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TIS2024第四届自免疾病细胞疗法与干细胞疗法论坛重磅来袭，点击图片查看重磅嘉宾，合作详询：王晨 180 1628 8769 （扫码立即报名获取TIS2024免费票） 本报告对外泌体的结构、分类、工程化技术、纳米递送系统的演变、商业应用、工业制备与质量控制分析、产业链上下游分析、产业驱动因素、市场容量、挑战与问题、代表公司等多方面进行了系统分析，为创业投资和产业发展提供了有力研究基础。 作    者  |  郭允乐、贾心语、王哲 编    辑  |  郭维、胡旭海、杨贺 邮   箱  |  vdcapital@vdcapital.net 刊    号  |  Vol.107 2013年，三位“外泌体“领域的科学家荣获“诺贝尔奖”，这也让“外泌体”这个名词进入大众视角，这是一种30-150nm的纳米级的脂质结构，自身对抗衰、修复、抑制炎症、美容等都具有非常显著的功效，并且它的穿透性极强、吸收更佳、无免疫原性，是一种非常优质的“活性物质递送系统”。 图1. 2013年诺贝尔生理或医学奖-外泌体 目   录 [向上滑动阅览]                  1. 外泌体概述                   1.1 递送系统的演变                   1.2 外泌体结构与形成                   1.3 天然外泌体                   1.4 工程化外泌体                   1.5 外泌体的功能应用              2. 外泌体的商业应用                   2.1 天然外泌体疗法                   2.2 工程化外泌体递送                   2.3 外泌体偶联药物                   2.4 医疗美容与护肤品                   2.5 体外诊断/早期筛查              3. 外泌体的工业制备与质控              4. 外泌体产业链分析              5. 产业驱动因素与挑战              6. 外泌体产业市场分析              7. 国内外代表性公司 Vol.1 外 泌 体 行 业 概 述  1.1  递送系统的演变 随着治疗方式从“小分子”扩展到包括“核酸”、“多肽”、“蛋白质”、“抗体”、“核酸”、“活细胞”，活性物质的递送和吸收能力成为了新的挑战。 图2. 治疗方式的演变 现代药物递送技术始于1952年，诞生了Spansule (缓释胶囊)技术，到20世纪80年代，口服和透皮制剂为小分子药物提供了长达24小时的治疗持续时间，并主导了药物递送领域和市场；1989年，基于Lupron Depot (PLGA聚合物)的批准为长效注射剂和植入剂打开了大门，并出现递送各种小分子、多肽、蛋白质的系统的百花争艳；1990年第一个Adagen (PEG化蛋白)的问世标志着聚乙二醇化药物的新纪元，在过去的30年里已开发约20种聚乙二醇化蛋白药物，该技术从1995年的Doxil (PEG化脂质体)批准开始在纳米制剂中应用，在2018年批准了siRNA药物如Onpattro (PEG化LNP)、2021年批准了mRNA药物如Comiranty (PEG化LNP)；2000年，美国政府推出了“国家纳米技术倡议”(NNI) ，被称为“纳米医学”，Mylotarg (ADC)、Doxil (PEG化脂质体)、Abraxane (白蛋白-紫杉醇复合物)成为纳米医学的典型代表；药物-聚合物复合物和偶联物中的ADC至今备受关注，2009年第一个抗体-药物偶联物Mylotarg (ADC)获批；2018年Onpattro (LNP)的获批打开了LNP递送系统的广泛应用，众多创业公司进入该领域，但还需要进一步的发展，如“内体逃逸”以实现胞质溶胶等；2017年首个眼科AAV基因递送药物Luxturna (AAV)上市，AAV等病毒递送系统进入了爆发期；2021年，exoIL-12(Exosome, 外泌体）率先进入人体临床试验，标志着外泌体递送系统进入了产业化的征途，虽然该产品由于某些原因暂停，但后起之秀ExoFlo™(Exosome, 外泌体)外泌体药物已处于临床III期，外泌体作为活性物质的递送系统将开启纳米医学和细胞与基因治疗的新篇章。 图3. 递送系统的演变 外泌体递送系统不同于传统递送系统，包含天然外泌体和工程化外泌体： 天然外泌体内部包裹了多种调节蛋白、microRNA和mRNA等天然活性物质，具有优异的治疗和美容效果，作为细胞治疗的“无细胞疗法”的重要手段。1）在医美护肤领域：ExoCoBio的干细胞外泌体已经于2018年上市销售，是世界首创将源于干细胞培养液的外泌体（ASC-EXOSOME™）成分冷冻干燥制成的产品，以具卓越的肌肤再生及抗炎效果为主要产品特征；国内“天津外泌体科技”的Y3系列美容产品已经获得欧洲的CE认证，可在欧盟进行大规模销售。2）在治疗药物领域：干细胞天然外泌体药物ExoFlo™中发现了多种蛋白和核酸物质，可替代干细胞治疗，处于美国III期临床试验；CAR-T细胞来源的EVs表达高水平的穿孔素和颗粒酶B以及CAR，有效地杀伤实体肿瘤。 表1 外泌体药物ExoFlo™中发现的调节蛋白 工程化外泌体是通过“基因工程”或“化学工程”对外泌体进行工程化改造以实现活性物质的靶向递送，可广泛递送小分子、多肽、蛋白、抗体、核酸等活性物质，具有增强的载药效率、靶向性、抵抗机体清除率等特点。工程化外泌体领域目前没有产品获批，作为药物治疗处于临床II期阶段，2023年3月，工程化外泌体代表企业Codiak由于产品开发失利而宣告破产保护，该领域开发具有一定挑战性。 1.2  外泌体结构及形成 外泌体(Exosome)是几乎所有细胞均可释放的、直径约30-150 nm的细胞外囊泡(Extracellular vesicle, EV)，由细胞内多泡体(multivesicular body，MVB) 与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中。 EV可分为Exosome (外泌体, 30-150 nm)、Ectosome (核外颗粒体, 100-1000 nm)、Apoptotic bodies(凋亡小体, 50-5000 nm)三大类。Exosome由胞吐作用(exocytosis)释放，Ectosome由质膜向外出芽(Outward budding)而分泌，Apoptotic bodies在凋亡后期由程序性死亡细胞释放（图4）。 图4. 细胞外囊泡亚型示意图 (Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 170) 在经典分泌途径中，带有蛋白质货物如胞外蛋白的囊泡在高尔基体（GOLGI）中分拣和包装，将其货物运输到质膜（PM），通过与质膜融合，膜蛋白和分泌蛋白都被有效地运输到它们预定的目的地（图5）。 各种类型的货物，如蛋白质、RNA等，也可以通过质膜向外出芽形成脱落的囊泡（核外颗粒体, Ectosome）方式运输到细胞外空间。货物通过细胞内吞作用（受体介导和自由摄取）摄取，形成初级内体（EE）。在初级内体（EE）中，货物要么被回收到质膜（PM），要么被封闭在多泡体（MVBs）的腔内囊泡（ILV，外泌体前体）中（图5）。 外泌体（Exosome）的形成始于初级内体（EE）的膜向内出芽，随后形成多泡体（MVBs）。在胞吐途径①中，多泡体（MVBs）与质膜（PM）融合，将其内容物（外泌体，Exosomes）释放到细胞外空间，外泌体货物运送到受体细胞可以通过直接与受体细胞膜融合（Membrane fusion），胞饮作用/吞噬作用（Pino- or phagocytosis），或配体-受体结合（Receptor binding）等各种机制发生；在降解途径②中，多泡体（MVBs）被运送到溶酶体（LS）进行酶辅助降解。这一途径对于抑制激活的生长因子受体的信号传导尤为重要（图5）。 图5. 不同类型EV形成通路 Extracellular protein-胞外蛋白；Receptor-受体；Cargo-货物: 蛋白、RNA等；Regular protein export/secretion-调控蛋白运输/分泌；Intraluminal vesicle (ILVs)-腔内小囊泡；Exosome-外泌体；Shed vesicle/Ectosome-核外颗粒体；PM-质膜；ER-内质网；EE-初级内体；LE-次级内体；LS-溶酶体；MVB-多泡体；GOLGI-高尔基体；NUCLEUS-细胞核；Exocytic pathway-胞吐途径；Degradative pathway-降解途径；(Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 170) 在外泌体的生成过程中，有几种蛋白密切参与，包括Rab GTPases、ESCRT蛋白，以及被用作外泌体标记的CD9、CD81、CD63、flotilin、TSG101、神经酰胺和Alix等。不同来源的细胞生成外泌体的速率、大小、组分(货物)均有异质性。外泌体腔内组分主要由mRNA、miRNA、gDNA片段、以及无数不同的蛋白质组成，这些组分类型取决于细胞的起源（图6）。 图6. 外泌体的组分和鉴定 外泌体作为细胞间物质交流和信号传递的途径，不同细胞间通过分泌携带有不同组分的外泌体实现通讯，这些分泌的外泌体被受体细胞吸收，通过释放内含物实现物质和信号的交流（图5）。 1.3  天然外泌体 使用不同细胞来源产生的“天然外泌体”已经在医美领域实现商业化，同步也正在进行多项药物临床试验，最快已处于临床III期试验，显示出不错的安全性和有效性。布局天然外泌体的代表企业包括ExoCoBio、天津外泌体科技、佰傲医学、Direct Biologics等，这些企业将是外泌体行业最先商业化的企业。 1983年，Pan和Johnstone在研究网织红细胞成熟到红细胞过程的研究里，在体外培养的绵羊红细胞培养液上清液中发现了一种从网织红细胞释放的囊泡，含有网织红细胞来源的脂质、蛋白质和酶，后来命名为“外泌体”。1996年，Raposo等发现B淋巴细胞分泌的外泌体携带MHC-Ⅱ类分子、共刺激因子和黏附因子。2007年，Lotvall和Valadi发现细胞之间可以通过外泌体中的RNA来交换遗传物质。2013年，诺贝尔生理或医学奖授予从事细胞内囊泡(外泌体)运输调控机制研究的3位科学家——James E. Rothman、Randy W. Schekman和Thomas C. Südhof，由此将外泌体研究推向了前所未有的新高潮。 图7. 细胞分泌外泌体图示 几乎所有类型的细胞，都可以产生并释放外泌体。根据不同生物来源分类，外泌体分为动物细胞外泌体、植物外泌体、微生物外泌体。 1.3.1 动物细胞外泌体 天然外泌体 哺乳动物细胞外泌体由几乎所有类型的“健康细胞”和“病理细胞”分泌，存在于不同的体液中，例如血浆、尿液、乳汁、唾液、羊膜、细支气管肺泡、滑膜以及腹水等。在循环外泌体中，80-90%来自血小板、淋巴细胞、树突状细胞、其他免疫细胞，通过循环系统到达其他细胞与组织产生远程调控作用。正是基于此，外泌体天然具有活性物质的递送功能(天然递送系统)和作为疾病的特异性生物标记物(诊断标志物)。 图8. 哺乳动物细胞外泌体 目前可通过GMP大规模生产获得动物细胞外泌体的主要包括：牛奶外泌体、人心脏祖细胞外泌体、骨髓间充质干细胞外泌体、脂肪干细胞外泌体、树突状细胞外泌体、HEK293细胞外泌体。 图9. 处于临床的外泌体种类和GMP生产 （Tzu Chi Medical Journal 2020, 32, 113-120） 1.3.2 植物外泌体 天然外泌体 植物外泌体（plant exosome）的形成区域通常始于反式高尔基体或者早期内体，随后形成多囊泡内体（MVEs）或者多泡体（MVBS），并选择性地将mRNA、miRNA、其他非编码RNA等多种RNA、脂质、DNA等结合进囊泡中，最终植物外泌体与质膜结合将内含物释放。植物外泌体体积小、组织穿透性强，在不同的酸碱度和温度下都能维持较好的理化稳定性，成为经皮递送、靶向给药、基因传递等递送理想载体。 目前，公开报道的植物外泌体研究包括葡萄外泌体、生姜外泌体、芦荟外泌体、人参外泌体、金银花外泌体、甘草外泌体、红景天外泌体、西兰花外泌体、葡萄柚外泌体、小麦外泌体、大蒜外泌体、蒲公英外泌体、洋葱外泌体等。研究发现，植物外泌体蕴含了植物中90%的活性成分，是植物有效成分浓缩的精华中的精华。1kg植物仅能提取1μg植物外泌体，而其活性却远高于1kg植物提取物。 图10. 植物外泌体或衍生的PELNV的生物功能 （Molecular Therapy. 2021, 29, 13-31） 植物外泌体含有较为丰富的miRNA，为一类长度约为22个核苷酸的内源单链非编码RNA，来自药用植物外泌体的miRNA可能作为新的生物活性成分与哺乳动物系统相互作用，外泌体作为中药活性成分的应用将越来越广泛。 1.3.3 微生物外泌体 天然外泌体 微生物外泌体的研究主要集中在细菌胞外囊泡(BEVs) ，其发现可追溯到20世纪60年代。BEVs类型多种多样，根据产生方式不同包括：革兰氏阴性细菌来源的外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMVs)、古菌和革兰氏阳性细菌来源的细胞质膜囊泡(cytoplasmic membrane vesicles，CMVs)、外-内膜囊泡(outer-inner membrane vesicles，OIMVs)、破裂性外膜囊泡(explosive outer membrane vesicles，EOMVs)。 图11. 不同的途径导致形成不同的膜囊泡类型 （Nat Rev Microbiol . 2019, 17(1):13-24.） BEVs直径范围为20-400 nm，影响多种生物过程，包括毒力因子的运输、DNA转移、噬菌体的拦截、抗生素和真核宿主防御因子、细胞解毒、细胞代谢物输出、细胞间通讯等。 BEVs与哺乳动物宿主细胞的相互作用多集中在肠道微生物菌群。肠道菌群积极促进肠道和远端器官的基本功能（相关阅读: 肠道微生态药物的发展和投资趋势）。在肠道生态系统中，微生物群与宿主之间的双向通讯不涉及直接的细胞接触。越来越多的证据表明，细菌分泌的BEVs通过向宿主细胞运输和传递调节宿主信号通路和细胞过程的效应分子来介导菌群功能，肠道微生物群释放的BEVs可能对健康和疾病有很大的影响。BEVs可能作为预防肠道感染或炎症和免疫相关疾病的治疗、营养策略，使用分离的BEVs将可能克服在免疫缺陷个体中使用活益生菌的潜在风险。肠道微生物群组成和多样性的失衡与包括癌症、神经、代谢和免疫紊乱在内的多种疾病有关，在患者和健康人群的血液和尿液样本中发现了肠道微生物群来源的BEVs，其特征与肠道微生物组高度相关，这为诊断提供了新的策略。 1.4  工程化外泌体 为了拓展其作为纳米递送系统的可能性，科学家通过生物工程、化学工程策略来设计并装载“工程化外泌体”，开发出了基于工程化外泌体的“纳米递送系统”。生物工程 (Biological Engineering)通过膜结合蛋白的遗传融合引入靶向基序，如多肽、蛋白、ASO等，代表企业有Codiak、Evox、唯思尔康、恩泽康泰等。化学工程 (Chemical Engineering)指通过“脂类化学反应”或“膜结合蛋白化学反应”或“脂质-脂质相互作用”安装不同的片段，如抗体、蛋白、适配体、小分子、聚合物等，代表企业有天津外泌体科技等。 图12. 工程化外泌体的表面修饰方式  根据外泌体纯化前还是纯化后进行装载分为三种装载方式： 内源装载 (Endogenous loading)：对来源细胞进行生物工程改造，使其分泌工程化外泌体，也称Pre production； 外源装载 (Exogenous loading)：先分离纯化好高纯度外泌体，进行负载改造，也称Post production； Per production：在外泌体形成过程中，利用物理方法破坏-再造质膜而封装活性物质，挤压出细胞膜过程中装载上目标分子的“类EVs样囊泡”； 图13. 工程化外泌体的装载方式 （Advanced Drug Delivery Reviews. 2021, 178: 113972.）  1.4.1 内源装载 工程化外泌体 内源装载 (Endogenous loading) 是在分泌外泌体的细胞上做基因工程改造，让其产生携带目标分子的外泌体。例如，构建融合表达特定蛋白和外泌体膜蛋白的质粒，通过转染等方式，让该融合蛋白在外泌体来源细胞中大量表达，这些细胞分泌的外泌体就会携目标融合蛋白。RNA、蛋白质、核酸、各种小分子，都可以采用内源装载。不过，与外源装载相比，内源装载的实验难度更大、周期更长。 图14. 内源装载方式 (Crit Rev Biotechnol. 2020, 40(6): 804-820.) 1.4.2 外源装载 工程化外泌体 外源装载 (Exogenous  loading) 的常用方法有孵育、超声透化、电穿孔、脂质体融合、化学偶联(点击化学)。 孵育是让待装载的分子与外泌体在一定条件下充分接触，依靠外泌体膜本身的疏水性被动完成装载。孵育法操作简单，不会破坏外泌体膜的完整性，主要适用于疏水小分子，装载效率受药物浓度影响，所需时间较长。 电穿孔是通过外加电场，在外泌体膜上形成临时的亲水性孔道，增加外泌体膜的通透性，使小分子物质能够穿过孔道进入外泌体内部。主要适用于装载亲水分子，过量投入外泌体有助于提高回收率。但会引起外泌体聚集，破坏外泌体膜的稳定性，也可能导致核酸药物本身聚集导致假阳性结果。 超声是利用探针超声仪对外泌体进行超声处理，使外泌体膜变形，产生瞬态小孔，增加膜的通透性，从而小分子物质扩散到外泌体中。主要用于装载亲水分子，装载后有些小分子物质也会附着于外泌体膜外侧。装载效率高于电穿孔和孵育，但对外泌体膜的损伤较大，可能导致外泌体破裂且实验重复性较差。 脂质体融合外泌体是实现活性物质直接装载的一种有希望的替代方法。为了控制和改变外泌体纳米载体的生物功能，京都大学Katsura通过用冻融技术融合脂质体和外泌体的质膜从而得到杂交的外泌体。特定遗传修饰细胞分泌的外泌体与各种脂质体融合，是非常有效的膜工程方法。如Lipofectamine含有脂质亚基，可在水环境中形成脂质体并捕获核酸，带正电的脂质体表面与带负电的外泌体质膜融合，随后释放核酸完成杂交外泌体的装载。也有研究单位利用穿膜肽（CPP）转染核酸药物到外泌体中，快速简便且高效。维渡纵横认为，脂质体融合外泌体技术与LNP的四组分原理有着异曲同工之妙，为mRNA和siRNA药物的发展提供了更广阔的空间。 图15. 脂质体融合外泌体 (Sci Rep. 2016, 25: 21933.) 化学偶联外泌体是最具商业化潜力的新兴技术，通过“脂类化学反应”或“膜蛋白化学反应”安装多种功能性分子，如多肽、抗体、蛋白、脂质、适配体、小分子、聚合物，在外泌体上进行可控、可调节的多功能化改造。化学偶联技术可控制功能化分子在外泌体上的“装载数量”与“装载位点”，实现多种功能化分子的“多元装载”，用于靶向递送、药物示踪等。值得注意的是，外泌体偶联药物(EDC)的高效Payload装载，突破了抗体偶联药物(ADC)载药率低、安全性有限的瓶颈。根据维渡纵横统计，天津外泌体科技有限公司(简称“天津外泌体科技”)可能是国内唯一掌握该技术商业化的公司，根据已发表文章显示其药物装载率达92.3%、溶解性提高71.4倍、半衰期提高36.2倍、药峰浓度提高3倍、 口服相对生物利用度提升2.6倍；装载Herceptin抗体的外泌体呈现靶向效果相比对照组提升174.5倍。 图16. 外泌体化学偶联技术 1.5  外泌体的功能 不同的细胞通过分泌携带不同组分的外泌体实现细胞间通讯，这些外泌体被受体细胞吸收，通过物质交换或释放内含物实现物质和信号的交流。 外泌体与受体细胞的信息交流可能通过以下四种途径实现：1）外泌体表面膜蛋白被目的细胞表面受体识别，激活靶细胞；2）外泌体在蛋白酶作用下产生的表面膜蛋白碎片作为目的细胞表面受体的配体；3）外泌体脂膜与目的细胞膜融合，将蛋白质和 RNA等内容物释放进去；4）目的细胞通过胞吞的形式摄入外泌体。 经由以上几种途径，外泌体将其携带的生物信息运输到靶细胞或经体液运输而被远端组织细胞摄取，进而影响目的细胞的基本功能和基因表达，这些外泌体参与了一系列生理和病理过程，如繁殖和发育、抗原呈递、免疫调节、组织愈合、感染、代谢和心血管疾病、神经退行性疾病、癌症发生发展等。 Vol.2 外泌体的商业应用  外泌体在美容抗衰、药物治疗、递送载体、体外诊断和科研试剂方面有着广阔的应用前景，其中美容护肤抗衰产品已率先实现了商业化。本章将详细阐述：天然外泌体疗法、工程化外泌体递送、外泌体偶联药物(工程化外泌体)、医疗美容与护肤、体外诊断早筛的商业化应用。 2.1  天然外泌体疗法 干细胞由于其旁分泌机制发挥治疗作用成为再生应用中最流行的外泌体细胞源。间充质干细胞、胚胎诱导的多能干细胞、组织特异性干细胞、初级前体和成熟细胞等分泌的外泌体都有案例成功应用于再生治疗中。同时，科学家也发现免疫细胞来源和肿瘤细胞来源的外泌体可用于肿瘤免疫治疗和开发肿瘤疫苗。 表2. 天然外泌体疗法全球临床进展 2.1.1 肺部感染和ARDS治疗 天然外泌体疗法 2021年3月，美国FDA批准Direct Biologics公司的干细胞外泌体药物ExoFlo™的IND申请，顺利进入临床I/II期试验。它是从人骨髓间充质干细胞中分离出来的细胞外囊泡型生物产品——外泌体，首发适应症为治疗中度至重度新型冠状病毒感染和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。根据Direct Biologics公司披露，ExoFlo™的II期临床没有出现不良事件(AE)和重大不良事件(SAE)；ExoFlo-15ml组的死亡率具有统计学意义上的降低，与安慰剂组相比，在18-65岁的呼吸衰竭患者中，绝对和相对风险分别降低了30.8%和61.6%；在18-65岁的ARDS患者中，死亡的绝对风险和相对风险分别降低了41.9%和57.7%。2022年7月，ExoFlo™进入临床III期试验，2023年1月，ExoFlo™完成了400例患者的临床III期临床入组，是美国FDA首次批准应用干细胞外泌体用于疾病治疗的重大里程碑。ExoFlo™除了新冠感染治疗和ARDS适应症外，其他适应症包括克罗恩病、肠易激综合征、溃疡性结肠炎、器官移植排斥、下腰痛，处于临床I期试验阶段。 Direct Biologics公司认为ExoFlo™的成功源自公司的cGMP放大工艺和无菌工艺获得了超纯无菌外泌体；每毫升可提供超过100亿个外泌体带来了优异的功效；完美的质量控制使每一瓶外泌体都具有质量一致性。 图17. ExoFlo产品 西比曼的haMPC-Exos用于肺部感染处于IIT研究，入组了60例志愿者，正在瑞金医院开展（NCT04544215）。 肺损伤相关实验研究表明，干细胞外泌体具有积极的治疗作用。Vitti Labs的外泌体药物EV-Pure用于治疗肺纤维化和女性生殖障碍/原发性卵巢功能不全适应症已经于2022年10月进入临床I期（NCT05387239）。 2.1.2 心血管疾病治疗 天然外泌体疗法 干细胞外泌体的心脏保护机制已成为研究热点，越来越多的研究证实，干细胞外泌体具有与干细胞相似的心脏保护功能，能显著提高心肌细胞的存活率、抗心肌细胞损伤、促进新生血管形成、改善心脏功能、抗炎、抗心肌细胞凋亡、促进心肌细胞再生。外泌体具有较好的稳定性，较少引起受体细胞的突变以及免疫排斥反应，有望成为治疗心血管疾病的有效方法。 间充质干细胞外泌体在治疗心血管疾病如心肌梗死和心力衰竭方面具有巨大的潜力。《Stem Cells journals》发表了相关综述，讨论了间充质干细胞外泌体促血管生成、增强其生物活性改善心脏组织修复的方法。2022年4月，由Tehran University of Medical Sciences发起的Mitochondria and MSC-derived exosomes用于治疗心肌梗塞的临床试验正式开展，入组了20例志愿者来评估疗效（NCT05669144）。 间充质干细胞外泌体在缺血性心脏病中具有很好的疗效。发表在《BioMed Res》杂志的研究发现，间充质干细胞外泌体的注入抑制了缺血性心脏病疾病模型大鼠的心脏的纤维化和炎症反应，并且明显改善了心脏的功能。2021年9月，伊斯法罕医科大学的最新临床研究（NCT03384433）通过5例患者探索了携带miR-124的间充质干细胞外泌体对缺血性心脏病的临床治疗作用。 2.1.3 肝肾损伤治疗 天然外泌体疗法 肝脏疾病相关实验研究表明，干细胞外泌体具有保护和治疗作用，Du等研究证明干细胞外泌体通过激活SPhks和s1p信号通路保护肝脏免受肝缺血/再灌注损伤，促进细胞增殖；Li等研究发现干细胞外泌体可以通过抑制肝细胞上皮间充质细胞的转移和胶原蛋白的生成来改善肝纤维化。 肾损伤相关实验研究表明，外泌体中携带的miRNA和蛋白能够减轻肾缺血/再灌注损伤，减少细胞凋亡，促进细胞增殖，从而修复肾损伤。2022年4月，ILIAS Biologics公司的外泌体药物ILB-202进入了临床I期，靶向NF-κB用于治疗急性肾损伤。 图18. ILB-202机制 2.1.4 眼科治疗 天然外泌体疗法 外泌体可在泪液、房水、玻璃体液、血液等眼部体液中稳定存在，在调节眼部细胞迁移、增生、凋亡、免疫反应、血管生成等方面发挥重要作用，与角膜损伤、糖尿病视网膜病变、年龄相关性白内障、青光眼、年龄相关性黄斑变性、葡萄膜黑色素瘤等眼病关系密切。 Erciyes University的治疗产品Wharton jelly derived mesenchymal stem cell exosomes处于II/III期临床（NCT05413148），用于治疗视网膜色素变性。该研究于2022年8月开始，入组135例志愿者。 原生生物的间充质干细胞外泌体PSC-MSC-Exo处于IIT研究，用于治疗干眼症。中山大学脐带来源间充质干细胞来源的外泌体也处于IIT研究用于治疗干眼症。 2.1.5 肿瘤治疗 天然外泌体疗法 肿瘤细胞来源的外泌体通常包含一些肿瘤抗原，可以使抗原递呈细胞激活，故而外泌体可用于肿瘤疫苗的开发，且一些研究发现此类肿瘤疫苗具有很好的可行性和安全性。医药魔方数据显示，复旦张江的Chimeric exosomal tumor vaccine（嵌合外泌体肿瘤疫苗）目前处于临床I期研究，用于治疗膀胱癌。 图19. 外泌体在肿瘤免疫中的功能 免疫细胞来源的外泌体能够介导和调节机体对肿瘤的免疫反应，外泌体在肿瘤免疫治疗方面的潜力受到广泛关注。树枝状细胞（DC）产生的外泌体包含大量的MHC-多肽复合物和免疫刺激相关的分子，能够激活相关的T细胞，介导体内抗肿瘤应答，在多个临床试验中表现出良好的抗肿瘤疗效。CAR-T细胞来源的EVs表达高水平的穿孔素和颗粒酶B以及CAR，诱导表达其同源抗原的肿瘤细胞死亡，EV由于体积小，能够跨越生物屏障，可以有效地穿透实体肿瘤，该文章CAR-T-Derived Extracellular Vesicles: A Promising Development of CAR-T Anti-Tumor Therapy发表于《Cancer》(Cancers 2023, 15(4), 1052)。 图20.  T淋巴细胞衍生的细胞外囊泡参与免疫反应 2.1.6 软骨损伤治疗 天然外泌体疗法 骨关节炎是临床常见病，以关节软骨损伤、软骨下骨硬化、滑膜炎症等为特征。近年来大量研究表明，干细胞外泌体具有抗炎、免疫调节、促进组织修复和再生等作用，是治疗骨关节炎和软骨损伤的新疗法，不同干细胞来源的外泌体对骨关节炎均能起到保护和治疗的作用。SF-MSC-EX用于治疗软骨损伤处于临床II期试验阶段（ NCT05261360），该试验于2022年3月开展，入组受试者30例。Cells for Cells的CelliStem OA-sEV处于临床I期，用于治疗膝骨关节炎。四川大学华西医院的Autologous AdMSC-Exo治疗骨关节炎已开展IIT研究。 2.1.7 其他治疗 天然外泌体疗法 干细胞外泌体可以用于治疗脑卒中、糖尿病、卵巢早衰、克罗恩病、肠易激、皮肤相关疾病、移植物抗宿主病、伤口愈合等疾病。 2.2  工程化外泌体递送 外泌体的作用不断被发掘，广泛作为药物、医美护肤、疫苗的递送载体。外泌体载体作为“新型纳米递送系统”，综合了细胞药物递送和纳米技术的优势，一经发现就备受学术界和工业界关注。 外泌体作为递送载体具有诸多优势：a. 具有天然的靶向能力，通过工程化修饰，可靶向到特定的组织和器官，解决传统递送系统难以解决的靶向问题；b. 无免疫原性，包裹的核酸药物不易降解，降低药物全身暴露毒性；c. 外泌体是纳米级的，并携带细胞表面分子，具有克服生物屏障的能力；d. 可跨越血脑屏障，实现颅内药物递送；e. 奶源外泌体可将易降解药物制成口服制剂；f. 外泌体更容易储存；g. 作为天然纳米颗粒可降低安全风险（相关阅读：纳米递送系统行业研究报告）。 科学家通过内源装载或外源装载的技术手段（1.4 工程化外泌体），构建工程化外泌体，装载递送蛋白类、核酸类、多肽类分子实现创新药和疫苗（1类新药）、装载小分子化学药或中药有效成分实现老药新用（2类新药/505b2），提高患者用药效率、降低用药频率、联合用药提升治疗效果、减少全身暴露的副作用，是全球给予厚望的下一代革命性纳米递送载体。截至目前有5个工程化外泌体药物进入临床试验，1个处于IIT研究（表3）。 表3. 工程化外泌体全球临床进展 2.2.1 装载蛋白 工程化外泌体递送 CovenD24（也称EXO-CD24）由OBCTCD24 Ltd和Elpen Pharmaceutical Co. Inc.联合研制，用于抗新冠肺炎，共计开展了一个临床I期试验和4个临床II期试验（NCT04969172、EudraCT2021-002184-22、EudraCT2021-004259-17、NCT04902183、NCT04747574），先后共入组了526例志愿者，取得积极成果，超过90%的参与试验的新冠重症患者在5天内治愈出院。CovenD24是一种以外泌体为载体、内含CD24蛋白的药物，CD24主要通过与特定细胞受体结合，能够抑制免疫反应及细胞因子释放，抵抗COVID-19。但目前CD24这一靶点尚无新药获批，默沙东以4.25亿美元预付款收购的CD24-Fc融合蛋白药物（MK-7110）终止了新冠肺炎的临床III期试验，实体瘤适应症正在开展临床I/II期试验。所以CovenD24选择CD24或具有较大研发风险。 图21. CD24/Siglec-10信号通路 CD24与巨噬细胞上的Siglec-10互相作用，可抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬，敲除CD24或Siglec-10，将促进巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。CD24被认为是一种新型肿瘤免疫靶点，与明星分子CD47一样，也是一种肿瘤细胞“别吃我”信号蛋白。 exoIL-12™和exoSTING™由Codiak BioSciences研发，是基于该公司工程化外泌体技术平台engEx™ PLATFORM开发的两款产品，也是全球最先进入临床的工程化外泌体递送药物。该平台使用PTGFRN和BASP1作为支架蛋白，将靶向配体或治疗分子安装到外泌体的表面PTGFRN蛋白上或腔内BASP1蛋白上，达到运输至靶组织靶细胞和治疗疾病的作用。 图22. engEx™ PLATFORM外泌体递送平台 exoIL-12™是一种外泌体治疗候选药物，通过外泌体支架蛋白PTGRFN在表面展示完全活性形式的IL-12。回溯历史，白介素类产品通过激活T细胞和NK细胞具有强大的抗肿瘤免疫反应，但由于无法在局部持续保留、全身暴露引起严重不良事件，导致多个临床试验失败，特别是在刚刚过去的2022年，所以Codiak在外泌体全新领域再叠加风险极高的IL-12或将带来较大的研发风险。 小贴士 白介素临床失败案例 2009年11月，罗氏的重组IL-12（Ro24-7472）宣告II期临床试验失败； 2022年3月，BMS与Nektar合作开发的IL-2受体激动剂NKTR-214联合Opdivo治疗黑色素瘤的III期临床试验宣告失败； 2022年8月，Moderna停止开发靶向IL-2的治疗自身免疫性疾病的mRNA药物mRNA6231； 2022年8月，Codiak宣布暂停推进exoIL-12™的II期临床试验，具体原因未披露； 2022年9月，红细胞治疗先驱Rubius首发的两个产品RTX-224（IL12/4-1BBL）、RTX-240（IL15/4-1BBL）也是触碰了白介素的魔咒宣告I期临床试验失败并破产清算； 2022年10月，赛诺菲宣布终止偏向性IL2疗法SAR444245的II期临床试验； 2022年11月，IL-2/IL-15激动剂NL-201宣布临床I期失败，Neoleukin公司裁员70%； 2023年1月，默克转让IL-12类似物M9241给PDS Biotechnology。该分子于2011年进入临床I期，至今已开发12年，仍处于临床II期试验，可见白介素类产品开发的难度之大； 2023年2月，阿斯利康放弃IL-12产品MEDI9253的推进。 exoIL-12™适应症为皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL），给药途径为瘤内注射。2020年12月，Codiak公布临床Ⅰ期试验达到了主要终点，55例健康志愿者中显示出良好的安全性和耐受性，没有局部或系统治疗相关的不良事件，也没有检测到IL-12的全身性暴露。2022年6月，Codiak公布CTCL试验部分，2例患者均得到治疗，每位患者在多个肿瘤病变处接受了20余次exoIL-12注射(6.0 μg)，治疗时间大于6个月，未观察到3级及以上治疗相关不良事件。患者001表现出部分缓解，疾病负担减少61%，注射和未注射的所有皮肤病变CAILS评分的改善范围为20-80%，治疗医生认为不需要再注射。患者002注射了20次，疾病负担降低了43%，注射和未注射的所有病变的CAILS评分均有30-50%的改善。披露数据结果的同时宣布将于2023年第一季度启动II期试验，但2022年8月公司突然公告暂停exoIL-12™的临床II期，具体原因未披露。 图23. exoIL-12™的结构 exoSTING™是将STING激动剂纳入外泌体腔内，同时在外泌体表面表达高水平的PTGFRN蛋白，以促进肿瘤抗原提呈细胞的特异性摄取。该产品依然通过瘤内注射方式治疗头颈部鳞状细胞癌、三阴性乳腺癌、甲状腺间变性癌、皮肤鳞状细胞癌，2022年9月完成27例志愿者参与的临床I/II期试验。在所有剂量队列中，exoSTING耐受性良好，未观察到三级或更高级别的剂量限制毒性或治疗紧急不良事件，但在3例患者中观察到与治疗相关的不良事件(TRSAE)——2例二级细胞因子释放综合征、1例一级发热。在注射肿瘤和远端非注射肿瘤中观察到抗肿瘤活性的迹象。数据支持将exoSTING推进到II期临床，特别是在早期疾病中，与免疫治疗结合可能疗效增强。公司计划2023年第一季度启动临床II期试验，但2022年8月公司突然公告暂停exoSTING™项目。 图24. exoSTING™的结构 2.2.2 装载核酸 工程化外泌体递送 exoASO™-STAT6是在外泌体表面装载了针对STAT6转录因子的反义寡核苷酸(ASO)，同时在外泌体表面表达高水平的PTGFRN蛋白以促进选择性靶向M2极化肿瘤相关巨噬细胞的摄取。该产品适应症为晚期肝细胞癌(HCC)、胃癌转移至肝脏、结直肠癌转移至肝脏，给药方式为静脉注射，处于临床I期阶段，入组30例志愿者，暂无临床数据披露。 图25. exoASO™-STAT6的结构 2.2.3 装载小分子 工程化外泌体递送 将小分子药物装载于外泌体有利于提高药物的稳定性、溶解度、生物利用度、靶向性等, 增强药物的有效性和安全性。小分子既可以装载在外泌体内部，也可以装载在外泌体表面，但需要筛选一些适合装载的小分子，方法有共孵育、挤压、超声、反复冻融、微流控、供体细胞共培养和再分泌以及下文提到的外泌体偶联药物。 目前已经有研究团队研究了外泌体装载紫杉醇、阿霉素、紫草素、青蒿琥酯等分子，表现出优异的效果，为后续新药的开发奠定了坚实基础。 图26. 牛奶外泌体-阿霉素的内部装载 （Journal of Extracellular Vesicle, 2021, 10 (13): e12163） 2.2.4 口服给药 工程化外泌体递送 牛奶是外泌体的可扩展来源，含有来自多种细胞来源的丰富外泌体，已经证明牛奶外泌体(MEs)是进化上保守的细胞外囊泡(EV)，具有良好的稳定性和低免疫原性，显示出优异的跨物种耐受性。牛奶外泌体可以在胃中的强酸性条件和肠道中的降解条件下存活，保持结构的完整性，从而在局部或运输到循环系统后发挥作用。牛奶外泌体穿越胃肠道屏障的能力使其成为一种有前途的口服给药工具，已被广泛接受为运输多种生物分子和化疗药物的有前途的口服药物载体。 2023年3月11日，天津外泌体科技（Tingo Exosomes Technology Co., Ltd）开发出mRNA-牛奶外泌体新型口服递送系统，相关研究成果于发表于《Vaccines》。牛奶外泌体能够保护mRNA免受消化道酶和pH值变化等因素影响，基于这些特性，天津外泌体科技研发团队开发出高效mRNA-牛奶外泌体新型口服疫苗，初步实现SARS-CoV-2 RBD mRNA的口服递送。 图27. mRNA-牛奶外泌体新型口服疫苗 （Vaccines 2023, 11(3), 673） 2.3  外泌体偶联药物 2021年7月26日，Nature子刊Nature Biomedical Engineering在线刊发了中科院魏炜教授团队联合首都医科大学陶勇教授团队和昆士兰大学余迪教授团队共同署名文章，开发出外泌体偶联VEGF单抗，利用Treg来源的外泌体(rEXS)为载体，通过基质金属蛋白酶(MMP)敏感肽段(cL)连接VEGF抗体(aV)，创建了rEXS-cL-aV体系。当玻璃体腔注射后，利用rEXS向炎症部位的趋化性，携带aV富集于眼底新生血管病灶，随后利用病灶部位高表达的MMP酶解敏感肽段cL并释放aV，在小鼠模型中证明其潜在成药性，疗效显著优于VEGF单抗，具备强大的市场潜力。 图28. 外泌体偶联VEGF单抗 (Nat Biomed Eng. 2021, 5(9): 968-982) 天津外泌体科技自主研发的“EXC外泌体生物靶向药物递送平台” (Exosome-Xenobiotic Conjugation) 已经实现Her2抗体负载的外泌体靶向递送，外泌体对Her2抗体的负载阳性率高达76%，抗体负载后的外泌体在37℃与4℃下被Her2阳性细胞摄取率分别高于对照组阴性细胞6.3倍与174.5 倍(相关阅读：天津外泌体实现外泌体外源装载靶向递送)。除了偶联抗体，天津外泌体科技使用小分子青蒿琥酯作为模型药物，实现了超过90%的装载率和包封率，每个外泌体可装载超过7×10E5个青蒿琥酯分子，实现了毫克级药物装载。该公司利用EXC平台设计并制备了首个EDC (Exosome-Drug Conjugation) 模板药物，外泌体表面化学偶联抗体和小分子，突破ADC药物载药率低、安全性有限的瓶颈。 图29. EDC相对ADC的潜在优势 2.4  医疗美容与护肤 “外泌体/细胞外囊泡”携带原细胞分泌的蛋白质、活性因子等高生物活性物质，激活细胞再生功能，渗入皮肤后释放囊泡包裹的营养物质，持续滋养，调整细胞微环境，增强细胞活力，进而促进细胞迁移，促进胶原蛋白及弹性修复损伤、细胞再生，恢复皮肤年轻态，在医疗美容与护肤品领域的应用非常有潜力。 韩国ExoCoBio（ASCE+™、EXOMAGE™ 和 CELLTWEET™）、佰傲医学（芙媄逸、绽媄娅、秘零）、远想生物（凝光E.R.T）、三禾医疗（奥永丽）、捍马医疗（奥本源）、天津外泌体科技（牛奶外泌体原料+Y3）、娇韵诗（光芒小瓷瓶）等公司的产品已陆续实现商业化落地。 图30 ExoCoBio外泌体美容护肤品的机制 2.4.1 皮肤修复 医疗美容与护肤品 2019年，ExoCoBio在Stem Cell Research and Therapy上发表了一篇科学论文，证明干细胞来源的外泌体可以显著改善“特应性皮炎”，抑制多种炎症靶点，促进伤口愈合，在世界上属首次系统化的报道。研究表明，干细胞具有旁分泌的特性，能够修复损伤组织、促进细胞生长及调节免疫反应，其分泌的外泌体作为细胞分泌的关键一环，可以通过大部分毛细血管到达远处损伤部位，并且可以与现有已知活性药物进行组合，增强疗效，促进炎症消除和伤口愈合。 “ASCE plus-SRLV”是世界首创将源于干细胞培养液的外泌体（ASC-EXOSOME™）成分冷冻干燥制成的产品，以具卓越的“肌肤再生”及“抗炎”效果为主要产品特征。产品组成为含有冷冻干燥的外泌体及多种有效成分的粉末安瓶及液态安瓶，使用时将两种安瓶混合后使用。ASCE plus外泌体可以减少55%的炎性细胞因子，促进7倍的胶原蛋白合成，以及增加3倍的弹性蛋白合成，达到皮肤修复再生、延缓衰老、改善痘肌、炎症等作用，从而全方面改善皮肤问题。2021年6月，ExoCoBio公司与biobijou公司合作进入中国市场。 图31. 美容产品ASCE+ 2021年3月，梅奥诊所开展了一项《A Phase I Open-Label Trial to Determine the Safety of PEP on a Skin Graft Donor Site Wound》研究，入组了37例受试者，确定一种被称为PEP（一种源自美国人的聚集血小板的血液制剂）的生物制剂在有皮肤移植供体伤口的人中的安全性（NCT04664738）。 2.4.2 延缓衰老 医疗美容与护肤品 2019年，美国约翰霍普金斯大学科研团队研究发现，高度纯化的诱导多能干细胞来源的外泌体（iPSCS-EXO）用于培养活性氧（ROS）水平升高的衰老间充质干细胞时， 衰老间充质干细胞的ROS水平降低，衰老表型减轻。因此，来自人类干细胞的外泌体可以缓解干细胞在培养中的老化（Stem Cells. 2019, 37(6):779-790.）。 2020年7月7日，英国伦敦玛丽皇后大学Ana O’Loghlen 团队在《Cell Metabolism》（IF=21.567）发表了“Small Extracellular Vesicles Have GST Activity and Ameliorate Senescence-Related Tissue Damage”。研究指出，年轻细胞分泌的细胞外囊泡（sEV）可以通过减少氧化损伤来改善老年个体细胞的衰老，揭示了外泌体通过自身GST活性调节GSH/GSSG而影响细胞和器官的ROS积累，从而调控衰老表型。近期，该研究在《Nature Reviews Molecular Cell Biology》杂志（IF=55.47）上进行了Highlight推荐（Cell Metab . 2020, 32(1): 71-86.）。 2022年，Science Advances杂志上发表一篇文章，用来自年轻动物的脂肪间充质干细胞(ADSC)的小细胞外囊泡(sEV)治疗老年动物，发现通常随着衰老而改变的几个参数有所改善，例如运动协调性、握力、抗疲劳性、毛皮再生、肾功能、虚弱（Sci Adv. 2022, 8(42): eabq2226）。 图32. 外泌体的抗皮肤衰老作用 2.4.3 敏感肌修复 医疗美容与护肤品 据中山大学附属第三医院皮肤科副主任郑跃介绍，该院皮肤科从 2020年10月开始到2021年7月完成了一项临床试验，招募了44例不同类型皮肤敏感的患者，用涂抹式的外泌体舒缓修复敏感性皮肤。临床研究初步显示，外泌体对皮肤屏障有较好的修复作用，它对敏感性皮肤，特别是有红斑或者是有红区炎症的敏感性皮肤有较好的治疗效果，也就是反映了外泌体的抗炎作用。郑跃表示，临床试验结果认为，外泌体作为皮肤修复的手段之一，可以单独使用或根据皮肤状态和需求联合功效性护肤品、玻尿酸、光电等其他医美手段一同使用。 中山大学附属第三医院皮肤科主任赖维认为：外泌体免疫原性低，还含有抗炎成分等，除了修复敏感肌，还有抗衰老和皮肤美容的功能，可以满足敏感肌和衰老肌肤的修复、抗炎、舒缓及皮肤活力再生。 在科罗拉多州丹佛市举行的2022年美国皮肤外科学会（ASDS）上，梅奥诊所的Saranya Wyles 医学博士团队公布一项外泌体美容研究，招募了56名患者，平均年龄为 54岁，将外泌体产品应用于患者面部，6周后，面部发红的状况得到改善、血红蛋白过程改善 92%、不同年龄组的脉管系统也有所改善。特别是40多岁、50多岁和60多岁的患者，在发红和皮肤老化方面得到了持续改善。 2.4.4 美白淡斑 医疗美容与护肤品 娇韵诗参与的一项发表在Nature子刊上的研究发现：角质细胞释放的外泌体可以调节黑色素细胞的色素沉着，这种外泌体会携带有能力调节色素沉着的微小RNA与黑色素细胞进行交流。基于这项研究，娇韵诗发现了能够通过抑制外泌体中包含的信息来发挥美白淡斑效果的光滑金虎尾果提取物。目前，光滑金虎尾果提取物已在娇韵诗护肤品中使用，即娇韵诗旗下的美白产品光芒小瓷瓶的主打美白成分之一（Nature Communications. 2015, 24(6), 7506)。 2.4.5 生发 医疗美容与护肤品 法国化妆品原料商Silab与法国国家健康与医学研究院INSERM合作的研究发现，成纤维细胞外泌体在毛发生长中具有关键作用：真皮与毛囊之间的外泌体通讯是毛发生长的一条值得关注的生物学通路，来自成纤维细胞的外泌体能促进Norrin（一种能激活参与毛发生长的β-连环蛋白通路的配体）的分泌。Silab据此推出了一款能够作用于“真皮和毛囊之间的外泌体通讯系统”的天然生发成分HAIRGENYL®酵母提取物。 2022年4月，韩国外泌体生物技术公司ExoCobio推出ASCE plus-HRLV，这是世界上首个基于外泌体的防脱生发产品。 图33. ASCE plus防脱和抗皮肤衰老/抗炎作用 （Cells. 2020, 9(5): 1157.） 2.5  体外诊断/早期筛查 外泌体可在多种体液（例如血液、尿液、唾液、脑脊髓液）中检测到，其结构较为稳定、内容物丰富，携带大量特异性细胞因子、功能性mRNA、生长因子、脂类物质等参与细胞间物质运输和信息传递，与多种疾病的发生和发展过程密切相关。特定的蛋白质、核酸、信号分子、脂质等可反映细胞水平的异常，可被用作疾病诊断的无创或微创生物标志物。作为新兴体外诊断技术，在肿瘤肿瘤及其他多种慢性疾病的筛查和诊断等领域应用前景巨大。 2.5.1 肿瘤 体外诊断与早期筛查 外泌体已成为继循环肿瘤细胞（CTC）、循环肿瘤DNA（ctDNA）后液体活检领域研究的热点。相较于CTC、ctDNA两种检测方式，外泌体检测具有样本形式丰富、内含物更稳定两大优势，更易得到理想的检测浓度。 图34. 外泌体应用于肿瘤早筛的检测流程 2.5.2 中枢神经系统 体外诊断与早期筛查 外泌体作为一种由细胞分泌的、能够通过全身循环和局部扩散作用介导细胞间信息交流的载体，对CNS疾病的发生发展和传播以及治疗都有着重要的作用。外泌体源性miRNA能通过血脑屏障，稳定且不易被降解，敏感性高，有望成为CNS疾病早期诊断指标；但是，需要提高脑脊液或血液样本外泌体的获取效率和分离纯化，减少外泌体在提取过程中的分解。此外，外泌体在CNS疾病的发生、发展以及参与疾病的机制等尚需进一步研究。 2.5.3 感染疾病 体外诊断与早期筛查 外泌体参与细胞间信号传递、凝血、炎症和细胞内稳态等多种生物学过程影响感染性疾病的发生发展。越来越多的研究表明外泌体与感染性疾病的关联性，外泌体可能被用作感染性疾病的生物标志物，具有预防感染的可能性，多项研究表明外泌体可作为细菌感染、病毒感染（HIV、肝炎病毒、呼吸道病毒）及其它感染性疾病诊断标记物，揭示外泌体能够为感染性疾病的诊断、治疗及预防提供新思路。 2.5.4 心血管疾病 体外诊断与早期筛查 心血管疾病诊断的生物标志物主要是对已知心肌蛋白的靶向分析，肌酸激酶同工酶、肌红蛋白及肌钙蛋白等生物标志物目前已广泛应用于临床。肌钙蛋白是急性心肌梗死诊断的金标准，但对其他心血管疾病的诊断缺乏特异性。外泌体的成分和生物学内容物对细胞激活和损伤具有特异性，它们具有作为心血管疾病诊断和预后生物标志物的潜力。由于有些外泌体是在特定的应激条件或损伤条件下形成，因此循环系统中的外泌体逐渐被认定是心血管疾病的生物标志物的候选者。近年来研究发现外泌体miRNAs参与心血管疾病的生理和病理机制及外泌体miRNAs的临床应用已成为心血管疾病诊断研究的前沿和热点外泌体miRNAs作为急性心肌梗死、慢性心力衰竭和冠状动脉疾病等心血管疾病新的诊断性生物标志物有很好的研究前景。 2.5.5 呼吸系统疾病 体外诊断与早期筛查 外泌体miRNA在呼吸系统疾病的疾病标志物研究中有着广泛的应用，外泌体miRNA在特发性肺纤维化、慢阻肺、肺结核及哮喘等呼吸系统疾病的发病机制中具有重要意义，且它们具有非免疫原性和快速提取的特点，因此，外泌体miRNA有希望作为肺部疾病的一种新的诊断和治疗的生物标志物。 Vol.3 外泌体的生产与质控  外泌体行业已经到了大规模产业化的前夕，规模化生产和质量控制成为非常重要的一环。 3.1  生产工艺 产量低、回收率或纯度低、靶向特异性差，使得外泌体的大规模生产仍是阻碍其发展的主要瓶颈之一。实验室阶段的外泌体生产具有一定的局限性，一些开放性操作拓展至放大生产时会导致一系列挑战，因此需要一些创新性的技术来衔接，以支持更大规模的生产需求。 图35. 外泌体实工业化生产 外泌体的生产流程包括：外泌体的获取(生产)、分离、纯化、制剂。如果是外源装载外泌体还需要经过工程化后再纯化，再制备成相应制剂。 3.1.1 外泌体的生产 外泌体的生产工艺 来源于干细胞和293细胞等动物细胞外泌体的收获需要先进行大规模细胞培养，以生产获得含有外泌体的原料。牛奶外泌体的收获不需要细胞培养，直接从新鲜牛奶中即可获取，是一个高效、大量获取外泌体的来源，最容易产业化。植物外泌体需对植物进行提取获得外泌体原料。 干细胞外泌体的获取 干细胞是一种“贴壁依赖细胞”，具有贴壁依赖性，在二维表面上如T型方瓶、烧瓶、多层细胞工厂等培养系统已经相当成熟，但不足以满足未来商业化可行性的需要。贴壁细胞培养平台扩大生产的技术要素主要集中在最大化培养表面积上， Cytiva推荐基于3D微载体贴壁悬浮培养的工艺。微载体（Microcarrier）培养系统是贴壁培养和悬浮培养相结合的一种操作单元，具有比表面积大、允许环境参数监控、方便取样、易于放大、可在无蛋白水解酶的作用下实现细胞迁移等优点，既解决了2D贴附培养技术中的空间问题和在线监控问题，又解决了悬浮的均质问题。 图36. 干细胞3D微载体培养生产外泌体 来自马萨诸塞大学医学院的研究人员开发了一种稳健可放大的符合GMPs的间充质干细胞生产外泌体的方案，即生物反应器中基于3D微载体进行贴壁依赖性细胞培养并结合切向流过滤（Tangential Flow Filtration，TFF），使外泌体的产量提高了140倍，在治疗性siRNA转移至原代神经元的能力上具有7倍的活性。 在搅拌式生物反应器（SR）中使用微载体悬浮培养，可明显增加"贴壁依赖细胞"的培养效率及外泌体产量，适用于中试和大规模生产，但保持细胞和外泌体的表型不发生改变方面也存在挑战。当细胞从静态平面培养转移到动态3D环境时，搅拌和通气引起的剪切应力可能导致细胞及外泌体表型改变。有报道称，在转速为180 rpm生物反应器中培养T淋巴细胞引起IL-2受体下调，细胞扩增减少。剪切应力可诱导间充质干细胞p38丝裂原活化蛋白激酶和细胞外信号相关激酶的机械转导途径，导致成骨分化，进而改变外泌体表型。此外，限制高剪切动态系统中的细胞死亡以最大限度减少凋亡小体杂质至关重要（动物细胞来源外泌体生产中的细胞培养工艺. Cytiva思拓凡, 2022）。 HEK293细胞外泌体的获取 HEK293细胞是一种悬浮适应细胞，在病毒载体（如LV、AAV）的生产中被广泛使用，其无血清悬浮培养工艺已相对比较成熟。搅拌式生物反应器（SR）尤其适合悬浮适应细胞的外泌体生产，与其他悬浮适应的细胞系相比，HEK293细胞具有明显的结团倾向，通过使用抗结团剂纠正细胞的结团现象，可使细胞生长得到明显改善，单位体积外泌体产量提高8倍。 牛奶外泌体的获取 牛奶外泌体需从新鲜牛奶中提取制备，采用超速离心法(UC)或多种化学前处理方法去除乳蛋白，切向流超滤技术(TFF)进一步去除残留的乳蛋白，实现牛奶外泌体样品的初纯与浓缩。 植物外泌体的获取 植物外泌体与其他外泌体的提取方式类似，可适用如超速离心法、免疫亲和捕获法等传统分离方法；但由于植物细胞存在细胞壁和机械组织，必要时也可以考虑纤维素酶解等辅助手段。例如浆果类植物，如番茄、荸荠等富含水分，仅需通过传统的机械粉碎结合已有的外泌体提取技术即可实现对外泌体的有效提取。而对于非浆果类植物，如人参、田七等块茎类药用植物，外泌体直接提取较为困难，需采用酶解等样品前处理手段。 3.1.2 外泌体的分离纯化 外泌体的生产工艺 外泌体分布在极其复杂的体系中，单一方法很难获得高纯度的外泌体，需要利用外泌体的不同物理化学和生化特性进行多方法的联合，这使得高产量的外泌体分离纯化非常具有挑战性。对于外泌体的分离纯化，可以通过确定的程序，超速离心法、超滤法、免疫亲和层析、基于电荷中和的聚合物沉淀法、尺寸排阻色谱、微流体技术、切向流过滤来完成产品的分离纯化（Theranostics 2020; 10(8):3684-3707）。 超速离心法 超速离心法可分为“密度梯度离心法”和“差异超速离心法”两大类，该方法是公认的外泌体分离金标准方法。超速离心法需要昂贵的设备和训练有素的技术人员，特别是对于梯度超速离心。同时，分离的外泌体的结构和生物学功能可能会受到长时间的超离心力的影响，不利于下游应用（例如样品中的高水平蛋白质聚集体和脂蛋白污染不利于外泌体的功能研究和药物开发），超滤和尺寸排阻色谱法可以弥补此类问题。 超滤法 超滤可以使用具有不同分子量截止值（MWCO）的超细纳米过滤膜从样品中分离细胞外囊泡，并通过大小区分外泌体和核外颗粒体。与超速离心方法相比，大大缩短了处理时间并不需要特殊设备。重要的是，通过轻松调整滤光片大小，超滤允许研究人员对具有定义粒径的细胞外囊泡（包括外泌体）的特定亚群进行分类。该方法包括串联配置的微滤器和顺序超滤两种。 图37. A.微滤器；B. 顺序超滤 运行模式包括直流过滤（DFF）或切向流过滤（TFF）。 图38. 切向流过滤示意图 DFF对于采用离心式装置的较小流量（最多30mL）处理过程效果较好，但DFF技术会受到膜堵塞问题的不良影响。为了减少胶质层的形成，可使用浮动式搅拌棒配置（搅拌槽）或通过生成一个受控的层流，在膜片的上游侧生成交叉流。搅拌棒运行可改善超滤效果，但在获得最佳性能方面仍有局限性。因为搅拌速度和时序水平取决于棒体摆动范围，而此范围会随着摆动半径的改变而变化。 切向流过滤（TFF）是一种应用于生物分子分离和纯化的快速有效的方法。该方法可用于各生物领域，例如免疫学、蛋白质化学、分子生物学、生物化学和微生物学。TFF可用于对容量从10mL到数千升的样品溶液进行浓缩和脱盐处理。此方法可用于分馏大小不一的生物分子、获取细胞上清液，以及对发酵培养基和细胞裂解物进行澄清处理。 图39. 切向流过滤设备 由于效率高、设备成本低、操作快速、便携性良好、可达到中等纯度等优点，超滤越来越受欢迎。但在过滤过程中，其剪切应力会引起的潜在劣化；并且可能由于堵塞和膜捕获而造成原料的损失。 尺寸排阻色谱法 尺寸排阻色谱法（SEC）能够以最小的结构损伤分离外泌体，不会影响囊泡结构和完整性，能够保存分离外泌体的天然生物活性。在过去的50年中，各种细小的多孔材料，如葡聚糖聚合物（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose）、聚丙烯酰胺（Sephacryl或BioGel）等被运用到SEC的优化中。 图40. SEC尺寸排阻色谱法示意图 该方法易于扩展和自动化，用于高通量外泌体制备。但设备成本相对较高，需要额外的外泌体富集方法。 高度亲水的聚合物与外泌体周围的水分子相互作用，产生疏水性微环境，导致外泌体沉淀。现有的基于聚合物的外泌体沉淀方法通常采用分子量为6000至20000 Da的PEG。该法易于使用、设备需求低、样品量兼容性高、效率高、可分离蛋白质聚集体、其他细胞外囊泡、聚合物污染物的污染物。但所需的处理时间较长，需要复杂的清理步骤，会影响下游分析和定量的结果。 免疫亲和力捕获法 免疫亲和力捕获法是识别外泌体特异性标志物的抗体（固定在固体表面上）和外泌体的流体一起孵育富集外泌体，通过额外的洗脱步骤收集外泌体。外泌体标志物如Rab5、CD81、CD63、CD9、CD82、膜联蛋白和Alix等跨膜蛋白已被广泛用于商业化选择性外泌体分离。该方法具有较高的捕获效率和灵敏度，而且还可容纳较大的起始样品量；此外，该方法可以通过检测分离的外泌体上的疾病特异性标志物如EpCAM，CD133，EGFR直接转化为诊断平台（外泌体纯化工艺挑战盘点. 医麦客, 2022）。 图41. 免疫亲和力捕获法示意图 该方法相关的非中性pH和非生理洗脱缓冲液可能会不可逆地影响所收集的外泌体的生物学功能，寻找对外泌体损伤更低的洗脱液，另外该法产量较低、抗体基成本较高的问题，化学抗体或许是下一步的改进方向。 微流体技术 微流体技术可分为“基于免疫亲和力的微流体分离技术”、“基于尺寸的微流体分离技术”以及“非接触式微流体”。微流体技术结合了外泌体分离和分析，将含外泌体的流体添加到介质中后，根据细胞外囊泡的物理和生化特性，分离外泌体，可以从少量体液中快速分离外泌体，并进行实时外泌体表征分析以进行原位诊断。该方法高效方便，但只适合小样本分离。 3.2  质量控制 作为新型生物制品，目前没有专门针对外泌体质量控制的法规和指导原则。但外泌体是细胞产物，其质量控制与指导原则可参照细胞产品相关原则。针对细胞治疗和细胞相关产品，FDA于2016年发布了“Content and Review of Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Somatic Cell Therapy Investigational New Drug Applications (INDs)”，该指导原则就细胞库、生产过程中添加的各物料等在生物安全性、产品质量稳定性进行详细指导。此外，ICH发布的Q5A(R1)、Q5A(R2) EWG对细胞产品中外源病毒检测提供了指导意见。国家药品监督管理局于2017年发布了《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则》及相关问题解读，该指导原则对细胞治疗及其相应产品在使用血清及其它物料、细胞库等存在风险进行评估指导。外泌体作为细胞代谢过程中的产物，产品的质量与宿主细胞的质量息息相关，诸多文献对外泌体GMP级生产流程进行优化和质量监控，主要包括上游细胞安全生产检测和下游外泌体生产检测。 图42. GMP生产外泌体流程及质量监控图 3.2.1 细胞安全生产 外泌体的质量控制 2022年10月31日，国家药监局核查中心官网正式发布备受关注的《细胞治疗产品生产质量管理指南（试行）》，指导药品上市许可持有人规范开展细胞治疗产品的生产和质量管理，保证产品质量，同时，这也为细胞治疗药物研发企业提供了更清晰的研发、生产和发展路径。细胞制备应满足《中华人民共和国药典》、《药品生产质量管理规范》、《药品注册管理办法》、《药品生产监督管理办法》、《药品生产质量管理规范》及其附录、《药品注册核查管理规定》、《药品不良反应报告和监测管理办法》、《药品召回管理办法》、《药品说明书和标签管理规定》、《药品生产企业现场检查风险评定原则》、《医疗废物管理条例》、《病原微生物实验室生物安全管理条例》。 对细胞安全生产的基本要求：有细胞采集、加工、检定、保存和临床应用全过程的标准操作程序(SOP)和完整的质量管理记录；整个过程必须遵循细胞产品质量控制标准(QC)，并拥有与其配套的检测设备和检测方法；细胞库的细胞必须保证可溯源；按照批准的细胞产品质量控制标准对每批次细胞产品进行严格检测，包括细菌、真菌、支原体和内毒素。 3.2.2 外泌体生产检测 外泌体的质量控制 外泌体生产纯化过程中涉及到的关键设备、仪器、耗材及试剂，包括超速离心机、纯化仪、填料、移液管、离心管等，都应由符合GMP要求；同时应定期检查耗材的储存及有效期是否符合要求，保证所用原料、试剂与耗材的安全有效；最终产品质量严格遵循《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则》对其进行相应检测。 图43. 外泌体质量控制项目 目前亟需对不同分离方法在外泌体回收效率、纯度、蛋白标志物、装载药物量等方面进行评价，制定统一的流程和标准。科学家使用NanoFCM对不同样品外泌体用不同纯化方法纯化进行了研究，NanoFCM可在单颗粒水平对外泌体的颗粒浓度、大小、纯度、蛋白等进行表征，研究纯化方法对外泌体的影响，优化外泌体的纯化过程，有望为建立标准有效的外泌体分离和质控方法提供表征手段。 Vol.4 外泌体产业链分析  外泌体产业处于起步阶段，尚未形成完善的产业链格局。产业链上游为原材料、设备、服务供应商；中游为外泌体治疗药物、医美产品、诊断试剂供应商；下游为流通和应用终端。 图44. 外泌体行业产业链分布 4.1  产业链上游 产业链上游主要为1）细胞培养、奶源供应、植物原材料、微生物原材料等，通过培养、提取、分离纯化获得外泌体原料的相关企业；2）过程中相关的制造设备、试剂、耗材，以及提供外泌体CRO与CDMO服务的相关企业；3）外泌体检测检测领域的上游供应商还包括提供抗原、抗体等试剂原料及设备部件的相关企业。 目前国内主要制造设备、试剂和耗材仍以进口为主，跨国企业仍处于垄断地位。对于大规模外泌体原料的供应商和CDMO服务商，国内主要以天津外泌体科技（牛奶外泌体、干细胞外泌体、293细胞外泌体）、思珞赛等企业为代表；外泌体CRO服务主要以恩泽康泰、天津外泌体科技、思珞赛、宇玫博生物等为代表。 4.2  产业链中游 产业链中游为利用上游供应商提供的原材料、设备、耗材、试剂进行外泌体相关治疗、美容、诊断等产品的研发、生产、销售。目前外泌体领域处于起步阶段，全球约50余家从事外泌体相关产品开发的公司。 目前，国内外只有医美和护肤品上市销售，国外以韩国ExoCobio为代表，国内以佰傲医学、天津外泌体科技等公司为代表。 新药研发、诊断试剂均处于临床研究和临床前研究阶段，国外以ExoFlo、Codiak、Aegle、Exopharm、OBCTCD24、ILIAS、Evox、Exosome等为代表；国内以唯思尔康、纽兰生物、汇芯生物、安龄生物、亿微生物等为代表。 4.3  产业链下游 产业链下游为流通与终端机构。终端主要包括治疗药物面向的医疗机构、医美产品面向的医美机构、诊断产品面向的三方医检机构和医疗机构，以及护肤品面向的经销商（包括电商平台）和个人消费者。 Vol.5 产业驱动因素与挑战  5.1  产业驱动因素 5.1.1 基础研究突破 外泌体产业驱动因素 随着细胞外囊泡(EVs)运输调控机制研究的清晰，以及“精准外泌体”概念的提出，全球外泌体研发持续升温，有关外泌体载药、外泌体疗法、诊断和早筛等方向的研究成果陆续发表在Science、Nature等各大顶级期刊上，论文发表数量呈近爆炸式增长，近年平均每年外泌体相关论文都在3000篇以上，2019年为3279篇，2020年为4295篇，2021年5074篇，2022年为5204篇；国内2020年度国家自然科学基金申请项目的评审结果中，外泌体相关课题中标达到2000余项。外泌体已成为生命科学和基础医学研究的一大热点，为外泌体的应用与产业化探索奠定了坚实的基础。 图45. 外泌体学术研究成果发表情况 5.1.2 跨国药企布局 外泌体产业驱动因素 外泌体产业的商业运用引起了大型跨国药企的注意，新兴的生物技术公司与大型跨国药企产业化合作的态势逐渐明朗。以礼来、武田、爵士制药为代表的大型跨国药企已经分别与拥有外泌体创新技术平台的公司达成多项高额合作，接连签署数笔10亿美元级大额合作开发协议，共同开发外泌体靶向疗法。 爵士制药：2019年1月，爵士制药与Codiak达成了以外泌体载药为核心的血液系统恶性肿瘤和实体肿瘤的新药研发合作。爵士制药同意向Codiak支付5600万美元的研究经费，并为合作的五个新药项目支付高达2000万美元的临床前开发里程碑付款，若项目实现约定里程碑，则每一个靶标再支付2亿美元款项。在I/II期临床试验结束后，爵士制药将负责后续的临床试验、新药申请以及商业化推广。 礼来制药：2020年6月9日，礼来公司与Evox达成一项12亿美元的合作协议，利用其技术平台开发递送RNA干扰药物和反义寡核苷酸药物(ASO)的工程化外泌体，治疗中枢神经系统疾病。 武田制药：2020年3月，武田也与Evox公司达成一项8.82亿美元的合作，利用外泌体递送蛋白质及mRNA核酸药物，治疗包括C型尼曼-皮克病在内的罕见病。Evox将负责推进临床前研究并进行临床试验的申请。 5.1.3 应用价值驱动 外泌体产业驱动因素 外泌体本身可以做为药物、美容护肤产品的活性成分，又可以做为小分子、蛋白、核酸等活性物质的纳米递送系统，还可以被用于诊断和早筛的无创或微创生物标志物，应用前景非常广阔。开启了纳米医学产业、细胞与基因治疗产业、医美与护肤产业和体外诊断产业的新篇章。 5.1.4 政策驱动 外泌体产业驱动因素 2022年5月10日，国家发改委印发《“十四五”生物经济发展规划》，“外泌体治疗”首次进入国家经济发展规划，在《生物经济创新能力提升工程》专栏关于“关键共性生物技术创新平台建设”中提到：围绕加快创新药上市审批、强化上市后监管，建设药品监管科学研究基地，建设抗体药物、融合蛋白药物、生物仿制药、干细胞和细胞免疫治疗产品、基因治疗产品、外泌体治疗产品、中药等质量及安全性评价技术平台。 5.1.5 商业化驱动 外泌体产业驱动因素 随着细胞与基因治疗产业的不断发展和成熟，外泌体产业的上游商业化技术不断完善，为外泌体产业奠定了商业化基础。 图46. 微载体大规模细胞培养生物反应器 外泌体领域率先在医美和护肤品方面获得突破，产品全球销售，打开了产业化的大门；多种外泌体药物和外泌体诊断试剂也处于人体临床试验阶段，最快已处于III期临床，在安全性和有效性方面获得了一致认可。 5.2  问题与挑战 2023年，张琪、于湄、刘磊、田卫东等在《中国组织工程研究》发表了“工程化外泌体研究现状与临床转化的挑战”， 阐述了外泌体产业面临的一些问题和挑战（中国组织工程研究，2023，27(19):3052-3060）。 5.2.1 亲本细胞选择与培养 外泌体产业问题与挑战 目前，对于外泌体生产的最佳技术暂时还未达成共识。 亲本细胞的选择构成了外泌体生产的首要关键步骤，不同的细胞生产的外泌体生物学特性有差异，研发人员需要根据外泌体的活性和组织归巢特性以及潜在的免疫原性和致癌性来选择亲本细胞。 培养过程中的微小变化可能会改变外泌体的生物学特性。即使来源于相同的亲本细胞，由于培养条件的变化，比如亲本细胞的代数、培养方式、培养基等变化，最后得到的外泌体也有可能不同，这也是外泌体生产过程需要考虑的关键问题。从生产过程安全性的角度来看，最好使用封闭式系统，但这比开放式系统更难监控。牛奶来源的外泌体是获得大量生物相容性外泌体的有效替代来源，从复合牛奶中大规模获取外泌体更加适合工业化生产。 5.2.2 分离纯化工艺 外泌体产业问题与挑战 外泌体的分离纯化也是一个不容忽视的关键程序。不同的分离提纯方法得到的外泌体产量差距悬殊，外泌体亚群也有所不同，这为质量控制带来了挑战。目前亟需对不同分离纯化方法在外泌体回收效率、纯度、蛋白标志物、装载药物量等方面进行评价，制定统一的流程和标准。 5.2.3 成分表征 外泌体产业问题与挑战 外泌体的表征集中在测量颗粒大小和数量，以及检测特定的表面蛋白和货物。透射电子显微镜成像是表征外泌体结构和大小的标准方法。此外，扫描电子显微镜和动态光散射可以对外泌体进行表征。合格的体外表征与量化可以预测载药外泌体系统的预期治疗潜力，但是至今仍然缺乏外泌体量化以及分子和物理特征描述的金标准，寻找开发外泌体最佳表征与量化方式是目前研究中不可忽视的一部分。由于外泌体的大小和复杂性，现有技术可能会限制工程化外泌体产品的物理化学、免疫化学或功能的细节表征，有限的产品表征能力也对工程化外泌体产品的机制理解有一定影响。 5.2.4 质量控制 外泌体产业问题与挑战 外泌体这种复杂程度的物质和构造只能由活细胞产生，面临一定程度的内在生物变异而导致产物的异质性，异质性既受细胞内的生物加工影响，也受制造工艺的影响。如培养条件(细胞传代、细胞密度、外泌体收获频率）会影响产物质量的各个方面，包括产量、外泌体组成、外泌体生物活性。 在外泌体生产过程中检测和评估产品质量的变化比在蛋白和抗体生产过程中更具挑战性。由于微小的变化可能对产品质量和活性产生相当大的影响，外泌体制造过程的稳定性比细胞和抗体生产过程的稳定性要低，但外泌体制造仍可以建立在这些工艺的基础上。外泌体的大小、成分、结构的复杂性是独一无二的，因此需要额外的程序对外泌体生产进行控制。这些过程可能包括测量大小和浓度、排除污染物、识别功能标记物和评估载药量以评估每一数量的外泌体的治疗活性等措施，以确保外泌体终产品满足先前确定的关键质量属性。 5.2.5 存储稳定性 外泌体产业问题与挑战 外泌体建议在-80℃下存储，其大小和数量在-80 ℃下保持不变，潜在问题是有可能造成一些生物活性的改变以及储存和运输的成本相对高昂。另有研究表明，在4℃下储存会对外泌体结构造成聚集和损坏。 科学家们提出了其他的替代方法。WU等提出将外泌体保存在GelMA水凝胶中可减少外泌体聚集，达到保存外泌体的目的。另一种较常见的保存方法是冷冻干燥，冻干的外泌体可以在室温下储存，且能够保持外泌体的囊泡大小和蛋白质含量、结构完整性、生物活性、运送药物分子的药代动力学等关键属性，效果可以与新鲜外泌体媲美。 5.2.6 产品安全性 外泌体产业问题与挑战 纳米药物可能会导致一些不良免疫反应发生，比如过敏反应、细胞因子释放综合征、生物活性的中和、与内源性蛋白对应物的交叉反应和非急性免疫反应等。因此，对工程化外泌体的安全性和有效性加以证明对研究人员来说是一项挑战。 目前，产品制造商被要求注明药物中所有能够引起药理、免疫或新陈代谢作用的物质，并且在最终配方中使用的非活性成分 ( 称为赋形剂 ) 也应予以申报。国际胞外囊泡协会声明，如果整个治疗效果可以归因于外泌体负载的药物，而不是载药外泌体系统中的外泌体，则外泌体可以被视为赋形剂。在这种情况下，仅需要外泌体的安全性描述，而不需要描述其作用方式或机制。如果安全和质量标准均充分达到要求，并且提供了可信的作用方式和机制，则可以允许进行人体临床试验。 同种异体外泌体、异种外泌体要转化为安全有效的临床治疗产品，需要通过持续监测来严格把控亲本细胞的选择、免疫学、致癌效应的评估以及病毒污染的风险等问题。监测方法的选择特别是灵敏度，是确定外泌体药物载体临床转化的关键挑战之一。目前，监管机构尚未发布关于如何测试外泌体的安全性和有效性的指导意见，因此需要对现有的测试方法进行改进或者寻找新方法对工程化外泌体的安全性和有效性进行证明。 5.2.7 工程化外泌体成药性 外泌体产业问题与挑战 天然外泌体已经在美容护肤领域上市销售，药物领域也进入临床III期，其商业价值和成药性确定性很高。 工程化外泌体主要是发挥其递送活性成分的优势，搭载“何种活性成分”直接影响药物的成败，Codiak的临床管线暂停对行业信心影响较大。Codiak作为工程化外泌体载药的标杆企业一直备受关注，先后解决了外泌体骨架蛋白筛选、内源装载技术、规模化生产等难题。2022年Codiak首发进入临床的两个药物管线分别为exoIL-12™和exoSTING™（详见章节2.2.1 装载蛋白），治疗方式为“瘤内注射”。2022年中公布了临床I期实验结果：exoIL-12™安全性良好，临床Ⅰ期试验均达到了主要终点，并且2例患者均得到治疗，表现出部分缓解。exoSTING™未观察到三级或更高级别的剂量限制毒性或治疗紧急不良事件，在3例患者中观察到二级细胞因子释放综合征和一级发热。结果均支持产品推向临床II期，但Codiak于2022年8月宣布暂停推进两个产品的II期临床，股价暴跌，2023年3月27日宣告申请破产保护，引来业界轩然大波，并引来“工程化外泌体作为纳米递送载药系统是否能顺利商业化”的大讨论。 维渡纵横推测，Codiak暂停两个产品的临床II期而导致申请破产保护，可能有以下几方面的原因考量： 破 产 保 护 可 能 原 因 首先，其装载的活性成分具有一定挑战：IL-12的人体临床试验多以失败告终，从2022年至今有8个产品宣告失败被放弃，并且创业公司Rubius因此破产清算，令人望而却步；STING激动剂可能在直接瘤内注射时有散开风险，对后续临床试验失败风险或有顾虑；出于风险考量暂停产品的II期临床开发。 其次，两个产品均为“瘤内注射”产品，或可能存在一定局限性。 再次，Codiak是由风险投资机构Flagship Pioneering推动成立的公司，Flagship同样也是Rubius的大股东。鉴于Rubius刚刚在白介素领域（IL-12和IL-15）的失利导致资金链断裂而破产，或建议Codiak及时止损，申请破产保护并寻求出售其资产，旨在实现股东价值最大化。Codiak首席执行官Douglas Williams博士表示，董事会和管理团队考虑到"财务需求"及"临床研究项目"匹配度后，决定申请破产保护。 虽然Codiak暂停了前两个管线的临床II期，但从目前取得的I期临床结果来看，验证了工程化外泌体递送所起到的作用，在安全性、靶向性、多重搭载上均实现了突破。Codiak本将重点推进exoASO™-STAT6治疗晚期肝细胞癌等临床急需适应证，并改进为“静脉注射”给药，但由于财务问题而寻求出售研发管线。 综上，我们认为，工程化外泌体作为递送系统的安全性是可控的，但是选择装载的活性分子和靶点关乎到整个药物开发的成败。在工程化外泌体产业的发展初期，建议创业公司可以利用工程化外泌体搭载一些成药性高或者已经成药的活性分子，以“创新”结合“守正”的思路降低整个药物研发的风险。 Vol.6 产业市场规模分析  据Grand View Research 2018年的研究报告指出，仅作为药物递送系统，外泌体药物市场规模预计在2030年将达22.8亿美元，目前全球包括罗氏、武田、礼来在内的多家巨头均在积极布局外泌体这一赛道。 商业调查机构Roots Analysis在2023年3月1日发布的《 2022-2040 年外泌体疗法市场报告》称，在新型平台和先进技术发展的推动下，以及相关企业在外泌体疗法研发方面的不懈努力，外泌体治疗市场预计将以41%的年增长率增长。由于未来几年许多外泌体治疗候选药物获得批准，预计数十亿美元的市场。 Vol.7 外泌体代表公司分析  2022年，维渡纵横对外泌体领域公司做了盘点，详见《2022年外泌体行业研究报告》(点击相关阅读：2022年外泌体行业研究报告)。本文将主要对几个具有代表性的重点公司作简要阐述。 7.1  ExoCoBio ExoCoBio成立于2017年1月，总部位于韩国首尔，开发基于干细胞来源外泌体的药妆。公司的融资总额已经达到了约5630万美元，资金来自于韩国的顶级投资者，包括Seven Tree Equity Partners、CSQUARED Global Asset Management、TS Investment Partners、K2 Investment、Intervest、KDB Capital、Atinum Investment、GU Equity Partners、QUANTUM Ventures Korea、Platinum technology Investment等。 ExoCoBio产品包括了ASCE+™、EXOMAGE™和CELLTWEET™，用于皮肤护理、调节皮肤免疫功能、头皮护理。ASCE+是ExoCoBio专利外泌体再生技术，通过5种生长因子、6种肽、19种氨基酸、4种不同类型的辅酶、维生素和矿物质、谷胱甘肽和多种其他活性成分，可实现营养供给和更强大的皮肤再生效果，更高能深度修复，修复创面，净疤除横，改善痤疮。 图47. ASCE+™产品 2021年6月ExoCoBio与LG化学签订用于抗衰老产品解决方案韩国国内共同销售的业务合作保证协议。 7.2  Direct Biologics Direct Biologics是一家拥有开创性细胞外囊泡 (EV) 平台技术的再生生物技术公司，总部位于美国德克萨斯州奥斯汀。在研产品包括ExoFlo和XoFlo两个系列。ExoFlo是利用间充质干细胞(MSC)分泌的外泌体起到组织再生和修复作用。Direct Biologics 是迄今为止第一家也是唯一一家获得FDA III期临床批准的的外泌体公司，批准产品为ExoFlo™，是一种从人类骨髓间充质干细胞中分离出来的细胞外信号产物，含有生长因子和外泌体。研究表明，BM-MSC来源的细胞外囊泡可以下调人类炎症并上调组织修复。 ExoFlo™ 正用于治疗与COVID-19相关的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，2022年4 月21日FDA批准该公司使用ExoFlo进行其III期临床试验。 2022年10月13日，上市的特殊目的收购公司 Good Works II Acquisition Corp. (Nasdaq: GWII)  和Direct Biologics宣布签署协议，在满足所有成交条件后，Direct Biologics 将成为一家上市公司。预计将于2023年上半年交易完成，合并后的公司命名为Direct Biologics, Inc.，将在纳斯达克资本市场交易。 图48. Direct Biologics研发管线 7.3  天津外泌体科技 天津外泌体科技孵化自九州通集团天九再生医学，2021年重组成立，以外泌体技术为核心，布局严肃医疗和消费医疗业务方向。 公司已构建四大外泌体技术平台：1）外泌体规模化制备平台，实现牛奶/293细胞/间充质干细胞外泌体规模化制备，单次处理500L以上规模，可大规模、高纯度制备外泌体，突破外泌体工业化应用的第一道瓶颈。2）首创外泌体表面修饰装载平台，特有的BioBIND®技术可将广泛的功能性物质外源装载到外泌体表面，并保证外泌体与活性物质的生物学活性。通过模块化装载，突破ADC药物载药量低、安全风险高的瓶颈。3）优化设计的TAD自组装基因药物装载技术平台，优化基因药物装载系统，用于各种基因药物、mRNA疫苗开发，具有免疫原性低、装载基因片段大、靶向效应突出、可口服给药等优势。4）脂质嵌合装载平台，实现核酸、多肽等生物大分子和小分子的口服递送。 严肃医疗方面，天津外泌体科技开发了“牛奶外泌体原料”，产品经多级超深层过滤层析技术制备，纯度达到99%以上；其平台技术可提供纳米递送系统药物装载CRO与CDMO服务，联合开发基于外泌体的创新药或二类新药，可装载抗体、多肽、小分子、核酸等活性物质。 消费医疗方面，牛奶外泌体原料正式准予纳入国际化妆品原料(INCI)目录，商品名称“ Milk Exosomes ”，INCI编号“35079”，并接续开发了“然”系列外泌体-多肽复合原料。公司同时自主开发用于医美护肤的医疗器械级液体敷料和妆字号功能性护肤品，旗下Y³-EXOSOMES LIQUID BANDAGE获欧盟CE认证，可在欧盟27个成员国及其他认可欧盟CE认证的国家进行销售。 图49. Y3系列美容产品(CE认证) 7.4  思珞赛 思珞赛成立于2019年，专注于新型纳米药物，尤其是外泌体相关创新药物的研发和应用，并致力于外泌体本身及其作为药物递送载体的创新技术开发和临床应用转化。此外，基于专业和完善的TAXY™外泌体研究平台，公司同时对外提供相关领域的科研CRO服务和CDMO服务。 2022年7月，思珞赛完成逾千万美元的Pre-A轮融资，由诺辉创投领投。 思珞赛对外泌体载药技术进行了全方位的创新性研发，独立开发了程序化药物递送系统TAXYTM。建立了拥有自主知识产权的外泌体生产细胞系ExoBoost，该细胞系与现有细胞系（如293T，Expi293F）相比，能将外泌体产量提升20倍。此外，公司开发了外泌体药物装载系统ExoPack，能将蛋白或核酸药物高效地、选择性地装载到外泌体的内部或者表面。根据外泌体进入细胞的不同机制，根据受体配体作用的不同，开发出了不同组织靶向性的外泌体ExoTarget，可以靶向脑部、肺部、肌肉等。 思珞赛拥有近1千平米GMP生产和质控区，在质粒构建、菌种库建立和检定、细胞库建立和检定、工艺开发和优化、QC检测及放行、细胞培养及外泌体纯化领域积累了丰富的开发和生产经验。依托自有的外泌体药物研发平台、生产技术优势、完备的多功能GMP车间和GMP生产体系，公司现已具备制备从实验室级别（<2L）放大到工业级别（200L）样本量的能力。 7.5  Exosome Diagnostics Exosome Diagnostics于2018年6月25日被Bio-Techne以2.5亿美元现金和3.25亿美元的里程碑款项收购。 Exosome Diagnostics专注于研发基于生物流体的诊断技术，可利用血液、尿液、脑脊液等外泌体回收RNA、DNA，对疾病的特定基因特征进行分析。公司已开发出ExoDx Lung(ALK)肺癌诊断试剂盒和ExoDx Prostate(IntelliScore)(前列腺癌)血液/尿液检测试剂盒，患者只要提供一份血液或尿液样本，就能从获取的外泌体中分析内含RNA、蛋白质等成分，从而对癌症进行精准诊断。公司能够开发各种病理学中的新型高灵敏度诊断方法，包括前列腺癌、膀胱癌、肾癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤等多种疾病，以及目前尚无诊断解决方案的癌症。 7.6  汇芯生物 汇芯生物成立于2017年，主要致力于探索外泌体在疾病早期诊断和治疗方面的应用，特别是将外泌体与液体活检技术相结合来实现癌症的早期筛查。2021年至今相继完成天使轮、Pre-A轮、Pre-A+轮超亿元融资，投资方包括中南创投、苇渡资本、凯风创投、绿河投资。 汇芯生物推出了全球首台用于外泌体分离纯化的非标记自动提纯系统—EXODUS®。纯化原理为负压振荡系统(NPO)结合双耦合谐波振荡系统(HO)作用于纳米超滤芯片; 样本中的游离核酸与蛋白等杂质通过纳米孔快速去除并截留外泌体，从而纯化富集外泌体。技术特点如下：该系统的应用特点为：适用于多种生物样本，外泌体回收率≥90%；适用的样本体积范围宽，杂蛋白去除率≥99%；完整度高，保留生物活性，能够用于细胞外囊泡亚型的分离。主要用于基因组学和蛋白质组学分析、生物分子的载药研究、体外和体内的功能性分析。基于先进的外泌体纯化技术平台，汇芯生物在泌尿系统肿瘤诊断试剂盒开发、规模化干细胞外泌体制备等领域也取得了积极进展。除此之外，汇芯生物还对外提供外泌体分离与提纯、表征与鉴定及外泌体分析服务。 7.7  Codiak Codiak成立于2015年，是由风险投资机构ARCH Venture Partner与Flagship Pioneering共同推动成立的生物科技公司，2020 年 10 月 14 日在 NASAQ 股票市场上市，股票代码为“CDAK”。Codiak Biosciences 在其 A、B 和 C 轮融资以及 IPO 后的三轮融资中筹集了 2.574 亿美元，受“资本寒冬”和“暂停两个临床II期试验管线”影响，当前市值仅剩余1805万美元（原因见5.2.7）。 Codiak致力于工程化外泌体，用外泌体来介导药物递送以及精准治疗，拥有核心专利平台engEx™，可以生产出工业级别和规模的外泌体。Codiak 发现了天然存在的外泌体蛋白——PTGFRN 和 BASP1，作为支架将靶向配体和活性分子引导至外泌体的表面或内腔。在研管线7条，exoIL-12、exoSTING、exoASO-STAT6处于临床I/II期，但exoIL-12、exoSTING项目已暂停，其余产品处于临床前研究阶段。 图50. Codiak研发管线 7.8  Evox Evox Therapeutics创立于2016年4月，分别于2016年、2018年和2021年进行三轮融资，总融资 1.692 亿美元，聚焦基于外泌体递送载药的罕见病治疗。 Evox开发的DeliverEX™外泌体递送技术平台可设计修饰外泌体，并将蛋白质、RNA药物以及小分子药物加载到被修饰的外泌体中，使其靶向目标组织，尤其是向大脑和中枢神经系统的递送。Evox同时具有其独有的专利支架蛋白TSPAN2，相比Codiak的PTGFRN支架蛋白，在载药量和外泌体特异性方面具备优势。 利用DeliverEXTM平台，Evox正在开发内部和合作伙伴的外泌体治疗品管线，用于治疗危及生命的罕见疾病（溶酶体贮积症、苯丙酮尿症、瓜氨酸血症I型等）。Evox与武田制药合作开发外泌体载体的蛋白替代疗法，用于治疗LSD及另一项罕见疾病；与礼来制药合作开发RNAi和ASO药物，用于治疗神经系统疾病。 图51. Evox研发管线 7.9  EVerZom EVerZom 成立于2019年9月，是一家总部位于法国的初创公司，开发符合GMP标准的细胞外囊泡生产平台。作为外泌体领域的CDMO公司，EVerZom旨在通过突破性的专利生产技术，克服外泌体规模化生产的难题。EVerZom的专利创新在于对细胞应用激流刺激来触发大量的外泌体释放，通过改造一个生物反应器来诱导“ turbulence stimulation”，使外泌体的生产速度比传统方法快10倍。 EVerZom为客户提供外泌体制造、表征、分离、工程化服务。同时提供脂肪来源的间充质干细胞外泌体和来自鼠干细胞的外泌体标准品。 图52. EVerZom已服务客户 7.10  Exopharm Exopharm 是一家澳大利亚CRO公司，致力于开发外泌体治疗产品并将其商业化，先后推出产品Plexaris™和Exomeres™。Exopharm可提供从成体干细胞及其他细胞分离纯化外泌体的技术，并克服了现有外泌体纯化工艺的不足。Exopharm与全球20大制药公司Astellas子公司AIRM达成合作服务协议。 Exopharm拥有两项独家专有技术，可实现外泌体的高级定制——LOAD 技术可改善核酸药物加载到外泌体中，而 EVPS 技术可使外泌体定向于选定的细胞类型。LEAP则为外泌体纯化技术平台，解决大规模、低成本临床级外泌体的挑战。这些工程化 EV (EEV) 被设计为适用于遗传疾病、神经变性、病毒感染和癌症等适应症领域的精准药物。 7.11  唯思尔康 唯思尔康成立于2021年7月，作为国内外泌体领域的后起新秀，唯思尔康刚成立即获得亿元天使轮融资资金，由元生创投、联想之星、北极光创投、博远资本、苏州科创基金、苏州中新园创等多家知名投资机构联合参与。目前，唯思尔康已建设完成基础研发中心2000平米，完成外泌体平台的搭建，为外泌体新药研发奠定基础。 modEXO工程外泌体载药平台，是在对外泌体技术深入挖掘理解的基础上，依靠外泌体低免疫原性、多功能、高负载的特点，突出动态模块化设计，以促进组织细胞特异性药物递送、优化医疗窗口、缓释组织药理学、精确的剂量控制、个体定制诊疗方案，实现精确靶向的临床需求。基于该平台已开发多个管线，管线第一梯队是肿瘤免疫方向，第二梯队是免疫方向。 图53. 唯思尔康研发管线 7.12  恩泽康泰 北京恩泽康泰生物科技有限公司成立于2017年6月，该公司是国内首家致力于外泌体技术开发与临床转化的创新型高科技企业，旗下业务板块主要分为：其一，是基于外泌体的创新药研发，主要涵盖肿瘤免疫、罕见病及神经系统疾病等领域；其二，以外泌体为基础的转化医学研究服务，主要与临床专家合作展开科学研究，目前业务已经覆盖全国主要重点城市，已经与国内50多家知名三甲医院和科研单位以及多家精准医学企业建立合作。 恩泽康泰建立了高效的外泌体工程化改造平台，布局了核心平台性IP，并具备成熟的规模化外泌体量产及高纯度分离能力。通过工程化改造的方式对外泌体进行改性，大幅提高了外泌体携带特定有效成分的载量，并实现特定器官的选择性递送。目前，基于自主研发的外泌体技术，恩泽康泰围绕罕见病治疗、肿瘤免疫两个领域展开了管线布局。在罕见病方面，利用基于外泌体的蛋白替代疗法，为缺失特定胞内蛋白的患者（如溶酶体贮积病）补充所需的蛋白，从而起到治疗的效果；在肿瘤免疫方面，利用外泌体激活免疫细胞自身的免疫信号，并配合PD-1/L1单抗药物的使用，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应。 2019年3月，恩泽康泰宣布完成数千万元Pre-A轮融资，由金芒投资领投，澜峰资本、恩然创投跟投。2021年7月，该公司宣布完成近亿元的A轮融资，由隆门资本领投，泰煜投资、火山石投资跟投。2022年，公司宣布完成数千万元A+轮战略融资，由百度风投领投，老股东泰煜投资、火山石资本继续追加投资。2023年3月完成数千万元A++轮融资，本轮融资由中博聚力、延瑞投资共同参与，老股东百度风投继续加持。 END 免责声明：本文仅作知识交流与分享及科普目的，不涉及商业宣传，不作为相关医疗指导或用药建议。文章如有侵权请联系删除。 TIS2024第四届免疫细胞疗法与干细胞疗法论坛重磅来袭，合作详询：王晨 180 1628 8769

摘要：液体活检是一种通过血液、唾液和尿液等生物液体进行微创检测的革命性策略，用于癌症的诊断和预后预测。外泌体是细胞外囊泡（EVs）的一个子集，它们在供体细胞和受体细胞之间穿梭分子货物，并在调节细胞间通讯中发挥着关键作用。越来越多的研究表明，外泌体有很大的潜力作为液体活检中的新型生物标志物，因为大量的外泌体富集在体液中，并参与了许多生理和病理过程。然而，外泌体在临床应用中的进一步发展受到高质量分离和组分分析方法缺乏的极大限制。本综述旨在提供关于外泌体分离、表征和内容检测的传统和新型技术的全面概述。此外，总结了外泌体作为液体活检中潜在生物标志物在癌症诊断、治疗监测和预后预测中的作用。最后，评估了将基于外泌体的液体活检应用于精准医学的前景和挑战。 1.引言 癌症是全球主要的死亡原因之一。越来越多的证据表明，癌症的发展是一个动态过程，涉及多种组分，包括肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞。到目前为止，组织活检被认为是癌症诊断的最常用方法。然而，提取的少量组织无法代表肿瘤的异质性或监测动态的肿瘤进展，并且这种侵入性方法可能会增加转移的潜力，最终导致生存和预后不良。由于微创性，液体活检通过收集血液和尿液等生物液体的样本，已经引起了广泛关注，并为癌症诊断和实时监测创造了更多机会。外泌体，直径为40-160纳米，是由大多数细胞积极释放并在体液中稳定循环的脂质双层膜囊泡。最初被低估为细胞废弃物的运输工具，外泌体现在被认识到是细胞间通讯的重要参与者。积累的证据表明，包括核酸、蛋白质和脂质在内的各种生物活性分子富集在外泌体中，并且可以从供体细胞转移到受体细胞，导致信息的细胞内转移。外泌体中的生物活性货物可能被受体细胞摄取，促进肿瘤发生和进展。此外，外泌体参与了前转移生态位的形成、肿瘤血管生成和肿瘤免疫抑制。而且，外泌体可以反映其亲本细胞的生理和病理状态的改变。这些发现导致了分析循环外泌体及其衍生货物可能为癌症液体活检提供新机会的想法（见图1），突显了外泌体作为癌症诊断、进展监测和预后预测的生物标志物的潜力。 图1 外泌体作为液体活检的新靶标。外泌体在体液中富集，并在肿瘤发生、进展和转移中发挥关键作用。与传统的循环肿瘤细胞(CTC)和循环肿瘤DNA(ctDNA)相比，外泌体显示出卓越的特性，如活细胞分泌的囊泡、大量存在和稳定循环。传统和先进的技术已被用于从各种体液中分离外泌体并检测外泌体的载物。特定外泌体分子的检测可能为癌症诊断、进展监测和预后预测提供新策略。 目前，循环肿瘤细胞（CTCs）、循环肿瘤DNA（ctDNA）和外泌体已成为液体活检的三个主要分支。与CTCs和ctDNA相比，外泌体在液体活检中显示出更大的优势。首先，在生物液体中存在大量的外泌体（约10^9个/mL）有助于相对容易地获得囊泡，而每毫升血液样本中只有几个CTCs。其次，外泌体由活细胞分泌，具有来自其亲本细胞的丰富生物学信息。因此，外泌体比ctDNA更具代表性，后者有限地反映了凋亡或死亡肿瘤细胞的信息。第三，由于其脂质双层，外泌体本质上是稳定的，即使在恶劣的肿瘤微环境中也能稳定循环。高生物学稳定性允许长期储存样本以进行外泌体分离和检测。值得注意的是，将外泌体应用于液体活检的一个重大挑战是高效和高纯度的分离，这源于它们的纳米尺度大小和固有的异质性。此外，由于癌症外泌体只占体液中外泌体总数的一小部分，超敏感和特异性检测是发展基于外泌体的癌症诊断的先决条件。迄今为止，已经开发了各种方法用于外泌体分离以及外泌体蛋白和核酸的检测。尽管取得了显著进展，但灵敏度和特异性有限、纯度和通量低仍然是学术研究和实际应用的重大挑战。因此，需要积极研究开发易于操作、高灵敏度和高纯度的外泌体分离和检测平台。在这篇综述中，我们讨论了外泌体分离和检测的最新进展以及它们在临床上的应用，强调了新开发的外泌体分离和检测技术。此外，总结了外泌体作为癌症液体活检中潜在生物标志物的应用。 2.外泌体生物发生和内容物 外泌体是由大多数细胞积极释放的异质群体的膜结构囊泡，可以在许多人体液体中找到，如血液、唾液、眼泪和尿液。外泌体生物发生的过程涉及质膜的内陷、多囊泡体（MVBs）的形成和外泌体分泌。MVBs是由内吞体膜向内膨胀形成的内吞结构。在MVBs内部积累的囊泡，称为腔内囊泡（ILVs），通过MVBs与质膜的融合作为外泌体释放（见图2）。广泛的研究表明，供体细胞衍生的生物活性分子富集在外泌体中，这表明外泌体在遗传信息交换中的关键作用。值得注意的是，与亲本细胞相比，外泌体中特定的RNA组分显示出很大的差异，这可能归因于外泌体形成过程中独特的货物分选过程。货物分选的机制尚不清楚，已报道内吞体分选复合物（ESCRT）依赖方式和ESCRT独立机制参与了这一过程。有趣的是，四跨膜蛋白（CD9、CD63和CD81）、热休克蛋白（HSP60、HSP70）和ESCRT相关组分（Alix和TSG101）已被确认存在于外泌体中，这为它们的识别和检测提供了一定的标记。 图2 外泌体的生物发生、内容物和内化作用。外泌体是由多囊泡体与质膜融合而衍生的囊泡。来自供体细胞的细胞质内容物，如核酸和蛋白质，被分选进入外泌体，并通过内吞作用、吞噬作用、直接融合或直接结合（受体-配体相互作用）的方式传递给受体细胞。 越来越多的研究表明，各种与疾病相关的蛋白质和核酸被装载到外泌体中，并且在不同起源的肿瘤中差异性表达。Hoshino等人指出，通过蛋白质组学分析，血浆衍生的外泌体可以识别特定的癌症类型并区分肿瘤来源。他们发现，51种和19种血浆衍生外泌体蛋白分别在胰腺癌和肺癌中被特异性识别。此外，据报道，卵巢癌中外泌体的CD63高表达，而在肺癌中低表达。CD317和表皮生长因子受体（EGFR）在非小细胞肺癌（NSCLC）衍生的外泌体上高度表达。与健康受试者相比，糖蛋白-1（GPC-1）在胰腺癌患者的血清外泌体中显著增加，并且可以用于早期检测胰腺癌，具有100%的诊断特异性和敏感性。除了蛋白质，如miRNA、mRNA和lncRNA等核酸在外泌体中差异分布，并且可以用作特定的癌症生物标志物。例如，在胶质母细胞瘤患者的血清外泌体中检测到突变型EGFRvIII mRNA。Zhou等人报道，外泌体miR-15a-5p的表达水平在子宫内膜癌中比其他癌症类型高7-19倍。此外，外泌体miR-1247-3p的高表达与肝癌的肺转移正相关，这表明预后不良。鉴于外泌体由活细胞分泌，外泌体中的具体内容物可以反映其亲本细胞的病理生理状态，这使它们成为疾病进展动态监测的有用生物标志物。总的来说，被分选到外泌体中的货物不仅可以为它们的识别提供额外的特征，而且为癌症患者的诊断、治疗监测和预后预测提供了有希望的生物标志物，为液体活检提供了一种新工具。 3.外泌体分离和富集方法 由于独特的形成方式和特定的货物分选过程，外泌体在大小和分子内容上是异质的。从复杂的生物组分中外泌体的分离和富集对于基础研究和临床转化至关重要。到目前为止，已经开发了许多方法，这些方法在分离外泌体的数量和纯度上有显著差异。 4.传统分离方法 4.1.基于超速离心的分离 作为外泌体分离的金标准，超速离心是最常用的方法，包括差速超速离心和梯度密度超速离心。传统的差速超速离心最初由Johnstone等人提出，用于从网织红细胞的培养基中分离外泌体。通常，首先使用低速离心（300 g）去除细胞碎片，然后使用20,000g速度的离心去除其他大囊泡。最后使用高力（100,000g）沉降外泌体。然而，这种方法需要昂贵的仪器，并且存在聚集蛋白的污染。更多的离心周期可以获得更纯净的结果，但会导致更低的回收率。梯度密度超速离心是获得更高纯度外泌体的更好选择。在离心过程中，不同大小的颗粒从两个或多个溶液中分离成不同的层，其密度从上到下增加。基于此，该方法已被应用于分离外泌体，发现它们在密度为1.15到1.19g/mL处浮动。尽管比超速离心具有更高的纯度，但耗时的过程和对大量生物液体的需求大大限制了其在临床应用中的使用。 4.2.基于大小的分离 固定范围直径的特征允许通过基于大小的方法分离外泌体。过滤是使用具有特定孔径的膜过滤器进行外泌体分离的一种基于大小的方法，具有操作简单和有效纯化的优点，但产量低。超滤通常应用于从大量原始材料（如细胞培养基）中浓缩外泌体。目前，超滤与超速离心的结合已被广泛采用，在这种方法中，过滤用于去除细胞和大囊泡，而外泌体的纯化通过超速离心实现。此外，尺寸排除色谱（SEC）可以根据样品的大小和凝胶孔径分离生物分子组分。在分离过程中，大分子早期被洗脱，而小分子或颗粒直接扩散进入孔中。Anita N Böing等人开发了一种基于交联琼脂糖CL-2B柱的SEC协议，该协议可以有效地从无血小板上清液中分离直径大于70nm的外泌体。郭等人表明，CL-6B柱在颗粒产量和外泌体纯度方面比CL-2B柱表现更好。与离心和过滤方法相比，SEC具有温和处理和非破坏性结果的优点。此外，SEC与超速离心的结合可能具有提高的回收率和纯度。 4.3.沉淀技术 对于沉淀技术，使用高度亲水的聚合物与外泌体膜周围的水分子竞争性结合，从而降低溶解度，最终实现外泌体分离的低输入体积。迄今为止，聚乙二醇（PEG）是用于外泌体分离的最常用聚合物。Rider等人提出了一种名为ExtraPEG的外泌体纯化方法，该方法能够快速富集外泌体，并从囊泡中获取足够的内容物以供下游分析。最近，许多依赖沉淀技术的商业试剂盒已经被开发用于外泌体的分离和富集，如ExoQuick™和Total Exosome Isolation。Ding等人的研究表明，与其他试剂盒相比，ExoQuick™能够产生相对较高的外泌体产量。然而，这种方法经常因其高成本和共沉淀蛋白聚集体的污染而受到批评。 5.新的富集方法 外泌体特异性标记物和组分的发现为分离外泌体及外泌体亚群（图3）提供了新的途径。通过针对肿瘤相关蛋白如GPC-1和EpCAM（上皮细胞粘附分子）的特异性抗体和核酸适配体，可以很好地区分癌细胞来源的外泌体和正常细胞来源的外泌体。此外，微珠、微流控芯片和热泳等应用使得外泌体的快速便捷富集成为可能。在这里，我们总结了新方法在外泌体富集中的优势和局限性（表1）。 5.1.免疫亲和富集 由于简单性和特异性的优势，免疫亲和分离策略已被用于许多研究中的外泌体富集（图3A）。例如，张等人制造了一种针对活化微流控芯片的抗CD81功能化外泌体分离方法。杨等人报告了一种通过形成AuNC-外泌体-AuR复合物的三明治结构进行外泌体分离的集成微流控装置（图3Aa）。该装置在30分钟内从5mL尿液样本中获得了5×109个颗粒的产量。然而，捕获的外泌体的解离仍然是一个巨大的挑战，这源于抗原和抗体之间的强亲和力。为了解决这一挑战，康等人开发了一种外泌体特异性双模式免疫过滤（ExoDIF）装置。生物素化的抗CD63抗体固定在内通道表面，该表面依次用3,3'-二硫双磺苏糖咪啶（DTSSP）、生物素化牛血清白蛋白和亲和素处理。结果，从高稀释的细胞培养基中捕获了近87.1%的外泌体。值得注意的是，被捕获的外泌体可以通过DTT（二硫苏糖醇）解离，通过破坏DTSSP中嵌入的二硫键（图3Ab）。 最近，康等人提出了一种EVs on demand芯片（EVOD），通过四氮唑-抗EpCAM/抗EGFR抗体（TzAb）与TCO（反式环辛烯）功能化的微流控表面之间的反应，实现了癌症相关外泌体亚群的捕获。该芯片能够从癌症患者中选择性地比从健康捐赠者中多分离出76%的EGFR+外泌体，显示出对NSCLC早期检测的巨大潜力。孙等人设计了一个有趣的共价化学介导的EV点击芯片，通过多标记鸡尾酒（抗EpCAM、抗ASGPR1（唾液酸糖蛋白受体1）、抗CD147）从血浆样本中识别、富集和回收肝细胞癌（HCC）特异性外泌体（图3Ac）。所提出的外泌体纯化系统实现了超过81%的回收率和超过85%的纯度，为检测肝细胞癌提供了一种新的液体活检工具。尽管意义重大，但这些方法成本高且依赖于标记物。此外，应更多关注捕获外泌体的非破坏性释放。 5.2.磁性分离和富集 基于磁性珠的免疫亲和富集近年来因其便利性和高效率而受到广泛关注（图3A）。通常，外泌体通过抗体修饰的磁性珠被捕获，然后通过磁场力分离。例如，方等人进行了CD63抗体共轭磁性纳米粒子以分离外泌体。此外，新型免疫亲和超顺磁性纳米粒子（IS-NPs）被证明具有高效率，通过β-环糊精（β-CD）和4-氨基偶氮苯（AAB）之间的相互作用将抗CD63抗体与超顺磁性纳米粒子结合（图3Ad）。α-CD，一种从β-CD-AAB包合物中提取AAB的竞争性试剂，被适应用于外泌体的洗脱。结果，在人工模型样本中外泌体的捕获和释放效率分别高达80%和86.5%。与传统分离方法相比，IS-NPs方法显示出更高的产量、更高的纯度以及更好地保留了外泌体的结构和功能完整性。特别是癌症衍生的外泌体亚群的分离可以通过将磁性珠与针对肿瘤特异性生物标志物的抗体结合来实现。罗等人通过免疫亲和磁性珠和基于DNA折纸的核酸适配体进行了外泌体的快速分离和捕获。通过与DNA荧光探针的结合，可以实现外泌体的定量检测。李等人开发了一种均质磁荧光外泌体（hMFEX）纳米传感器，用于从乳腺癌患者的80μL血浆中分离GPC-1阳性外泌体。何等人开发了一个微流控平台，通过将样本与抗EpCAM或抗CA125抗体标记的磁性珠混合来捕获肿瘤衍生的外泌体。总的来说，免疫磁性分离方法有潜力促进快速分离和临床应用的循环外泌体在所需领域的实现。 图3 外泌体分离新技术。A 免疫亲和/免疫磁性富集。版权所有 2020 年 Yang ，2017 年 Kang ，2018 年 Cai ，2020 年 Sun 。B 基于物理特性的分离。版权所有 2017 年 Liu ，2019 年 Sunkara V ，2019 年 Hattori 。C 脂质介导分离。版权所有 2018 年 Xu ，2021 年 Jiang 。D 基于声学的分离/热泳富集。版权所有 2021 年 Tayebi ，2019 年 Liu ，2021 年 Tian 。 5.3.基于物理特性的分离方法 基于尺寸的微流控芯片被用来从大细胞碎片或其他膜状囊泡中分离外泌体（见图3B）。刘等人设计了一个基于尺寸的外泌体全隔离芯片（ExoTIC），其中30-200纳米的外泌体通过多个纳米孔膜被富集和纯化（见图3Ba）。与传统的超速离心和商业PEG沉淀试剂盒相比，ExoTIC从小体积的人类血浆中获得了更多的外泌体产量。然而，膜孔堵塞大大限制了外泌体的连续分离。为了克服这个问题，陈等人引入了一个超快隔离系统，EXODUS，它将双耦合谐波振荡集成到双膜过滤器配置中。通过周期性负压和气压切换，在线性纳米孔阳极氧化铝膜上产生了周期性负压振荡，允许小颗粒（即蛋白质和核酸）和流体通过，而较大的外泌体则留在中心腔室。此外，两对振荡器通过横向波和声流学流动使颗粒重新悬浮到液体中，有效限制了污染和颗粒聚集。此外，切向流过滤（TFF）是一种有效减少孔堵塞潜在技术，由于流向和过滤方向垂直状态。Sunkara等人开发了一个微流控切向流过滤装置，Exodisc，用于从人类血浆和尿液中分离外泌体，与传统方法相比，显示出更好的外泌体产量（见图3Bb）。决定性横向位移（DLD）已被用于外泌体分离，因为不同大小的颗粒在具有特定角度显示的微柱平台上表现出不同的轨迹。Wunsch等人提出了一个纳米尺度的横向位移（nano-DLD）阵列，其中较大的囊泡在阵列中横向位移并被收集在侧通道，而较小的囊泡以之字形从阵列中排出，最终实现尿液来源的外泌体的收集。然而，DLD受到通量低和需要高电压的限制，囊泡的密度和刚度可能会干扰基于DLD的外泌体分离。 5.4.基于脂质的分离 囊泡表面的脂质分子使外泌体捕获得以通过亲和介导（见图3C）。万等人报道了一种脂质纳米探针，用于从血浆中快速分离外泌体。外泌体的脂质双层被生物素标记的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚（乙二醇）（DSPE-PEG）探针标记，其中DSPE通过疏水效应插入外泌体膜，PEG在水相中提供溶解性。NeutrAvidin包被的磁性亚微米颗粒被用于通过亲和素-生物素亲和收集外泌体。结果，仅需要15分钟就能分离外泌体，大大缩短了分离程序。值得注意的是，胆固醇-PEG1000约6.4纳米被认为可以最小化脂质纳米探针表面固定时的空间位阻，从而实现了更高的捕获效率。此外，吸附在囊泡膜上的脂质分子也被应用于捕获外泌体。T细胞膜蛋白4（Tim-4），对磷脂酰丝氨酸（PS）有很高的亲和力，已被证实有助于从血清样本中简单分离外泌体，使快速下游分析更加容易（见图3Ca）。此外，TiO2壳层与外泌体磷酸基团的亲和作用是富集磷酸化肽段的一种新策略。庞等人使用Fe3O4@TiO2纳米颗粒在5分钟内富集和分离外泌体，捕获效率为96.5%。Fe3O4@TiO2纳米颗粒与表面增强拉曼散射（SERS）标签的结合可以同时富集外泌体并实现目标miRNAs的原位鉴定（见图3Cb）。 5.5.基于声学的分离方法 基于声学的微流控是一种简单高效的外泌体分离方法。通常，超声波应用于样本，颗粒根据其物理特性（如大小和密度）经受不同的作用力并被分离（见图3D）。Anson等人利用微米级种子颗粒和纳米颗粒在谐振腔中的超声波散射来富集外泌体。集成的声学装置实现了快速操作、非接触和连续分离尿液和血浆样本中的外泌体。吴等人开发了一个声流学平台，用于直接、无标记、非接触富集全血中的外泌体。该装置集成了两个分离模块，其中一个能够去除直径大于1微米的颗粒，另一个可以从未外泌体和其他颗粒中分离外泌体。最近，顾等人报道了一个声学驱动的旋转液滴装置，其中倾斜的交错换能器（IDTs）被用来根据不同频率的声波使纳米颗粒移动。通过将两个不同大小的液滴放置在一起，可以特别集中固定大小的颗粒。结果，该方法可以从5微升样本中在不到1分钟的时间内分离外泌体。此外，Tayebi等人将声辐射力（ARF）与介电泳（DEP）结合起来，在流动路径中放置高频（>10 MHz）的交错换能器，同时产生ARF和介电泳力场。介质中的颗粒通过流体阻力、ARF和DEP力场之间的竞争呈现横向平移，从而实现了细胞外囊泡的主动分离（见图3Da）。 5.6.热泳富集 热泳是指颗粒通过局部激光加热诱导的温度梯度，从高温区域迁移到低温区域的现象。为了解决耗时的分离和纯化程序的挑战，刘等人开发了一种敏感的热泳方法来富集肿瘤衍生的外泌体。通过使用针对肿瘤特异性标记物的核酸适配体，热泳能够实现快速分离和富集外泌体，而无需预先分离外泌体（见图3D）。外泌体的积累产生了核酸适配体的放大荧光信号，这使得外泌体表面生物标志物的分析以及miRNAs的检测成为可能（见图3Db）。田等人进行了类似的检测，分析了1微升血浆中的外泌体，为转移性乳腺癌的液体活检提供了一种低成本、敏感的方法（见图3Dc）。 6.外泌体表征 如2018年细胞外囊泡研究的最小信息标准（MISEV2018）所建议，外泌体的鉴定应包括西方墨点验证外泌体特异性标记物，并且至少使用两种方法对外泌体单个颗粒进行表征。 6.1.可见表征 透射电子显微镜（TEM）被认为是识别和表征单个外泌体的常用方法，其典型结构为杯状（见图4A）。对于扫描电子显微镜（SEM），通过收集从样本中弹出的电子来呈现图像（见图4C）。值得注意的是，外泌体的形态可能会受到样本处理过程中脱水的影响。相反，冷冻电子显微镜（冷冻-EM）是更好的选择，因为它避免了样本固定和脱水。外泌体在非常低的温度下被分析，并且呈现出与TEM图像不同的圆形结构（见图4B）。此外，原子力显微镜（AFM）可以通过振幅调制和相位调制提供表面形态和材料属性（刚度、粘附性）的信息（见图4D）。而且，特定外泌体膜标记功能化的AFM探针允许单个外泌体中蛋白质的识别和检测。 图4 外泌体表征技术。A 透射电子显微镜。版权所有 2020 年 Li。B 冷冻电镜。版权所有 2018 年 Tian。C 扫描电子显微镜。版权所有 2010 年 Sharma 。D 原子力显微镜。版权所有 2010 年 Sharma。E 动态光散射。F 纳米颗粒追踪分析。G 可调电阻脉冲传感。 6.2.定量表征 动态光散射（DLS）是一种测量外泌体尺寸分布和zeta电位的技术。散射光的干涉和强度变化可以通过传感器识别，从而估计颗粒的尺寸分布（见图4E）。然而，蛋白质聚集体和大囊泡的污染使得DLS很难将它们与外泌体区分开来。纳米颗粒跟踪分析（NTA）是一种广泛用于确定颗粒浓度和尺寸分布的方法（见图4F）。颗粒被一束光照射，散射光信号被光学显微镜收集。可调电阻脉冲传感（TRPS）检测外泌体通过充满导电介质的孔时离子电导率变化产生的电信号（见图4G）。 7.检测外泌体内容物的技术 7.1.传统的蛋白质分析 外泌体中的膜蛋白和细胞质蛋白都可以被检测到。一些外泌体上的膜蛋白参与了癌症的发展和进展，因此被用作外泌体分离和纯化的靶点。西方墨点和酶联免疫吸附测定（ELISA）是检测外泌体蛋白质的两种常规方法。然而，这些方法面临着复杂程序和低灵敏度问题。 8.新的蛋白质检测方法 8.1.比色检测 到目前为止，已经开发出多种新技术来检测外泌体蛋白质（见表2）。比色检测是一种通过比较或测量有色物质的颜色强度来确定组分含量的方法（见图5A）。与其他纳米材料如Fe3O4 NPs和AuNPs类似，DNA具有显著增加单壁碳纳米管（s-SWCNTs）过氧化物酶活性的能力。夏等人开发了一种直观简单的外泌体检测方法。简要地说，CD63核酸适配体提高了s-SWCNTs的微小过氧化物酶活性，并有效地催化了3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）的氧化，使无色溶液变蓝。相反，外泌体的加入诱导核酸适配体从纳米管表面释放，溶液的颜色由深变浅，这可以通过肉眼或紫外-可见光谱仪观察到，检测限（LOD）为5.2×105个粒子/μL。如前所述，ZnO-芯片被设计用于有效分离外泌体。在外泌体与一抗混合物（抗CD9/CD63抗体）孵育后，通过HRP（辣根过氧化物酶）标记的二抗识别（见图5Aa）。最后，通过紫外-可见光谱仪或微孔板分析仪获得了最小可检测浓度为2.2×104个粒子/μL。梁等人设计了一个与双膜过滤器和ELISA集成的微流控系统，用于检测膀胱癌患者尿样中外泌体的含量。除了常见的外泌体蛋白，比色法也可以用来检测癌症特异性蛋白。例如，PSA（前列腺特异性抗原）核酸适配体基础传感器被用于在500μL人类血浆中直观检测前列腺癌特异性外泌体。此外，Di等人报告了一种纳米酶辅助免疫吸附测定（NAISA），它能够灵敏和快速地多重分析外泌体蛋白（见图5Ab）。外泌体表面蛋白可以被固定在微孔板表面的抗体特异性捕获并催化比色反应。来自微孔板阅读器的信号强度与目标蛋白的数量成正比。结果，NAISA允许从临床样本中快速分析多种外泌体蛋白，如CD63、CEA（癌胚抗原）、GPC-3（Glypican-3）、PD-L1（程序性死亡配体1）和HER2（人类表皮生长因子受体2）。 8.2.荧光检测 荧光光谱光度法是一种根据荧光光谱线的阳性和强度进行物质鉴定和含量测定的方法（见图5B）。何等人进行了一种微流控芯片，用于检测30μL血浆样本中的表面和腔内生物标志物。该芯片获得了IGF-1R（胰岛素样生长因子1型受体）的显著提高的检测灵敏度，0.281pg/mL的IGF-1R和0.383pg/mL的p-IGF-1R，这比ELISA实现的灵敏度高100倍（见图5Ba）。刘等人开发了一种免疫吸附测定，其中免疫磁性珠被用来捕获外泌体，然后与酶报告分子结合，可以产生用于量化液滴微流控系统中GPC-1+外泌体的荧光信号。魏等人提出了类似的单分子阵列（SiMoa）平台，通过该平台可以超灵敏地检测通用外泌体和肿瘤衍生外泌体，检测限分别为34个粒子/μL和25个粒子/μL。余等人进行了一种基于CD63核酸适配体的检测方法。外泌体上的CD63可以与修饰在磁性珠表面的核酸适配体结合，导致Cy3标记的短序列进入上清液。上清液中的荧光强度用于量化复杂临床样本中的外泌体。氧化石墨烯具有通过荧光共振能量转移（FRET）与荧光染料结合时淬灭荧光的能力。例如，当FAM标记的核酸适配体被吸收到氧化石墨烯膜上时，荧光被淬灭，而目标外泌体与核酸适配体竞争性结合并重新表现出荧光信号，检测限为1.6×105个粒子/mL（见图5Bb）。李等人开发了一种基于聚集诱导发光体（AIEgens）的简便荧光核酸适配体传感器。氧化石墨烯吸收（含有四苯基的叔胺）TPE-TAS/核酸适配体复合物在没有外泌体的情况下允许荧光淬灭。当目标外泌体被引入时，核酸适配体优先与其目标结合，导致TPE-TAS/核酸适配体复合物从氧化石墨烯表面分离，随后出现“开启”的荧光信号。在优化条件下，肿瘤衍生外泌体的线性范围大约为4.0×105个粒子/μL至1.8×107个粒子/μL。 8.3.电化学检测 电化学检测是通过测量样品的电化学势或电流来检测分析物的方法，具有高灵敏度和宽测量范围的优点（见图5C）。近年来，研究人员开发了电化学生物传感器，因为当识别元素如抗体和核酸适配体特异性结合到外泌体时，改变的电化学信号可以量化外泌体。曹等人提出了一种电化学生物传感器，用于准确检测PD-L1+外泌体（见图5Ca）。外泌体首先被抗CD63功能化的磁性珠捕获，然后与抗PD-L1连接的DNA链结合，引入超支化滚环放大（HRCA）。HRCA可以降低环境pH值，导致PVP@HRP@ZIF-8分解并释放HRP，从而产生放大的电化学响应，因此实现了癌症衍生PD-L1+外泌体的识别和检测。这种生物传感器对PD-L1+外泌体显示出宽动态范围（1×103至1×1010个粒子/mL），检测限为334个粒子/mL。Jeongmin等人报告了一种HiMEX方法，该方法集成了磁性外泌体分离和外泌体结合蛋白的电化学检测，经过酶放大。从20μL血浆样本中外泌体中肿瘤生物标志物（EGFR、EpCAM、CD24和GPA33）的联合检测有助于结直肠癌的诊断和监测。电化学方法，特别是基于核酸适配体的生物传感器在检测和分析外泌体蛋白方面显示出巨大潜力。Kashef-Kheyrabadi等人介绍了一种可分离的微流控装置，该装置实现了基于核酸适配体的电化学生物传感方法（DeMEA）。在这个系统中，针对EpCAM的核酸适配体被固定在预先电镀金纳米结构的电极表面，微流控涡旋可以增加外泌体和传感表面之间的碰撞（见图5Cb）。因此，DeMEA能够量化不同阶段乳腺癌患者血浆样本中的外泌体，为癌症特异性外泌体的高度敏感和早期检测提供了一种方法。 图5 新方法检测外泌体内容物。A 比色检测。版权所有 2018 年 Chen，2020 年 Di 。B 荧光检测。版权所有 2014 年 He，2018 年 Jin 。C 电化学检测。版权所有 2020 年 Cao 。2020 年 Kashef-Kheyrabadi L。D SPR/SERS 检测。版权所有 2014 年 Hyungsoon Im ，2020 年 Dong。E 单外泌体检测。版权所有 2019 年 Wang，2019 年 He 。F ddPCR。版权所有 2020 年 Sun ，2021 年 Liu。G 分子信标。版权所有 2016 年 Ji Hye Lee ，2015 年 Ji Hye Lee 。H LSPR 检测。版权所有 2021 年 Wu 。 8.4.表面等离子共振检测 表面等离子共振（SPR）是一种物理光学现象，由金属膜/液体界面处的全反射光引起，用于分析分子间相互作用（见图5D）。Im等人开发了一种基于透射SPR的纳米等离子体外泌体（nPLEX）检测方法，通过周期性纳米孔阵列（见图5Da）进行。每个阵列中的功能化抗体，nPLEX传感器显示出与目标外泌体蛋白水平成比例的光谱移动或强度变化。在另一项研究中，由于等离子体效应，AuNC-Exosome-AuR上观察到显著改善的散射波长移动和散射强度。通过抗LRG1抗体偶联的AuR探针评估了肺癌患者和健康个体尿液中外泌体中LRG1（富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1）的差异表达。范等人开发了一种基于SPR成像（SPRi）的生物传感检测方法。抗体（抗CD63/抗EGFR/抗EpCAM）修饰的金芯片与不同识别位点之间的生物亲和相互作用允许对NSCLC衍生的外泌体进行多重表征。这种生物传感器的检测限估计为104个粒子/μL。尽管具有多种优点，但纳米等离子体生物传感器的广泛应用受到纳米结构制造困难的限制。为了解决这一挑战，刘等人开发了一种无需纳米结构的强度调制SPR生物传感器。在这个传感器中，激光的反射强度和参考强度被两个光电探测器记录，并用于量化外泌体蛋白的表达水平，显示出比ELISA更高的检测灵敏度。 8.5.表面增强拉曼散射 表面增强拉曼散射（SERS）能够通过电磁和化学机制增强附着在粗糙金属表面的小型分子的拉曼信号（见图5D）。一种新的检测方法被报道用于外泌体的实时检测和蛋白质分析。通常，镀金的载玻片与3D打印的抗体阵列结合使用，用于捕获外泌体，QSY21包覆的金纳米棒被用作标记剂，用于定量检测目标蛋白。通过这种针对HER2和EpCAM的检测方法，定量确定了乳腺癌患者血浆衍生的外泌体水平。提出的3D打印阵列模板实现了廉价、便携且易于建立的检测平台，为新型癌症液体活检的发展提供了新策略。董等人表明，蛋白质磷酸化状态的分析可能为癌症诊断提供新的可能性（见图5Db）。开发了一种类似蜂巢的Au包覆的TiO2大孔反蛋白石结构，用于在无需任何标记过程的情况下捕获和分析外泌体。1087 cm-1的SERS峰的强度指的是外泌体磷酸化蛋白中的P-O键，且峰强度至少是来自癌症患者的血浆的两倍。然而，上述两种检测方法都需要预先分离外泌体，这大大阻碍了快速分析。庞等人提出了一种简单的免疫分析方法，直接从血清样本中捕获和分析外泌体PD-L1。Fe3O4@TiO2纳米颗粒被设计用于分离外泌体，抗PD-L1抗体修饰的Au@Ag@MBA SERS标签被应用于外泌体PD-L1的标记和SERS检测。这种检测方法在40分钟内成功定量了4μL血清样本中的外泌体PD-L1。 8.6.CRISPR/Cas系统辅助检测 在CRISPR/Cas9系统中，Cas9核酸酶可以通过识别特定的互补双链DNA（dsDNA）含有PAM（protospacer adjacent motif）序列，并通过导向RNA（gRNA）的帮助，高效地剪切dsDNA序列。通过特异性靶向外泌体蛋白的核酸适配体，蛋白质的检测可以转化为核酸的定量。最近，赵等人报告了一种结合了基于核酸适配体的外泌体膜蛋白识别和CRISPR/Cas12辅助的荧光信号放大的检测方法。在这个系统中，CD63核酸适配体特异性地靶向外泌体膜蛋白，触发核酸适配体的构象变化并释放阻断链（与核酸适配体具有互补序列）。释放的阻断链随后被CRISPR/Cas12a识别，导致对TaqMan探针的转剪切，荧光报告团和猝灭团的分离，最终产生放大的荧光信号。结果，这种方法实现了103至107个粒子/μL的线性检测范围，并成功应用于直接检测血浆外泌体，无需超速离心。邢等人开发了一种apta-HCR-CRISPR检测方法，用于从50μL鼻咽癌患者血清中检测循环的核糖体蛋白+或PD-L1+外泌体。核糖体蛋白或PD-L1靶向核酸适配体首先通过HCR（杂交链反应）放大，产生长重复的CRISPR可靶向DNA单元。通过收集CRISPR-Cas12a的旁路剪切活性诱导的荧光信号，该检测方法实现了102个粒子/μL的检测限。李等人进行了类似的检测，用于超灵敏检测CD109+和EGFR+外泌体。CRISPR/Cas系统预计将成为识别和定量外泌体蛋白的敏感工具，并可能有助于癌症的诊断和治疗监测。 8.7.单个外泌体检测 内在异质性是阻碍体液中外泌体分析的主要因素之一。单个外泌体检测可能提供更准确的肿瘤进展信息（见图5E）。郭等人提出了一个ssDNA辅助的单个外泌体检测平台。滚环放大（RCA）有助于从表面蛋白产生放大的荧光信号，使单个外泌体容易可视化，检测限为82个囊泡/μL。此外，刘等人开发了一种λ-DNA和核酸适配体介导的方法，允许通过大小和肿瘤相关标记表达对外泌体进行二维分析。 由于纳米尺寸的外泌体不能通过常规流式细胞术敏感地识别，因此醛/硫酸盐乳胶珠被用来与囊泡结合，然后被荧光抗体染色并对其蛋白标记进行表征。例如，抗GPC-1抗体和Alexa-488标记的二抗被引入到附着外泌体的珠子上，阳性珠子的百分比在此被称为GPC-1+外泌体的百分比。此外，外泌体中表达的EpCAM、HER2和EGFR的检测表明了它们在癌症诊断中的潜在作用（见图5Ea）。此外，纳米流式细胞术的发展为单颗粒的多参数分析提供了新的选择。通过纳米流式细胞术使用免疫荧光标记测量单个外泌体的CD9、CD63、CD81、CD235a、CD45、CD41a和CD144的表达，以评估通过六种不同方法分离的外泌体制备的质量。刘等人使用纳米流式细胞术分析泪液衍生外泌体中CD9、CD63、CD81、CD47、CD45、CD24和EpCAM的表达，并发现泪液中外泌体浓度大约是血浆外泌体的100倍。 9.传统的核酸分析 除了蛋白质载体外，外泌体中也包裹有核酸。RNA是外泌体中主要的核酸载体，已显示出作为癌症诊断和预后预测的特定生物标志物的潜力。然而，检测外泌体核酸的准确性和可行性常受到其低丰度的阻碍。为了定量外泌体核酸的表达水平，已使用了如qRT-PCR（实时定量逆转录PCR）、微阵列和下一代测序（NGS）等技术。尽管qRT-PCR具有高灵敏度，但它只能用于检测已知序列的核酸。NGS有利于高通量发现和定量未知的外泌体RNA转录本。然而，需要解决的不足之处包括高成本、大量数据和构建文库的复杂性。通过杂交探针和目标基因的互补组合，微阵列可以一次分析外泌体中的数千种核酸，但存在灵敏度低的缺点。为了克服这些限制，正在投入更多努力开发高灵敏度和便捷的外泌体核酸检测方法（见表3）。 10.新的核酸检测技术 10.1.ddPCR 液滴数字PCR（ddPCR）是一种技术，其中PCR反应混合物被分成油包水乳液中的数万个水性液滴（见图5F）。每个单独的液滴包含不超过一个目标基因的副本，并根据荧光幅度被标记为阳性或阴性。然后通过泊松分布和阳性液滴的比例估计目标核酸的浓度。ddPCR与qPCR的比较表明，ddPCR在分析尿液外泌体miRNAs方面具有更高的准确性和灵敏度。Chen等人使用ddPCR从胶质母细胞瘤（GBM）患者的血清或脑脊液（CSF）衍生的外泌体中识别IDH1（异柠檬酸脱氢酶1）转录本。在携带突变型IDH1胶质母细胞瘤患者的CSF衍生外泌体中鉴定出突变型IDH1 mRNA，并且在来自肿瘤患者的外泌体中发现IDH1 mRNA的水平高于健康对照组。Sun等人最近使用ddPCR从肝癌（HCC）患者的血浆样本中定量10种HCC特异性mRNA（见图5Fa）。通过计算数字评分评估了HCC外泌体衍生mRNA签名的诊断价值。此外，通过ddPCR检测外泌体miR-15a-5p以区分子宫内膜癌（EC）患者和健康受试者。Shen等人报告说，在与良性肺肿瘤相比，从恶性肺癌患者的EpCAM特异性外泌体中通过ddPCR定量了更多的lncRNAs RP11-77G23.5和PHEX-AS1的拷贝数。 10.2.分子信标 分子信标（MB）是一种发夹状的寡核苷酸，两端分别标记有荧光染料和猝灭剂（见图5G）。MB设计用于与目标序列自发杂交，从而破坏发夹环结构并诱导荧光出现。Lee等人观察到，分子信标与癌细胞和人血清中外泌体中的miRNA-21的杂交获得了高荧光信号（见图5Gb）。此外，通过基于MB的生物传感器从人尿液中外泌体中检测到miR-375和miR-574-3p。人血清中外泌体中miR-21、miR-375和miR-27a的表达水平被检测出来（见图5Ga）。Oliveira等人利用CPP（细胞穿透肽）将MB传递穿过血浆膜，然后检测红细胞（RBC）衍生外泌体中的miRNA-451a。Chen等人设计了一个2'-O-甲基化和硫代磷酸酯修饰的分子信标，用于定量分析人血浆中外泌体miRNA-1246。使用Triton X-100破坏外泌体膜后，探针可以特异性地靶向内部的miRNA-1246并显示定量荧光信号。Zhang等人开发了一个集成的外泌体分离和检测系统，其中外泌体可以通过微流控技术使用少量样本分离。同时，纳米孔检测技术有效地提高了无需放大和荧光标记的肿瘤相关miRNA的检测效率。基于分子信标的生物传感器具有简单程序、无需外泌体预分离和核酸提取的优势，显示出它们在癌症诊断和预后液体活检中的巨大潜力。 10.3.DNA四面体探针 DNA四面体是一种具有高可控性的DNA纳米结构，可以通过化学修饰和DNA自组装提供多样化的放大信号标签。Gao等人进行了一个基于DNA四面体纳米探针的FRET传感平台，用于灵敏地检测不同细胞系中的miR-146b-5p。Chen等人报告了一个发夹四面体纳米探针，用于人血清中外泌体miR-21的定量测量。在没有miR-21的情况下，荧光供体-猝灭剂对的结构导致了低FRET效应，而目标miRNA的存在诱导了干环结构的破坏和强FRET的发生。因此，该检测方法在1×10-12至10×10-9M（摩尔/升）的范围内获得了良好的线性，并检测限为45.4×10-15M。Zhang等人提出了一个类似的基于两个多功能DNA四面体辅助催化发夹组装的电化学生物传感器。通过利用局部反应和级联放大，该传感器能够在30分钟内灵敏地检测肿瘤相关外泌体miRNA，低至7.2 aM。 10.4.局域表面等离子共振 局域表面等离子共振（LSPR）发生在入射光频率与贵金属纳米颗粒或金属导电电子的整体振动频率相匹配时（见图5H）。Joshi等人开发了一种基于LSPR的生物传感器，用于无标记和非破坏性测量外泌体miR-10b。金纳米棱柱通过化学合成到硅烷化的玻璃基底上，然后功能化HS-C6-ssDNA和PEG6-SH。目标miR-10b和HS-C6-ssDNA的直接杂交诱导双链DNA的形成，这可以增加纳米棱柱的折射率并改变LSPR偶极峰的波长（λLSPR）。miR-10b的浓度可以通过ΔλLSPR来评估。该平台足够灵敏，即使在亚阿摩尔浓度范围内，也能区分miR-10b和miR-10a（仅一个核苷酸差异）。Wu等人开发了一种基于SPRi的生物传感器，用于准确诊断NSCLC的多种外泌体miRNAs，其中Au-Ag异质结构和DNA四面体框架被用来增强SPR信号，每种外泌体miRNA都可以被不同SPR信号超灵敏地识别（见图5Ha）。 10.5.基于TIRF的单囊泡成像 作为单外泌体分析方法，全内反射荧光（TIRF）已经出现，为提供有关外泌体异质性的额外信息（见图5E）。He等人提出了一个基于TIRF的单囊泡成像检测方法，该方法将分子信标探针送入外泌体，从而诱导目标miRNA的放大荧光（见图5Eb）。他们对单个囊泡进行了直接可视化和人血清样本中miR-21的原位定量分析，发现这种检测方法在区分癌症患者和健康受试者方面比传统PCR检测方法表现更好。 10.6.热泳辅助检测 Zhao等人开发了一种热泳传感器，用于无需RNA提取或目标放大即可原位检测外泌体miRNA（见图5F）。修饰在纳米孔中的核酸适配体能结合目标外泌体miRNA，诱导荧光的出现。经过热电泳积累后，荧光信号被放大，允许在少量血清样本中灵敏地检测0.36 fM外泌体miRNA。此外，Han等人提出了一种基于DNA四面体的热泳检测（DTTA），实现了血清外泌体中14 aM mRNA的检测限。DNA四面体的两个荧光标记的识别序列被外泌体内化后，可以结合目标mRNA，导致FRET信号增加。热泳效应被应用于进一步放大FRET信号，实现了对外泌体中PSA mRNA的高灵敏度检测。DTTA检测显示，外泌体PSA mRNA在区分前列腺癌和良性前列腺增生方面比血清PSA蛋白表现更好（AUC：0.93对比0.74），为精确检测前列腺癌提供了一种新方法。 10.7.CRISPR/Cas系统辅助检测 最近，CRISPR/Cas系统为开发用于检测和定量外泌体中核酸的分析方法提供了新机会。已经提出了将核酸放大与CRISPR/Cas整合的策略，以提高分析特异性和灵敏度。例如，Wang等人进行了一种名为滚动循环放大辅助CRISPR/Cas9切割（RACE）的平台，用于检测多种外泌体miRNA。在RCA过程中，Padlock探针在HiFi Taq DNA连接酶的存在下识别单碱基差异。由大量重复目标序列和PAM结构组成的长ssDNA的放大产物被Cas9核酸酶特异性识别。因此，与ssDNA杂交的TaqMan探针被Cas9蛋白完全切割，允许“开启”荧光变化，可以方便地通过光谱测量。结果，这种RACE平台可以用于高度特异性地检测人血浆中的单一或多种外泌体miRNA。然而，基因组中大量的天然PAM结构可能增加非目标效应的风险，极大地损害分析的特异性。 11.机器学习 机器学习指的是一种技术，它通过构建已知数据的模型来预测和分析未知数据。作为人工智能的关键分支，机器学习已被广泛用于外泌体生物标志物的多重分析。已经开发了诸如线性判别分析（LDA）、主成分分析（PCA）、神经网络（NN）、支持向量机（SVM）和随机森林（RF）等算法，将多变量数据分类为典型的分类模型，然后应用于未知生物数据的预测和分组。Kawakami等人证明，机器学习算法在预测和诊断上皮性卵巢癌方面比传统的逻辑回归分析表现更好。Wu等人使用尿液衍生外泌体的荧光信号作为输入数据，应用KNN（K-最近邻）和SVM作为机器学习模型，进行外泌体生物标志物分析。通过引入机器学习算法，诊断模型能够对多种疾病进行准确诊断和分类。刘等人使用LDA确定了七个外泌体生物标志物的总签名，这在区分前列腺癌和良性疾病方面取得了高准确性。田等人通过LDA分析了1μL血浆中外泌体的八个与癌症相关的蛋白质的加权和。PCA是一种算法，它通过正交变换将一组可能相关的变量转换为一系列线性无关变量。Shin等人使用PCA探索了细胞外泌体和人血浆外泌体的特征。结果表明，机器学习模型能够以95%的准确率对正常和肺癌细胞系衍生的外泌体进行分类，并在预测整个队列的肺癌方面获得了0.912的AUC。刘等人采用RF、NN和SVM分析了乳腺癌患者的多种外泌体衍生mRNAs，与单一标志物相比，表现出改善的诊断性能。这些研究表明，将外泌体分析与机器学习相结合在癌症液体活检中具有巨大潜力。值得注意的是，典型的机器学习方法需要大型数据集，而临床样本数量有限和数据不足可能导致准确性和可靠性差。更强大机器学习算法的出现将有利于液体活检中外泌体的分析。 12.外泌体在癌症液体活检中的意义 近期研究表明，外泌体在早期诊断、疾病监测和预后预测方面优于CTCs和ctDNA。在此，我们总结了外泌体在多种癌症液体活检中的应用（见图6，表4）。 图6 外泌体在癌症液体活检中的应用。癌症衍生的外泌体富集了差异表达的蛋白质和核酸，并且已被测试作为不同癌症早期诊断、分期分类和预后预测的新生物标志物，突显了它们在癌症液体活检和精准医疗中的重要价值。 12.1.HCC 肝细胞癌是癌症相关死亡的第四大原因。装载在HCC衍生外泌体中的分子签名可用于诊断。发现外泌体miR-21能够抑制HCC细胞的凋亡，并在HCC患者中上调。诸如CEA和GPC-3等外泌体蛋白能够区分HCC患者和健康受试者，可能作为无创癌症诊断的有希望的生物标志物。在包含158个样本的研究中，收集血浆用于检测10个HCC特异性基因，包括甲胎蛋白（AFP）、GPC3、白蛋白、载脂蛋白H等。观察到与非癌症队列相比，通过ddPCR在HCC队列中获得了更高的荧光信号。这10个基因签名通过机器学习进一步计算，显示出在区分早期HCC和有风险的肝硬化方面具有巨大潜力，AUC为0.93。Nakano等人比较了接受肝移植的HCC患者中外泌体miR-92b和循环AFP的表达水平。揭示了外泌体miR-92b能够预测HCC的早期复发，AUC为0.925，而AFP的AUC为0.651。Zhu等人整合了血浆外泌体RNA序列、无细胞RNA序列和TCGA组织RNA序列数据集，以识别5个非编码RNA（circ-0073052、circ-0080695、SNORD3B-1、LINC01226和HULC）作为肝癌的潜在生物标志物。此外，SNORD3B-1、circ-0080695和miR-122的组合面板在将肝癌患者与健康捐赠者分类方面显示出最高的AUC（89.4%），与其他标志物面板相比。通过所选的面板，在测试和验证集中，79.2%的AFP阴性样本和77.1%的早期肝癌样本被成功检测，这表明外泌体RNAs小组在早期诊断肝癌方面的潜力。 12.2.PDAC 作为与胰腺癌进展相关最公认的指标之一，miRNA-10b目前正在被广泛研究用于胰腺导管腺癌（PDAC）的早期诊断。Joshi等人指出，胰腺癌患者、患有慢性胰腺炎（CP）的高危患者和健康个体之间外泌体miR-10b的水平显著不同，这表明miR-10b在诊断胰腺癌和预测可能发展为PDAC的CP患者方面的潜力。Pang小组使用双SERS生物传感器进行一步检测外泌体中的mRNAs，也得出了相同的结论。Melo等人发现，GPC-1+循环外泌体（GPC-1+crExos）在识别PDAC患者与健康个体和慢性胰腺炎方面表现出高特异性和敏感性（AUC=1.0），优于CA199（AUC=0.739）。此外，GPC-1+crExos的水平与手术前后患者的肿瘤负担和生存相关，表明GPC-1作为治疗反应和预后监测的可靠生物标志物的潜力。此外，GPC-1和CD63的组合被证明在将PDAC患者与健康受试者区分开来方面显示出99%的敏感性和82%的特异性。此外，迁移抑制因子（MIF）被报道在区分胰腺癌的不同阶段方面比GPC-1和EGFR表现更好。 12.3.CRC 结直肠癌（CRC）是最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率都很高。外泌体中的环状RNA与癌症的发生和发展有关。由于其环状结构，它提供了一个稳定的癌症诊断生物标志物。发现环状RNA-0004771在CRC患者血清外泌体中上调。外泌体circ-0004771的AUC用于从健康对照中识别CRC为0.88，用于区分I和II期患者与其他良性肠道疾病为0.816，这表明circ0004771可以作为结直肠癌的潜在诊断标志物。Wei等人探索了新的外泌体生物标志物，用于结直肠癌的早期诊断和预后。对血浆样本的检测显示，与健康和良性对照相比，CRC患者中CD9、CD63和EpCAM的表达显著更高（分别为0.90和0.96的AUC）。此外，miR-15b、miR-21和miR-31被报道在CRC患者血清外泌体中高度表达。ROC曲线显示miR-15b的AUC为0.86，组合的miR-15b、miR-21和miR-31小组展现出81.21%的敏感性和81.03%的特异性。 12.4.NSCLC 非小细胞肺癌占肺癌引起的死亡的80%以上。与正常人相比，NSCLC患者血清外泌体中PD-L1的水平较高。Pang等人在一个更大的患者队列中进一步证实了外泌体PD-L1的诊断价值，AUC为0.97。Ma等人发现，与健康个体相比，复发性NSCLC患者中外泌体miR-21的表达更高。然而，在外泌体中也发现了高水平的miR-21在其他癌症中，如结直肠癌、乳腺癌和肝癌。因此，检测多种miRNAs可能对NSCLC诊断更有价值。Wu等人证明miR-21、miR-378、miR-139和miR-200在NSCLC患者和健康捐赠者之间差异表达，为NSCLC早期诊断提供了更多可选的生物标志物。值得注意的是，实验结果表明，与血浆和支气管肺泡灌洗液相比，NSCLC患者尿液衍生外泌体中外泌体RNAs的数量更多，这可能为选择样本分析外泌体提供了新的方向。 12.5.乳腺癌 乳腺癌（BC）是女性癌症相关死亡的最常见原因。早期诊断可以有效降低死亡率并取得更好的治疗效果。尽管作为广泛使用的生物标志物，CA15-3（碳水化合物抗原15-3）对于诊断原发性和转移性乳腺癌（MBC）的敏感性还不够。Lee等人证明，癌细胞衍生的外泌体miR-21、miR-222和miR-200c可在体液中量化，并用于乳腺癌诊断。Lu等人报道，RDW（红细胞分布宽度）、MPV（平均血小板体积）和CA15-3的组合显示出比单一生物标志物更好的特异性和敏感性，用于识别乳腺癌。此外，通过机器学习计算八个生物标志物（CA15-3、CA125、CEA、HER2、EGFR、PSMA、EpCAM和VEGF）的加权和，鉴定出一种外泌体签名。结果，该签名显示出高度的区分准确性，用于区分MBC与非转移性肿瘤和年龄匹配的健康捐赠者（91.1%）。此外，据报道，外泌体签名能够准确监测MBC治疗反应，并作为MBC患者无进展生存的独立预后因素。 12.6.前列腺癌 PSA是检测前列腺癌的广泛使用的生物标志物。然而，增加的PSA也出现在如良性前列腺增生（BPH）等炎症性疾病中。因此，迫切需要开发敏感和特异性生物标志物，以早期诊断患者并监测癌症进展。Li等人报道，外泌体ephrinA2具有比血液中循环PSA更好的能力，以区分前列腺癌患者和BPH患者，AUC为0.906。此外，发现血清外泌体中EpCAM和PSMA增加。此外，据报道，外泌体TUBB3 mRNA的表达与转移性去势抵抗性前列腺癌患者阿比特龙治疗的无进展生存期差有关。 12.7.外泌体在临床试验和癌症液体活检中的应用 由于与CTC和ctDNA相比，外泌体具有活细胞分泌、大量存在和稳定循环的优势，基于外泌体的液体活检已在临床试验中进行了测试，其中一些已经获得批准并进入市场。2016年，Exosome Diagnostics提出了世界上第一个基于外泌体的液体活检，ExoDx™ Lung (ALK)，用于从血样中分离和分析外泌体RNA。在CLIA认证实验室中，ExoDx™ Lung (ALK)被证明是一种准确、实时的工具，用于检测NSCLC患者中的EML4-ALK突变，敏感性为88%，特异性为100%，这比cfDNA提供了一种更直接和敏感的检测基因融合的方法。此外，ExoDx Prostate IntelliScore (EPI)已获得FDA认证。基于对外泌体中ERG、PCA3和SPDEF RNA的检测，EPI提供了一个风险评分，以预测PSA在2到10ng/mL之间的患者是否有可能发展为高级别前列腺癌。根据ExoDx，前瞻性研究中达到了93%的敏感性，并且当EPI阈值设定为15.6时，避免了26%的不必要的针刺活检。三个独立的、前瞻性的、多中心的临床试验宣布EPI的表现优于标准护理，并且可以用来协助早期诊断前列腺癌和消除不必要的前列腺活检。此外，MedOncAlyzer 170是一种新开发的液体活检系统，能够一次性检测外泌体RNA和ctDNA。它可以从小量（0.5ml）的患者血液或血浆中识别多种癌症类型中的显著和功能性突变。由于外泌体和ctDNA的独特形成方式，MedOncAlyzer 170在检测癌症进展和治疗的所有阶段的突变方面准确且高度敏感。尽管临床应用价值已经得到验证，但仍然需要更大的临床样本、人群和试验来确认基于外泌体的液体活检在癌症诊断和治疗中的作用。 13.结论和展望 目前，在精准医疗领域，组织活检的局限性已逐渐被认识到。相反，液体活检具有微创性、易于获取样本和动态分析的优势。外泌体已被证实在体液中稳定循环，并包含反映肿瘤进展状态的多样化信息。外泌体作为诊断和预后生物标志物的潜力已在多种癌症中进行了研究。然而，外泌体的高异质性和纳米尺寸为获取其分子信息和相互作用带来了巨大的技术挑战。在这篇综述中，我们总结了传统和新型技术隔离、表征和检测外泌体的优点和缺点。基于物理或生物学特性的技术正在被广泛开发用于外泌体分离，微流控设备的应用在超快速分离高产量的纯外泌体方面具有巨大潜力。尽管取得了革命性的进展，但目前尚无标准化方法用于从细胞培养基和人体体液中高通量、高纯度、最小损伤分离外泌体。循环外泌体中包含的多种分子突显了外泌体在液体活检中的潜力。需要更快、更便捷的方法来验证外泌体货物作为癌症诊断中的生物标志物。大多数新的检测平台虽然优于传统方法，但仍面临低灵敏度和不同外泌体亚群的高异质性挑战。单外泌体检测和分析技术可能揭示特定外泌体的独特分子轮廓，并提供一种可行的策略来获取准确的癌症相关信息。对外泌体异质性的进一步探索将解决当前外泌体研究中的许多挑战。改进开发新策略，从体液中分离外泌体并以快速和敏感的方式分析外泌体内容物，将促进基于外泌体的液体活检在癌症精准医疗中的实践应用。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：外泌体逐渐被认为是细胞间通讯的重要媒介。它们将活性生物分子传递给目标细胞，并在多种生理和病理过程中发挥重要作用，展现出作为疾病新治疗策略的巨大潜力。方法：在这篇综述研究中，我们研究了过去二十年间发表的关于外泌体在不同疾病中应用的文章，以及这一领域的视角和挑战。结果：外泌体的主要临床应用包括将其用作生物标志物、无细胞治疗剂、药物传递载体、外泌体动力学的基础分析以及癌症疫苗。来自人类或植物的不同来源的外泌体被用于各种临床试验中。大多数研究人员使用循环系统中的外泌体进行生物标志物实验。间充质干细胞（MSCs）和树突细胞（DCs）是两种广泛认可的外泌体来源。MSCs衍生的外泌体通常用于炎症治疗和药物传递，而DCs外泌体用于在癌症患者中诱导炎症反应。然而，外泌体的临床应用面临各种问题和挑战。此外，基于外泌体的临床试验的转化需要符合特定的良好生产规范（GMP）。在这篇综述中，我们根据应用类型和疾病对临床试验中的外泌体进行了总结。我们还讨论了关于外泌体动力学和临床应用的主要问题和挑战。结论：外泌体是临床试验中治疗许多疾病的有希望的平台。这个令人兴奋的领域正在迅速发展，对外泌体发挥各种作用的潜在机制的理解还远远不完整，需要在这些小囊泡的研究中进一步进行多学科研究。 背景 细胞外囊泡（EVs）是由大多数细胞通过多种机制产生的异质性细胞衍生囊泡，通过转移生物信号如许多非编码RNA、编码RNA、DNA链、片段和脂质到对应细胞，促进细胞间通讯。EVs还可以通过许多体液传递其货物/信息，包括循环系统、唾液、脑脊液（CSF）、尿液、牛奶和支气管肺泡灌洗液（BALF）。一旦传递到目标细胞，EVs可以通过驱动不同的信号通路来调节受体细胞的命运和形态，这可能导致正常生理或病理学，具体取决于EVs的来源和细胞状态。越来越多的证据表明，EVs在一系列细胞过程中发挥关键作用，包括增殖、生长、发育、血管生成、免疫调节、感染、转移、重编程和重塑。已经记录了三种主要的EVs亚类，包括微囊泡（MVs）或外泌体、凋亡体和小外泌体（图1）（表1）。MVs指的是由质膜产生的EVs，大小范围为100-1000纳米，通过一个复杂的机制，称为脱落或质膜的芽生，类似于病毒向外芽生细胞膜。另一种越来越吸引科学家注意的EVs是小外泌体，大小范围为30-150纳米。这些囊泡据报道在大小和货物上也是异质的，因此在目标细胞信号上发挥着不同的功能。小外泌体的起源是参与内吞作用途径的囊泡，是一种称为多囊泡体（MVBs）的晚期内吞体开始产生小外泌体。EVs的最新进展表明，小外泌体的生物生成可能与另一个内膜系统相互作用，以维持细胞稳态。例如，正常生理和几种疾病中报道了小外泌体信号通路和自噬之间的串扰。在过去的十年中，寻求改善治疗结果并专注于精准医疗的外泌体的转化医学有了显著增加。外泌体具有独特的性质，吸引了研究人员使用它们来治疗许多疾病，包括退行性疾病和癌症。到目前为止，已经使用不同来源的外泌体进行了许多临床试验来治疗各种疾病。尽管这种方法很有趣，临床试验也显示出满意的结果，但这个领域存在一些挑战和限制，需要进一步的调查来验证这些结果，并为基于外泌体的研究引入一个黄金标准。系统地检查外泌体的效率和安全性需要确定它们的个性和纯度。国际细胞外囊泡协会（ISEV）通过在2014年和2018年发布MISEV指南，启动了EVs分离和表征程序的标准化，这些指南讨论了在基于EVs的研究中必须考虑的最重要的特征。此外，EV-TRACK数据库成立于2017年，为研究人员在发表前提供他们的纯化和表征方法，并就实验计划的可能限制提出建议（https://evtrack.org/about.php）。本文概述了外泌体的潜在临床应用以及在这条路线上的挑战和问题。 图1 细胞外囊泡(EVs)的生物生成。EVs的两个主要亚类是外泌体和微囊泡(MVs)。外泌体的生物生成过程复杂，发生在细胞质中位于多囊泡体(MVBs)内。ESCRT复合体和不同的分子以依赖ATP和不依赖ATP的方式，促进外泌体的装载、排序和形成。外泌体的货物来自高尔基体、内体途径和细胞质。Rab蛋白介导内体室和外泌体的细胞内运输。MVBs已报道能与质膜、溶酶体或两栖体融合。当MVBs与质膜融合时，外泌体被释放到细胞外环境中。有证据表明外泌体生物生成途径可能与自噬通路存在交叉。MVBs可能与自噬体融合形成称为“两栖体”的混合囊泡，这些囊泡最终与质膜或溶酶体融合。MVs比外泌体大，通过向外芽生和脱落过程从质膜形成。EVs可以通过三种可能的方式影响目标细胞的命运和信号通路，包括内吞作用、受体-配体相互作用，以及与质膜的直接融合。 外泌体 外泌体是指许多细胞释放到细胞外基质中的膜结合囊泡。主要思想是这些纳米颗粒在细胞内生成，在多囊泡体（MVBs）内，通过MVBs膜的内陷，导致在MVBs内生成腔内囊泡（ILVs）（图1）。 这些囊泡可能被称为前外泌体，当MVBs与细胞膜融合后，它们可以被分泌出细胞；现在被称为外泌体。MVBs总是不将ILVs排出细胞外，而是它们可能与溶酶体融合，随后ILVs及其货物被降解以供回收和重复使用，以维持细胞稳态。此外，有证据表明MVBs可能与自噬途径的自噬体融合，并生成称为“两栖体”的混合囊泡，随后，两栖体现在可能与血浆膜融合并分泌带有其他货物的外泌体。了解MVBs如何以及为什么与不同的膜融合一直是一个长期目标，因为这对区分外泌体的异质性以及相关的生理后果、调节它们在临床使用中的产生以及监测病理条件至关重要。MVBs膜上存在各种分子和复合物，它们介导货物装载和向内芽生膜的排序，并使新形成的ILVs掐入MVBs。例如，一个由四个复合物组成的与ESCRT相关的机制，以调节的方式使用ATP分子介导生物生成和装载ILVs，或者涉及一个不依赖ESCRT的机制。许多与MVBs相关的Rab蛋白以不同的方式促进MVBs的运动。其中，Rab7、Rab8、Rab11、Rab27和Rab35在调节外泌体途径中的作用已被认可。SNARE蛋白是短分子，它们促进MVBs和细胞质膜的融合。分泌到细胞空间后，外泌体与目标细胞相互作用，这些细胞要么靠近，要么远离。有人提出，外泌体或其他EVs利用三种机制来影响受体细胞的功能，包括内吞作用（例如吞噬作用和胞饮作用）、受体-配体相互作用和直接融合，这些机制导致细胞和生物过程的变化，参与正常生理或恶化病理条件。这是外泌体的旅程；然而，需要进一步的调查来确定外泌体是如何为一个明确的目的而产生的。外泌体的货物包括来自细胞膜、内体室、细胞质和来自内膜系统的分子，如高尔基体[7,18]。外泌体在干燥过程中呈现特定的双凹形或杯状，而在透射电子显微镜下它们呈现球形[26]。这些囊泡的密度为1.08-1.19 g/ml，具有常见的外泌体标记物，如CD9、CD63、CD82、CD81、Alix和Tsg101。成千上万种类型的生物分子存在于外泌体中，包括蛋白质、众多RNA和脂质，这些数据被各种数据库收集和呈现，如Vesiclepedia（http://www.microvesicles.org）、Exocarta（http://www.exocarta.org）和中国的一个生物信息学实验室（http://bioinfo.life.hust.edu.cn）。了解驱动外泌体生物生成和装载的机制，以及外泌体的货物和外泌体被其他细胞摄取的方式，将支持科学家实现精细和高效的转化医学。值得一提的是，完全理解外泌体的性质、纯度和来源对于下游实验至关重要。例如，来自干细胞的外泌体可能参与再生和正常生理，而来自感染或癌细胞的外泌体则介导病理学（图2）。 图2 外泌体的临床应用。在临床试验中，外泌体被用作生物标志物、无细胞治疗（外泌体治疗）、药物输送系统和癌症疫苗。来自植物细胞、间充质细胞、T细胞和树突细胞的外泌体被用于治疗不同的疾病。此外，这些来源的外泌体是药物输送系统的有希望的载体。在直接方法中，外泌体被装载治疗剂，而在间接方法中，适当的细胞通过基因工程改造或与治疗剂共培养以产生人工外泌体。 临床试验 已经很好地建立起来，外泌体是治疗许多疾病的理想候选者。在临床试验之前，许多临床前实验已经证实了外泌体治疗许多疾病的优势，从再生医学领域到癌症。近年来，外泌体在临床试验中进行了研究，总共有两种类型的外泌体在临床试验中使用，具体来说，人类细胞/样本和植物标本的外泌体。对ClinicalTrials.gov（https://clinicaltrials.gov/）的调查显示，外泌体的主要应用是生物标志物、外泌体治疗、药物输送系统和癌症疫苗（图3）。此外，一些试验旨在分析不同条件下人类样本中的外泌体。分析显示，共记录了116项试验，其中58项（50%）属于生物标志物应用（图3）。在外泌体治疗方面，已注册了33项（28.44%）研究（图4）。在药物输送系统试验中，有6项（5.17%）研究，而在外泌体基础分析方面，已注册了17项（14.66%）研究（图4）。最后，有2项临床试验（1.72%）与外泌体疫苗研究相关。临床试验中的外泌体需要符合良好生产规范（GMP）。GMP等级外泌体生产方法包括细胞类型、培养环境、培养系统和培养基。生产后还需要进一步纯化，通常分为三个步骤。GMP外泌体的第三个主题是建立表征和鉴定方法，包括物理配置和生物活性功能特征。此外，欧洲药品管理局（https://www.ema.europa.eu/en）发布了关于先进治疗药物产品分类的科学建议。该机构描述了细胞和分子生物技术的新科学进展导致了先进治疗的发展，如基因治疗、体细胞治疗和组织工程。这个生物医学的新兴领域为治疗人类疾病和功能障碍提供了新的机会。此外，它为研究人员提供了先进治疗药物产品的指导方针、建议和标准，并修订了指令和法规。 图3 基于外泌体的临床试验分析 图4 外泌体治疗产品当前良好生产规范（GMP）生产流程图 生物标志物应用 如上所述，外泌体存在于许多生物液体中，可能为监测正常生理状态下的细胞状态或病理条件发生时提供了一个新的窗口。通过简单的液体活检，如血浆、血清、尿液、唾液等，外泌体和其他细胞外囊泡可用于分析它们的货物，用于诊断、预后、进展和化疗抗性生物标志物应用。尽管大多数细胞类型都会释放外泌体，但有证据支持在几种病理条件下，如癌症，外泌体分泌上调。外泌体在大多数体液中是稳定的，并能保护生物分子免受降解。在病理条件下，细胞变化可以反映在细胞释放的外泌体的生物成分中。外泌体的货物改变可以通过转录组学、蛋白质组学和脂质组学研究进行鉴定和分析；因此，特定分子水平的差异对于生物标志物应用将是有用的。不同的实验室已经显示了癌细胞及其体外外泌体的miRNAs差异表达，此外，一些在体外和动物癌症模型上进行的研究表明miRNAs表达水平的改变。不同的miRNAs正在开发中，包括miRNA-200-5p、miRNA-378a、miRNA-139-5p和miRNA-379用于肺癌，miRNA-21用于食管鳞状细胞癌，被建议作为非侵入性诊断生物标志物。此外，外泌体蛋白对许多癌症具有生物标志物潜力。在癌症的情况下，早期发现肿瘤对于有效治疗至关重要。如图4A和B所示，其中43项（74.13%）临床试验与癌症生物标志物研究相关，其余属于其他疾病（约25.87%）。深入了解外泌体货物排序机制及其分泌、通过特定体液的转移以及在生理设置和不同疾病背景下的稳定状态水平，将产生更强的生物标志物，用于监测疾病的发生和发展。此外，进一步的研究对于验证外泌体生物标志物与传统癌症生物标志物相比的特异性和灵敏度至关重要。 药物输送应用 外泌体作为用于输送治疗剂的生物纳米平台已在临床前和临床实验中进行了研究。在纳米技术领域，设计智能载体进行靶向药物输送是黄金标准。外泌体可能是将几种药物输送平台制剂转化为临床应用的良好申请者。从药物输送的角度来看，外泌体在磷脂结构方面类似于脂质体。然而，外泌体可以从各种体液和细胞中收集，具有不同脂质和表面蛋白和受体的复杂结构；这些生物分子可能有助于组织和细胞靶向，而一些则保证最小的非靶向相互作用。这些独特的蛋白质装饰的磷脂膜可能具有与邻近和远距离目标相互作用的理想条形码。尽管进行了广泛的研究，基于外泌体的药物输送系统相对于其他合成纳米载体（如脂质体）的优越性，以及相关的利益风险比仍然是辩论的问题。治疗剂，包括核酸、蛋白质和药物，至少可以通过两种通用方法插入外泌体，然后被运送到特定目标。这些方法是直接方法或外源性方法，其中药物通过几种方法加载到分离的外泌体中；以及间接方法或内源性方法，其中亲本细胞被加载药物或基因改造以表达所需的蛋白质、受体和RNA。如果亲本细胞正确产生所选分子的外泌体，则内源性方法具有较低的复杂性水平。或者，有一种称为外泌体启发的脂质体的方法，其中一个所需的脂质体与外泌体融合以构建混合载体。正在进行的临床试验表明，外泌体被用于输送治疗剂，例如，在ClinicalTrials.gov资源中有六项临床试验注册（https://clinicaltrials.gov/ct2/home）。在两项临床试验中，作者旨在通过直接方法将姜黄素封装到植物衍生的外泌体中，用于治疗结直肠癌和肠易激综合症（NCT01294072和NCT04879810）。此外，三项临床试验旨在修改间充质干细胞（MSCs），以产生过度表达的外泌体（表2）。这些试验都没有完成，到目前为止结果尚不可用。值得一提的是，一些临床试验使用来自肿瘤细胞的微粒来输送药物（例如NCT02657460和NCT01854866）。这些研究使用了微粒而不是外泌体的术语，并且在ISEV基于EVs研究的指南之前就已经记录了。 尽管研究人员已经努力利用外泌体的独特属性来推进智能药物输送系统，这些系统在药代动力学、靶向和安全性方面显示出可观的利润，与合成纳米载体相比，临床转化这些结果面临挑战。由于外泌体本身的特征复杂性、尺寸异质性和自然（批次到批次）的差异贯穿其组装过程，其固有的生物发生过程风险高于原始合成制造方法。此外，需要技术上可行且可重复的方法来用治疗药物加载它们。尽管脂质体的加载方法已经优化并在工业环境中使用，但外泌体仍然需要这样的方法。当前的细胞培养和外泌体纯化方法限制了标准化和大规模生产外泌体的实施。因此，要使外泌体被视为可靠的治疗载体，需要可扩展的制造工艺，以快速、成本效益和可重复的方式生产外泌体。 外泌体治疗 如今，人们对使用细胞衍生物（如外泌体）而非干细胞进行治疗的兴趣日益增加。来自干细胞的外泌体代表了与干细胞相同的治疗和临床益处。目前，已知许多来自原生干细胞的外泌体已被证明能够恢复不利条件和受损组织。一些实验室采用了提高外泌体产量和改善外泌体治疗潜力的策略，包括干细胞的预处理、干细胞的遗传修饰以及外泌体与生物材料的结合。例如，使用去甲肾上腺素和N-甲基多巴胺来促进间充质干细胞（MSCs）分泌外泌体，而不影响其调节能力。其他物理策略包括将干细胞与低氧、酸性介质和脂多糖共同孵育。除了动物细胞，微生物和植物衍生的外泌体也被认为具有。然而，这些外泌体/EVs的安全性需要评估。在临床背景下，外泌体已注册用于治疗多种疾病。近年来，由于COVID-19肺炎的爆发；由于其免疫调节和再生潜力，MSCs衍生的外泌体正日益受到检验。根据ClinicalTrials.gov资源（https://clinicaltrials.gov/ct2/home），共有33项外泌体治疗临床试验注册，其中20项临床试验使用了MSCs衍生的外泌体（60.60%）。研究人员还使用植物、T细胞和DCs衍生的外泌体治疗不同疾病。大多数研究（9项临床试验）属于SARS-CoV-2肺炎治疗（图4）。这些结果表明，来自MSCs的外泌体经常用于再生医学。然而，一些研究表明，MSCs外泌体治疗有时被视为“双刃剑”。与令人满意的结果相反，外泌体治疗的安全性、副作用和不良结果尚不完全清楚。一项临床研究旨在调查植物（葡萄）外泌体预防头颈部癌症放化疗相关口腔粘膜炎的能力（NCT01668849）。最近，FDA指出，内布拉斯加州接受未经批准产品治疗的患者报告了严重的不良反应，这些产品被宣传为基于外泌体的产品。该机构强调，目前没有监管批准的外泌体产品，患者被一些诊所欺骗，以预防和治疗多种疾病。除了外泌体的产量，许多其他属性也受到选择的分离方法的影响。外泌体的纯度和物理化学属性是受不同分离方法影响的主要因素。可以使用不同的方法，如超滤、尺寸排除色谱、水相两相系统和基于聚合物的沉淀，用于外泌体的大规模生产。达到临床使用的大规模所需外泌体是一个主要挑战。外泌体的产量通常少于1 µg外泌体蛋白/mL培养基，而大多数研究中外泌体的有益剂量约为10-100 µg外泌体蛋白/小鼠。在临床试验中使用外泌体需要符合GMP。在GMP中，外泌体的显著问题普遍存在。首先，大规模生产。实现基于外泌体的治疗的一个主要问题是外泌体的低生产力。其次，收集高质量和统一的外泌体。外泌体的物理化学和纯度属性是受不同分离方法影响的主要问题。第三，标准化储存条件。第四，开发外泌体的治疗潜力。对于外泌体的压倒性低效率，阐明它们的治疗潜力可能是一种可能的解释。过度表达或富集治疗性生物分子是提高治疗潜力的简单方法（图5）。此外，将外泌体输送到目标组织/细胞是一个关键问题。由于外泌体的生物学效应是通过它们被目标细胞摄取来实现的，因此澄清和控制外泌体的生物分布对于临床治疗应用是必要的。骨髓来源的MSCs、人类心脏祖细胞、单核细胞来源的DCs、脂肪组织来源的干细胞和HEK293细胞等五类细胞已在GMP中用于生产外泌体。尽管已有几项实验研究报告，但关于植物衍生外泌体的GMP生产证据较少。总的来说，一个正常的临床试验项目和监督监测值得注意，以确认患者在接受干细胞和外泌体治疗时的安全性。 图5 分析基于外泌体的生物标志物临床试验(A, B)以及针对不同疾病的基于外泌体治疗的临床试验(C) 外泌体疫苗 肿瘤细胞衍生的外泌体已被用于治疗以引发强烈的抗肿瘤免疫反应。此外，基于外泌体的疫苗对几种传染病显示出了希望的结果。来自先天免疫细胞和肿瘤细胞的外泌体有潜力被用作癌症疫苗（图2）。外泌体上的几种活性分子，如MHC和共刺激分子，促进免疫细胞的抗肿瘤反应。最近在分析外泌体货物方面的进展也导致了活性剂的增加，这些活性剂可能被用于癌症免疫疗法。基于对外泌体在癌症免疫疗法中功能的广泛研究，已经使用外泌体进行了许多临床前研究。在接受抗Survivin免疫疗法的胶质母细胞瘤患者中，CD9+/SVN+和CD9+/GFAP+/SVN+外泌体的低水平与患者持续生存相关。此外，肿瘤细胞衍生的外泌体含有DNA链，这些DNA链可以通过STING/cGAS途径诱导免疫细胞反应，因此，这些外泌体可能在免疫检查点治疗中调节肿瘤免疫。来自癌症患者的DCs衍生外泌体在一些小规模临床试验中被证明是安全和可行的用于免疫疗法。DCs外泌体免疫疗法在精确和精确的免疫反应方面优于其他疗法。此外，DCs外泌体免疫疗法具有更高的生物稳定性和生物利用度，成本更低。在第一阶段I临床试验(NCT01159288)中，作者使用自体DCs衍生外泌体进行疫苗接种，以对抗转移性黑色素瘤，并展示了它们的安全性。然而，他们没有观察到深刻的CD4+或CD8+T细胞反应；仍然需要检查疫苗抗原分布背后的机制。此外，在另一项研究中，DCs衍生外泌体已被证明可以增加NSCLC患者的NK溶解活性并诱导MAGE特异性T细胞反应。在一项免疫疗法II期临床试验中，作者旨在通过使用IFNγ DCs外泌体来增强进展期NSCLC患者的T细胞和NK免疫反应。作者报告说这些外泌体可以增强患者的NK细胞的抗肿瘤免疫。然而，关键的临床结果，无进展生存期(PFS)的50%，没有实现，研究中没有描述出色的免疫反应。最后一个可信的选择是将DCs外泌体疫苗与基于NK的疗法相结合，以产生针对NK依赖性肿瘤的协同免疫原性结果。此外，似乎构建一种经过修饰的永生化DC系库，该库被修饰以表达单一MHC II分子和/或没有MHC蛋白，可以使DCs外泌体的恒定生产变得有希望，减少治疗成本和细胞培养时间间隔。在对免疫细胞招募有抵抗力的脑癌中，DCs外泌体在小鼠模型中已被证明对胶质瘤有希望，表明这些外泌体免疫疗法可以成为胶质母细胞瘤的新疗法。根据目前的研究结果和临床试验，外泌体被认为将成为各种癌症的免疫治疗疫苗。临床试验管理了符合当前GMP标准的自体DCs外泌体。迄今为止的临床试验对于证明自体外泌体管理的可行性和短期安全性非常重要，但基于外源性外泌体产品的疗法的安全性问题将更加严格。尽管一些研究已经描述了大量外泌体生产的协议和生物相容性的发展，但需要额外的临床前和临床审查以确认。最后，相对较小的尺寸和统一的形状使外泌体能够成功逃避单核吞噬系统的清除，不仅延长了它们的循环时间，也暗示了它们在细胞-细胞通信中的优越性。 结论 在过去二十年中，EVs/外泌体领域取得了惊人的进步。许多研究人员正在进行外泌体的发现和应用，为人类健康提供帮助。然而，指导方针、标准化、命名和动力学仍需取得更一致的方法。外泌体在体内转移的事实以及货物通过体液传递和送达目标的机制存在不足，是我们建议需要进一步考虑的领域。我们主要鼓励来自不同学科的研究人员，如临床医生、细胞生物学家、技术权威和计算机专家的合作，可以在外泌体假定的任何领域带来重大飞跃。在这项研究中，我们根据潜在应用和疾病类型，认真审查了外泌体的治疗应用和最近临床试验的现状。尽管临床前研究描述了有希望的结果，但获得更大成果需要对外泌体基础治疗进行许多改进。人类和衍生的植物外泌体已在临床试验中记录。来自人类细胞的外泌体占大多数，并与植物相比有完整的报告。外泌体的临床应用包括用作预后和诊断疾病的生物标志物、药物输送载体、无细胞治疗和癌症疫苗。所有这些应用都伴随着挑战和限制，需要更多的探索和标准化。进一步的研究表明，符合GMP的人类外泌体可以满足临床试验的使用需求。我们认为，外泌体在疾病管理中的有效性主要取决于技术进步，这些技术进步允许它们的发现、对不同疾病发展的敏感性和特异性。 为了推动人用及兽用疫苗行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展将于2024年8月16日-17日在苏州共同举办“第三届新型疫苗研发峰会”。诚邀全国相关领域专家、学者和企业家共享学术盛会。现将有关事宜通知如下。 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