TRIM28

核糖体作为负责细胞内蛋白质合成的分子机器，在细胞的生命活动中发挥着关键作用。核糖体由核糖体RNA（rRNA）和核糖体蛋白两部分组成，此前对核糖体蛋白的功能研究主要集中于其参与个体发育及疾病发生等领域，其与衰老之间的相关性还有待深入揭示。 2024年9月11日，中国科学院生物物理研究所卫涛涛研究组联合中国科学院动物研究所刘光慧研究组、中国科学院北京基因组研究所张维绮研究组、中国科学院动物研究所曲静研究组在《Nucleic Acids Research》杂志在线发表了题为"CRISPR screening uncovers nucleolar RPL22 as a heterochromatin destabilizer and senescence driver"的研究论文。该研究利用CRISPR/Cas9基因筛选技术发现核糖体蛋白RPL22是驱动人干细胞衰老的重要因素，首次揭示了RPL22可以通过破坏核仁区域异染色质结构，引起rRNA表达增加并引发细胞衰老。 在该项研究中，研究人员首先对332个核糖体相关基因进行了基于CRISPR/Cas9技术的基因功能缺失筛选，发现了10个可能与人干细胞衰老相关的核糖体相关基因，其中核糖体蛋白RPL22与人干细胞衰老的关系最为密切，且RPL22在人间充质祖细胞衰老的过程中发生积累。 图1：基于CRISPR/Cas9技术的基因功能缺失筛选发现RPL22与人干细胞衰老相关 随后研究人员通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和干细胞定向诱导分化技术，获得了缺失RPL22的人类胚胎干细胞和人间充质祖细胞，并发现过表达RPL22明显加速细胞衰老，而敲除RPL22则缓解细胞衰老。 为了揭示RPL22发挥作用的分子机制，研究人员首先通过SUnSET实验发现敲除RPL22的人间充质祖细胞的整体翻译水平并没有发生明显变化；随后通过构建缺失核糖体功能的RPL22突变体，发现其仍可以显著促进人间充质祖细胞的衰老，提示RPL22的促衰老能力不依赖于其核糖体功能。 图2：RPL22在晚代细胞核仁内出现聚集 研究人员通过免疫荧光技术发现，在人干细胞衰老的过程中，RPL22在晚代细胞的核仁内发生积累；而解除RPL22的核仁定位后，RPL22失去了促进rRNA表达和促进细胞衰老的能力，这些实验结果表明RPL22的促衰老能力依赖于其核仁定位。 研究人员利用蛋白免疫共沉淀技术发现RPL22可以与异染色质蛋白KAP1和HP1γ发生蛋白相互作用，并使其表达水平下调；进一步利用ChIP-qPCR技术发现RPL22蛋白的积累会下调核仁异染色质区域异染色质蛋白KAP1、HP1γ和H3K9me3的蛋白水平，破坏核仁区域的异染色质结构；而核仁异染色质结构的破坏会引起其中本处于高度抑制状态的rDNA区域被激活，导致rRNA表达的增加，进而诱发细胞衰老。解除RPL22的核仁定位后，RPL22即失去了上述的破坏核仁异染色质、促进rRNA表达和促进细胞衰老的能力。 此外，研究人员还发现RPL22在人间充质祖细胞中的蛋白敲除可以缓解病理性衰老（HGPS和WS病理性衰老模型）、压力应激衰老模型（UV和H2O2诱导的压力应激衰老模型）和生理性衰老模型（老年人体分离的原代间充质祖细胞）等多种衰老模型的衰老表型，表明RPL22可能可以作为干预衰老和衰老相关疾病的潜在分子靶标。 图3：RPL22下调核仁异染色质区域异染色质蛋白KAP1、HP1γ和H3K9me3的蛋白水平，破坏核仁区域的异染色质结构，进而诱发细胞衰老 综上所述，该研究通过CRISPR/Cas9基因功能缺失筛选发现RPL22是人干细胞衰老的重要驱动因子，并首次揭示了核糖体蛋白RPL22可以通过与核仁区域异染色蛋白相互作用并下调其表达进而破坏核仁异染色质的结构，上调rRNA的表达，从而促进细胞衰老的全新分子机制。此外敲除RPL22可以缓解多种衰老模型的衰老表型，表明RPL22可能作为干预衰老和衰老相关疾病的潜在分子靶标。 中国科学院生物物理研究所博士研究生李洪宇、中国科学技术大学博士研究生王敏、中国科学院动物研究所博士研究生蒋晓钰和海南医科大学荆耀彬研究员为论文的共同第一作者；中国科学院动物研究所刘光慧研究员、中国科学院生物物理研究所卫涛涛研究员、中国科学院北京基因组研究所张维绮研究员和中国科学院动物研究所曲静研究员为论文的共同通讯作者。 文章链接： https://doi.org/10.1093/nar/gkae740 原文链接： https://ibp.cas.cn/tpxw_2020/zxtpxw_20200509/202409/t20240914_7363112.html 本文仅用于学术分享，转载请注明出处。若有侵权，请联系微信：bioonSir 删除或修改！

侃言 蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）是一种异双功能分子，通过诱导泛素-蛋白酶体系统(UPS)对靶标蛋白质进行泛素化和降解。这是一种事件驱动的作用机制，相比于小分子抑制剂有诸多优势，比如：催化性质的低浓度低剂量需求、减少给药量和给药频率、减少毒副作用、更加长效持久、有效降低药物耐药、靶点适用自由度高等，具有非常高价值的治疗应用前景。 然而，由于可利用的E3配体的开发和应用有限，高频过度的使用仅有的如VHL(60.1%)、CRBN(30.1%)配体（数据来自iScience)，导致PROTACs耐药性问题成为困扰当前PROTACs治疗的一大难题。因此，开发肿瘤组织特异性E3配体就变得非常重要，依靠肿瘤自身癌蛋白(oncoprotein)，将极大地降低突变耐药的机率。 近日，PROTACs奠基人、Arvians创始人、耶鲁大学著名科学家Craig Crews教授在JACS上刊载了其团队最新研究成果，突出强调基于肿瘤组织，特异性E3连接酶底物衔接蛋白配体的开发，在解决PROTACs耐药性突变问题上的重要性。 文章的第一作者李科博士为我多年好友。许多关键性问题，也和李博士进行了探讨。 文章于2024年8月27日在线，地址如下： https://doi.org/10.1021/jacs.4c05393 1 PROTACs耐药性 与     肿瘤特异性E3复合体蛋白   PROTACs作为一种异双功能分子，有效地诱导靶蛋白和E3连接酶邻近，形成三元复合物，使靶蛋白泛素化，进而被蛋白酶体识别后降解。然而，由于过度依赖和高频使用VHL、CRBN等E3连接酶配体，也出现了PROTACs耐药性问题。 依赖肿瘤自身癌蛋白，开发肿瘤组织特异性E3连接酶配体，是解决当前PROTACs耐药性问题的关键。 E3连接酶底物衔接蛋白：MAGE-A3 黑色素瘤抗原A3型蛋白(MAGE-A3)，是一种组织特异性表达的蛋白，也是一种E3连接酶的底物衔接蛋白，与E3连接酶结合，通过改变亚细胞位置或靶向泛素化的独特底物，来调节E3连接酶的活性。 MAGE蛋白家族包括I型(AMGE-A/B/C)和II型(AMGE-D/E/F/G/H/L/Necdin)两种抗原类型、以及众多亚族。其中，I型为MAGE睾丸癌抗原，主要在生殖组织中表达，若启动子去甲基化异常表达则易导致癌症；而II型MAGE蛋白可在多种组织中表达。 MAGE同源结构域(MHD)在I/II型蛋白中都是高度保守的。然而，尽管结构相似，MHD底物结合间隙中的独特残基，被赋予了与不同蛋白伴侣特异性结合的能力。 MAGE-A3就是这种具有与E3连接酶结合能力的组织特异性衔接蛋白，因此，极具潜力作为开发肿瘤特异性PROTACs的靶点： 能够作为E3连接酶底物招募模块 在体细胞组织中极少表达 能够在多种肿瘤类型中发现 最近的研究发现，MAGE-A3与三重基序蛋白28(TRIM28)相互作用，并调节TRIM28。而TRIM28的表达无处不在，具有多种功能，包括E3连接酶激活。 因此，由MAGE-A3配体组成的PROTACs，可以在表达MAGE-A3的肿瘤组织中，特异性地招募由TRIM28介导的靶蛋白泛素化。 MAGE-A3在免疫治疗中的应用 此外，诱导MAGE-A3降解，可能对癌细胞具有抗增殖作用。而MAGE蛋白家族本身就是癌症免疫治疗的热门靶点，已有多项临床试验针对MAGE-A3抗原。 PROTACs介导的MAGE-A3降解有可能增加抗原在同源MHC复合物上的呈递，进而改善免疫治疗的结果。 2 DNA编码化合物库技术（DEL) 助力     E3连接酶衔接蛋白MAGE-A3配体发现    研究人员利用DEL技术，针对MAGE-A3的MHD进行亲和力筛选，如上图A，包含约109个DEL化合物。 DEL具有广泛的靶点适用性，也非常适合缺乏酶功能的靶标、以及非活性位点抑制剂类配体的发现。并以发现的苗头化合物为起点，指导靶标特异性异双功能小分子的设计。 DEL苗头化合物发现和类药性优化 从这个包含约十亿多种化合物的超级化合物库中，对MAGE-A3同源结构域进行筛选后数据分析，最终发现了两个来自不同文库的相似的“化学型”家族：苯甲醛支架、氨基嘧啶支架，如上图B。 在这两个相似的“化学型”富集中，通过对全长分子的富集度、物化特性、组成合成砌块、以及起始原料的综合考虑分析对比，最终选择了一些列分子进行off-DNA合成、验证。化合物KL346就是其中用于后续验证的代表，如下图。 通过对KL346和MAGE-A3 MHD进行ITC生物物理表征，发现了低微摩尔结合亲和力，如上图B，KD=8.1±2.3 μM。同时也发现了KL346:MAGE-A3复合体构成的化学计量比例为1：2（N~0.5)。 配体“成药性”也是PROTACs成功的关键，出于此考虑，研究人员根据采用常见的策略来截断DEL苗头化合物，获得化合物MJBIA9836(如上图A)：去除组成苗头化合物中靠近寡核苷酸标签的合成砌块，一般认为其多作为间隔而不是药效团，对配体亲和结合力贡献较小。 如上图B，结果也证实，截取后的分子保留了相当的结合亲和力，但其类药性特性却获得了极大的改善。 如上图C，通过细胞热移试验(CETSA)，MJBIA9836相比于DMSO对照组，稳定了两个MAGE-A3阳性细胞系内源性MAGE-A3或增加了蛋白水平。这表明，改善后的化合物具有细胞渗透性。 靶标:配体相互作用的结构表征 如上图，研究人员利用分子对接技术，通过MAGE-A3晶体结构，评估了MJBIA9836的潜在结合位点，并对观察到的1:2结合化学计量进行了合理化。 单体与二聚体模型对接结果揭示了一个相似的结合位点。在没有变构的情况下，二聚体模型中的结合界面是位于预测的显示1：2结合化学计量的结合位点。因此，研究人员进行了进一步的结构表征以验证配体结合位点和辅助基于结构的配体优化。 然而，MJBIA9836的溶解度有限，研究人员获得了其吗啉类似物KL861，其结合亲和力与MJBIA9836相当，但溶解度提高，并用于单晶结构分析，如下图。 单晶衍射与分子对接结果一致，疏水作用是配体结合的驱动力。同时，也再次印证了单个配体分子与MAGE-A3二聚体结合。 为了确定MAGE-A3与配体的生物活性位点，研究人员利用靶标突变体进行进一步的研究。观察到R211A侧链靠近二聚体界面，并且位于配体羰基的氢键距离内，研究人员获得了R211A突变的MAGE-3A MHD，如上图B。 3    MAGE-A3配体驱动的PROTACs    在获得了MJBIA9836在体外、结构、以及细胞内均能够结合MAGE-A3的证实后，研究人员以此进行PROTACs设计，并验证MAGE-A3配体在靶向降解剂中的实用性。 PROTACs设计及验证 如上图，研究人员首先基于VHL和CRBN设计PROTACs，进行概念性验证（POC）。然而，仅基于VHL招募的PROTACs以剂量依赖性的方式降低MAGE-A3的水平，并观察到VHL蛋白水平升高，如下图B。 最有效的PROTAC为KL465，如上图A，装配有（rh)-VHL。有效降低HeLa细胞MAGE-A3水平，Dmax~60%，DC50~2μM。 VHL的重要性 为了进一步验证VHL在靶标降解中的重要性，研究人员设计了KL465的无活性版本——KL633，如下图B。在KL633组成中，对于VHL结合至关重要的羟基脯氨酸部分，其立体化学倒置，因此在保持了相当的物化特性的同时，不具有VHL招募活性。 在上图A中可以看出，两种浓度下，KL465能够诱导靶标有效降解；但KL633、MJBIA9836并不能显著降低MAGE-A3的蛋白水平。这表明，KL465降解靶标是VHL依赖性的。 如图C，KL465在MAGE-A3阳性细胞中，其对细胞增殖的抑制作用更大。这表明，与单独结合配体相比，MAGE-A3的降解显著降低了细胞活力。 总之，这些数据表明，使用KL465降解MAGE-A3可以降低癌细胞活力，并且这种观察到的效果不是由于脱靶毒性导致。 KL465不影响MAGE-A3:TRIM28相互作用 利用MAGE-A3配体作为肿瘤特异性TPD的E3招募元件，还需要小分子配体不破坏MAGE-A3:TRIM28的相互作用，验证如下图。 利用TR-FRET试验，最终表明，基于MAGE-A3的配体或基于配体设计的PROTAC都不能与TRIM28竞争性结合MAGE-A3，不影响其相互作用。 4       总结与展望     当前的PROTACs设计和应用，依然依赖于VHL和CRBN，两者都是Cullin-E3复合物的E3连接酶衔接蛋白。然而，它们的广泛表达限制了其组织和疾病特异性降解。而且，高频过度的使用，也出现了耐药性问题。这主要归因于E3连接酶机制的突变，而不是靶蛋白，因此，发现更多E3连接酶配体将势在必行。 而compartment-特异性降解在这个形势下将具有远大的前景。PROTACs开发的下一步逻辑必将是在特定组织或疾病状态中，利用E连接酶靶向降解。 然而，针对E3连接酶底物结合位点可能需要占据较浅的口袋或内源性蛋白质底物的竞争，这两种情况都为E3连接酶结合带来挑战。幸运的是DEL技术为此提供了一种快速高效的组合方法。DEL技术已经成功发现多种E3连接酶伙伴配体，如DCAF1、GID4、MAGE-A3等，助力PROTACs开发。 整合DEL筛选数据、与机器学习（ML）强大能力，可以增强可扩展性、结构多样性、总体命中率、效力和类药性。 本文中KL465对靶标适度降解，可能有以下几个因素： 在组织培养中观察到的MAGE-A3半衰期短，重合成速度快，这限制了观察到的最大降解； 开发PROTACs使用的配体仅表现出中等结合亲和力，减少了低效三元复合物的形成； PROTACs的连接子还没有进一步探索优化。 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

引言 蛋白质在细胞中的各种功能执行过程中起着关键作用，系统地研究其功能对于现代生物学来说是一项重要而又复杂的任务。传统的遗传筛查方法，通过基因敲除或抑制来研究基因功能。尽管这些方法非常强大，但通常不能直接揭示蛋白质的具体功能，同时还受到功能冗余和基因必需性的限制。 为了解决这些问题，研究人员开发了基于基因功能充分性的筛选方法。这些方法通过引入开放阅读框（ORF）文库直接评估蛋白质功能。然而，现有的系统方法不仅成本高昂且难以维持，还倾向于偏向较短的ORFs（<5 kb），这是由于DNA合成、克隆、病毒包装和细胞内传递的限制造成的。 随着CRISPR-Cas9技术的发展，基因编辑和基因功能研究取得了显著进展。利用这项技术，研究人员可以精确地在基因组中特定位点引入标签或进行基因敲除，从而研究基因功能。这些技术已经成功应用于多达1300个基因的系统标记。然而，实现全基因组范围的覆盖仍然是一个巨大的挑战，因为许多基因的表达水平或基因长度限制了传统方法的适用性。 在这一背景下，ORFtag技术应运而生。ORFtag是一种创新的方法，通过使用含有启动子、选择基因、功能标签和剪接供体序列的逆转录病毒载体，实现了对内源开放阅读框（ORFs）的融合标记。ORFtag技术的多功能性、成本效益高且效率高，能够在蛋白质组范围内进行大规模平行标记和功能研究。（7月5日Nature Methods “Proteome-scale tagging and functional screening in mammalian cells by ORFtag”） 具体而言，ORFtag通过大规模转染培养的细胞，使ORFtag盒随机整合到基因组中，并通过将功能标签与整合位点下游的剪接受体位点剪接，驱动邻近内源基因座的转录，形成近N端融合蛋白。利用这种方法，研究人员能够在小鼠胚胎干细胞中进行转录激活因子、抑制因子和转录后调控因子的功能筛查。筛查可识别出新的调控因子，包括通过其他方法无法获取的长ORFs。 综上，ORFtag技术的开发和应用，代表了蛋白质功能研究领域的一次重要进步。这一方法不仅为系统地研究蛋白质功能提供了新的工具，还为未来的基因功能研究和蛋白质工程奠定了坚实的基础。通过这种创新技术，研究人员可以在大规模上进行蛋白质功能的高通量筛查，从而更全面地理解蛋白质在细胞生物学中的重要作用。 蛋白质在几乎所有细胞过程中的核心作用，使得系统地研究其功能变得至关重要。然而，现有的方法在确定蛋白质功能方面仍然面临挑战。遗传性功能缺失筛选尽管能够识别参与特定细胞过程的基因，但通常不能直接提供蛋白质功能的深入见解。此外，功能冗余和许多基因的必需性也会限制这些方法的效果。 相比之下，基于充分性的检测方法能够直接确定蛋白质的功能。然而，目前系统的方法依赖于开放阅读框文库（open reading frame libraries, ORFeomes）的传递和表达，这不仅成本高昂且难以维持，还倾向于偏向于较短的ORFs（<5 kb），这是由于DNA合成、克隆、病毒包装和细胞内传递的限制造成的。 通过工程化的本地基因位点可以克服这些限制，最近的CRISPR–Cas9技术已经能够系统地标记多达1300个基因，但实现全基因组覆盖仍然具有挑战性。 为了克服这些挑战，研究人员开发了一种名为ORFtag的创新技术。ORFtag是一种多功能、成本效益高且效率高的方法，能够在蛋白质组范围内进行大规模平行标记和功能研究。ORFtag使用含有启动子、选择基因、功能标签和剪接供体序列的逆转录病毒载体。通过大规模转染培养的细胞，ORFtag盒随机整合到基因组中，并通过将功能标签与整合位点下游的剪接受体位点剪接，驱动邻近内源基因座的转录，形成近N端融合蛋白。 具体来说，ORFtag是基于逆转录病毒载体，这些载体包含一个启动子、一个选择基因和一个功能标签。标签后面接一个剪接供体序列。大规模转染培养的细胞后，ORFtag盒随机整合到基因组中，通过将功能标签与整合位点下游的剪接受体位点剪接，形成近N端融合蛋白。 在该研究中，研究人员通过三种不同的筛查方法验证了ORFtag的效用： 转录激活因子筛查：将蛋白质与细菌四环素阻遏蛋白（TetR）的DNA结合域融合，使其能够招募到整合的绿色荧光蛋白（GFP）报告基因上游的TetO结合位点。通过荧光激活细胞分选（FACS）筛选出GFP表达增加的细胞，鉴定出转录激活因子。 转录抑制因子筛查：使用构建的报告基因使GFP报告基因持续活性，通过FACS筛选出GFP表达减少的细胞，鉴定出转录抑制因子。 转录后基因调控因子（PTGR）筛查：将候选ORFs与lambda噬菌体N（λN）蛋白融合，使其能够招募到在报告基因3'非翻译区（UTR）中的boxB位点。通过筛选GFP表达减少的细胞，鉴定出在转录后水平上调控GFP表达的蛋白质。 ORFtag是蛋白质组功能筛查的多功能工具（Credit: Nature Methods） 图a. ORFtag方法的总体概述。ORFtag基于逆转录病毒载体，这些载体包含一个强启动子（Pstrong）、选择基因（NeoR）和功能标签。标签后面接一个剪接供体序列。在大规模转染的细胞中，ORFtag盒随机整合到基因组中，通过将功能标签与整合位点下游的剪接受体位点剪接，形成近N端融合蛋白。 图b. 三种不同的筛查方法。转录激活因子筛查：融合的蛋白质与TetR（细菌四环素阻遏蛋白）的DNA结合域融合，使其能够招募到TetO结合位点上游的GFP报告基因。通过荧光激活细胞分选（FACS）筛选出GFP表达增加的细胞，鉴定出转录激活因子。转录抑制因子筛查：构建的报告基因使GFP报告基因持续活性，通过FACS筛选出GFP表达减少的细胞，鉴定出转录抑制因子。转录后基因调控因子（PTGR）筛查：候选ORFs与lambda噬菌体N（λN）蛋白融合，使其能够招募到报告基因3'非翻译区（UTR）中的boxB位点。通过筛选GFP表达减少的细胞，鉴定出在转录后水平上调控GFP表达的蛋白质。 图c. ORFtag整合位点的基因组信息，显示了在Yap1（转录激活因子）、Zfp57（转录抑制因子）和Cnot9（PTGR因子）等基因座的插入位点。结果表明，在这些基因座存在显著的筛查特异性的插入富集。 图d. 火山图（volcano plot），突出显示了已知和新发现的筛查结果。 通过这三种筛查方法，研究人员发现了显著的、筛查特异性的插入富集，例如： 转录激活因子筛查：Yap1（转录共激活因子） 转录抑制因子筛查：Zfp57（含KRAB域） PTGR筛查：Cnot9（mRNA去腺苷化酶复合物亚基） 使用严格的阈值（FDR < 0.1%，log2比值≥1）确定了139个潜在的转录激活因子，207个抑制因子和77个PTGR蛋白。激活因子靶蛋白包括几个已知的转录激活因子，如p65、Ep300、Mediator复合物亚基和所有Kmt2(a-d)组蛋白甲基转移酶，这些因其长ORFs（长达17 kb）无法通过传统方法筛查。抑制因子靶蛋白包括75个KRAB锌指抑制因子及其共抑制因子Trim28、HP1家族蛋白、H3K9甲基转移酶和Polycomb抑制复合物组件。PTGR筛查识别出microRNA路径（Ago2、Tnrc6a/b/c）和无义介导降解路径（Smg1、Smg9、Upf2）的核心组件，以及Ccr4-Not去腺苷化复合物（Cnot2、Cnot3、Cnot9）和翻译抑制剂（Eif4e2、Eif4enif1）。 ORFtag方法在蛋白质功能研究中的高特异性（Credit: Nature Methods） 实验设计与数据分析 不同筛查结果的重叠性： 图a展示了转录激活因子（绿色）、转录抑制因子（蓝色）和转录后基因调控因子（PTGR，黄色）筛查靶蛋白的重叠性。结果显示，三种筛查的靶蛋白几乎没有重叠，表明ORFtag不导致非特异性基因的反复和人为检测。 筛查靶蛋白的功能富集： 图b显示了筛查靶蛋白在人类同源基因中的富集情况，包括DNA结合域、激活域、抑制域和RNA结合蛋白。此外，激活因子筛查靶蛋白显著富集于ORFeome激活因子，尽管重叠有限。 功能领域的富集： 图c展示了激活因子、抑制因子和PTGR筛查靶蛋白的蛋白质结构域、生物过程和细胞成分的GO富集情况。结果显示，这些基因均与其相关的功能一致，进一步验证了筛查结果的特异性。 实验验证 独立验证筛查靶蛋白： 图2d展示了对选定筛查靶蛋白的独立验证结果。通过流式细胞术检测GFP强度，结果显示所有测试候选蛋白质，包括先前未与相应生物过程相关联的靶蛋白，均能够在招募实验中验证其功能。例如：骨架蛋白Pxn或未表征蛋白1700102P08Rik的招募足以强烈激活转录。E3泛素连接酶Trim8和未表征蛋白Msantd3的招募则足以抑制转录。神经活动相关蛋白Maco1和E3泛素连接酶Trim13在招募到mRNA的3'UTR时能够抑制报告基因表达。 未表征蛋白质的细胞功能分配： 为评估ORFtag在未表征蛋白质细胞功能分配中的潜力，进一步研究了锌指蛋白Zfp574的内源功能。ORFtag筛查特异性地将Zfp574识别为转录激活因子。使用生长素诱导降解系统（AID），结果显示Zfp574的耗竭导致显著的生长缺陷，表明Zfp574对细胞适应性至关重要。快速耗竭Zfp574后进行的PRO-seq进一步揭示了Zfp574严格作为转录激活因子的作用，这与ORFtag的结果一致。通过Cut&Run技术识别了Zfp574的140个基因组结合位点，其中大多数（87.9%）位于基因转录起始位点（TSS）附近，表明Zfp574作为选择性转录激活因子，特异性地结合并激活一小部分支持细胞适应性的基因。 为了验证筛查结果，研究人员选择了每个筛查中的八个，跨越广泛的富集得分，重点是尚未证明直接功能的蛋白。通过单独克隆和转染每个筛选出的蛋白，发现所有测试的候选蛋白质，包括先前未知的调控因子，都能够在招募实验中验证其功能。例如：Pxn和1700102P08Rik蛋白质的招募足以强烈激活转录。Trim8和Msantd3的招募则足以抑制转录。Maco1和Trim13在招募到mRNA的3'UTR时能够抑制报告基因表达。 为了评估ORFtag在未表征蛋白质的细胞功能分配中的潜力，研究人员进一步研究了Zfp574的内源功能。ORFtag筛查特异性地将Zfp574识别为转录激活因子。使用生长素诱导降解系统（AID），显示Zfp574的耗竭导致显著的生长缺陷，表明Zfp574对细胞适应性至关重要。快速耗竭Zfp574后进行的PRO-seq进一步揭示了Zfp574严格作为转录激活因子的作用，这与ORFtag的结果一致。通过Cut&Run技术识别了Zfp574的140个基因组结合位点，其中大多数（87.9%）位于基因转录起始位点（TSS）附近，表明Zfp574作为选择性转录激活因子，特异性地结合并激活一小部分支持细胞适应性的基因。 ORFtag的多功能性和高效性使其成为研究蛋白质功能的一种强有力工具。通过这种创新技术，研究人员可以大规模进行蛋白质功能的高通量筛查，从而更全面地理解蛋白质在细胞生物学中的重要作用。ORFtag不仅为系统地研究蛋白质功能提供了新的工具，还为未来的基因功能研究和蛋白质工程奠定了坚实的基础。通过这种创新技术，研究人员可以更深入地了解蛋白质在细胞过程中的具体角色，从而推动生命科学研究的不断发展。 参考文献 Nemčko F, Himmelsbach M, Loubiere V, Yelagandula R, Pagani M, Fasching N, Brennecke J, Elling U, Stark A, Ameres SL. Proteome-scale tagging and functional screening in mammalian cells by ORFtag. Nat Methods. 2024 Jul 5. doi: 10.1038/s41592-024-02339-x. Epub ahead of print. PMID: 38969721. https://www.nature.com/articles/s41592-024-02339-x 责编|探索君 排版|探索君 转载请注明来源于【生物探索】 End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell 综述