摘要:近年来,CAR-T细胞疗法获得成功,却难以在实体瘤治疗中有显著效果,鉴于此,用自然杀伤细胞(NK细胞)替代T细胞,即CAR-NK细胞疗法,可能是一种更好的替代方案,而且有可能成为“现成”产品。NK细胞是机体的第一道防线,其具有抗体依赖的细胞毒性(ADCC)作用能自发杀伤肿瘤细胞和病原体,并参与机体的抗肿瘤免疫监视和免疫应答。本文综述了CAR-NK细胞的产生、抗肿瘤活性的机制、优势及临床试验,主要分析了CAR-NK细胞在实体瘤治疗面临的挑战及相应策略。一、CAR-NK细胞的介绍NK细胞因为其抗原独立,对显示特定表面特征的细胞具有强大的细胞溶解活性,独特的生物学特性、抗肿瘤机制、来源广泛、安全性高等优点,被认为是一种很有前途的CAR-T替代品。目前有不少于40项临床试验在实体瘤患者中调查过继输注NK细胞(通常与其他治疗方式相结合)的安全性和有效性(表1)。表 1 目前在实体肿瘤患者中测试NK细胞作为治疗剂的临床试验。N/A,不可用或不适用。CAR-T疗法在临床试验中的成功促进了CAR-NK细胞的发展。具有CAR结构的NK细胞的基因工程也类似于CAR-T细胞的生成。癌症患者采用CAR-NK疗法的程序如图1所示。图 1 用于癌症患者过继转移免疫治疗的CAR-NK细胞的生成。A.根据NK细胞胞内模体和功能,CAR结构从第一代到第四代的进化。B.CAR-NK细胞通过CAR依赖和CAR非依赖方式杀伤肿瘤。C.制造CAR-NK细胞产品的不同细胞来源和相应的程序。1 CAR-NK细胞的产生CAR-NK细胞采用T细胞设计的前四代CAR结构,由胞外抗原结合区(scFv)、胞外铰链区和跨膜区以及胞内信号转导区域组成,现在又结合NK细胞的特异性区域,使其具有更强的NK细胞激活和抗肿瘤反应,CD28和4-1BB是两个常用的经典共刺激结构域。目前临床上使用的NK细胞主要有五种来源:人外周血(PB)、脐带血(UCB)、人胚胎干细胞(hESCs)、诱导多能干细胞(iPSCs)以及NK-92细胞系。将CAR基因导入NK细胞的途径可分为病毒途径和非病毒途径(图2)。病毒转导系统是CAR-NK转导使用的主要方法,常用的病毒载体有:狒狒包膜糖蛋白(BaEV-GP),重组腺相关病毒(AAV),CD19-CAR慢病毒等等。非病毒途径常用mRNA电穿孔法。图2将CAR导入NK细胞的多种途径。介绍了病毒转导(上)和非病毒电穿孔(下)两种NK细胞基因工程方法及其优缺点。2癌症致死机制NK细胞具有细胞毒性和免疫调节双重功能,具有强力杀伤肿瘤细胞的能力,且不具主要组织相容性复合体(MHC)限制性,当NK细胞接触到MHC分子下调的肿瘤细胞时,由于抑制信号的缺失可引起NK细胞对肿瘤的杀伤,同时,当某些肿瘤细胞激活信号的上调也会引起NK细胞的激活和对肿瘤细胞的杀伤。NK细胞可以通过CAR结构的基因工程靶向杀伤肿瘤(图1B)。对于实体瘤,抗Her2和抗EGFR工程NK治疗已在胶质母细胞瘤、乳腺癌和卵巢癌等几种癌症中得到报道,其他抗原包括间皮素,PSCA, GPA7和EpCAM也可作为实体瘤CAR-NK细胞靶点。表2总结了抗靶向CAR-NK细胞治疗实体瘤的一些临床前研究。表 2 CAR-NK细胞治疗实体瘤的靶点同时,最近也有关于cbms的结构和基质可塑性的研究报道。Pires等人筛选出了结构紧凑的CBM64突变体(StCBM64B和StCBM64C,仅11 kDa),这些突变体在极端条件下也具有高亲和力(Kd~10-7M)和与纤维素基质的结合能力,是一种通用的亲和标签。总而言之,这些新的CBM具有超越目前用于蛋白质固定化策略的其他CBM的潜力。3CAR-NK细胞独特的优势与缺点与CAR-T相比,NK细胞来源丰富,且CAR-NK具有更好的安全性和多种可用的细胞毒性机制,但也有很多缺点阻碍了其推广。详见表3表 3 CAR-T疗法与CAR-NK疗法的优缺点比较二、CAR-NK在实体瘤治疗的障碍及应对策略临床结果表明,过继转移(ACT)的NK细胞在实体瘤治疗中必须满足: (1) 进入并充分渗透肿瘤微环境; (2) 较长持久性和增殖能力(3)调节强大的分泌和细胞毒功能。(1)NK细胞的扩增和纯化ACT需要大量具有高细胞毒性的NK细胞,但其在外周血淋巴细胞中所占比例不超过10-15%,需要体外培养扩增。将表达白介素15(IL-15)和黏附分子4-1BBL的K562饲养细胞与外周血自然杀伤细胞共培养是一种较好的方法,一项用含有IL-2、IL-21的GMP兼容培养液和照射的自体饲养层细胞进行的手动实验有效地诱导了85倍的NK细胞扩增。同种异体NK细胞可能被T细胞污染,从而影响NK细胞的治疗。研究发现,在第一次过继转移IL-15/4-1BBL激活的NK细胞(aNK)的人体试验中,aNK-DLI可能通过增强潜在的T细胞同种异体反应而导致急性GVHD。前体淋巴细胞缺失可能有助于纯化NK细胞。(2) CAR-NK细胞在体内的持久性NK细胞不会大量扩增,在体内的寿命很有限,导致其持久性差。细胞因子如IL-2和IL-15是参与NK细胞功能的关键分子。IL-15在体外可刺激NK细胞增殖,上调NK细胞表面活化受体NKp30的表达。ALT-803在体内可以促进CD8+T细胞和NK细胞的增殖,且患者对它的耐受性很好。(3)TME的抑制NK细胞运输受损以及具有免疫抑制作用的代谢TME特征会阻止ACT NK细胞进入实体瘤的TME中,限制其持久性或抑制其细胞毒功能(图3)。图 3 实体瘤中最佳NK细胞活性的环境障碍NK细胞的运输受多种因素的调节,而C-X-C基序趋化因子受体3(CXCR3)在实体瘤的NK细胞募集中有重要作用,在 IL2长期存在时,NK细胞CXCR3的表达在体外扩增过程中增加,除I型IFN或IFNG外的多种策略已被证明可促进TME中CXCR3配体的分泌,但有较大副作用。放射治疗(RT)已成功用于驱动NK细胞。肿瘤细胞可产生一些可溶性免疫因子,如TGF-β、前列腺素E2(PGE2)、吲哚胺2,3-双加氧酶、IL-10和PD-1,从而抑制NK细胞的功能。例如,TGF-β可能影响NK细胞的代谢,下调NKG2D和NKp30的表达。PGE2对NK细胞的分化和细胞毒作用有负面影响,并抑制其表面NKp44和NKp30的表达。缺氧可通过影响NK细胞的代谢和渗透来对其产生重大影响,逆转缺氧或使NK细胞对低氧水平更耐受可能恢复实体瘤TME中NK细胞功能,如运动训练,联合聚乳酸-共乙醇酸包裹的二氧化锰纳米颗粒治疗。一些检查点蛋白的配体可以帮助肿瘤细胞逃避免疫监视。CAR结构结合检查点蛋白阻断剂如抗PD-1、CTLA-4、LAG3和TIGIT具有更好的治疗效果。(4)抗NK细胞活性的免疫和基质屏障TME的许多免疫和基质细胞隔膜有效地抑制了NK细胞的效应功能,因此,靶向这些细胞群,如Treg细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)、MDSCs和癌症相关成纤维细胞(CAF),可以赋予肿瘤浸润性NK细胞优越的效应功能(图4)。图 4 实体瘤中免疫和基质屏障对最佳NK细胞活性的影响。Treg细胞介导的免疫抑制作用通常会使NK细胞激活受体如NKG2D的表达减少。一种NK细胞系被改造为表达包含转化生长因子β受体2的胞外区和NKG2D胞内区的嵌合受体,在临床前肝癌模型反映了良好的细胞毒反应,而且促进对固体TME的募集,抑制Treg细胞分化。人类实体肿瘤被TAMs大量渗透,TAMs通常由依赖CCL2的循环单核细胞的募集驱动。M2样TAMs不仅通过接触性和独立介导强大的免疫抑制效应,而且还促进新血管生成和转移性肿瘤扩散,从而支持各种肿瘤进展和耐药。研究表明,耗尽M2样TAMs或抑制其免疫抑制功能可在小鼠中介导强大的抗癌效果,同时M2样TAMs也可能提供靶点来提高过继转移的NK细胞对实体瘤的活性。MDSCs是由未成熟的骨髓来源的髓系细胞组成的异质性群体,具有显著的免疫抑制作用。MDSCs抑制NK细胞功能需要由膜结合的TGFB1促进物理接触。MDSCs抑制NK细胞的其他机制包括产生活性氧和活性氮,耗尽精氨酸等必需氨基酸,促进精氨酸酶1表达的升高。在原位肝细胞癌模型中,去除MDSCs可以恢复NK细胞依赖的肿瘤控制。在乳腺癌的临床前模型中,用一氧化氮合酶2抑制剂抑制MDSCs产生一氧化氮可以恢复NK细胞介导的ADCC,从而更好地控制肿瘤。其他有效抑制MDSC的化疗药物包括阿霉素、吉西他滨和小剂量环磷酰胺。实体瘤由CAF群体大量渗透。细胞因子如TGFB1,CXCL12可促进CAF在实体瘤的TME中积累。研究表明,CAF通过多种机制促进肿瘤进展和抵抗治疗,如促进新生血管生成,产生致密的间质反应,以及产生丰富的TGFB1直接抑制NK细胞的活性。靶向表达FAP的CAF或TGFB1信号在各种临床前肿瘤模型中介导了强大的抗癌作用,当使用具有ADCC能力的CAF靶向单抗时,NK细胞可以有助于抑制CAF。(5) “现成”CAR-NK细胞的储存、运输和回收现成的CAR-NK细胞的储存、运输和回收是促进大规模临床推广所必需的,但NK细胞在解冻后,其存活率和细胞毒作用显著下调,而用IL-2培养可以改善冷冻对NK细胞的影响。此外,细胞因子激活的NK细胞对低温非常敏感,所以需要在体温下运输。适当的细胞密度在运输过程中至关重要,过高的细胞浓度可能会导致细胞活性丧失。三、CAR-NK细胞与其他疗法的联合治疗NK细胞表达CD16,通过ADCC发挥杀瘤作用。而将CAR-NK细胞与针对不同肿瘤抗原的抗体联合治疗,可能会提高CAR-NK细胞的持久性和细胞毒性。以细胞因子为基础的治疗可能会提高CAR-NK细胞的持久性和细胞毒性,例如,PD-L1 CAR-NK细胞联合抗PD-1抗体和IL-15超激动剂N-803对C57BL/6小鼠的肿瘤生长有明显的抑制作用。此外,化疗是CAR-NK细胞治疗的重要辅助治疗手段,它不仅可以减少患者对输注的同种异体NK细胞的排斥反应,还可以重新编程TME以促进NK细胞在体内的渗透和存活。CAR-NK细胞联合免疫检查点阻断(ICB)治疗或通过基因编辑敲除ICB分子将是提高CAR-NK治疗特别是实体瘤治疗效率的一种有潜力的方法。结语目前,基于CAR-NK细胞的治疗因其独特的优势和现成产品相对于CAR-T治疗的可行性而成为一个热门的研究领域,有望成为治疗癌症的一种替代细胞免疫疗法,但NK细胞用于实体肿瘤的治疗仍然受到许多障碍的阻碍,如何优化NK细胞特异性CAR结构的基因编辑技术,如何快速有效地扩增和激活NK细胞,以及如何提高TME的持久性和修复以提高实体瘤的治疗效果等问题仍需继续研究和解决。参考文献:1. Tong, L., Jiménez-Cortegana, C., Tay, A.H. et al. NK cells and solid tumors: therapeutic potential and persisting obstacles. Mol Cancer 21, 206 (2022). https://doi.org/10.1186/s12943-022-01672-z2. Wang, X., Yang, X., Yuan, X. et al. Chimeric antigen receptor-engineered NK cells: new weapons of cancer immunotherapy with great potential. Exp Hematol Oncol 11, 85 (2022). https://doi.org/10.1186/s40164-022-00341-7