胞被证明能主动迁移到肿瘤部位，可以作为药物递送系统在抗原特异性环境中局部递送细胞因子和/或细胞毒性物质，显著改变免疫抑制肿瘤微环境，并通过吞噬作用消除肿瘤细胞。张等人使用CAR修饰的巨噬细胞解决了ECM引起的免疫细胞渗透不足的问题。体外研究表明，CAR-147巨噬细胞能够重塑肿瘤的ECM，诱导CD3+ T细胞渗透，并提高肿瘤微环境中IL-12和IFN-γ的水平，最终展现出抗肿瘤效果。 4.3.临床研究进展 从临床进展的角度来看，自2017年FDA批准首个CAR-T细胞疗法产品以来，全球已有10个CAR-T产品获得批准（补充表1）。自2013年以来，CAR-T、CAR-NK和TCR-T疗法的临床研究迅速增加，到2022年CAR-T细胞疗法的数量达到258例，值得注意的是，2023年的数据来自1月至10月（图2A）。从国家角度看，高风险细胞疗法的临床研究主要分布在美国和中国，占全球研究的80%以上（图2B）。CAR-T疗法的主要临床治疗靶点是CD19、CD22、CD20和B细胞成熟抗原（BCMA）。在血液肿瘤中，增长最快的适应症是淋巴瘤和骨髓瘤。目前，TCR-T有一种治疗产品在市场上，用于转移性葡萄膜黑色素瘤。总的来说，TCR-T在实体瘤中的进展速度比血液肿瘤快（图2C）。TCR-T的靶抗原主要集中在MART-1、HPV16-E6、NYESO、HPV16-E7等。在病症方面，TCR-T的临床研究主要用于实体瘤的治疗。这些实体瘤大多与病毒感染有关，如与人类乳头瘤病毒（HPV）感染相关的宫颈癌。此外，TCR-T在头颈、肝脏和结肠癌症的临床研究正在迅速进展（图2C）。就CAR-NK病症而言，血液肿瘤仍然是进展最快的，其中淋巴瘤病症的进展速度更快（图2C）。 图2. CAR-T、TCR-T和CAR-NK疗法的临床试验。临床试验数据统计。(A) 2018年至2023年细胞疗法临床研究的数量，分为CAR-T、TCR-T和CAR-NK几组。(B) 按国家分组的细胞疗法临床研究数量，同样分为CAR-T、TCR-T和CAR-NK几组，Y轴在50到450之间中断。(C) 针对不同适应症的细胞疗法药物的临床进展，细胞疗法药物的分组与(A)相同，适应症分为液体和固体肿瘤两组。原始数据下载自https://classic.clinicaltrials.gov/，更新至2023年10月30日。CAR-T：嵌合抗原受体T细胞；CAR-NK：嵌合抗原受体自然杀伤细胞；CNS：中枢神经系统；HPV：人乳头瘤病毒；TCR-T：T细胞受体T细胞。 CAR-NK的临床治疗靶点主要是血液肿瘤的CD19、CD22和BCMA，以及实体瘤的PSMA、HER2、ROBO1和MUC1。总的来说，TCR-T和CAR-NK仍处于早期临床开发阶段。到目前为止，CAR-M的临床研究仍处于起步阶段，只有一个I期临床试验（NCT04660929）。图2的数据可从补充表2获得。 5.结论与展望 免疫细胞治疗在肿瘤治疗中变得越来越重要。与替代免疫治疗方法（如免疫检查点抑制剂和细胞因子）相比，免疫细胞治疗表现出了优越的疗效、特异性，并倾向于引起可接受的副作用。当作为某些癌症的独立治疗时，特别是采用性T细胞转移疗法，在血液系统恶性肿瘤如白血病和淋巴瘤中显示出了显著的成功。然而，由于免疫抑制肿瘤微环境、肿瘤异质性、靶标抗原表达低等因素，一些实体瘤对单独的免疫细胞治疗更具挑战性。在许多情况下，转向另一种免疫细胞治疗或将免疫细胞治疗与其他治疗策略（如化疗、放疗、其他免疫治疗或靶向治疗）结合起来被认为是有益的，可以通过不同的机制增强整体治疗效果。目前，全球已有10个CAR-T产品获批，而DC疫苗和TCR-T各有一个获批产品。在低风险免疫细胞治疗方面，TIL和DC疫苗在治疗实体瘤方面显示出了希望。此外，CIK治疗与其他免疫策略结合使用时显示出协同的抗肿瘤效果。这些方法通常由具有不同功能特征的异质细胞组成，在治疗相对高异质性的恶性肿瘤方面具有优势。另一方面，高风险免疫治疗如CAR-T和TCR-T通常是定向的和高度特异性的，使它们特别适合相对快速增殖的恶性肿瘤。在血液肿瘤中，CAR-T和TCR-T已经得到了临床验证，它们在治疗实体瘤方面的应用正在稳步进展。而基于其生物学特性，CAR-NK和CAR-M在治疗实体瘤方面具有固有优势。TCR-T专注于特定的肿瘤相关抗原和新抗原，使它们在外来抗原如病毒相关恶性肿瘤方面受益。研究人员目前正在努力突破包括CAR-T在内的细胞治疗技术的瓶颈。新的细胞来源和降低GvHD风险和其他风险的方法为“现成的”或同种异体细胞治疗创造了机会，这些治疗可以事先准备并在需要时轻松地给多个患者使用，实现更快的诊断和癌症治疗。此外，针对CAR的新颖设计最小化了对健康组织的损害，并与传统治疗相比减少了副作用。某些设计甚至为治疗实体瘤提供了可能性。此外，修改肿瘤环境和诱导记忆T细胞的策略使得实现长期效果成为可能。同时，由于这些疗法新颖、复杂和技术性，它们可能对公共卫生和个体患者构成以前未探索的风险。TIL细胞治疗、DC/CIK细胞治疗和DC疫苗被认为是低到中等风险。风险因素包括生产中使用的生物活性物质，如抗体、细胞因子、血清、生长因子和抗生素，以及在保存、冷冻、解冻和冷链运输过程中的产品稳定性和活性风险。此外，产品本身可能存在固有风险，如不完全去除肿瘤细胞或其他不需要的细胞，以及与归巢、植入、迁移和增殖相关的潜在并发症或降低的产品活性。然而，高风险免疫疗法需要更多的操作，使用基因修饰细胞、自体干细胞或同种异体或异种细胞，这需要额外的评估。在临床上，这些疗法有时可能引发细胞因子风暴和细胞因子释放综合征（CRS），这两种都是危及生命的全身性炎症综合征。因此，这些产品的风险管理考虑相应更具挑战性。必须仔细评估产品与患者相互作用产生的即时和延迟影响的潜在风险。这些风险包括不需要的免疫原性及其相关效应，包括CRS、GVHD、移植物排斥、过敏反应、超敏反应和免疫缺陷。此外，评估与患者细胞的预期和非预期遗传修饰相关的潜在风险也很重要，包括细胞功能、细胞凋亡、生长或分化的变化、插入性突变或遗传毒性以及恶性转化的可能性。然而，准确评估免疫细胞治疗的风险仍然具有挑战性。一些真正的风险超出了预期或在临床前研究中没有被揭示。重要的是要理解风险在临床研究中无处不在，它被定义为在特定时间框架内发生不利结果的可能性。评估可接受的免疫细胞治疗风险水平涉及权衡各种因素，而不仅仅是绝对风险，而是可能随之而来的潜在治疗益处。与患有较轻微肿瘤或癌症适应症且存在适当治疗方法的患者相比，患有危及生命的晚期或严重恶性肿瘤的患者可接受的风险水平要高得多。总的来说，免疫细胞治疗的技术障碍相对较高，创新动力强，技术发展多。近年来进展呈爆炸性增长。尽管CAR-T、TCR-T和DC疫苗已获批准，但其他免疫细胞治疗仍处于早期临床和临床前研究阶段。低风险疗法如TIL面临由于无法完全消除Tregs而有限的效力。CIK细胞治疗在获取和扩增方面遇到困难。DC肿瘤疫苗受到缺乏理想的肿瘤特异性抗原、TAA免疫原性弱、难以高效诱导免疫原性DC以及体外DC致敏方法的静脉回输无法有效激活DC分化和成熟的影响。高风险细胞治疗在克服肿瘤异质性的障碍方面仍有很长的路要走。CAR-T细胞仍面临效应T细胞耗竭、细胞因子风暴和免疫抑制微环境等挑战。TCR-T细胞治疗的挑战包括如何减少TCR不匹配和针对新抗原的最小选择。CAR-NK疗法正在经历遗传操作和细胞增殖困难。尽管CAR-M可能成为有希望的抗癌疗法，但它们尚未完全实现。临床研究需要确认肿瘤相关巨噬细胞在决定TME是否可以将肿瘤靶向CAR-M转化为肿瘤支持表型方面的高适应性。然而，免疫细胞治疗在抗癌疗法的未来开发中仍具有至高无上的潜力。人们普遍认为，快速的技术创新将使这些疗法成为高效的癌症治疗手段，显著改善治疗效果，推进人类医疗保健。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：溶瘤病毒（OVs）正成为癌症治疗的潜在选择。自然和基因工程病毒表现出多种抗肿瘤机制。OVs通过直接细胞溶解、通过抗原释放增强免疫系统以及激活炎症反应来发挥作用，或者间接通过干扰肿瘤微环境中的不同类型元素、改变肿瘤细胞的能量代谢和抗血管生成作用。OVs的作用是多方面的，它们与宿主和肿瘤细胞有多种相互作用。在溶瘤病毒治疗中的一个重要障碍是病毒进入肿瘤细胞的途径以及它可能与不同的生物和非生物载体结合的可能性。在许多临床试验中，OVs已被证明能够消除对标准治疗有抵抗力的癌细胞（黑色素瘤、肺癌和肝癌）；然而，病毒本身的作用存在几种抗性元素。因此，有必要评估OVs与其他标准治疗方式（如化疗、免疫治疗、靶向治疗和细胞治疗）的结合，以提高反应率。本综述提供了OVs、它们在溶瘤病毒治疗中的使用以及这种疗法与目前用于癌症治疗的标准疗法的未来前景的全面更新。 1.引言 病毒通常被认为是导致人体致命感染的恶魔，但近几十年来，人们开始意识到可以将它们转变为保护天使，用作对抗恶性细胞的武器。使用病毒治疗癌症的想法源于一些病例报告中记录的肿瘤消退与病毒感染之间的关联。 近年来，溶瘤病毒（OVs）因其能够选择性地攻击和破坏肿瘤细胞，并可能刺激抗肿瘤免疫而受到特别关注。工程化肿瘤选择性靶向OVs具有可控的安全概况和对不同癌症的有效性，具有许多优势。被选为破坏肿瘤细胞的候选病毒必须具备某些特征：它必须是促炎性的，不应引起慢性传染病，对各种人群安全，应在肿瘤细胞中发挥溶解活性，并应具有整合到宿主基因组中的能力。促炎性的溶瘤病毒具有以下特征：存在可被免疫系统识别的抗原性，感染性，复制以触发强烈的免疫反应，以及有助于免疫识别和炎症反应的基因变异。 基因工程在开发具有可控安全概况和对广泛癌症高效性的OVs中发挥着重要作用。在这方面，OVs必须通过修改非编码突变并添加或删除某些功能、基因和非编码元素，专门为相应的肿瘤类型和肿瘤突变量身定制，以赋予它们额外的有益特性。癌症治疗使用OVs的三个研究方向是：病毒复制、肿瘤生长和免疫激活。因此，OVs的主要靶标是肿瘤细胞、宿主免疫和肿瘤微环境。大多数病毒载体通过释放肿瘤相关抗原引发免疫原性细胞死亡（ICD），随后引发抗肿瘤免疫反应。通过激活抗肿瘤免疫，OVs超越了ICIs和其他精确靶向药物的表现。OVs表现出广泛的抗肿瘤免疫增强特性。必须识别具有适当分子特征的患者，以从OV治疗中受益。因此，发现OV治疗的预测性生物标志物很重要。 2.溶瘤病毒治疗的有吸引力的病毒  病毒治疗是一种基于将OV感染的细胞引入被诊断出恶性肿瘤的宿主的治疗方法，可能是一种创新的未来癌症治疗方法。最近的研究揭示了使用OVs通过诱导系统性抗肿瘤免疫来特异性破坏肿瘤细胞。然而，这个过程并不像看起来那么简单，因为并非所有细胞类型和病毒都可用作此目的。了解不同类型病毒对选定肿瘤的肿瘤趋向性，以及它们可以包含的联合疗法，决定了选择适当和准确的病毒肿瘤治疗选项，以增加治疗的整体有效性。OVs可以是单链或双链RNA或DNA病毒，分为自然病毒株和基因修饰病毒。下面描述了合格的病毒肿瘤治疗候选病毒的主要类型，主要特征（表1）以及益处和问题（表2）： 单纯疱疹病毒（HSV），包括两个血清型（HSV-1和HSV-2），是一种带有核衣壳的包膜病毒，保护着双链DNA。HSV作为溶瘤病毒的优势如下：（i）大基因组和复杂结构，使得插入大片段和多个转基因成为可能，而不影响病毒效率；（ii）能够感染大多数类型的恶性细胞；（iii）插入多个转基因的灵活性；（iv）尽管在大部分人群中存在高频率的抗病毒抗体，但它们并不阻止病毒复制。HSV通过四种病毒糖蛋白，即gB、gD、gH和gL，与各种细胞受体结合。基于基因修饰HSV的Talimogene laherparepvec（T-VEC），编码人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），是唯一获得FDA和EMA批准用于治疗IIIB/C–IVM1a黑色素瘤的七个溶瘤HSV之一。T-VEC刺激局部和系统性抗肿瘤免疫反应。T-VEC已在两项II期临床研究中进行了评估——一项是与放射疗法联合治疗局部晚期皮肤血管肉瘤（NCT02923778），另一项是软组织肉瘤。OH2是另一种基因工程2型溶瘤HSV，表达GM-CSF以促进抗肿瘤免疫反应。G207是一种基因工程单纯疱疹病毒，缺失ICP 34.5和ICP 6区域的基因，具有直接溶瘤效应，也可以刺激系统性抗肿瘤免疫反应。G207衍生的三种基因组修饰的工程病毒是G47∆，在肿瘤中高度复制，并具有更多的细胞病理效应。 腺病毒（Ad），具有双链DNA基因组和二十面体衣壳，其C末端负责识别细胞受体。腺病毒溶瘤疗法的优势如下：病毒还破坏了癌症干细胞，触发了各种细胞死亡信号，并释放了许多损伤相关分子模式分子（DAMPs），如高迁移率盒1（HMGB1）、热休克蛋白（HSPs）和核酸。腺病毒诱导局部炎症反应，产生大量病毒颗粒，并释放肿瘤抗原，具有直接和间接溶瘤效应。 大多数溶瘤腺病毒（oAds）与柯萨奇病毒和腺病毒受体（CAR）结合感染细胞。Ad是溶瘤病毒治疗的合适候选病毒，并且由于其高遗传稳定性和可用性，是该领域研究最多的病毒之一。遗传稳定性指的是病毒保持其遗传物质，特别是治疗或所需基因，而不会随着时间的推移发生显著突变或改变的能力。2005年，中国FDA批准了第一种oAd Oncorine与化疗联合用于治疗鼻咽癌。截至2021年，人类腺病毒工作组已识别出104种注册的腺病毒基因型，其中18种目前正在进行病毒肿瘤治疗测试，自2005年至2021年共进行了59项试验。为了使溶瘤治疗有效，病毒需要基因工程改造，非必需基因必须被其他增强治疗效果的基因所取代。 正在研究的三种基因工程腺病毒，也称为条件复制腺病毒（CRAd），如下所示。第一代CRAd由Onyx-015代表，它结合并灭活p53和Ixovex-1，阻止肿瘤生长，并参与不同的临床试验。第二代CRAd包含一个工程化腺病毒Delta-24-RGD（DNX-2401），针对视网膜母细胞瘤（Rb）的肿瘤抑制途径。第三代CRAd由一种与DNX-2401相似的病毒代表，E1A启动子发生变化，以提高肿瘤抑制性能。 Maraba，一种弹状病毒，最近被认为是溶瘤病毒治疗的合适候选病毒。使用这种病毒的想法源于在溶瘤病毒治疗试验中使用类似病毒——水泡性口炎病毒，这种病毒具有更强的溶瘤活性。体外实验中，Maraba病毒对正常细胞表现出非常广泛的肿瘤趋向性，良好的肿瘤选择性和低毒性。此外，在异种移植模型中进行的体内研究显示了强大的抗肿瘤活性和优越的治疗效力。 麻疹病毒（MeV）是一种RNA副黏液病毒，对包括卵巢癌和乳腺癌、多发性骨髓瘤、间皮瘤和胶质母细胞瘤在内的广泛癌症类型具有趋向性。MeV溶瘤治疗正在与其他疗法（如化疗）联合测试，用于腹膜或卵巢癌的治疗。MeV与宿主细胞的相互作用是通过三种受体介导的，即Nectin-4、CD46和SLAM/CD150。由于存在预先存在的抗麻疹抗体，系统性给药MeV可能很困难，因此开发了几种策略，如使用细胞载体运输病毒，编码抑制免疫系统的基因，用非反应性糖蛋白替换某些糖蛋白，或与免疫抑制药物联合给药。MeV具有有利的安全性概况和有限的毒性，MeV特异性T细胞反应可能增加溶瘤病毒治疗的有效性。 新城堡病病毒（NDV）是一种在鸟类中自然发现的1型禽类副黏液病毒。它已经被用于溶瘤治疗研究五十年了；因为它不通过重组进行基因交换的过程，所以它是高度安全的。 这一点从人类是非许可宿主这一事实上可以看出。NDV通过其RIG-I受体，可以减缓肿瘤活性，并且具有非常广泛的肿瘤趋向性，包括对乳腺癌、结直肠癌和头颈部癌的趋向性。 呼肠孤病毒在环境中很常见，通过根除病毒感染的肿瘤细胞，其抗癌活性可以得到增强。尽管呼肠孤病毒已被作为治疗黑色素瘤、骨髓瘤和胶质瘤的治疗选择进行研究，但也在进行其他恶性肿瘤的试验（表3），如胰腺癌、肺癌和结直肠癌（与pelareorep和atezolizumab联合进行的GOBLET研究）。 柯萨奇病毒对膀胱癌有肿瘤趋向性，特别是。一些研究人员已经研究了柯萨奇病毒B3对结直肠癌治疗的溶瘤活性，并显示出显著的肿瘤生长抑制作用，但也出现了一些严重的副作用，如心肌炎和胰腺炎。在一项II期临床试验中，对无法切除的黑色素瘤患者进行柯萨奇病毒A21（V937）瘤内注射，6个月无进展生存率为38.6%（95% CI，26.0至52.4）（表3）。 小病毒是临床上研究用于癌症病毒治疗的最小病毒。已经研究了三种重要的方法来提高这种病毒的溶瘤活性，即与其他各种抗癌剂结合，制备具有升级的溶瘤和免疫调节功能的新型小病毒，以及使用细胞复合物作为生物标志物来监测对小病毒治疗的反应（表3）。 3.溶瘤病毒治疗的抗癌机制  3.1.选择OV  理想的OV必须满足以下要求：（i）高度靶向肿瘤细胞；（ii）快速复制和扩展；（iii）低免疫原性，减弱抗病毒反应；（iv）强烈激活免疫反应。 病毒复制和扩展涉及一系列过程，病毒在宿主生物体内复制自身并增加数量。不同类型病毒的具体机制可能有所不同，但这里是一般概述： 1. 附着和进入，病毒首次使用表面蛋白附着在特定宿主细胞上，然后通过与细胞膜直接融合或通过内吞作用进入宿主细胞。2. 释放病毒基因组。一旦进入宿主细胞，病毒将其遗传物质（DNA或RNA）释放到细胞中。3. 复制和转录。病毒基因组控制宿主细胞的机制以复制和转录其遗传物质。DNA病毒通常在宿主细胞核中复制，而RNA病毒在细胞质中复制。4. 翻译和蛋白质合成：宿主细胞的核糖体被劫持以使用病毒RNA或DNA中的指令合成病毒蛋白。5. 组装。新合成的病毒组分（蛋白质和遗传物质）被组装形成完整的病毒颗粒。6. 成熟，组装好的病毒颗粒经历成熟并获得感染其他细胞的能力。7. 释放。成熟的病毒从宿主细胞中释放出来，要么通过细胞溶解（细胞破裂），要么通过从细胞膜出芽。8. 传播和扩展。释放的病毒可以感染邻近的细胞，重复复制周期，并导致宿主内病毒种群的扩展。 低免疫原性，减弱抗病毒反应，指的是免疫系统对病毒表现出减少或弱反应的情况，特别是当病毒已经被减弱或削弱用于各种目的时，如疫苗开发。减弱的抗病毒反应涉及使用弱化的病毒形式作为疫苗。病毒被修改以减少其毒力，使其更不有害，同时仍然保留刺激免疫反应的能力。这种方法旨在诱导提供针对自然更强病毒形式的保护的免疫反应。T-VEC就是一个减弱的溶瘤病毒的例子。 在确定破坏恶性细胞的OV时，首先要考虑的是病毒骨架。DNA病毒具有多重优势，因为它们具有更稳定的基因组，并且比RNA病毒更容易进行基因工程。DNA病毒的免疫原性低于RNA病毒，并且具有更多的修复机制，减少了复制过程中错误的可能性。一些DNA病毒，如逆转录病毒，具有将其遗传物质整合到宿主基因组中的能力。RNA病毒体积较小，可以穿过血脑屏障，并且比DNA病毒具有更恒定的复制能力；然而，它们的遗传不稳定性和突变率高于DNA病毒。最常用的平台是那些带有DNA病毒的平台，如HSV-1和Ad。基因工程是增强OVs某些特性的替代方法。据报道，临床试验中有三分之二的病毒已经被基因工程改造。1991年首次尝试使用HSVs对OVs进行基因工程改造。今天，第四代基因工程溶瘤病毒可用于肿瘤免疫治疗。基因工程OVs的研究重点是提高它们的效力和安全性，主要是促进选择性复制，减少免疫原性，促进肿瘤破坏，并减弱病毒致病性。迄今为止，已有20多个病毒家族经过基因工程改造；这些包括MeVs、NDVs、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、牛痘病毒（VVs）、HSVs、Ad、痘病毒、粘液病毒和水泡性口炎病毒（VSVs）。这些转变的目的是针对病毒复制、免疫刺激的启动和肿瘤相关抗原的释放。一些临床前研究表明，工程化的OVs通过诱导所需的免疫反应发挥免疫调节作用。一个例子是通过添加GM-CSF或ICAM-1转基因来刺激宿主免疫反应。一个代表性的例子是VSV，其包膜中的糖蛋白已经被修改以减少病毒的神经毒性。已经为OVs的基因工程开发了各种策略。必须了解病毒的生物学和遗传学，以了解病毒与宿主之间的关系，并理解细胞如何防御病毒感染。基因工程使用具有不同机制的转基因来破坏肿瘤细胞。采用不同的策略替换病毒中的不同蛋白质以增加肿瘤靶向。许多病毒受体在癌细胞中高度表达，允许病毒在癌细胞中的摄取量高于正常细胞。一些受体，如层粘连蛋白、CAR、CD 46和CD155，在不同的癌细胞中表达过多，导致Ad、Sindbis病毒和Poliviruses的摄取量增加。一些病毒蛋白对肿瘤细胞有毒，并可以在病毒暴露时直接杀死细胞，而在病毒复制之前，如Ad编码的E3死亡蛋白和E4或f4蛋白。在一项研究中，VSV的糖蛋白G被一种脑膜炎病毒的变异蛋白替换，以增加VSV对恶性细胞的选择性。另一种策略是增加宿主对肿瘤的反应。T-VEC疫苗包含一个被基因改造以表达GM-CSF的Ad，增加了抗原呈递细胞（APCs）进入肿瘤免疫抑制微环境的招募，导致招募各种细胞因子，放大抗肿瘤活性。药物递送的效力与将药物递送到肿瘤床而不损害正常细胞有关，并将药物保持未降解直到它到达肿瘤。在一项研究中，用人血清白蛋白包裹的溶瘤Ad延长了病毒的存活率。在另一项研究中，人血清白蛋白涂层的腺病毒保护它免受中和抗体的侵害。 3.2.OVs的抗肿瘤机制 已经描述了OVs对肿瘤细胞作用的各种机制（图1）。 图1. 溶瘤病毒的作用机制。肿瘤细胞内病毒的复制引发免疫原性细胞死亡（ICD），随后释放肿瘤抗原激活免疫系统，重塑肿瘤微环境（TME），激活抗血管生成机制，增加肿瘤突变细胞中病毒复制，并传播病毒感染到其他肿瘤细胞。 OVs，无论是自然产生的还是由于基因工程修改，都表现出肿瘤选择性，通过靶向恶性细胞表面的受体，在癌细胞中优先复制，并引起癌细胞内途径和基因表达的细胞内异常，但不影响健康细胞。OVs可以感染健康细胞，但它们展现出抑制病毒传播的机制，这些机制在癌细胞中通常缺失。因此，在VSV感染中，正常细胞可以产生I型干扰素来阻止病毒复制，但大多数癌细胞I型干扰素信号传导有缺陷。研究表明，Semliki病毒感染在肿瘤细胞中诱导分泌WNT配体（WNT2B和WNT9B）和β-catenin（CTNNB1）的稳定，并以反馈机制减少IFNB1的表达，有利于减弱宿主的抗病毒反应。一些研究报告称，两个小鼠细胞系（NR6和B82），不表达表皮生长因子受体（EGFR），对呼肠孤病毒感染相对有抵抗力，但转染了编码EGFR基因的相同细胞系表现出显著更高的敏感性。这种感染效率的提高需要功能性EGFR，因为在表达突变EGFR的细胞中没有观察到，就像在肿瘤细胞中一样。诸如HPV、HCV和KSHV等致瘤病毒感染，已经发展出在感染期间减弱肿瘤抑制基因（如p53和RB）的机制，以促进病毒增殖，强调了这些守门人基因在控制病毒感染中的重要性。 OVs采用的主要抗肿瘤机制如下：(i) 直接肿瘤裂解；(ii) 通过激活抗肿瘤活性重塑TME；(iii) OVs的基因靶向；(iv) 破坏和重塑肿瘤部位的血管系统；(v) 肿瘤细胞的代谢重编程；以及(vi) OVs诱导的免疫原性细胞死亡（ICD）。3.2.1.直接肿瘤裂解 OVs采用的经典抗肿瘤机制是在癌细胞内复制，随后直接裂解这些细胞；这种机制被称为直接病毒诱导的溶瘤作用（图2）。因此，转基因表达并触发宿主免疫反应，从而激活抗肿瘤免疫。 图2. 溶瘤病毒（OVs）通过内吞作用或靶向一个或多个受体进入肿瘤细胞。OVs直接溶瘤作用的机制如下：(A) 大量OV复制，随后破坏溶酶体、自噬和细胞溶解；(B) OV改变通透性和线粒体代谢，随后发生细胞溶解；(C) OV决定肿瘤细胞应激反应，触发JNK途径和caspase级联反应，随后发生细胞溶解；(D) OV表面的蛋白质与TRAILR1和TRAILR2受体结合，激活TRAIL介导的凋亡（BioRender.com）。 有报道称，经过工程改造的新城堡病病毒导致肿瘤细胞线粒体膜通透性丧失，随后发生ICD。M1病毒诱导内质网应激介导的凋亡，随后肿瘤细胞溶解。携带TRAIL基因的工程病毒A4，可在病毒表面诱导TRAIL蛋白的表达，能够与肿瘤细胞上的TRAILR1或TRAILR2受体结合，并促进凋亡。这一机制通过直接肿瘤裂解在局部诱导肿瘤细胞死亡，但它也通过激活免疫系统（图2D）触发系统性反应，并激活参与肿瘤血管化的内皮细胞，减少肿瘤血管生成。3.2.2.通过激活抗肿瘤活性重塑TME OVs的抗肿瘤活性的一个复杂机制是TME重塑，激活抗肿瘤活性，局部OV诱导的炎症，以及对感染和未感染肿瘤细胞的间接介导凋亡。 肿瘤细胞的溶解释放肿瘤抗原，并在宿主中引发系统性抗肿瘤免疫反应。TME是一个由免疫细胞、血管和功能障碍的代谢途径组成的活跃的支持网络，这些途径刺激肿瘤细胞的增殖。一些环境由于肿瘤抗原水平降低和肿瘤抑制免疫细胞的浸润而被认为是免疫学上的“冷”。OVs是强大的免疫疗法剂，能够影响免疫抑制环境，创造一个有利于宿主免疫系统作用的免疫学上的“热”环境。OVs介导TME的重塑，创造一个有利于抗肿瘤免疫细胞的涌入和激活的环境，有利于肿瘤的消除（图3）。 图3. 冷TME包含基质和免疫抑制细胞。OVs引起细胞死亡。将抑制性免疫和代谢环境重塑为热TME。CAF，癌相关成纤维细胞；DC，树突细胞；IFN，干扰素；IL，白介素；MDSC，髓源性抑制细胞；NK，自然杀伤细胞；OV，溶瘤病毒；TME，肿瘤微环境；Treg，调节性T细胞（Biorender.com）。 OVs经历复制和扩增，这是肿瘤破坏的主要因素，导致新的肿瘤细胞被感染。这些复制和扩增过程是OVs特有的，并不在其他非生物癌症治疗中发现。 DC/T细胞激活 OVs通过包括先天免疫和适应性免疫以及诱导ICD在内的各种机制触发抗肿瘤免疫活性。 释放DAMPs。溶瘤病毒(OVs)导致内质网(ER)应激，随后是凋亡，病毒病原体相关分子模式(PAMPs)的释放，肿瘤相关抗原，损伤相关分子模式(DAMPs)的释放，以及先天免疫的激活。PAMPs与病毒元素一起结合到Toll样受体(TLRs)上，诱导树突状细胞(DCs)的成熟和细胞因子的释放。OVs激活的ICD可以随后释放其他DAMPs，如钙网蛋白(CRT)，ATP，热休克蛋白(HSPs)，尿酸，高迁移率族蛋白盒1(HMGB1)，以及细胞因子(IFN-α，IFN-γ，肿瘤坏死因子-α和白介素1,6,8和12)。DCs的激活。DAMPs也可以在DCs的TLR4配体(HMGB1和CRT)的支持下启动DCs的成熟。DCs在肿瘤中很少见，但代表与适应性和先天免疫系统相关的强大的专业抗原呈递细胞(APCs)。通过溶瘤效应调节肿瘤微环境中的DC群体提供了新的肿瘤抗原，并支持DCs的渗透和成熟。抗原呈递给CD4+和CD8+ T细胞后，激活效应T细胞反应，这些细胞记忆信息，在淋巴结中增殖，并迁移到肿瘤。遗传工程被用来通过删除或添加有效载荷(单克隆抗体，细胞因子和趋化因子)来修改溶瘤病毒，以增加肿瘤微环境中的免疫反应并限制不良反应。其中一个例子是添加GM-CSF，这是一种触发DCs转化为强大的APCs的细胞因子。临床前数据证明了GM-CSF武装HSVs的远隔效应。IL12也参与了DCs，T细胞和自然杀伤(NK)淋巴细胞在肿瘤微环境中的成熟，抑制调节性T细胞(Tregs)和MDSC活性，并诱导M1型巨噬细胞的极化。关于IL12的一个主要问题是其与致命炎症综合征的关联，这是由于IL12在全身的积累。为了避免这些毒性，工程化了一种表达IL12突变形式的oAd，以安全给药。 巨噬细胞的参与 TME中M2型巨噬细胞的存在是大多数癌症低总生存率的强大预后因素。在TME水平上，OVs作用于M2型巨噬细胞，这些细胞被重极化为M1表型，并表达各种促炎细胞因子和趋化因子(IFN-γ，CXCL10，各种白介素)，等等，这些因子加强了抗肿瘤免疫环境；这种效应已在一些OVs的研究中显示，包括VSVs，HSVs，呼肠孤病毒(RV)，副黏病毒(MeV和MuV)，GLV-1h68和Ad5 D24-RGD。 NK细胞的参与 NK细胞是溶瘤病毒疗法的重要介导者。此外，NK细胞参与对抗病毒感染，因此，它们可能对OVs的效力产生不利影响。OVs对NK细胞的影响包括促进NK细胞从循环中招募到肿瘤，增强NK细胞激活，并防止和逆转NK细胞的无反应性。OVs有能力裂解肿瘤细胞并触发免疫原性细胞死亡，随后释放DAMPs，被DCs检测到，促进炎症。此外，OVs感染DCs，作为对感染，肿瘤和髓样细胞的反应，产生趋化因子，招募NK细胞进入肿瘤。此外，DCs和其他髓样细胞产生各种细胞因子，增强NK细胞存活，并防止和逆转NK细胞的无反应性。当NK细胞被激活时，它们产生大量的IFN-γ并杀死肿瘤细胞。NK细胞配体在癌细胞表面的配体也由OVs调节。此外，OVs感染的细胞释放病毒蛋白，被NK细胞识别，增加激活受体的表达，并增强杀死肿瘤细胞。一些OVs介导增加细胞因子和趋化因子的产生，随后表达NK细胞抑制配体，如肿瘤细胞中的MHC-I。 已经证明，IL2武装的仙台病毒在血管肉瘤小鼠模型中增加了NK细胞的招募。在另一项研究中，表达IL-2的细小病毒(H-1PV)在胰腺导管腺癌模型中增加了NK细胞的激活。工程化的天花病毒(VV)，VV∆TK∆N1L，武装有IL12，并删除了胸苷激酶和N1L基因，作为新辅助治疗在各种小鼠和仓鼠手术癌症模型中使用时延长了存活时间。 中性粒细胞的参与 已经证明了基于VV和VSV的病毒促进肿瘤细胞凋亡的抗肿瘤效应。在临床前实验中，发现TGF-β极化的N2中性粒细胞具有促肿瘤效应，而1型IFN极化的N1中性粒细胞具有促免疫和抗肿瘤结果。N1促进CD8+ T细胞的招募和激活以及细胞因子的产生，如VGF，TNF-α，GM-CSF和IL12。一种名为PVSIPO的重组脊髓灰质炎病毒疫苗株，包括一个异源内部核糖体进入位点，被证明可以促进前列腺和乳腺癌中中性粒细胞的积累，并与改善存活相关。 Tregs的参与 Tregs也通过高表达转录因子Foxp3诱导强烈的免疫抑制活性。已经证明，感染AdCMV∆24可以降低TME中的Treg水平。最近的研究报告说，溶瘤VV可以直接感染并减少小鼠癌症模型中的Treg数量，随后产生抗肿瘤效应。 基质修饰 一些OVs针对肿瘤基质并重塑细胞外基质(ECM)以改善其抗肿瘤效应。一种表达松弛素的oAd与各种调节剂结合形成平台oAd/IL-12/GM-RLX，导致ECM降解，增强治疗性单克隆抗体的渗透，并在胰腺癌模型中促进抗肿瘤效应。此外，一种表达PH20透明质酸酶的oAd导致ECM中透明质酸的降解，从而改善了其传播。癌症相关成纤维细胞(CAFs)在许多癌症中上调，并通过成纤维细胞激活蛋白(FAP)激活基质中的成纤维细胞。肿瘤相关周细胞是胶质母细胞瘤模型中的主要基质细胞亚群。一种oAd，ICOVIR15，减少了FAP+周细胞，胶质母细胞瘤细胞和GMP相关基质FAP+小鼠细胞的数量。另一种溶瘤VV，Western reserve double-deletion (WRDD)，已被证明针对CAFs并在黑色素瘤中具有抗肿瘤效应。 3.2.3.OVs的基因靶向 基因靶向是OVs的主要抗肿瘤机制。例如，呼肠孤病毒利用通常在癌细胞中改变的特定细胞特征。在肿瘤细胞中，癌基因被激活，肿瘤抑制基因被灭活，导致特定蛋白的信号传导调节，如TP53，PTEN，RB1和RAS，并激活肿瘤形成，血管生成，抑制凋亡，侵袭和转移。这些信号级联被OVs靶向，调节肿瘤细胞中的各种信号通路。已经研究了呼肠孤病毒对肿瘤细胞培养的作用，并确定了病毒在肿瘤细胞内的有选择性复制步骤—Ras突变可以促进呼肠孤病毒进入和肿瘤转化，增强OVs的产生，诱导凋亡，并在呼肠孤病毒感染后防止干扰素产生，允许病毒由于有缺陷的抗病毒反应而扩散。呼肠孤病毒通过与特定细胞表面受体相互作用进入细胞。癌细胞上这些受体的表达或可及性的变化可能增强病毒进入和感染它们的能力。溶瘤VVs和VSVs只能感染肿瘤细胞并促进由于ras/丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)的高表达而破坏内皮细胞。有些病毒，如呼肠孤病毒，对肿瘤细胞有天然的偏好，而其他病毒，如Ads，VSVs和HSVs，必须适应这种对肿瘤细胞的选择性。 被OVs感染的健康细胞通过不同的机制抑制病毒的传播，这些机制在肿瘤细胞中通常不足。细胞的I型IFN相关抗病毒潜能与其对VSV对癌细胞的选择性相关。正常细胞产生I型IFN以防止病毒复制；然而，大多数肿瘤细胞的I型IFN产生有缺陷，因此，它们被提议用于VSV感染。3.2.4.破坏和重塑肿瘤部位的血管系统 影响肿瘤血管生成的因素由癌基因介导的蛋白的表达和诱导细胞条件的因素组成，如低pH值、缺氧、营养缺乏或诱导活性氧(ROS)。OVs的抗血管生成方式如下：(i) 直接感染肿瘤细胞，随后裂解新形成的血管的血管内皮细胞；(ii) OVs触发的免疫反应，导致细胞聚集和血流减慢；(iii) 表达病毒蛋白，阻断肿瘤诱导的促进血管生成的因子的合成（图4）。 图4. 溶瘤病毒(OVs)诱导的抗血管生成机制。(A) OVs促使中性粒细胞的招募，发展为微血栓和缺血，随后发生凋亡。(B) 工程化病毒可以诱导内皮细胞的直接裂解。(C) OVs可以调节转录因子，减少IL8的产生，从而刺激凋亡。(D) OVs与血管生成蛋白相互作用，下调VEGF的表达。(BioRender.com)。 许多OVs具有直接的抗血管特性。一种含有人类端粒酶逆转录酶元素的腺病毒，OBP-301，被设计用来调节E1基因的表达，产生具有抗血管生成效应的IFN-gamma，选择性地破坏小鼠结肠肿瘤中的癌细胞。在血管内，VSVs刺激血栓形成和炎症。 最重要的因素包括CRT、ATP、HMGB1、热休克蛋白（HSPs）和annexins[135]。增强树突细胞吞噬抗原的DAMPs之一是CRT。ATP从凋亡细胞释放并结合到巨噬细胞和单核细胞上的P2Y2受体，加速凋亡细胞的清除。HMGB1激活未成熟树突细胞中的TLR4，导致树突细胞成熟并加速树突细胞对肿瘤抗原的摄取。热休克蛋白（HSPs）能够结合到树突细胞受体上，刺激抗原肽；它们也刺激内在的促炎级联反应。Annexin A1（ANXA1）在解决炎症过程中和协助树突细胞活动方面发挥着重要作用。参与ICD发展的其他因素包括细胞因子、趋化因子、核酸和转录因子。一些溶瘤病毒（OVs）对肿瘤组织有天然的趋向性，而另一些则经过基因改造在肿瘤细胞中复制以检测特定目标并传递某些基因（图5）。 图5. 由天然溶瘤病毒（OVs）诱导的免疫原性细胞死亡途径。一些天然OVs，包括新城疫病毒（NDVs）、柯萨奇病毒（CVs）、麻疹病毒（MVs）、单纯疱疹病毒（HSVs）、牛痘病毒（VVs）、腺病毒（Ads）、森林塞姆利基病毒（SFVs）和绵羊痘病毒（ORFVs）可以诱导特定模式的免疫原性细胞死亡。NDV、HSV和Ad可以诱导多模式细胞死亡，调节濒死恶性细胞中损伤相关分子模式的暴露，随后招募先天免疫应答者并触发强烈的免疫反应。VV诱导坏死性凋亡，而CV、MV、SFV和ORFV诱导免疫原性凋亡（BioRender.com）。 免疫原性凋亡是OV诱导的细胞死亡的最常见类型。受体，如TRAIL-R、TNF-R和Fas，形成死亡诱导信号复合体（DISC），被病毒感染调节，并调节激活caspase-8，诱导凋亡。这些受体过度表达并触发caspase级联反应，启动外源性凋亡。腺病毒在肿瘤细胞中诱导凋亡，这是其自然特征。表达三聚体肿瘤坏死因子的H5CmTERT-Ad株（H5CmTERT-Ad/TRAIL）在对照组中比天然腺病毒具有更强的肿瘤杀伤效果。HSV也参与凋亡。一种工程化的oHSV-2配备了凋亡激活因子Her2-COL-sFasL，以增强感染细胞中caspase的激活并放大凋亡。坏死代表细胞通过自溶的过早死亡，包括细胞膜完整性的丧失、细胞器的肿胀和细胞死亡产物不受控制地释放到细胞外空间。坏死性凋亡是一种程序性坏死细胞死亡过程，可以诱导或增强抗肿瘤免疫。它经常与由于DNA、ATP、尿酸、核蛋白和HSPs的释放而激活的级联炎症体激活相关，这些物质激活类激酶蛋白（MLKL），随后膜通透性增加并释放DAMPs。OVs还触发目标肿瘤细胞中的多种细胞死亡过程。例如，野生型Ad血清型5诱导自噬、焦亡和坏死性凋亡细胞死亡途径。NDV触发凋亡并被发现激活内在和外在凋亡途径。溶瘤NDV株FMW（NDV/FMW）是肺、黑色素瘤和前列腺癌细胞中的ICD诱导剂，显示HSP70/90和ATP分泌，并在黑色素瘤细胞中触发凋亡、自噬和坏死性凋亡。NDV/Hitchner B1促进胶质瘤细胞中的凋亡和坏死性凋亡。 4.OVs的递送系统  4.1.溶瘤病毒的直接递送  4.1.1.瘤内递送  瘤内给药是临床试验中用于递送OVs的最常用途径。各种试验已经建立了瘤内给药的有效性，并研究了其通过避免循环洪流来保持OVs足够生物利用度的能力。瘤内局部给药方法通过减少病毒失活来利于这一过程。有限的病毒与先天免疫系统的相互作用降低了系统毒性的可能性，并通过对独特给药途径的期望病毒载量进行转移。限制因素包括由于密集的ECM而在肿瘤中达到的非治疗水平，以及由于新生血管生成而导致的瘤内灌注不足。瘤内给药的OVs可以诱导全身反应。肿瘤抗原的产生是对OVs和肿瘤细胞之间相互作用的反应。对T-VEC给药的研究显示，研究的黑色素瘤病变大小都有所减小，无论是注射的还是未注射的。 4.1.2.静脉内递送 静脉给药对于转移性癌症有益，当需要感染不同大小和位置的多种肿瘤时，以及由于肿瘤位置原因无法进行瘤内给药时。这种类型的给药可以确保OVs在肿瘤质量中更好地分布；然而，最佳OV剂量尚不确定。一些OVs在静脉给药时可以刺激更明显的免疫反应。免疫系统可以使用不同策略阻止OVs成功传播到目标组织。OVs可以非特异性地连接到血清蛋白或循环流中的循环细胞，随后被破坏。由于这些机制是先天免疫系统的一部分，它们在未暴露于特定病毒的患者中也有效，暴露史可以通过存在精确而有力的免疫反应通过抗体的存在显著破坏病毒。通过与病毒颗粒结合，抗体可以通过补体作用或被位于不同器官的巨噬细胞破坏而消除。肝脏、脾脏和肺是中和OVs的主要器官。另一个有效静脉给药OVs的障碍是肿瘤ECM和间质流体压力。高间质流体压力限制了进入肿瘤中心的通道，其中由于其周边的流体流动而具有最高值，但它也减少了大分子的通过。 4.2.通过OVs的货物系统递送 在OVs货物递送到肿瘤的领域已经进行了众多且多样的研究，可以分为生物和非生物递送系统。生物载体包括细胞、细胞膜介导的和血清白蛋白介导的OVs载体。非生物载体的OVs包括矿化纳米结构、磁性纳米结构和基于聚合物的纳米载体。 4.2.1.OVs的有机载体 细胞载体 间充质干细胞（MSCs）因其独特的生物学特性、广泛的治疗应用以及对组织工程的影响而在科学研究中受到越来越多的关注。MSCs通过分化成成骨细胞、脂肪细胞或软骨细胞来展示这种能力，并且具有广泛的分泌网络，包括多种介质、细胞因子和信号分子，除了它们显著的自我更新和多能性特征。这种分泌塑造了炎症反应，并控制了组织再生和修复所需的关键渗透过程。MSCs的调节行为是由MSC分子-靶细胞轴内的反馈驱动的。MSCs无法显示共刺激粒子，因此与较低的免疫活性有关，有机会用于肿瘤的基于细胞的免疫疗法。MSCs可能促进体外oAds的病毒复制，通过防止大鼠模型中的病毒特异性免疫反应，使运输和提高病毒的长期存活率成为可能。此外，与体内单独病毒接种相比，CR-MSCs可能减少刺激T细胞合成的IFN的数量，并导致oAds在扩散和存活方面的增加更大。全身给药的MSCs感染了肝细胞癌异种移植标本中的oAds，增强了病毒粒子的积累，并显著抑制了肿瘤增殖。另一项涉及由人类MSCs携带的复制Ad的研究，其中包括由甲胎蛋白启动子调节的E1A基因，显示在正位和皮下肝异种移植癌小鼠模型中显著限制了生长。经过全身给药后，MSCs被oAd污染，在肺和乳腺恶性肿瘤的正位小鼠模型中显示出治疗特性，提高了存活率。在转移性乳腺癌的实验模型中，全身注射工程化的人类MSCs，携带可复制病毒的副本，如Ad5/3.CXCR4和Ad5R6D.CXCR4 Ads，增加了动物的存活率。全身输注感染了HER2重定向溶瘤HSV的MSCs，在实验室模型中将感染传播到乳腺和卵巢癌细胞，随后减少了肺部和大脑的转移。对SKOV3ip.一个卵巢肿瘤异种移植的研究显示，腹腔内给药的MSCs装载了溶瘤MeVs在SKOV3ip.一个卵巢肿瘤异种移植可以进入肿瘤病变，并最终在小鼠中传播病毒感染，增加了平均寿命。针对MSCs的CRAd5/F11嵌合oAds显著抑制了结直肠癌细胞的生长。 神经干细胞（NSCs） 一些研究表明，NSCs具有迁移到脑肿瘤细胞的能力，并可能为各种抗癌剂提供运输平台。Ad（CRAd-Survivin (S)-pk7病毒）可以针对NSCs上的CD46受体。感染的NSCs迁移到胶质瘤细胞，从而减少肿瘤生长。NSCs和MSCs被用作载体在胶质瘤模型中运输oAd，观察到NSCs和MSCs都允许病毒复制并减少神经炎症。然而，NSCs释放的Ads数量多于MSCs，并且使用病毒载NSCs在肿瘤携带动物中注射瘤内，存活时间延长，这表明NSC细胞系中CXCR4的高表达是原因。Kim等人报告说，CRAd-S-pk7和NACA的组合提高了NSCs中oAds的复制，从而提高了OV的效率。 细胞膜介导的OVs系统递送 作为载体的某些实体在来自几种细胞类型的细胞外载体的多样化保护伞下共同可用。使用这些载体的好处，由生物模拟技术作为PEG化替代品，包括在环境中的安全性和耐用性，从而克服了药物递送系统的局限性。 整合来自细胞膜的运输者的主要优势在很大程度上是由于保留了它们来源的细胞内的固有功能和信号传导途径。结合这些纳米载体只包含来自单一来源的膜部分，如红细胞、血小板、癌细胞和负责免疫防御的细胞的膜，或者是从几种不同的细胞类型生成的，结果是有价值的载体选择，它们具有靶向肿瘤细胞的能力，是细胞膜的生物工程过程的结果，并且可以携带小分子，如遗传物质、特定药物和疫苗抗原。这些由细胞的基本组成部分生成的囊泡在肿瘤学试验中使用，主要是通过在它们内部运输实体或通过包裹纳米粒子-药物复合物。在所有细胞来源替代品中，红细胞为所讨论的目标提供了一些最有用的特征。可以相当容易地获得这些细胞，它们在血管系统中的平均存活时间很长，并且由于这些细胞缺乏天然细胞器，因此还有潜力封装额外数量的产品。依赖于具有混合涂层的囊泡的新模型，称为红细胞脂质体，由人工成分与红细胞膜的组合生成，对分布有益。随后，在体外和体内检查了肿瘤细胞膜，以评估病毒感染的程度及其破坏性影响。因此产生的颗粒，称为ExtraCRAd，被瘤内给药，并显示出通过clathrin介导的内吞作用的适当吸收，考虑到oAds感染需要表达CAR的需求，这是一个重要的好处。此外，这种设置对于体内抗体识别和灭活是一个重要的限制。 血清白蛋白介导的OVs系统递送 用不同材料包裹OV颗粒是一种保护它们免受免疫系统作用的策略。Ads和血清白蛋白之间的关联阻止了针对OVs的抗体的作用。抗体识别病毒的衣壳蛋白，并通过吞噬作用对它们进行涂层。因此，它们使OVs成为免疫效应细胞的目标；然而，它们也可以在细胞水平上阻止转导。白蛋白是血浆中浓度最高的蛋白质，并且具有长的半衰期。 经过基因工程改造后，白蛋白自然地结合到Ad的表面。形成病毒衣壳的最常见蛋白质具有高变区域，可以促进白蛋白和病毒之间的相互作用，但也是抗OV抗体的主要目标。使用降解ECM的蛋白酶可以增加肿瘤床中的病毒载量。透明质酸是ECM的组成元素之一。它是一种复杂的多糖，在某些癌症中以高浓度存在。透明质酸的积累可能发生在消化道癌症的上皮中，如结肠和胃。在卵巢、乳腺和前列腺癌症的肿瘤基质中，聚集是明显的。有些器官具有富含透明质酸的多层上皮和基质。在这些情况下，变化是可见的，并且与癌症进展相关。在头部、颈部和皮肤的鳞状细胞癌中，透明质酸水平降低，与肿瘤阶段有关。增加的浓度与侵袭性肿瘤和预后不良有关。透明质酸酶降解ECM并降低间质流体压力。因此，抗肿瘤剂对靶细胞的作用增加。透明质酸酶的表达增加了OVs的有效性。Hexon是Ad包膜中发现的一种重要蛋白质。衣壳蛋白与白蛋白的结合域结合。透明质酸酶的蛋白水解作用和基于白蛋白与病毒表面结合的递送机制决定了OVs的溶瘤效力。VCN-11是一种修饰的腺病毒，表达透明质酸酶和白蛋白结合域。目前正在研究其细胞毒性和逃避免疫系统的能力。这些OVs对肿瘤细胞的作用最强，并且细胞毒性是450倍。在体内，含有白蛋白结合域的OVs组中存在高滴度的中和抗体，表明它们没有作用。VCN-01是一种oAd，其透明质酸酶作用于胰腺间质基质。它可以增强化疗药物的效果。HAdV5是最好表征的Ad类型之一，靶向呼吸道上皮细胞。在具有健全免疫系统的个体中，可以轻松控制这种病毒的感染。这种病毒是溶瘤治疗的良好候选者，考虑到其个体性。这种病毒确保有效地转导到感染的细胞中。因此，在感染靶细胞后，遗传物质被转移到细胞核中。在将核酸释放到细胞核后，细胞使用病毒提供的遗传物质产生所需的蛋白质。此外，这种方法用于分裂细胞系和难以接近的细胞，如原代细胞。另一个优点是大规模生产的可能。适应悬浮培养的细胞确保了细胞培养的简便程序，从而提高了安全性并降低了生产成本。通过将白蛋白层适应病毒，可以减少OVs在肝脏中的清除。通过将适配蛋白附加到这个复合物上，可以将遗传物质传递给表达HER2或EGFRs的肿瘤细胞。此外，这种适应减少了免疫介导的清除。免疫中和可以通过阻断特定受体或将其暴露于蛋白酶体降解的抗体发生；这被称为抗体依赖性细胞内中和。先天免疫系统通过IgM抗体和补体系统与OVs相互作用。 细胞外囊泡（EVs） 细胞外囊泡是各种类型细胞释放的膜囊泡，通过携带脂质、蛋白质、RNA、DNA和碳水化合物参与细胞间信号传导，并根据其大小被分类为外泌体、微囊泡、凋亡小体和肿瘤小体。它们通常用于携带抗癌药物，如OVs。Garofalo等人报告说，Ad5D24-CpG和PTX封装在EVs中在体外和体内诱导了肺癌模型中的肿瘤周围炎症，提高了疗效和细胞毒性。来自肿瘤细胞的外泌体通常具有免疫抑制功能；然而，感染OVs的肿瘤细胞的外泌体可能具有免疫刺激功能。Labani-Motlagh等人表明，感染OVs的黑色素瘤细胞，装备有CD40（CD40L）和4-1BB（4-1BBL）配体，增强了树突细胞的激活和TME中的响应。OVs可以包含选择性在肿瘤中积累的外泌体，局部或在远处肿瘤中表达抗肿瘤效应。它们被设计成带有免疫刺激转基因的LOAd溶瘤腺病毒。LOAd感染的肿瘤细胞表达转基因包装到内体区室并作为外泌体释放。此外，mRNA在外泌体中的表达在LOAd700和LOAd703感染的细胞中显著增加。观察到任何感染的细胞都可以表达转基因，即使病毒只在肿瘤细胞中复制。然后未成熟的树突细胞被LOAd病毒感染，并在体外被外泌体激活。OVs用其免疫刺激转基因武装肿瘤衍生的外泌体，这可能部分解释了为什么局部治疗可以导致全身免疫。还证明了感染细胞中外泌体中微小RNA（miRNA）的转运发生了变化。 微粒子（MPs） 另一种用于OVs系统运输的车辆是微粒子（MPs），它们是通过外泌作用从细胞释放的直径最大为1微米的囊泡。微粒子提供免疫保护并延长oAds的释放。封装在微粒子或PLGA中的Ads为oAds提供了免疫保护。使用MPs的总循环系统对oAds的高保护增加了oAds的释放。肿瘤细胞衍生的MPs被用作oAds的货物，被运送到肿瘤细胞的细胞核，并保护Ads免受抗体的影响；由MPs携带的oAds比用游离oAds治疗肿瘤更有效。 4.2.2.无机载体介导的OVs系统递送 包括脂质体、树状分子、金纳米粒子、二氧化硅纳米粒子和氧化铁纳米粒子在内的各种类型的纳米粒子（NPs）可以与OVs链接。使用NPs递送OVs有两种策略。第一种是屏蔽和表面修饰，第二种是OV-NPs的联合疗法。将NPs递送到肿瘤部位有两种机制，即主动和被动。在被动机制中，EPR效应增加了肿瘤血管的通透性，NPs在肿瘤区域集中。主动递送涉及NPs对目标细胞的选择性结合，目的是在减少副作用的情况下增加治疗剂在肿瘤中的浓度。各种生物配体，如肽、蛋白质、核酸适体和多糖，对肿瘤细胞中的分子或受体表现出亲和力和特异性。 药物递送中的屏蔽 聚乙二醇（PEG）最常用于屏蔽NPs的表面，因为它在极端pH溶液中的生物相容性、稳定性和亲水性。PEG成功地与Ad载体结合，延长了循环时间并减少了肝脏毒性。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）是另一种通过内吞作用进入细胞的配体。阳离子脂质体（DOTAP/DOPE）被报道可以增强病毒基因组在肿瘤细胞中的转移，并增加肿瘤的通透性和优先靶向。 OV-NP联合疗法 金纳米粒子（AuNPs）在溶瘤病毒疗法中广泛使用，有助于DNA进入肿瘤，尽管存在抗体。设计了一种含有Ad的微胶粒包被的粒子，并与紫杉醇结合，显示出对肿瘤的高效性。我们测试了聚乙二醇-聚乳酸（PEG-PLA）与聚合物微胶粒的结合，携带紫杉醇到特定目标，比紫杉醇诱导了更高的抗肿瘤效应。另一种聚合物，聚半乳糖基-b-agmatyl二嵌段共聚物（Gal32-b-Agm29），涂覆了oAd，对肝肿瘤细胞表面表达的糖蛋白受体表现出非常强的亲和力。oAds也可以与水凝胶系统结合，提供决定恶性细胞细胞毒性影响的保护环境。oAds可以装载在海藻酸盐凝胶中并瘤内给药，与裸oAds相比，在肿瘤异种移植模型中显示出oAds的长效性。Almstätter等人将磁技术与OV递送结合起来，以改善OVs的递送。设计了四种磁性病毒复合模型，被证明可以提高OVs的疗效并减少系统毒性。 5.当前溶瘤病毒治疗策略  5.1.对溶瘤病毒治疗的耐药性  并非所有患者和癌症类型对病毒治疗都有相同的反应。这种治疗方法的局限性和挑战，以及治疗耐药性的存在，已经被描述。宿主对病毒的免疫反应是病毒治疗中的关键挑战。在几项临床前研究中，宿主免疫反应被证明在减少OVs的复制和更快的清除中发挥重要作用，并对降低抗肿瘤效力负责。在这种情况下，涉及OVs的新的治疗策略集中在调节宿主免疫系统以最大化抗病毒反应，从而改善肿瘤破坏[9]。已经描述了不同的耐药机制；这些包括抗病毒免疫、肿瘤细胞介导的、基质细胞和系统反应。对病毒感染的抵抗力可以在四个阶段完成：（i）病毒的进入和结合；（ii）病毒转录和翻译；（iii）细胞存活；（iv）细胞信号传导。包括中和抗体、正常细胞受体和ECM中的蛋白酶在内的多种因素影响病毒的结合和进入。在上皮-间质和间质-上皮转换期间，据报道细胞间连接得到加强，这使得OVs的渗透变得困难。 为了执行其自身基因组的转录和翻译，病毒的下一个关键步骤是适当调节宿主转录和负责将mRNA翻译成蛋白质的机制。例如，肿瘤细胞可以通过表观遗传修饰和表达几种蛋白质（如载脂蛋白B mRNA编辑酶）来影响病毒转录。几种存活蛋白保护肿瘤细胞免受病毒感染。除了表观遗传修饰外，对OVs的耐药性被发现与调节自噬、肿瘤细胞中的凋亡和促进细胞存活有关。Li等人证明了病毒治疗溶瘤活性的增加，其中Ads中的beclin-1活性促进了肿瘤细胞的凋亡。此外，对病毒感染和肿瘤细胞中的增殖的抵抗力与几个细胞存活调节因子（MEK、MAPK、MYCN、MDR1和SMAC）有关。感染的细胞释放可溶性信号，保护周围细胞免受各种病毒感染。此外，通过分泌干扰素在OVs感染的背景下触发肿瘤细胞中的干扰素受体（IFNR）基于Janus激酶（JAK-STAT）途径在抗病毒耐药性中发挥重要作用。基质细胞的抗病毒活性比肿瘤细胞更强，这影响了对OVs的治疗反应。Arwert等人表明CAFs通过干扰素调节转录因子3（IRF3）和干扰素基因刺激因子（STING）阻止病毒感染。类似地，在卵巢和乳腺癌中，肿瘤相关巨噬细胞通过分泌IFN促进对OVs的耐药性，从而创造了保护性的抗病毒状态。OVs也可以诱导局部免疫反应，随后将免疫学上“冷”的TME转化为“热”的，被免疫细胞浸润，其中干扰素信号通路发挥重要作用。干扰病毒治疗效力的机制存在于不同的水平，并涉及TME中不同细胞的相互作用。因此，上皮细胞代表了控制肿瘤中病毒传播的物理屏障。此外，肿瘤血管生成是病毒传播和感染的调节组成部分。对oncoviral治疗产生耐药性的另一个因素是肿瘤中存在缺氧区域。缺氧可以减少OVs在肿瘤细胞中的增殖并干扰肿瘤细胞的裂解机制。缺氧诱导因子1（HIF-1α）是缺氧中的主要因素，促进肿瘤细胞的血管生成和转移。除了物理限制外，前列腺素和VEGF与TME中的耐药性有关。使用病毒载体开发新疗法的困难与无效分布、肿瘤中的缺氧、血管屏障、亚优免疫反应和在细胞间水平发生的抗病毒分子机制有关。总而言之，某些机制对病毒治疗施加了一定程度的耐药性，并负责随后杀死肿瘤细胞。尽管如此，这种机制在赋予OVs耐药性方面的作用仍然不清楚。 这些数据表明需要鉴定新的因素，如肿瘤缺氧和表观遗传修饰，这些因素被认为是对溶瘤病毒治疗产生耐药性的组成部分。关于这一机制的额外数据将为研究人员和临床医生提供完美的工具，以合理设计OVs并制定适当的治疗策略。 5.2.当前将溶瘤病毒治疗与其他协同疗法结合在癌症治疗中的现状 如前所述，已经描述了在单药治疗中对OVs产生耐药性的几种因素。已经考虑了联合疗法来克服这个问题。这种方法在临床前和临床环境中的各种类型的肿瘤中证明了其有效性。 5.2.1.与化疗的结合 化疗仍然是传统的抗癌疗法。OVs与化疗在多个层面上协同作用，包括抑制免疫介导的病毒降解和中和。化疗通过多种机制补充病毒治疗，如通过增强肿瘤细胞的免疫原性、直接杀死癌细胞和阻断抗病毒免疫反应（NCT00006106、NCT00634595、NCT01584284）。环磷酰胺是一种烷化剂，可以提高使用不同病毒的病毒治疗的疗效。这种化疗药物触发的免疫调节被认为可以改善病毒的复制、传播和溶解活性。在临床前和I/II期研究（NCT00006106）中取得了有希望的结果，一种工程化的Ad载体，ONYX-015，与5-氟尿嘧啶和顺铂联合用于治疗头颈部或食管鳞状细胞癌的III期试验。联合治疗的患者反应率为79%，而单独接受化疗的患者为40%。此外，当Ad与不同的药物如阿霉素、吉西他滨、紫杉醇、伊立替康和环磷酰胺联合给药时，抗肿瘤效应得到加强。此外，在临床前研究中，对胶质瘤患者测试了替莫唑胺与OV的联合使用，并显示出良好的毒性剖面和提高的存活率。然而，OVs与化疗的结合效果仍然存在争议，需要进一步研究。尽管一些临床试验显示出有希望的结果，但其他涉及大样本的研究报告了这种联合方案的无效性。例如，Eigl等人在用多西他赛和pelarorep联合治疗的转移性去势抵抗性前列腺癌患者中，中位生存时间为19.1个月，而接受多西他赛治疗的患者为21.1个月（NCT01619813）。 5.2.2.OVs与放疗的结合 一些研究表明，病毒治疗和放疗的结合导致了有希望的治疗结果。尽管存在强有力的临床前数据，但由于缺乏一个完善的机制，这种效应是由于这两种疗法之间的协同活动。这种结合导致了改善的抗癌活性。放疗诱导的细胞修饰可以增加病毒在肿瘤中复制和传播的能力。Pokrovska等人证明，当OV与放疗结合时，通过增加病毒产生诱导了肿瘤特异性细胞毒性。在一项I期试验中，一种突变的HSV（G207）与复发性恶性胶质瘤的放疗结合，显示出临床反应的潜力。在这项研究中，9名患者中有6名显示出部分反应或稳定疾病，这被证明具有协同效应。另一种方法是，病毒治疗可以增加肿瘤对放疗的敏感性。表达p53的Ad诱导感染的p53缺陷肿瘤细胞对辐射诱导的凋亡更敏感，随后比未从放疗中受益的肿瘤细胞的凋亡减少，导致更大的肿瘤抑制。 5.2.3.OVs与免疫治疗的结合 尽管文献中关于免疫治疗和病毒治疗的结合的报告很少，但将针对PD-1和/或细胞毒性T淋巴细胞抗原-4（CTLA-4）的免疫检查点抑制剂与OV结合在癌症治疗中提供了新的视角，特别是在具有免疫抑制微环境的癌症中，其中PD-1/PD-L1抑制剂的单一疗法可能变得无效。这种疗法的溶瘤活性决定了细胞因子和其他分子的释放，这些分子具有将“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤的效果，这种修改可以改善免疫治疗对易感目标的效果。除了PD-1，一些也表达在TIL上的免疫检查点分子也被证明可以诱导免疫抑制微环境并减少活化的CD8+细胞。这一类包括CTLA-4、TIGIT、TIM-3和LAG-3。OVH-aMPD-1与抗TIGIT协同作用，并在MC38和Hepa 1-6肿瘤模型中显著改善免疫反应。然而，在难治性肺癌中，vvDD单一疗法与抗PD-1和抗TIM-3 mAbs的结合未能显示出治疗优势。重要的是，将超过两种ICIs作为治疗策略结合使用可以产生更好的抗肿瘤结果。T-VEC是一种瘤内疗法，是免疫疗法的领先组合。GM-CSF在这种结合中的作用是增强细胞免疫。T-VEC的作用来自于病毒载体的直接溶瘤效应和免疫反应触发的结合。在将T-VEC与抗CTLA4，ipilimumab联合用于治疗IIIB-IV期黑色素瘤的I期试验中，观察到了客观和持久的反应率的有希望的结果。此外，在一项开放标签的II期试验中，无论是原发性还是转移性肿瘤，与ipilimumab单一疗法相比，T-VEC与ipilimumab联合使用的目标反应率显著增加。在T-VEC与ipilimumab与ipilimumab单独用于晚期黑色素瘤的II期试验中，在5年分析中，联合治疗的中位PFS为13.5个月，ipilimumab为6.4个月，估计的5年OS在联合治疗组为54.7%，ipilimumab组为48.4%（NCT01740297）。Pexastimogene Devacirepvec（Pexa-VEC）是一种溶瘤牛痘病毒，与抗PD-1抑制剂，cepilimumab联合在肾肿瘤患者中在Ib期试验中显示出令人鼓舞的结果。这种联合疗法报告了37.5%的总体反应。腺病毒DNX-2401是一种OV，在接受恶性胶质瘤诊断的患者中进行了剂量递增研究。在那项研究中，单剂量的DNX-2401，瘤内给药，获得了不同的肿瘤反应。目前，这种OV正在与pembrolizumab联合用于胶质母细胞瘤患者的II期试验中进行研究。中期分析显示，48名接受联合治疗的患者中位总生存期为12个月，反应率为47%。将抗PD1/PD-L1与抗CTLA4和OV结合使用的三重疗法的想法最近变得非常吸引人，在其中一项研究中，Ad与抗PD-L1和抗CTLA4的结合在TNBC正位小鼠模型中显著抑制了肿瘤生长并延长了存活。通过增加CD8+ T和T记忆细胞的比例以及耗尽Tregs和极化为M1表型的肿瘤相关巨噬细胞，增强了抗肿瘤效应的协同增加，调节了TME。这种联合疗法具有很大的潜力，代表了一种有前景的治疗策略，用于改善癌症细胞治疗，应该很快就会可用。考虑到安全性、毒性剖面和有希望的结果，越来越多的ICIs和OVs正在进入临床试验。 5.2.4.激酶抑制剂的作用 药物病毒方法是用来克服对OVs的耐药性的策略之一，它将病毒治疗与针对激酶的分子治疗相结合。在临床前模型中，已经获得了重要的协同结果，明显的表现是在肿瘤组织中OVs的复制和传播显著增加。受体酪氨酸激酶（RTKs），位于细胞表面，控制大多数情况下介导细胞生长和存活的细胞内反应。一些途径，如MAPK级联或PI3K/Akt/mTOR途径，通过受体特异性配体结合在下游激活。RTKs的超激活导致细胞生长不受控制，是一个重要的药物靶标。最近，病毒治疗与RTK抑制剂的结合已经取得了一些有吸引力的效果。肿瘤间质液压力（IFP）高是有效药物递送的障碍，被认为通过阻碍病毒在整个肿瘤微环境中的接触和侵入，限制了OVs的临床效益。肿瘤组织中IFP增加的原因尚有争议。一个被认为对此有贡献的机制是异常的VEGF介导的血管化增强。Kottke等人指出，当将VEGF配体VEGF165与oReoV结合时，OV给药前给予VEGF165可以改变肿瘤血管并改善OV递送到肿瘤组织。两种酪氨酸激酶抑制剂，厄洛替尼和阿西替尼，与oHSV1结合，通过抑制oHSV1血管生成刺激病毒递送，并被报告影响小鼠胰腺肿瘤的肿瘤生长和血管生成。总的来说，这些观察结果证实了与不同的激酶抑制剂结合治疗的合理性，在临床前研究中取得了有希望的结果。此外，临床前研究的结果与药物病毒结合使用OVs与这些分子可以刺激病毒治疗在癌细胞中溶瘤效力的观点一致。 5.2.5.与细胞治疗的结合 嵌合抗原受体（CAR）-T疗法是治疗癌症的一种新颖且有前景的治疗方法，产生了有效和持久的临床反应。合成受体主要重新定向T细胞，消除表达特定靶标抗原的细胞。2017年，FDA批准了针对B细胞恶性肿瘤的抗CD19 CAR-T细胞疗法。CAR-T细胞疗法存在一些限制，包括主要毒性，限制了其对实体瘤的疗效，抗原逃逸，持久性有限，以及肿瘤渗透性差。这些都导致了新的方法，在这些方法中，CAR-T疗法与其他抗癌治疗相结合，以提高抗肿瘤效力并减少毒性。抗CD19 CAR-T细胞疗法彻底改变了B细胞恶性肿瘤的治疗。一些研究表明，CD-19在多种OV感染的肿瘤细胞类型表面表达，携带CD19-T编码基因（OV19T）。因此，CD-19刺激CAR-T细胞并触发肿瘤溶解，刺激来自死亡肿瘤细胞的OV19T的释放，可以激活内源性抗肿瘤免疫。此外，病毒治疗可以与免疫治疗和CAR-T细胞同时结合，增加TME中的免疫细胞数量并改善抗肿瘤反应。例如，可以同时给予表达IL12的Ad和全身HER-2和PD-L1阻断抗体。在临床前肿瘤模型中，这种结合显示出增强或协同效应。此外，抗CTLA4、病毒治疗、抗PD-(L)1抗体和新兴ICI抗体给药的时间是另一个需要进一步观察的重要领域。为了提高疗效并改善肿瘤反应性，需要系统探索免疫治疗在OVs和CAR-T细胞之前、之后和同时给药的效果。 6.结论及展望  溶瘤病毒在破坏肿瘤细胞方面的优势源于其本身的品质，包括直接细胞溶解、针对免疫系统、调节TME和直接特性，如调节肿瘤细胞中的特定途径、抗血管生成作用和调节肿瘤细胞代谢。基因工程在增强细胞溶解作用和肿瘤细胞攻击的多样性方面提供了巨大的优势。将病毒运送到肿瘤细胞的方法仍然是一个挑战，有多种可能性获得表现出更有效作用的OVs。在过去的几年中，许多研究已经使用非生物或生物纳米载体将OVs运送到肿瘤细胞中，并显示出有希望的结果。OVs作为单一药物疗法或与其他治疗策略结合在临床前和临床研究中都已得到证明。OVs具有抗肿瘤潜力；然而，作为一类新的抗癌治疗，它们的发展仍然存在一些特定的障碍。导致溶瘤病毒治疗失败的障碍包括OVs渗透和扩散不足、宿主抗病毒免疫、患者之间的个体差异、溶瘤病毒与病毒耐药或病毒敏感肿瘤细胞的相互作用，以及作为单一药物使用时的低或中等效力。单一OV给药的效力低是因为宿主免疫系统可能将其从血流中清除，病毒可能只在短时间内表达转基因，或者病毒传播可能受到限制。已经在用oHSV或oAds治疗的小鼠中进行了研究，在这些小鼠中，病毒颗粒被迅速清除。此外，oAds在目标组织中的效力有限且持久性低。为了克服这些限制，溶瘤病毒治疗可以与其他抗癌治疗结合使用，如化疗、放疗、靶向治疗或免疫治疗。治疗效果与宿主的抗病毒反应和OV诱导的抗肿瘤免疫之间的平衡有关；然而，影响这种平衡的生物学机制仍然不清楚。各种类型的肿瘤和癌症的不同阶段在选择OVs、运输方式及其与各种系统治疗的结合方面仍然具有挑战性。

iStock/ Marcin Klapczynski After several high-pro including BMS’ $1.5B breakup with Agenus, anti-TIGIT therapies are generating cautious optimism. TIGIT therapeutics have the potential to extend the benefits of checkpoint inhibitors to patients who can’t yet benefit from the anti-PD-1 and anti-PD-L1 therapeutics that have revolutionized cancer treatment. While the modality has seen a spate of high-pro recent mid-stage data from an anti-TIGIT therapy developed by iTeos Therapeutics shines a light on the continued interest and movement in this space. Last month at the 2024 European Society for Medical Oncology (ESMO) Congress, iTeos and GSK revealed Phase II results showing that iTeos’ anti-TIGIT candidate belrestotug plus GSK’s anti-PD-1 therapeutic Jemperli elicited promising response rates in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC). The data had been highly anticipated, with the prime ESMO presentation spot alone propelling a rise in iTeos’ shares, according to STAT News . TIGIT, short for T cell immunoreceptor with Ig and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domains, is an inhibitory receptor that is expressed on the surface of the T cells and natural killer (NK) cells, as well as other immune cells, explained Hua Wang, an assistant professor at the University of Illinois Urbana-Champagne. “Anti-TIGIT therapies . . . aim to reactivate the T and NK cells,” he told BioSpace . But while much excitement has surrounded this class of cancer therapy, companies in the space have suffered numerous setbacks, most recently in August when Bristol Myers Squibb canceled a $1.5 billion TIGIT deal and returned the asset to Agenus. Earlier in the summer, Roche and Merck each announced that recent Phase II/III studies comparing anti-TIGIT therapeutics alone or in combination, against either Keytruda or Keytruda plus chemotherapy, failed to meet the primary endpoints. Despite the challenges, the anti-TIGIT space has remained active. Roche and Merck are both continuing TIGIT studies, for example. “We believe TIGIT is a valid target, based on data and clear activity observed in some tumor types,” a Roche spokesperson told BioSpace in an email. Readouts for Roche’s Phase III trials of tiragolumab are expected this year in NSCLC, and for esophageal cancer and liver cancer in 2025. Meanwhile, Merck is conducting several Phase III studies evaluating a fixed-dose combination of its anti-TIGIT drug vibostolimab and Keytruda in NSCLC, including KeyVibe-003 , KeyVibe-006 and KeyVibe-007 . Other companies in the TIGIT space include BeiGene and AstraZeneca , as well as partners Gilead and Arcus Biosciences. The latter two companies are moving anti-TIGIT therapy domvanalimab and anti-PD-1 antibody zimberelimab plus chemotherapy into Phase III studies for lung and gastrointestinal cancers after positive Phase II data presented in the spring, as GSK and iTeos take their combo into Phase III in first-line NSCLC. Trial Design Matters The recent difficulties in the TIGIT space show how trial design affects outcomes, Michel Detheux, president and CEO of iTeos, told BioSpace by email. “Roche, Merck, and Arcus (with Gilead) each evaluated their TIGIT therapeutics combined with a PD-1 and chemotherapy in first-line NSCLC despite no pattern of care having been established to indicate that chemotherapy enhanced efficacy in that setting.” For example, in 2023, Roche’s SKY-01 Phase III trial “compared its TIGIT+PD-L1 [tiragolumab + atezolizumab] against its own PD-L1 [atezolizumab] instead of the standard of care [Keytruda, a PD-1 inhibitor], which created confusion about the performance of its TIGIT + PD-L1 and PD-L1,” Detheux said. More recently, he continued, Merck’s Keyvive-008 evaluated vibostolimab plus Keytruda in small cell lung cancer (SCLC). “Merck was attempting to beat a newly established standard of care with its TIGIT+PD-1 therapeutic, despite SCLC being an indication where TIGIT had failed previously, and where [Keytruda] also had failed.” Merck discontinued the Keyvive-008 trial. What the failed trials show is that “the immune checkpoint axis is perhaps more complicated than we thought,” Michael Gibson, an associate professor of medicine at Vanderbilt University, told BioSpace by email. “More components are involved in the tumor microenvironment than just the drug-target interaction.” Setbacks should be expected, though, Gibson added. “The nature of clinical investigation teaches us that setbacks are more common than progress. We learn a great deal from so-called negative trials.” The question of whether setbacks related to TIGIT therapeutics may be overcome “is both scientifically interesting and clinically challenging,” Gibson commented. He speculated that in the face of setbacks, this class may add therapeutic benefits as a combination therapy. While checkpoint inhibitors are the current companions of choice, there may be other possibilities. “Some insight may lie, for example, in drug mechanisms such as bispecifics and antibody-drug conjugates, combinations of inhibitors, modulation of the tumor microenvironment and even, perhaps, by affecting the patient’s microbiome,” Gibson said. Notably, “Roche found a correlation between the response to anti-TIGIT therapy and the expression level of CD-155 on the surface of the tumor cell. That’s very positive,” Wang said. “It suggests that patients who are not responding to anti-PD-1 or anti PDL-1 therapies who have a high expression level of CD-155 may respond to anti-TIGIT therapeutics.” Bright Lights Based on recent results from iTeos and GSK, as well as Gilead and Arcus, it appears the tide may be beginning to turn. At ESMO, iTeos and GSK reported that after at least 5.6 months of follow-up, 60% of patients given the belrestotug/Jemperli combo had an objective response, compared to about 30% of those given Jemperli alone. What sets belrestotug apart from most other TIGITs is that it has a mutli-faceted mechanism of action and appears effective at low doses, Detheux noted. TIGIT therapeutics by BeiGene, Roche and Merck required either “very high doses” or were ineffective, he said. Belrestotug is also the only TIGIT program that has had to comply with the FDA’s Project Optimus, with a dose-ranging exercise required to understand the efficacy and safety pro its TIGIT+PD-1 doublet, Detheux said. “We believe this will allow GSK and iTeos to succeed in selecting the optimal dose, whereas others have struggled and launched Phase III trials without conducting a more in-depth review of the dose selection.” Meanwhile, at the 2024 American Society of Clinical Oncology conference, Gilead and Arcus presented Phase II data from a combination of domvanalimab and zimberelimab plus chemotherapy in upper GI cancers. It showed that nearly 60% of patients achieved progression-free survival at 12 months. “By binding to TIGIT with Fc-silent properties, domvanalimab is believed to work by freeing up immune-activating pathways and activate immune cells to attack and kill cancer cells without depleting critical immune cells,” a Gilead spokesperson told BioSpace by email. Currently, fewer than 40% of cancer patients respond to immunotherapy . “Therefore, we need more new technology and immunotherapies and we have to keep testing. Hopefully, patients will respond,” Wang said. But, he added, whether future therapeutic options will include anti-TIGIT therapeutics remains to be seen. “I would be cautious about [speculating] whether anti-TIGIT therapeutics will be successful, but there’s some hope.”