GSK-3α

摘要细胞周期机制失调与细胞周期蛋白依赖性激酶 (CDK) 失调有关，是癌症的明确特征，最终促进异常增殖，促进肿瘤发生和疾病发展。对此，在过去几十年中开发了几种 CDK 抑制剂 (CDKI)（第1、2和3代CDKI）来抑制癌细胞增殖。第1代和第2代 CDKIs 因其特异性有限、毒性大，用于肿瘤患者的治疗未受到临床广泛关注。然而，最近开发的联合策略使我们能够降低这些 CDKI 的毒性和副作用，为其在临床环境中的潜在应用铺平了道路。第3代 CDKIs 在临床前和临床水平上产生了最有希望的结果，推动其进入针对多种恶性肿瘤，尤其是乳腺癌的临床试验晚期阶段，并彻底改变了传统的治疗策略。本综述讨论了第1、2和3代 CDKI 中研究最多的候选药物、其基本作用机制、既往失败的原因及其目前治疗不同恶性肿瘤的临床开发。简要总结了最近的临床试验结果和开发第三代 FDA 批准的选择性 CDK4/6 抑制剂（对抗最普遍的癌症）的进展。总的来说，这篇综述将提供从过去到现在 CDKIs 的透彻知识，让研究人员重新思考和开发创新的癌症治疗方案。细胞周期的进展在很大程度上依赖于CDKs，CDKs的失调与细胞周期失调和异常增殖有关，这是癌细胞的两个关键标志。在过去的几十年里已经开发了多种 CDKIs 来抑制癌细胞增殖。早期生成的 CDKI 显示出异常的抗癌活性，但其显著的毒性和有限的选择性使人们对其治疗用途产生怀疑。而第3代 CDKIs 则以相对较低的毒性和较高的特异性，产生了最有前景的临床结果，推动其进入针对多种恶性肿瘤，特别是针对乳腺癌的临床试验的晚期阶段，并彻底改变了传统的治疗策略。1.引言非程序性增殖是癌细胞的关键标志之一。癌细胞的非程序性增殖直接或间接由失调的细胞周期蛋白依赖性激酶 (CDKs) 介导Unscheduled proliferation is one of the key hallmarks of cancer cells. Unscheduled proliferation in cancer cells is mediated directly or indirectly by dysregulated cyclindependent kinases (CDKs)。细胞周期早期 CDKs 的表达形成了细胞增殖的条件。实现 CDKs 在细胞周期进程中的潜力，在过去的几十年里，多种 CDK 抑制剂 (CDKIs) 被开发用于阻断癌细胞增殖。包括第1、2、3代CDKI。尽管第1和第2种 CDKI 在临床前和临床研究（程度较轻）中显示出显著的抗肿瘤疗效，但由于其特异性较低和毒性严重，这些抑制剂在癌症患者的治疗中未受到太多临床关注。近年来联合治疗策略的发展使降低前一代 CDKI 的毒性和副作用成为可能，为其在临床环境中的应用开辟了可能。与第1代和第2代 CDKI 相比，在开发第3代 CDKI 的临床方面取得了显著进展。临床前和临床结果表明，这些选择性 CDK4/6 抑制剂可以显著降低多种恶性肿瘤的进展。其中4种抑制剂palbociclib、ribociclib、abemaciclib和 trilaciclib 已被 FDA 批准用于治疗不同的癌症，单独使用或与已确立的疗法联合使用。本综述讨论了第1、2和3代 CDKI 中研究最多的候选药物、其基本作用方式、既往失败的原因以及多发性恶性肿瘤管理的近期临床开发。此外，简要总结了 FDA 批准的第三代选择性 CDK4/6 抑制剂治疗最普遍癌症的最新临床试验结果和进展。1.1.CDK和细胞周期进程CDKs 是在细胞周期进程和转录调控过程中催化蛋白磷酸化的酶家族。CDKs的催化活性需要被称为细胞周期蛋白的调控伴侣的结合。几种 CDKs 和细胞周期蛋白已在不同物种中被鉴定识别，只有特异性的 CDK-细胞周期蛋白相互作用被认为控制细胞周期进程，即通过G1、S、G2和 M 期。在哺乳动物中，目前公认的模型是基于生化证据，其中 G1 至 S 期转变由 CDK4 或 CDK6 与D1、D2和 D3 细胞周期蛋白结合控制。在细胞周期早期，有丝分裂前信号增加细胞周期蛋白 D 的表达，细胞周期蛋白 D 结合并激活CDK4/6，最终激活CDK2/cyclin E。CDK4/CDK6使 Rb 蛋白磷酸化，CDK2进一步磷酸化Rb。在细胞周期蛋白-CDK4/6 复合物存在的情况下，Rb的过度磷酸化阻断 E2F 结合，使细胞进入 S 期，在那里发生 DNA 合成。当CDK2/cyclin A 磷酸化E2F1，阻断其 DNA 结合能力时，S期终止。CDK1与细胞周期蛋白 B 结合完成有丝分裂过程。据报道，CDK3与细胞周期蛋白 C 结合可使Rb 磷酸化，导致从 G0 期退出。也有报道 CDK3 有助于进入 S 期，部分是通过激活转录因子 E2F 家族成员，但其作用与 CDK2 不同。这些事件的概述和图形表示见图1.除了直接驱动细胞周期进程的CDKs（如CDK4、CDK6、CDK2、CDK1和CDK3）外，还揭示了一个控制转录的 CDKs 家族，其中包括CDK7、CDK8、CDK9、CDK10、CDK11、CDK12、CDK13等。在特殊组织环境中具有有丝分裂后功能的CDK，如CDK5，也已被确定。每个CDK 的重要性及其对细胞周期调控的贡献的细节已经在各种报告中讨论过。在本节中，我们打算概述调节哺乳动物细胞周期的 CDK 家族重要成员。鉴于 CDKs 在哺乳动物细胞细胞周期调控中发挥的至关重要的功能，所有恶性肿瘤都具有某些损害细胞周期正常控制的特征可能并不令人惊讶。这就是为什么在过去的30年里，多种靶向 CDKs 活性的药物不断进化，并在临床试验中进行了测试的原因。在最近的时代，选择性靶向 CDK 家族两个关键成员 (CDK4/6) 活性的最先进药物已成为现代癌症治疗的支柱。在下面的章节中，简要回顾了第1、2和3代靶向 CDK 活性 (CDKIs) 药物中研究最多的候选药物，它们最近在临床上开发用于治疗多种恶性肿瘤，它们的基本作用方式及其过去失败的原因，以及振兴它们用于癌症治疗的策略。图1.CDK家族蛋白及其相互作用的伴侣参与调节细胞周期进程。促有丝分裂信号在细胞周期早期促进细胞周期蛋白 D 的合成，细胞周期蛋白 D 结合并激活CDK4/6，随后激活CDK2/cyclin E。CDK4/CDK6使 Rb 蛋白磷酸化，CDK2进一步使 Rb 过度磷酸化。Rb的过度磷酸化阻止E2F 结合，使细胞进入 S 期，在那里发生 DNA 合成。在 S 期接近结束时，CDK2/细胞周期蛋白 A 磷酸化E2F1，阻止其与 DNA 结合并终止 S 期。CDK1与细胞周期蛋白 B 偶联完成有丝分裂过程。CDK3与细胞周期蛋白 C 结合使 Rb磷酸化，导致从 G0 期退出。除了这些直接驱动细胞周期进程的CDK 外，还发现了CDK7、CDK8、CDK9、CDK10、CDK11、CDK12、CDK13和 CDK19 等其他CDK，并证实参与转录调控。2.靶向各种恶性肿瘤的 CDKI进展2.1.第一代 CDKI一旦探索了 CDKs 在各种癌症中的治疗潜力，就会进化出 CDKIs 开发的研究。最初，多种 CDKI 被称为第一代CDKI，包括olomoucine、flavopiridol和roscovitine，被开发为潜在的癌症治疗药物，并在大量临床试验中进行了试验。然而，由于其相对于其类似物的亲和力有限且毒性严重，其中一些第一代CDKI（如olomoucine）尽管在临床前研究中对癌细胞具有相当大的抑制作用，但仍无法用于临床研究。相比之下，flavopiridol和 roscovitine 这两种第一代 CDKI 在研究方面引起了最大的关注，正在用于 I/II 期临床研究。2.2. FlavopiridolFlavopiridol 是研究最广泛的第一代CDKI，也是首次用于临床研究。Flavopiridol最初被发现是表皮生长因子受体的抑制剂，在多个实验模型中已被证明可以抑制各种癌症的生长，但后来，观察到其对CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、CDK7和 CDK9 的抑制活性强于对表皮生长因子受体的抑制活性（图2）flavopiridol的初步临床试验始于1994年，作为慢性淋巴细胞白血病和急性髓系白血病的一线联合治疗。此后，根据最大的临床试验数据库 (www.clinicaltrials.gov)flavopiridol已经在67项临床试验中进行了测试，该药主要用于治疗包括淋巴瘤、急性髓性白血病、前列腺癌和胃癌在内的多种癌症。flavopiridol的早期试验证明，在体外足以抑制细胞增殖和 CDK 活化的浓度可在人体中安全获得。此外，这些静脉注射 flavopiridol 的初步临床试验表明对多种癌症有效，如非霍奇金淋巴瘤和前列腺癌、结肠癌、肾癌和胃癌。然而，在这些研究期间，观察到严重的不良反应，如分泌性腹泻和促炎状态伴低血压，导致该药物的进一步临床开发停止。联合治疗策略的最新发展使其能够降低与强效药物相关的毒性和副作用，从而改善其在临床环境中的应用。在相同的背景下，已对各种药物与 flavopiridol 联合使用进行了检查，以降低 flavopiridol 在临床上的严重不良反应。例如，在 I 期临床研究中，食管癌、肺癌和前列腺癌均对序贯紫杉醇和favopiridol治疗有良好的反应。几项 I 期临床研究已经证明了联合使用 favopiridol 和多西他赛对抗转移性乳腺癌、多种非血液系统癌症和晚期实体瘤的巨大潜力。还进行了多项使用favopiridol的 II 期临床研究。其中许多在多种癌症中有中度至显著的结果，而另一些则产生了不令人满意的结果，需要对其他联合策略进行更多的实验。这些晚期临床研究的详细信息总结见表1。图2.总结了多年来开发的研究最广泛的第1、2和3代CDKI、其化学结构及其靶向的重要CDK。表1.部分第一代和第二代CDKI 的晚期临床试验概述2.3. RoscovitineRoscovitine 是一种基于嘌呤的CDKI，也是第一代 CDKI 之一，将在多种癌症的临床试验中进行探索。这种抑制剂已经证明了它能够结合和抑制 CDK 家族的多个成员，包括CDK1、CDK2、CDK5、CDK7和CDK9，即使在微摩尔浓度下 (2) 临床前研究了Roscovitine对多种癌细胞系和移植瘤模型的抑制作用，显示Roscovitine的抑制作用多通过细胞周期阻滞和凋亡诱导介导。此后，开展了几项以roscovitine 为单一药物的 I 期和 II 期临床试验，但结果未能给科学界留下明显的印象。使用 roscovitine 的 I 期临床试验证明没有客观的肿瘤反应，即使一些患者 (8/21) 达到了疾病稳定。另一项 I 期临床研究发现，各种类型恶性肿瘤个体的部分缓解和肿瘤稳定。还进行了一项 II 期临床试验，研究口服 roscovitine 治疗非小细胞肺癌的有效性；然而，这项研究被关闭，没有数据被披露 (NCT00372073)。与 flavopiridol 相似，roscovitine最近在临床水平上与常规治疗联合使用。最近完成的一项 I 期临床研究采用了sapacitibine和Roscovitine联合治疗BRCA（乳腺癌基因）肿瘤，研究显示出潜在的协同效应，导致细胞周期停滞和肿瘤细胞凋亡。根据这项研究，将 roscovitine 与 sapacitibine 联合使用增加了其总体疗效并降低了其细胞毒性，表明未来采用联合策略的研究可能会提高 roscovitine 的治疗疗效。使用 roscovitine 单药或联合治疗多种癌症的 II 期临床研究总结见表1。2.4.第二代 CDKI考虑到第一代 CDKI 抑制剂的细胞毒性和低选择性，已开发了几种第二代CDKI，并在各种临床研究中进行了试验。这些化合物包括多种化合物，如dinaciclib、AT7519、CYC065、P276–00、TG02、roniclib、RGB-286638、PHA793887、ZK-304709、P1446A-05、R547、SNS-032、AZD5438、AG-024322和PHA-848125。然而，并非所有研究均在早期临床研究之外进展，并在晚期临床研究中产生了令人满意的结果。例如，由于申办方公司的商业决定，停止了P276–00的临床试验。3项 I 期研究评估了AZD5438（一种对CDK1、CDK2和 CDK9 具有选择性的抑制剂）以不同给药方案给药时的临床安全性、耐受性、药代动力学和药效学，观察到耐受性较差，停止了其临床开发。R547是一种CDK1、CDK2和 CDK4 抑制剂，对CDK7、GSK3a和 GSK3b 的疗效较低，2007年在一项 I 期研究中进行了研究，但尽管声称毒性可控，但并未进一步进展。使用 SNS-032 抑制剂启动了两项 I 期临床试验，据称 SNS-032 抑制剂对CDK2、CDK7和 CDK9 具有选择性；然而，这些研究未进行随访。P1446A-05、ZK-304709和RGB-286638 的 I 期或 II 期研究也已终止。另一方面，三种第二代CDKI，即dinaciclib、AT7519和CYC065，在临床前水平进行了相当多的研究后，能够进入晚期临床试验。下面，我们分别对这3个第二代 CDKI 进行了详细的讨论。2.5. DinaciclibDinaciclib 是研究最广泛的第二代CDKI，主要被开发为一种非常有效的CDK1、CDK2、CDK5和 CDK9 抑制剂 (图2) 对CDK4、CDK6、CDK7的活性降低。在基于细胞的实验中，与早期世代相比，dinaciclib在抑制 RB 磷酸化方面表现出更大的有效性。此外，dinaciclib在超过100种多种肿瘤类型的肿瘤细胞系中阻止了细胞周期的进展，并在各种异种移植模型中引起植入的实体瘤消退。Dinaciclib在48例晚期实体瘤患者中进行了 I 期试验，这些患者每周接受一次2小时静脉输注，持续3周。直立性低血压和尿酸升高是记录的剂量限制性毒性；然而，总体而言，治疗耐受良好，在10例患者中观察到疾病稳定。在乳腺癌和非小细胞肺癌患者中进行了 dinaciclib 的 II 期试验，但在两项研究中，与标准治疗相比，dinaciclib导致疾病进展时间更短，因此试验被叫停。鉴于第一代 CDKI flavopiridol 在复发性和难治性慢性淋巴细胞白血病中观察到令人鼓舞的结果，还在该患者人群中研究了 dinaciclib 的治疗疗效。令人惊讶的是，54%的 dinaciclib 治疗患者出现缓解；然而，血细胞减少症和肿瘤溶解综合征被观察为不良后果。这表明 dinaciclib 可能对某些血液癌症的治疗有效，flavopiridol也证实了对这些癌症的疗效。设计了一项随访 III 期试验，在接受 dinaciclib 与 ofatumumab 治疗的复发/难治性慢性淋巴细胞白血病患者中，将无进展生存期 (PFS) 作为主要终点（ORR，部分缓解+完全缓解）和总生存期 (OS) 进行比较。PFS、ORR和 OS 的结果显示，dinaciclib对慢性淋巴细胞白血病的疗效优于ofatumumab，但由于样本量太小，无法进行统计分析。接受 dinaciclib 或 ofatumumab 治疗的患者的中位 PFS 分别为13.7个月和5.9个月。接受 dinaciclib 治疗的患者的 ORR 为40.0%，接受 ofatumumab 治疗的患者的 ORR 为8.3%。所有这些均为部分缓解。共有35.0%的 dinaciclib 患者和45.8%的 ofatumumab 患者能够使其疾病免于恶化。Dinaciclib患者的中位 OS 为21.2个月，而ofatumumab患者的中位 OS 为16.7个月。还使用了不同的组合策略来增强 dinaciclib 的效率并降低其毒性。例如，在一项 I 期随机递增3+3研究中，复发性/难治性慢性淋巴细胞白血病患者接受了dinaciclib+利妥昔单抗治疗。根据这项试验的研究结果，dinaciclib联合利妥昔单抗的耐受性良好，在复发/难治性慢性淋巴细胞白血病患者中表现出临床活性。同时进行了一项以 MYC 过表达作为反应预测因子的 dinaciclib 联合 pembrolizumab 治疗晚期三阴性乳腺癌 (TNBC) 患者的 Ib 期研究，结果在2020年 ASCO 年会上公布。晚期TNBC 患者除接受设定剂量的帕博利珠单抗 200 mg 每21天一次给药外，还在第1天和第8天接受 dinaciclib IV 给药。采用剂量限制性毒性 (DLT) 率为25%的毒性概率区间设计增加 Dinaciclib 的剂量，并对基线肿瘤组织进行MYC IHC，以确定临床反应。在本研究中，入组了32例患者（中位年龄53岁，中位既往治疗线数为2，13例患者 (41%) 既往患有ER+乳腺癌）。剂量递增阶段招募了18例无 DLT 的患者；33 mg/m2是推荐的 II 期剂量 (RP2D)。剂量扩展研究增加了14例患者，剂量为33 mg/m2，使实验得出结论。结果显示所有患者均发生3级不良事件 (AE)，包括发热(12.5%)、疲乏 (12.5%)、中性粒细胞减少(37.5%)、转氨酶炎性升高 (3.2%) 和神经肌肉无力(3.2%)。疲乏 (63%)、腹泻 (63%)、恶心 (63%) 和中性粒细胞减少症 (53%) 是最常见的所有等级不良反应。在初步疗效分析中观察到临床获益率为47%，c-MYC高表达与临床缓解显著相关，需要进一步验证 c-MYC 作为联合治疗缓解的预测标志物。在这些令人鼓舞的结果之后，正在进行一些进一步的晚期临床试验，采用 dinaciclib 单药或与其他药物联合治疗各种癌症。表2总结了这些研究。表2.正在进行的palbociclib 单药或联合治疗晚期临床试验列表2.6. AT7519Dinaciclib为发现AT7519铺平了道路，AT7519是另一种对CDK1、CDK2、CDK4、CDK5、CDK6和CDK9表现出抑制活性的抑制剂（图2）与dinaciclib相似，这种抑制剂在多种人癌细胞系中表现出令人鼓舞的疗效，即使在纳摩尔浓度下也是如此。在一项探索AT7519生物学特征的研究中，AT7519显示可诱导人肿瘤细胞的细胞周期停滞和随后的细胞凋亡。在同一研究中，在人结直肠癌异种移植模型中观察到显著的肿瘤消退，证明了显著的抗癌有效性。同样，Dolman等人于2015年发表的一项临床前研究。表明AT7519作为治疗MYCN扩增的高危神经母细胞瘤患者的潜在疗法。在最近的一项临床前研究中发现，纳摩尔浓度的AT7519通过阻止G2/M期细胞并诱导细胞凋亡，大大抑制鼻咽癌的生长。I期临床试验已被用于研究AT7519是否能有效治疗晚期难治性实体瘤或非霍奇金淋巴瘤个体。共有34例患者参加本试验，其中32例接受所有4个剂量水平的治疗。粘膜炎、发热性中性粒细胞减少症、皮疹、疲乏和低钾血症是观察到的一些剂量限制性毒性。在19例可评价疗效的患者中，10例的最佳缓解为疾病稳定。II期推荐剂量为27.0 mg/m2。还进行了一项使用AT7519治疗复发性套细胞淋巴瘤和复发性难治性慢性淋巴细胞白血病的II期临床试验。然而，在16个月期间仅累积了7例患者的预后。因此，试验提前结束。在一项I/II期开放性多中心研究中，还在既往接受过多发性骨髓瘤治疗的患者中研究了AT7519M单药治疗和与硼替佐米联合治疗。在本研究中，AT7519M和硼替佐米全剂量有效联合给药，患者组对该治疗耐受良好。AT7519M和硼替佐米的最大耐受剂量分别为21 mg/m2和1.3 mg/m2。在接受过硼替佐米预治疗或硼替佐米难治的部分患者中，AT7519M与硼替佐米联合给药产生了显著缓解（33%PR）；然而，AT7519M单药治疗后未观察到显著疗效。此外，2016年4月启动了一项使用onalespib和AT7519治疗转移性或不能手术的实体瘤患者的I期临床试验，目前正在进行中。本研究的主要目的是确定onalespib和AT7519 M联合治疗晚期、转移性和不可切除的恶性实体瘤的安全性、耐受性和最大耐受剂量。表1包含此类临床研究的更多信息。2.7.FadraciclibFadraciclib(CYC065) 也是一种第二代CDKI，来源于 roscovitine 和CCT068127。这种抑制剂对CDK2、CDK5和 CDK9 表现出很强的效力(图2)。在急性髓系白血病和急性淋巴细胞白血病的临床前模型中，表明 CYC065 通过抑制CDK9 限制白血病细胞系的增殖和存活，从而降低 RNA 聚合酶Ⅱ介导的转录和 MCL1 表达，从而引发细胞凋亡。此外，CYC065可通过促进细胞周期进程和抑制分化，降低 MEIS1 的表达，MEIS1是混合谱系白血病干细胞发生和维持所必需的转录辅因子。同样，另一项临床前研究探索了 CYC065 对 AML 和混合谱系白血病的治疗潜力。发现相关癌细胞系对这种抑制剂极为敏感，导致这些癌细胞快速凋亡。此外，同一研究表明，小鼠经口给予 CYC065 可使 AML 肿瘤生长减少90%以上。考虑到这种新兴的强效 CDKI 令人鼓舞的结果，单独使用这种抑制剂或与 venetoclax 联合使用的不同 I/II 期临床试验正在包括复发性/难治性急性髓系白血病 (AML)、慢性淋巴细胞白血病和多发性实体瘤在内的多种恶性肿瘤中进行。这些 I/II 期临床试验的详细信息见表1。2.8.第三代 CDKI绝大多数来自第1代和第2代的 CDKIs 在其分子靶点上没有选择性（图2）阻止这些早期一代 CDKIs 在临床方面完全开发的主要障碍是对其作用的潜在机制缺乏坚实的理解。就众多第1代和第2代 CDKI 的治疗疗效而言，尚不清楚哪些 CDK 在体内条件下受到抑制，以及通过何种机制受到抑制。此外，由于其中许多早期 CDKI 靶向正常细胞增殖和存活所必需的多种蛋白，如 CDK1 和CDK9，因此这些药物在晚期临床研究中的进一步开发也受到其无法区分癌组织和健康组织的限制。归因于这些早期生成 CDKI 的缺点意味着，改善对特定 CDK 的选择性对于CDKI 作为癌症治疗药物的有效开发至关重要。因此，开发了特异性靶向 CDK 4 和 CDK6 的选择性更强、毒性更小的第三代CDKI。这些药物包括palbociclib、ribociclib、abemaciclib和最近开发的trilaciclib。这些都是口服选择性 CDK 4/6 抑制剂，可阻止 RB 的磷酸化，引起 G1 期阻滞和肿瘤细胞的衰老。它们似乎具有相似的临床作用和相似的化学结构（图2）这些第3代 CDKIs 被认为是迄今发现的最耐人寻味、最有前景的 CDKIs 家族，彻底改变了几种侵袭性恶性肿瘤的治疗。已对 CDK 4 和 CDK6 抑制剂在癌症中的作用以及palbociclib、ribociclib、abemaciclib和 trilaciclib 的药理学特性进行了广泛研究。下面简要概述这些新一代 CDKI 治疗多种恶性肿瘤的最新临床发展。2.9. PalbociclibPalbociclib是研究最广泛的第三代CDKI之一。口服生物可利用的palbociclib由辉瑞开发，并于2015年2月获得FDA的批准。Palbociclib是一种CDK4/6抑制剂，IC50（抑制浓度）为9-15 nmol/L，通过与ATP（三磷酸腺苷）口袋结合发挥作用。重要的是，它对任何其他激酶都没有任何作用。CDK4/6激酶及其共调节伴侣细胞周期蛋白D促进G1-S转换，因此，在RB蛋白磷酸化和E2F转录因子被激活的细胞中，阻断这一步可抑制细胞周期进程。Palbociclib在多种类型癌症的各种临床前研究中显示出良好的结果。例如，在人肝癌细胞系中，palbociclib通过诱导可逆性细胞周期停滞来抑制细胞生长。在亚微摩尔剂量下，发现80%的口腔鳞状细胞癌细胞系对palbociclib敏感。在40种卵巢癌细胞系中发现了palbociclib的浓度依赖性抗增殖作用，但各细胞系之间的作用差异很大。通过降低Rb磷酸化，palbociclib能够成功地将多种肿瘤细胞（包括HT29、Colo205和DLD1等）阻滞在G1细胞周期阶段。在不同癌症类型的异种移植小鼠模型中也观察到相似的结果。例如，palbociclib在ApcMin小鼠体内可有效给药，抑制肿瘤细胞生长，而对正常上皮细胞无影响。在小鼠异种移植模型中进行试验时，Palbociclib对多种肿瘤（包括乳腺癌）具有抗肿瘤活性。此外，已证实palbociclib可通过阻断c-Jun/COX-2通路抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭以及上皮间质转化和转移。在获得关于palbociclib疗效的令人鼓舞的临床前结果后，在不同的人类癌症类型中使用palbociclib单药和与其他疗法联合进行了多项I/II/III期临床研究，包括胰腺神经内分泌癌（NCT02806648）、卵巢癌（NCT03936270）、转移性胰腺导管腺癌（NCT02501902）、转移性结直肠癌（NCT03446157）以及KRAS突变的非小细胞肺癌和实体瘤（NCT02022982）。尽管palbociclib正在几种不同的癌症中进行研究，但最令人鼓舞的发现是在乳腺癌中。这是palbociclib大多数晚期临床研究（II/III期）在乳腺癌患者中进行的主要依据。在综述的单独章节中记录了这些临床研究的结局（第三代CDKI治疗乳腺癌的临床研究的最新突破），并将其列于表2中。2.10. Abemaciclib礼来公司实验室的研究人员首次确定 abemaciclib 是一种抗肿瘤药物，也是 CDK4 和 CDK6 的双重抑制剂。后来研究表明，abemaciclib是 CDK4 和 CDK6 ATP 结合结构域的竞争性抑制剂，对 CDK4 的疗效是 CDK6 的14倍。根据其生物活性和对 CDK4/细胞周期蛋白 D1 和CDK6/细胞周期蛋白复合物的极特异性抑制选择Abemaciclib。与 palbociclib 相似，未检测到对其他必需细胞周期相关激酶的活性。IC50值是 palbociclib 和 ribociclib 的1/5（将在下文讨论），因此，abemaciclib对 CDK4/细胞周期蛋白 D1 复合物的选择性更高。在 abemaciclib 治疗多种癌症（包括结直肠癌、肺癌、胶质母细胞瘤和血癌）的临床前表征期间，、 abemaciclib 即使在纳摩尔浓度下也能通过抑制 Rb 蛋白磷酸化抑制 CDK4 和CDK6，引起 G1 期阻滞，增殖变慢。Abemaciclib连续给药时耐受性良好，在肿瘤异种移植模型中评价时显示出显著的剂量依赖性抗癌疗效，导致肿瘤体积减少70%。基于临床前研究中获得的非常有前景的结果，abemaciclib进入了临床开发阶段。进行了一项 I 期多中心研究，以评估 abemaciclib 单药治疗多种晚期恶性肿瘤的安全性、药代动力学特征、药效学作用和抗肿瘤活性，包括乳腺癌、非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、黑色素瘤和结直肠癌。本研究共纳入225例患者：剂量递增队列33例，肿瘤特异性队列192例。3级疲乏是研究期间观察到的剂量限制性毒性。最大耐受剂量为200 mg/12 h。胃肠道、肾脏或造血系统影响和疲乏是最常见的不良事件。既往接受过治疗的乳腺癌、非小细胞肺癌和黑色素瘤患者均获得了放射学缓解。激素受体阳性乳腺癌的总缓解率为31%；然而，61%的患者出现缓解或疾病稳定持续6个月或更短时间。在另一项 I 期研究中，接受 abemaciclib 单药或联合氟维司群或其他抗激素治疗的HR+转移性乳腺癌患者显示出有利的药代动力学和毒性特征，其中腹泻、中性粒细胞减少症、恶心和疲乏是最常见的3级治疗相关副作用。未记录到4级事件或发热性中性粒细胞减少症。接受abemaciclib+氟维司群治疗的HR+转移性乳腺癌患者组表现出最有前景的结局，在平均接受过4次既往全身治疗的患者中，62%证实了部分缓解。这些发现引发了 II 期和 III 期临床研究的开始。在 MONARCH 1 临床 II 期试验中，研究了 abemaciclib 单药在内分泌治疗后疾病进展且既往接受过化疗的难治性HR +/HER2-转移性乳腺癌患者中的抗肿瘤活性，在 MONARCH III 期试验中，在内分泌治疗后疾病进展的HR +/HER2晚期乳腺癌患者中评价了 abemaciclib 与氟维司群的联合用药。综述的后面部分详细讨论了这些临床试验的结果。由于其在HR +/HER2晚期乳腺癌中的显著临床结果，目前正在多项正在进行的 i/II/III 期临床试验中对该抑制剂单药或与其他已确定的癌症疗法联合治疗多种恶性肿瘤进行临床研究。例如，在头颈部鳞状细胞癌 (NCT03655444)、转移性肾细胞癌 (NCT03905889)、胆道癌 (NCT04003896)、胶质瘤 (NCT05413304)、骨和软组织癌 (NCT04040205)、转移性或局部晚期间变性/未分化甲状腺癌 (NCT04552769) 和子宫内膜癌 (NCT04393285) 中。这些正在进行的临床研究的结果可能为各种流行癌症的新型、有效的治疗方式铺平道路。2.11. RibociclibRibociclib 由诺华国际公司开发，2017年获得 FDA 批准，与来曲唑联合使用时，可用于晚期乳腺癌患者的治疗。与其他第三代 CDK 抑制剂一样，Ribociclib是一种口服生物可利用的小分子药物，可特异性抑制CDK4/6，从而降低视网膜母细胞瘤蛋白磷酸化，阻止细胞周期进程并将细胞周期阻滞在 G1期。已证明 Ribociclib 可降低细胞周期蛋白 D1 和 CDK4 复合物以及细胞周期蛋白 D3 和 CDK6 复合物的结合，对CDK4 的选择性是 CDK6 的4倍。在肺癌细胞系和原发性肿瘤组织中进行的 CDK4/6 抑制剂活性的化学蛋白质组学研究表明，ribociclib对 CDK4 和 CDK6 的选择性远高于palbociclib，后者已被证实可与两倍多的激酶发生相互作用。在一项癌细胞系广泛研究中，分析了 ribociclib 对超过500种细胞系的活性，其显示出剂量依赖性抗肿瘤活性，与各种肿瘤细胞系中的 CDK4/6 抑制具有良好的相关性；但在神经母细胞瘤细胞系中的作用更为明显。另一项探索ribociclib 治疗作用的研究发现，ribociclib治疗与神经母细胞瘤细胞系来源的异种移植动物模型中磷酸化Rb、Ki67和细胞增殖的减少有关，导致整个治疗过程中肿瘤生长显著延迟。这些令人鼓舞的临床前方面的结果与其他在多种癌症类型中的结果一起，单独或与标准疗法一起，导致研究人员在 I/II/III 期临床试验中探索这种第三代抑制剂的作用。在美国和欧洲以及日本进行了第一项 I 期临床试验，检查了 ribociclib 单药治疗多种 Rb 阳性晚期实体瘤和淋巴瘤的有效性。使用 ribociclib 作为单药，这些探索性临床试验表明在 Rb 阳性恶性肿瘤中具有可接受的安全性特征和早期临床有效性，支持在临床环境中进一步探索该药物。从那时起，ribociclib成为多种肿瘤类型的多项 I/II 期临床试验的主题，包括 BRAFV600 和 NRAS 突变黑色素瘤 (NCT01777776，NCT01781572)、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、食管鳞状细胞癌、胃肠道间质瘤和结直肠癌 (NCT04000529)、畸胎瘤 (NCT02300987)、脂肪肉瘤 (NCT03096912)、骨髓纤维化 (NCT02370706)、卵巢癌 (NCT03056833) 和子宫内膜癌 (NCT03008408)。然而，最先进的临床试验正在研究 ribociclib 与几种常规疗法联合治疗HR+乳腺癌。这些高级临床研究的详细信息包含在本综述的后续章节中。2.12. TrilaciclibTrilaciclib 是G1 Therapeutics（原名G-Zero Therapeutics）开发的最新第三代短暂性 CDK 4/6 抑制剂，与化疗联合用于治疗癌症，尤其是小细胞肺癌和TNBC，具有骨髓保护、潜在抗肿瘤疗效和安全性获益。CDK控制细胞周期进程，trilaciclib诱导骨髓中增殖的造血干祖细胞发生一过性、可逆性 G1 细胞周期阻滞，保护其免受化疗损伤。2021年02月12日，FDA首次批准 trilaciclib 在含铂/依托泊苷方案或含托泊替康方案治疗广泛期小细胞肺癌 (ES-SCLC) 前给药可降低成人化疗诱导的骨髓抑制风险。多项研究表明，trilaciclib是一种非常有效、具有选择性和可逆性的CDK 4和 CDK6 抑制剂。用 trilaciclib 处理24 小时的正常成纤维细胞系产生了显著和一过性的 G1 细胞周期停滞。同一研究发现，在化疗前给予 trilaciclib 可减CDK4/6 依赖性细胞的凋亡，表明瞬时 trilaciclib 可引起这些细胞的 G1 细胞周期停滞，并降低与骨髓抑制相关的细胞毒性化疗药物的体外毒性。在小鼠同基因肿瘤模型中，在化疗加免疫检查点抑制剂方案中添加 trilaciclib 改善了抗肿瘤有效性，部分是通过改变肿瘤微环境中 T 细胞亚型的增殖和组成。在健康志愿者的首次人体 I 期临床试验中，96或 192 mg/m2 trilaciclib 单次给药以剂量依赖性方式抑制了CD45 +/CD3+淋巴细胞的增殖。此外，在 24 h 时，trilaciclib增加了骨髓造血干细胞和祖细胞的 G1 细胞群，在 32 h 时部分恢复，并且对于研究中评估的所有骨髓祖细胞亚群，G1期细胞的比例增加。此外，最近开展了一项 II 期试验，评估 trilaciclib 联合化疗方案吉西他滨和卡铂（GC方案）治疗复发性或转移性 TNBC 的疗效。本研究的结果表明，在标准 GC 治疗的基础上加用 trilaciclib 可显著增加生存率。除这些试验外，正在对晚期/转移性膀胱癌 (NCT04887831)、乳腺癌（NCT04799249、NCT05113966和NCT05112536）、结直肠癌 (NCT04607668) 和小细胞肺癌 (NCT04902885) 进行额外的 II/III/IV 期临床研究。希望这些先进的正在进行的临床试验的发现可能为多种常见恶性肿瘤的创新、成功的治疗方法铺平道路。2.12.1.过去和现在对CDKIs 的挑战如前所述，在过去的几十年里，已经开发了三代 CDK 抑制剂 (CDKIs)。尽管第1和第2代 CDKI 在临床前和临床研究（程度较轻）中显示出显著的抗肿瘤活性，但由于许多原因，这些抑制剂在癌症患者的治疗中未获得太多的治疗关注。阻碍早期一代 CDKI 进一步临床开发的主要因素之一是其缺乏选择性，从而导致毒性增加。由于这些早期生成的 CDKI 靶向几种CDK，尚不清楚这些早期生成的 CDKI 特异性靶向哪种CDK，尚不确定这些早期生成抑制剂治疗作用的基础机制。同样方面的另一个因素是抑制对正常细胞生理活动很重要的必需CDK，包括增殖、存活、检查点激活、DNA修复和复制。这导致正常细胞的细胞毒性水平更高。另一方面，第3代或选择性CDKI（CDK4/6抑制剂）尚未遇到这些问题，使其取得最令人鼓舞的结果，进行晚期临床试验，并获得 FDA 批准。然而，尽管在临床方面取得了显著的成功，但固有和获得性耐药对其更广泛的使用构成了重大挑战。临床上，据报告，只有一部分接受治疗的患者对晚期 CDKI 产生应答，而其他患者表现出固有耐药性，无法从这些药物中获益，通常转换为化疗。同时，一些患者最初从治疗中获益，但后来获得了对这些 CDKI 的耐药性。多项研究试图探讨耐药的相关机制，发现 RB 的基因丢失和突变、细胞周期的各种关键调控因子如p16、CCNDI、CCNE1、E2F、CDK2、CDK4、CDK6、CDK7、CDK9的扩增、参与细胞存活和增殖的关键通路的激活，如 FGFR 通路、PI3K/AKT/mTOR通路、ER/PR的表达缺失、CDKI耐药的免疫相关机制、癌细胞内的代谢改变、药物诱导的基质功能改变等是 CDKI 治疗耐药的重要可能机制。这些机制最近在多篇报道中进行了详细介绍。尽管发表了过多的临床前研究，但 CDKI 耐药机制与临床验证的明确背景尚待研究。这突出了该课题临床和临床前研究的重大差距。迫切需要对耐药机制进行更彻底的研究，发现生物标志物来识别可能或可能不会从这组药物中获益的个体，并采用不同的抑制剂/药物来对抗 CDKI 耐药的组合策略。2.12.2.第三代 CDKIs对抗乳腺癌临床研究的最新突破乳腺癌已超过肺癌成为全球发病率最高的癌症。HR+/HER2-乳腺癌是最常见的乳腺癌亚型，占所有乳腺癌病例的70%以上。内分泌治疗 (ET) 在辅助和转移背景下对该亚型乳腺癌均高度有效。尽管有这种有效的疗法，但仍有一部分辅助治疗患者会因无法治愈的转移性疾病而复发，这可能与内分泌治疗产生耐药性有关。HR+转移性乳腺癌患者最终对进一步内分泌治疗产生完全耐药性，预示着向持续终生化疗的转变。因此，在辅助和转移背景下改善内分泌治疗的疗效将对许多乳腺癌患者产生非凡的获益，是未满足的医疗需求。目前正在开发多种靶向作用于细胞生长和控制关键通路的新药，以提高内分泌治疗对HR+乳腺癌的疗效。考虑到细胞周期失控导致非限制性生长（癌症的典型标志）和CDK在细胞周期调控中的潜在作用，在过去几十年中开发了多种靶向不同 CDK 的CDKI，以阻断癌细胞增殖，如本综述前面部分所述，并总结于图2中。针对晚期乳腺癌亚型已经取得了最大程度的成功。事实上，CDKIs作为乳腺癌治疗药物的临床前和临床研究结果都彻底改变了乳腺癌的治疗方式。几篇杰出的报道详细介绍了 CDKIs 在乳腺癌治疗中的临床前和早期临床效果。总结 CDKIs 在乳腺癌治疗中最先进的临床研究的最新成果，重点介绍现代一代CDKIs。2.12.3.palbociclib治疗乳腺癌的临床开发Palbociclib是首个临床可用的CDK4/6抑制剂，并于2015年2月获得FDA加速批准，联合来曲唑用于ER+和HER2-转移性乳腺癌绝经后女性患者的一线治疗。Palbociclib首次在两项I期单药治疗剂量递增研究中进行了评估，包括74例晚期癌症患者。在这些研究中，Palbociclib的剂量限制性毒性是骨髓抑制/中性粒细胞减少症，具有可逆性和非累积性。研究期间，共有69%的患者发生任何级别的中性粒细胞减少。疲乏、恶心、腹泻、呕吐、便秘和皮疹是最常见的非血液学毒性。选择125 mg/天给药3周停药1周的II期剂量，因为其耐受性增加。还对Palbociclib与紫杉醇每周一次联合治疗进行了研究；由于中性粒细胞减少症的发生率和需要减少剂量，故确定Palbociclib剂量为100 mg，给药3天，停药4天，以进行进一步研究。然后在II期试验中使用Palbociclib。一项在28例所有亚型的治疗前转移性乳腺癌患者中进行的palbociclib单药治疗II期试验发现，临床获益率（PR+SD>6个月）为21%，最常见的3/4级毒性仅限于中性粒细胞减少症和血小板减少症。在I期安全性导入期后进行了PALOMA-1 II期研究，该研究将患有激素受体阳性HER2-转移性乳腺癌的绝经后个体随机分配至来曲唑组或来曲唑+palbociclib组。将患者分为2个队列（队列1，N =6；队列2，N =99）。未选择队列1作为生物标志物，而评价了队列2的细胞周期蛋白D扩增和/或p16缺失。根据试验的最终报告，总研究组的主要终点PFS从来曲唑单药的10.2个月改善至来曲唑和palbociclib联合治疗的20.2个月，缓解率从33%增加至43%。加用palbociclib改善了两组的生存期；但是，生物标志物的表达与更好的结局之间没有明确的相关性。该研究显示了palbociclib的总体、可控毒性特征。PALOMA-2是一项随机III期研究，主要设计用于验证PALOMA-1的结果。在该试验中，666例女性患者按2:1的比例随机接受palbociclib+来曲唑或安慰剂+来曲唑。大约一半的个体之前接受过新辅助或辅助化疗，一半之前接受过辅助内分泌治疗。palbociclib-来曲唑组和安慰剂-来曲唑组的中位PFS分别为24.8个月和14.5个月。亚组分析显示所有指定组的获益一致。palbociclib–来曲唑组和安慰剂–来曲唑组的临床获益率（完全或部分缓解，或疾病稳定至少24周）分别为84.9%和70.3%。此后，设计了PALOMA-3，这是一项III期研究，旨在探索palbociclib+氟维司群在通常更年轻和风险更高的既往经治晚期HR +/HER2–乳腺癌患者中的作用。在本试验中，如果早期内分泌治疗后癌症复发或进展，且大多数患者已绝经，则有资格入组研究。共计521例患者按2:1的比例随机接受palbociclib或匹配安慰剂+氟维司群治疗。palbociclib+氟维司群组和安慰剂+氟维司群组的中位PFS分别为11.2个月和4.6个月。更新后的OS分析表明，palbociclib+氟维司群组的中位OS为34.8个月，而安慰剂+氟维司群组的中位OS为28.0个月。还在亚洲患者中进行了PALOMA-4临床研究，以检查来曲唑与palbociclib联用的有效性和安全性。随机分配患者（来曲唑和palbociclib，N =169；来曲唑和安慰剂，N =171）。OS的中位随访时间为52.8个月。截至数据截止日期（2020年8月31日），来曲唑和palbociclib组的中位PFS为21.5个月，安慰剂和来曲唑组为13.9个月，所有患者的ORR分别为37.3%和31.6%。与安慰剂组和来曲唑组相比，来曲唑组和palbociclib组中最常见的3/4级不良事件是中性粒细胞减少症、白细胞减少症、血小板减少症和贫血。PALOMA-4进一步验证了来曲唑和palbociclib作为ER+/HER2-晚期乳腺癌绝经后亚洲女性患者一线治疗的疗效和安全性。除了上文讨论的临床研究外，许多评价palbociclib单药或联合治疗对转移性和早期乳腺癌疗效的晚期临床试验正在进行中。例如，2017年6月开始了一项palbociclib靶向治疗转移性乳腺癌的随机、开放性、III期临床研究，主要目的是证明palbociclib联合抗HER2治疗+内分泌治疗在改善激素受体阳性/HER2 +转移性乳腺癌受试者的结局方面优于单独的抗HER2治疗+内分泌治疗。另一项于2018年启动的III期临床研究考察了激素受体HR+/HER2-晚期或转移性乳腺癌患者在他莫昔芬基础上加用palbociclib与单用他莫昔芬相比的疗效，不考虑绝经状态。此外，正在进行一项IV期临床研究，以验证palbociclib联合内分泌治疗与化疗相比可改善转移性乳腺癌患者的至治疗失败时间。本研究的目的是提供1级证据，证明palbociclib+内分泌治疗是需要一线治疗的转移性乳腺癌患者的治疗选择，不仅与内分泌治疗相比，而且与化疗联合或不联合内分泌维持治疗相比。这些晚期临床试验的更多详情见表4。预期这些正在进行的试验中的新临床证据可以阐明palbociclib在晚期乳腺癌治疗中的意义。2.12.4.ribociclib治疗乳腺癌的临床开发2017年3月13日，FDA批准ribociclib联合芳香化酶抑制剂（AI）作为HR+/HER2-晚期乳腺癌绝经后女性的一线治疗。2017年8月24日，欧盟委员会批准该药用于相同用途。这些批准主要基于MONALEESA临床试验项目的结果，其中包括MONALEESA-2、MONALEESA-3和MONALEESA-7试验。这些临床研究的主要目的是评价来曲唑联合ribociclib作为转移性或复发性HR+/HER2-乳腺癌绝经后女性患者的一线治疗。在MONALEESA 2临床研究中，668例患者以双盲方式随机接受ribociclib或安慰剂口服给药3周，停药1周，随后每4周为1周期，同时连续接受来曲唑治疗。患者必须有可测量的疾病或≥1个溶骨性病变，并根据是否存在内脏转移进行分类。Ribociclib的起始剂量为600 mg，即3片200 mg片剂。这项于2021年发表的临床研究的最新结果显示，在中位随访79.7个月后，ribociclib联合来曲唑与安慰剂联合来曲唑相比，OS增加具有统计学意义（中位数，63.9个月vs. 51.4个月）。研究人员表示，这是第一项在绝经后HR+/HER2-晚期乳腺癌患者中证明第三代CDKI具有统计学显著和临床重要OS优势的研究。MONALEESA 3试验在726例既往仅接受过一线内分泌治疗的晚期乳腺癌绝经后女性或男性患者中比较了氟维司群+ribociclib与氟维司群+安慰剂。这些试验的更新OS结果（于2021年在美国临床肿瘤学会年会上公布）表明，在中位随访时间延长至56.3个月后，ribociclib+氟维司群在HR+/HER-晚期乳腺癌绝经后患者中保留了OS获益，并且该获益在大多数患者亚组和治疗环境中保持不变。ribociclib联合氟维司群和氟维司群单药组的中位OS分别为53.7个月和41.5个月。与氟维司群单药治疗相比，ribociclib+氟维司群延迟了后续化疗的必要性，并改善了无化疗生存期。在MONALEESA-7试验中，研究人员使用各种联合治疗的ribociclib来评估绝经前/围绝经期晚期HR+/HER2-乳腺癌患者。在该试验中，患者接受ribociclib+他莫昔芬（每日20 mg）、安慰剂+他莫昔芬或ribociclib+芳香化酶抑制剂（来曲唑每日2.5 mg或阿那曲唑每日1 mg）、安慰剂+芳香化酶抑制剂治疗。此外，MONALEESA-7研究中的所有受试者在每个28天周期的第1天接受戈舍瑞林3.6 mg皮下给药，以抑制卵巢功能。中位随访53.5个月后，本研究的最新OS数据表明，与安慰剂+内分泌治疗相比，ribociclib联合内分泌治疗改善了OS（中位数，58.7个月vs. 48.0个月）。与安慰剂联合非甾体类芳香化酶抑制剂相比，ribociclib联合非甾体类芳香化酶抑制剂也改善了OS获益（中位数，58.7 vs. 47.7个月）。这些更新结果进一步表明，在延长随访超过4年后，在绝经前/围绝经期患者中，与单独内分泌治疗相比，ribociclib+内分泌治疗继续表现出临床相关的OS获益。此外，目前正在进行多项临床试验，以进一步研究ribociclib联合多种乳腺癌治疗的疗效。例如，一项II期、多中心、随机、开放性研究于2019年启动，预计于2025年完成。本研究的目的是检查400 mg ribociclib联合非甾体类芳香化酶抑制剂治疗既往未接受过任何治疗的绝经前和绝经后HR+/HER2-乳腺癌女性的安全性和有效性（NCT03822468）。另一项在原发性可手术HR+/HER2乳腺癌（2/3级，II期）男性和女性患者中开展的II期、开放性、多中心国际试验于2022年5月开始，旨在评价对新辅助ribociclib和来曲唑治疗有生物反应的患者接受非化疗治疗的安全性和长期疗效（NCT05296746）。HARMONIA是一项国际、多中心、随机、开放标签、III期研究，于2022年3月开始。本研究的主要目的是证明ribociclib联合内分泌治疗（来曲唑或氟维司群）在延长晚期HR+/HER2-和HER2富集乳腺癌患者的无进展生存期方面优于palbociclib联合内分泌治疗（来曲唑或氟维司群）（NCT05207709）。该研究将从全球约80家研究中心入组约456例HER2富集疾病患者。关于更多使用ribociclib的临床试验的详细信息见表3。表3.正在进行的ribociclib 单药或联合治疗的晚期临床试验列表2.12.5.abemaciclib治疗乳腺癌的临床开发Abemaciclib也是第三代CDKI，与palbociclib和ribociclib相比，具有独特的毒性特征，这可能是由于其对CDK4的抑制作用高于CDK6以及可能对CDK9的抑制作用。最初，由于JPBA I期研究的有希望的发现，FDA授予abemaciclib突破性疗法认定。随后，在2017年9月28日，FDA批准该抑制剂用于HR+/HER2-晚期乳腺癌患者的两种不同治疗环境。设置1为内分泌治疗和化疗治疗后疾病进展后的单药治疗，设置2为内分泌治疗后疾病进展后与氟维司群联合治疗。JPBA是一项大型、多中心Ib期研究，在33例患者中进行初始剂量递增，随后为扩展期，涉及192例特定恶性肿瘤患者，如乳腺癌、胶质母细胞瘤、肺癌、黑色素瘤和结直肠癌。在该剂量递增试验中，abemaciclib的最高耐受剂量确定为200 mg每日两次；与palbociclib和ribociclib不同，其在连续给药方案中耐受性良好。3级疲乏被确定为剂量限制性毒性。疲乏和胃肠道、肾脏或造血系统毒性是研究期间观察到的最常见治疗不良反应。还观察到骨髓抑制；但发生率低于palbociclib和ribociclib，仅10%的患者发生3/4级中性粒细胞减少症。试验中1例受试者被诊断为发热性中性粒细胞减少症。11%的患者发生1/2级肌酐升高，但这可能不是实际肾脏疾病损害的体征，因为药物影响肌酐肾小管分泌。2个乳腺癌队列被纳入研究的扩展期。Abemaciclib单药连续给药治疗47例既往接受过大量治疗的乳腺癌患者，不考虑其ER或HER2状态。在接受早期内分泌治疗时出现疾病进展的47例患者中，10例患者的治疗方案中还添加了Abemaciclib。在HR-乳腺癌患者中未观察到缓解；然而，31%的HR+患者对治疗有缓解，临床获益率为61%。此外，在由19例广泛预治疗转移性HR+乳腺癌患者组成的小型队列中，abemaciclib 200 mg每日两次与氟维司群联合治疗显示，可测量疾病患者的缓解率为36%，所有个体的临床获益比为63%。I期试验的有前景的结果使abemaciclib在HR+乳腺癌组中的研究得以扩展。单臂II期MONARCH 1试验的结果为FDA批准abemaciclib单药治疗奠定了基础。II期MONARCH 1研究招募并治疗了132例晚期HR+/HER2-乳腺癌患者，这些患者均接受过内分泌治疗和化疗（200 mg abemaciclib每日两次）。尽管存在耐药患者人群，其中大多数有内脏转移，但临床获益率达到42.4%。此外，在涉及abemaciclib、MONARCH 2和MONARCH 3的两项III期试验中招募了乳腺癌患者。MONARCH 2 III期研究在内分泌治疗后进展的晚期HR+/HER2-乳腺癌女性患者中比较了abemaciclib（150 mg，每日两次）联合氟维司群（500 mg）与安慰剂联合氟维司群的影响。在abemaciclib组中观察到的中位PFS为16.4个月，而安慰剂组为9.3个月。在可测量疾病患者中，abemaciclib组的ORR为48.1%，安慰剂组为21.3%。与安慰剂组相比，腹泻、中性粒细胞减少症、疲乏和恶心是abemaciclib组中最常见的不良反应。中性粒细胞减少症、白细胞减少症和腹泻是abemaciclib组最常报告的3级或4级不良事件。Abemaciclib正在MONARCH 3 III期研究中进行测试，该研究正在招募既往未接受过任何全身治疗的HR+/HER2晚期乳腺癌绝经后患者。共计493例绝经后女性被随机分配接受abemaciclib（150 mg，每日两次，连续给药）+芳香化酶抑制剂（阿那曲唑1 mg或来曲唑2.5 mg，每日一次）或安慰剂+芳香化酶抑制剂。MONARCH 3是唯一纳入绝经后患者的研究，而MONARCH 1和MONARCH 2没有描述患者的绝经状态。根据2022年欧洲肿瘤内科学会（ESMO）大会上公布的III期MONARCH 3试验的预定第二次期中分析的最新结果，在芳香化酶抑制剂（NSAI）中加用abemaciclib可使激素受体HR+/HER2-晚期乳腺癌患者的中位总生存期延长12.6个月。经确定，安全性结果与abemaciclib的既往观察结果一致。此外，多项I/II/III/IV期临床试验正在检查abemaciclib联合众多成功乳腺癌疗法的有效性。例如，探索abemaciclib联合芳香化酶抑制剂对HR+/HER2-晚期乳腺癌患者影响的II期临床研究（HERMIONE-7）于2020年1月启动。本试验将评估abemaciclib联合芳香化酶抑制剂在接受高剂量氟维司群预治疗的转移性乳腺癌患者中的临床获益率。预计共有121例患者入组研究（NCT04227327）。2021年2月，启动了一项新的临床研究阶段，以研究氟维司群联合abemaciclib联合或不联合氟维司群治疗ER+和Her2-转移性乳腺癌的影响。本试验的目的是确定将abemaciclib给药延迟一个月是否比从开始使用氟维司群和abemaciclib治疗既往治疗后进展的ER+/HER2-乳腺癌更成功（NCT05305924）。2022年4月，宣布了一项IV期临床研究，探索abemaciclib联合内分泌治疗在激素受体阳性HER2局部进展或转移性乳腺癌中的获益，重点是副作用控制（MINERVA，NCT05362760）。本研究旨在评价abemaciclib联合芳香化酶抑制剂或氟维司群作为一线治疗在绝经前和绝经后转移性HER2 +/HER2-乳腺癌患者中的安全性、疗效和生活质量。其他多项使用abemaciclib的临床试验也正在进行中。这些试验的详细信息见表4。表4.正在进行的Abemaciclib 单药或联合治疗晚期临床试验列表2.12.6.trilaciclib治疗乳腺癌的临床开发Trilaciclib 是最新的第三代 CDK 4/6 抑制剂，最近在美国获批用于治疗小细胞肺癌患者，以减少化疗带来的骨髓抑制。根据 trilaciclib 开发者 G1 Therapeutics 的新闻稿，FDA已授予 trilaciclib 快速通道资格认定，与化疗联用治疗局部晚期或转移性 TNBC 患者（新闻发布）。G1 Therapeutics,Inc.（2021年07月19日）。快速通道是 FDA 设计的一个流程，旨在促进药物的开发和加快审查，以治疗严重疾病并填补未满足的医疗需求。尽管已报告 trilaciclib 是一种基于细胞的CDK 44/6 的非常强效、选择性和可逆性抑制剂，但目前仅有少数临床试验正在研究其治疗 TNBC 的疗效。例如，在一项随机 II 期研究中，在吉西他滨和卡铂给药前静脉给予trilaciclib，并在 TNBC 患者中与单独化疗进行比较。本研究的目的是在102例既往接受过不超过2个疗程化疗的TNBC 患者中研究 trilaciclib 的骨髓保护作用。第1组在第1天和第8天给予 1000 mg/m2 吉西他滨和卡铂，第2组在第1天和第8天给予吉西他滨和卡铂以及240 mg/m2 trilaciclib，第3组在第2天和第9天给予吉西他滨和卡铂，第1、2、8和9天给予trilaciclib，21天为一个周期。记录的骨髓抑制水平无明显差异。尽管 OS 不是研究的主要终点，但结果具有显著性，第1组的 OS 为12.6个月，第2组为20.1个月，第3组为17.8个月。贫血、血小板减少症和中性粒细胞减少症是研究期间观察到的最常见副作用。鉴于这些发现，目前正在开展多项随机 II/III 期研究。例如，正在进行一项 III 期、多中心、随机、双盲、安慰剂对照研究，在接受首次或第二次治疗的局部晚期、不可切除或转移性 TNBC 患者中比较在吉西他滨和卡铂给药前给予 trilaciclib 与安慰剂的安全性和有效性 (PRESERVE 2，NCT04799249)。目前正在进行另一项 II 期、多中心、开放性、单臂研究，以评估在既往接受过至少2种治疗（其中至少1种治疗为转移性疾病）的不可切除、局部晚期或转移性 TNBC 患者中，在 sacituzumab govitecan-hziy 给药前给予trilaciclib 的安全性和疗效 (NCT05113966)。此外，正在启动一项 II 期临床研究，以评估 trilaciclib 联合标准治疗在早期 TNBC 新辅助治疗背景下的作用机制以及安全性和有效性 (NCT05112536)。关于使用 trilaciclib 治疗晚期乳腺癌的最新正在进行的临床试验的更多详细信息见表5。表5.正在进行的Trilaciclib 单药或联合治疗的晚期临床试验列表2.12.7.未来展望和结论在过去的几十年中，CDKI研发领域见证了晚期癌症疗法方面的兴奋和乐观的一面，增长迅速，由此产生了一批具有多种抑制靶点的市售药物，对多种癌症具有多样化的抑制靶点。这篇综述只涵盖了经过相当多研究和临床评价的 CDKIs 的一个部分，其他大量 CDKIs 现在正在开发中。尽管早期开发的CDKIs（第一代和第二代抑制剂）在临床前和一定程度上在临床研究中表现出了显着的抗肿瘤疗效，但由于其特异性低、副作用严重，这些抑制剂用于癌症患者的治疗在临床方面并没有受到太多的关注。现在正在这方面进行一些临床试验，以确定联合治疗和优化这些第1代和第2代 CDKI 是否会产生任何有希望的结果。与第一代和第二代 CDKI 相比，开发第三代CDKI（palbociclib、ribociclib、abemaciclib和trilaciclib）取得了很大进展。临床前和临床结果表明，这些选择性 CDK 4/6抑制剂可减少多种恶性肿瘤的进展，在乳腺癌中具有突出的活性。为此，这4种 CDK 4/6 抑制剂中有3种获得FDA 批准，1种处于晚期乳腺癌治疗的快速通道资格认定。乳腺癌晚期临床研究的临床数据目前表明，作为单药治疗的疗效，以及在内分泌/化疗的基础上加用 CDK 4/6 抑制剂治疗晚期乳腺癌的获益。然而，这些药物联合内分泌/化疗的结果似乎更有前景。这些抑制剂进一步开发方式的主要障碍是一致的毒性信号、缺乏预测性生物标志物和耐药性。在这方面，正在进行多次尝试。进一步深入研究降低相关毒性、探索预测的生物标志物和确定 CDK 4/6 抑制的原发性或继发性耐药机制，可能为这些抑制剂的治疗应用提供创新的生物医学依据。内容来源：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1044579X22002607#fig0005声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

感谢关注转发，欢迎学术交流请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程糖原合酶激酶3（GSK-3）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，作为多种细胞功能的重要调节剂，与阿尔茨海默病、情绪障碍、2型糖尿病和癌症等各种疾病相关。有大量证据表明，中枢神经系统中的GSK-3β在与阿尔茨海默病相关的神经元纤维缠结中发现的异常、过度磷酸化、微管相关tau蛋白的产生中发挥重要作用。BMS公司评估了一系列含有基于嘧啶的铰链结合杂环的类似物，从而鉴定具有优异激酶选择性的高效GSK-3抑制剂。其中，化合物34和40具有较好的口服生物利用度和脑渗透性GSK-3抑制剂，可有效降低磷酸化3xTg-AD转基因小鼠的水平。阿尔茨海默病的两个主要组织病理学标志是细胞外β淀粉样蛋白（Aβ）斑块的形成和tau蛋白过度磷酸化引起的细胞内神经原纤维缠结（NFT）的积累。β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块的积累和神经原纤维缠结被认为是导致神经元死亡和脑组织损伤的潜在因素。发现和开发阿尔茨海默病的有效治疗方法是未满足的重大医疗需求。图1. 嘧啶类GSK-3β抑制剂分子设计及优化过程GSK-3是脯氨酸介导的丝氨酸/苏氨酸激酶，广泛分布于全身。但其在静息、未受刺激的细胞中具有持续活性。目前已经鉴定出两种GSK-3的异构体：GSK-3α（51kDa）和GSK-3β（47kDa），在全长蛋白中有84%氨基酸序列一致，在催化结构域有98%氨基酸序列一致。GSK-3之间的主要结构差异位于GSK-3α的N端区域富含Gly的片段。GSK-3α受Tyr279（激活）和Ser9（抑制）的磷酸化调节。GSK-3α和GSK-3β在组织中广泛表达，并在大脑中大量存在。GSK-3β是在大脑大多数区域中发现的主要亚型。GSK-3调节多种细胞过程，如代谢、增殖、细胞存活、基因转录、翻译和细胞骨架。还充当众多信号传导途径的下游调节开关，包括细胞对Wnt信号传导、胰岛素信号传导途径等。GSK-3通过β-连环蛋白的磷酸化作为Wnt信号通路的抑制剂来控制细胞分化和增殖。关于GSK-3抑制以及由此引起的细胞内β-连环蛋白的增加是否导致原癌效应的不确定性一直是GSK-3抑制剂疗法的问题。然而，最近的研究表明，抑制GSK-3β来调节关键神经元分子靶点的潜在治疗窗口可以实现，同时可以避免基于机制引起的β-连环蛋白驱动的效应。微管相关蛋白tau蛋白主要存在于神经元中，在神经元中它充当微管骨架的稳定蛋白。多个丝氨酸和苏氨酸残基被GSK-3磷酸化。GSK-3β多度激活导致的tau蛋白过度磷酸化已被证明会出现与阿尔茨海默症相关的表位，导致tau蛋白从微管分离并丧失tau蛋白的微管稳定性。这回导致神经元细胞骨架不稳定，并对细胞内结构产生有害影响。过度磷酸化的tau蛋白组装形成成对的螺旋片段，随后聚集导致细胞内NFT的形成，这是阿尔茨海默症的特征之一。支持GSK-3在阿尔茨海默症作用的其它证据包括GSK-3在阿尔茨海默症的细胞质中积聚，使神经元缠结，其在阿尔茨海默症脑内的分布于神经原纤维变化的发展顺序一致。粒血管变性神经元也含有活性GSK-3β，这说明它参与了神经变性。锂是一种广泛用于治疗双相情感障碍的药物，也是一种GSK-3β抑制剂，在动物研究中已显示可降低tau磷酸化。对过度表达突变3xTg-AD转基因小鼠使用氯化锂，导致阿尔茨海默症中已知过度磷酸化位点的tau磷酸化水平显著降低。在另一项研究中，当产生高磷酸化tau蛋白水平的3xTg-AD转基因小鼠用氯化锂处理1个月时，观察到体内tau磷酸化的减少。GSK-3抑制可能提供潜在的治疗阿尔茨海默症的方法。目前报道了多种不同的化学结构类型的小分子GSK-3抑制剂，如马来酰亚胺、苯并呋喃、2-氨基吡嗪、4-嘧啶酮、4-吡啶酮和吲唑等母核结构属于作为治疗阿尔茨海默症的GSK-3抑制剂结构类型。最近，借助结构设计和PET成像，发现了一系列高效、选择性、脑渗透性恶唑-4-甲酰胺GSK-3β抑制剂。还发现该系列中的铅放射性标记类似物可能适合作为GSK-3的PET成像剂。图2中显示了在啮齿类动物中测试了四种GSK-3抑制剂。芳基马来酰亚胺1、吡唑2和苯并呋喃3发现可显著减少啮齿类动物的tau磷酸化。此外，据报道，化合物3可以改善3xTg-AD转基因小鼠记忆和认知功能。Tideglusib（4）是一种非ATP竞争性GSK-3抑制剂，已经完成阿尔茨海默症临床II期研究。图2. 部分代表性GSK-3抑制剂BMS公司内部筛选化合物过程中确定了吡咯并吡啶酮结构，旨在提高激酶选择性的SAR发现了一类以异烟酰胺为代表的GSK-3抑制剂（如图3所示）。该类化合物的共晶结构表明，吡啶酰胺片段与GSK-3β铰链区的氢键相互作用。异酰胺5对GSK-3表现出优异的激酶选择性，对化合物5在3xTg-AD转基因小鼠模型中发现，口服给药10mg/kg和30mg/kg可显著降低tau磷酸化水平。然而，此类化合物在小鼠体内的清除率很高，主要是由于环丙基甲酰胺基团易于水解。因此，用吡啶-2-氨基取代环丙基甲酰胺，以化合物6为代表，其中吡啶氮模拟羰基氧。与化合物5相比，化合物6的效力有所提高，表现出高激酶选择性，并在10mg/kg和30mg/kg剂量下显著降低tau磷酸化。图3. 化学结构演变到嘧啶胺类结构的过程然而，吡啶基的氮需要靠近异烟酰胺核心位点连接的芳烃环，这一要求限制了化合物5中环丙基甲酰胺的替换取代基范围，如图4用对氯苯胺取代5-氯吡啶-2-氨基导致效力降低14倍（比较化合物8和9）。与化合物9相比，化合物8的效力提高可能是由于5-氯吡啶-2-氨基中的N和酰胺NH之间可能直接或水介导形成分子内氢键，分子有利于生物活性构象。为了扩大围绕环丙基甲酰胺取代的SAR范围，BMS公司集中研究基于嘧啶基铰链结合杂环的化合物7一系列化合物。假设化合物7中的酰胺相对于嘧啶环更倾向于平面构象是最佳GSK-3β的首选构象，这种构象在酰胺和临近的嘧啶氮之间形成有利的偶极排列或潜在的内部氢键作用。BMS公司基于化合物7代表嘧啶类GSK-3抑制剂的SAR和体内药效评价。图4.比较化合物8和9的GSK-3β抑制活性在GSK-3β/α竞争测定中用荧光标记的小分子在其Kd下测量每种化合物的效力，以确定GSK-3β/α的IC50值。在酶学实验测定中通常观察到中等水平亚型选择性，并不认为具有真正的亚型选择性（如表1所示）。化合物14和15在吡啶环和嘧啶环的2位没有取代基，其GSK-3β的IC50大于2000nM。当吡啶基被4,4-二氟哌啶-1-基取代时，化合物16效力发生显著改善，GSK-3β的IC50为260nM。由于该胺与激酶铰链区中的Val135残基之间形成氢键相互作用，在嘧啶的2位引入胺导致效力提高9倍（化合物17 vs 16为30nM vs 260nM）。当化合物17中嘧啶2位的胺基被苯胺取代时，抑制活性显著提高了150倍，这可能是由于苯基增加了与蛋白质侧链的疏水作用。化合物18的GSK-3β的IC50提高至0.20nM。表1改造的化合物GSK-3β和GSK-3α亚型之间的效力小于2倍。接下来通过改变嘧啶2位和吡啶4位的取代基进一步探索SAR，以优化效力和体外代谢稳定性（如表2所示）。该系列基于嘧啶的GSK-3抑制剂具有高抑制活性，其中化合物35抑制活性最佳，GSK-3β的IC50为0.07nM。发现苯胺对位引入取代基具有良好的耐受性（如化合物26、27、29、33），间位氟和氯取代也具有良好的耐受性（如化合物28和29）。相反，在某些情况下，苯胺邻位引入取代基抑制活性降低8倍和25倍（如化合物31 vs 29和化合物38 vs 33）。用吡啶替换苯胺也可以耐受（如化合物47和48）。与表1显示的结果类似，表2中化合物的GSK-3β和GSK-3α亚型之间的效力通常相差3倍以内。在细胞水平测试中，用tau蛋白瞬时转染的U2OS细胞在高内涵成像测试GSK-3抑制剂调节S396氨基酸的tau磷酸化的能力（结果如表2所示）。此类化合物在GSK-3抑制剂细胞水平测试中非常有效。许多化合物的pTau IC50值低于两位数纳摩范围内，其中化合物32、33、34、35和43最有效，pTau IC50值约为10nM或更低。含有2位被苯胺取代的嘧啶和吡啶铰链结合杂环的两对类似物的GSK-3β 的IC50值比较如表3所示。结果发现嘧啶29比吡啶9强25倍（GSK-3β 的IC50分别为0.49nM vs 13nM），嘧啶43比吡啶49强70倍（GSK-3β 的IC50分别为0.28nM vs 20nM）。为了更好地了解基于嘧啶的铰链结合杂环与基于吡啶的铰链结合化合物相比的改进效率，进行扭转扫描以探测芳基铰链结合基团和酰胺键之间的键旋转能量分布。图5所示的吡啶（50）和嘧啶（51）能量最小化模型结构，扭转被限制在-150°至180°之间。溶剂化相中扭转扫描的相对能量分布（kcal/mol）如图5所示。吡啶铰链结合物（50）的结果表明，平面构象（扭转=0°和180°）在约1kcal/mol之内，而嘧啶铰链结合化合物（51）结果表明，180°旋转异构体（生物活性构象）是扫描中观察到的最低能量构象，比0°旋转异构体优选约5 kcal/mol。在生物活性构象中，酰胺NH位于嘧啶的N3氮的孤对电子附近，导致偶极-偶极相互作用。因此，嘧啶类结构偏向于生物活性构象，而吡啶除了生物活性构象外，还可以采样其它的低能构象。与化合物9和49相比，化合物29和43的酶抑制活性更好，与图5所示的扭转扫描结果一致，这表明嘧啶铰链结合化合物比吡啶类结构更可以增强GSK-3抑制活性。图5. 扭转扫描以探测理论铰链-结合基团和酰胺键（红色标注部分）之间的键的旋转能量分布通过将化合物与人、大鼠和小鼠肝微粒体一起孵育10分钟后测试体外代谢稳定性。化合物与人、大鼠和小鼠肝微粒体孵育10分钟后，代谢稳定性分为高（>75%剩余）、中（50%-75%剩余）、低（<50%剩余）代谢稳定性。在R2有苯基或2,2,2-三氟乙氧基取代的化合物与苯胺上的4-Cl、4-CN、4-CF3、4-OCHF2或4-OCF3取代基配对（如化合物29、33、41、44或46）具有中到高代谢稳定性，而未取代苯胺或4-Me或4-OMe取代苯胺的化合物（如22、26或27）降低整体代谢稳定性。苯胺邻位或间位的氯取代对代谢稳定性没有显著影响，而邻位甲基取代导致代谢稳定性适度降低。化合物18在R2为4,4-二氟哌啶基取代，体外代谢稳定性较差。当与代谢稳定的苯胺如4-CN或4-CF3组合时，R2处具有2,2,2-三氟乙氧基取代类似物显示出良好的代谢稳定性。化合物33与GSK-3β催化结构域的共晶结构如图6所示。蛋白质结晶为二聚体，并在每个结合口袋中观察到配体的类似相互作用。嘧啶的SP2氮与嘧啶2位的苯胺NH和GSK-3β催化结构域铰链区的Val135形成氢键。吡啶环氮与Lys85形成氢键。在酰胺羰基和Asp200的主链NH之间也观察到水介导的氢键。苯基占据核糖结合口袋，苯胺与蛋白质侧链形成疏水相互作用。与蛋白质的这些额外的疏水性接触导致效力显著改善。图6B描绘了化合物33与GSK-3β的ATP结合位点结合模式。图6. 化合物33与GSK-3β激酶结构域的X-ray共晶结构（PDB ID:8FF8）由412种激酶（Ambit/DiscoverX/Eurofins）对化合物进行广泛的激酶选择性分析评估。以1μM浓度测定71种化合物结果如图7所示。用吡啶基4位上的苯基替换4,4-二氟哌啶导致总体激酶选择性显著改善（比较化合物18和29）。其中，化合物30和45也具有优异的激酶选择性。除GSK-3β外唯一显示出显著活性的激酶是GSK-3α。化合物34和36的选择性略低于上述三种化合物，仍具有良好的激酶选择性。GSK-3和CDK是CMGC激酶家族的成员，GSK-3与CDK2（与GSK-3最相似的激酶）共有33%氨基酸序列一致。还通过较小的内部25种激酶（包括CDK2和CDK5）测量上述化合物的IC50值，以评估其选择性。化合物34对CDK2（620倍，IC50=0.22μM）和CDK5（3600倍，IC50=1.3μM）具有高度选择性。PIM1是这种组唯一的其它类型激酶，其中化合物34的IC50=0.72μM。化合物40（未在 Ambit/DiscoverX/Eurofins 激酶组中测试）还对CDK2（840倍，IC50=0.47μM）和CDK5（1200倍，IC50=0.68μM）表现出优异的选择性，并且PIM1的IC50值为1.4μM。34的IC50值为该组中其余激酶中的 40 种均>2.0μM。总体上，在吡啶基的4位如化合物29、30、34、36、40和45处具有芳基的化合物对脱靶激酶具有优异的选择性。图7. 化合物18、29、30、34、36和45的激酶选择性分析图PAMPA实验中评估化合物的被动渗透性。结果发现，化合物29、30、34、40和45具有较好的渗透性，并且所有化合物具有高度的膜渗透性（表4所示），且不是P-gp底物。其中，化合物34具有最高的渗透性、化合物40具有良好的渗透性，其余三个化合物渗透性稍低，但在可接受的范围内。BMS公司测试了所选化合物的血浆蛋白结合情况，发现这些化合物由于其亲脂性在人、大鼠和小鼠中均表现出高血浆蛋白结合。化合物34和40在小鼠脑组织匀浆中具有较低的未结合部分，这类化合物的tPSA约为100 Å2或更小。计算表中所示化合物的中枢神经系统（CNS）多参数优化（MPO）评分，其中考虑六种理化性质（pH7.4时的clogP、clogD、分子量、tPSA、HBD数量和pKa）CNS MPO分数范围为3.3至3.7，处于适合中枢神经系统候选药物范围的下限（≥4为理想）。然而，当体内实验结束时测量化合物34和40的脑和血浆暴露量时，确定34和40的脑血浆比分别为0.9和1.0。由于该系列化合物的亲脂性，它们的水溶性较低。水溶性在pH1.0和pH7.4下测定 化合物34水中溶解度分别为0.016和<0.001mg/mL，在pH1.0和pH7.4下测定化合物40水中溶解度分别为0.031和0.001mg/mL。药代动力学研究在雄性C57BL6小鼠中用化合物30、34和40进行药代动力学研究。化合物通过静脉注射2 mg/kg和口服10 mg/kg给药，药代动力学指标如表5所示。当静脉给药时，所有三种化合物均表现出低中度清除率，并且具有较长的半衰期为2.5h至2.9h。这些化合物的Vss超过体内总水体积。当以口服给药时，化合物34和40吸收良好。两种化合物的暴露量都很高，且易于口服（F%分别为100%和53%）。与化合物34和40相比，化合物30的暴露量和口服生物利用度较低，可能是用于该化合物Caco-2测定中渗透性较低。抑制Tau磷酸化使用LaFerla 3xTg-C57BL6小鼠对化合物34和40进行了评估。这些小鼠可以产生高水平的过度磷酸化Tau蛋白，并出现与年龄相关的进行性板块和缠结病理学，这是阿尔茨海默症的已知特征。使用氯化锂作为阳性对照，给药剂量为250mg/kg（腹腔注射给药）。在两个独立实验中，当以10mg/kg的剂量口服纳米混悬剂给药，化合物34和40分别是pTau396降低33%和37%（如图8所示）。实验结束时（5小时），测量末端血浆和脑暴露量，化合物34在血浆和脑暴露量分别为410±150nM和370±80nM，平均脑与血浆全药浓度比值为0.9。化合物40在血浆和脑暴露量分别为180±50nM和180±70nM，平均脑与血浆比为1.0。根据测量的小鼠中未结合的脑和血浆分数（表4），确定34和40的Kp, uu值是相等的。两个化合物的Kp, uu计算值均为0.4。图8. 3xTg-阿尔茨海默症转基因小鼠体内药效结论BMS公司发现了一系列高效的基于嘧啶的GSK-3抑制剂。扭转扫描探测铰链结合嘧啶和酰胺之间键的旋转能量分布表明生物活性构象本质上是有利的。PAMPA和Caco-2测定结果表明这些化合物具有很高的跨膜渗透性。412种激酶的激酶选择性评估表明，吡啶环4位上带有苯基的类似物表现出优异的激酶选择性（化合物29、30、34和45）。化合物34和40也对内部激酶组中的CDK2和CDK5显示出优异的选择性，且两个化合物在小鼠药代动力学研究中具有高暴露量和优异的口服生物利用度。化合物34和40体内研究表明，这些化合物是脑渗透性GSK3抑制剂，可显著降低3xTg-AD转基因小鼠中的tau磷酸化。说明此类GSK-3抑制剂具有成为阿尔茨海默氏病的潜力治疗手段。文章来源doi: 10.1021/acs.jmedchem.3c00364.请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程1.药渡CyberSAR结合药物设计思想，挖掘了文献及专利报道的活性的结构，通过CyberSAR以方便快速获得研发人员兴趣靶向结构，以供开拓思路，就GSK-3β抑制剂举例如下：2.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“聚类结构视图”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献和专利具有关于GSK-3β相关实验测试活性的分子以“母核结构聚类 “的形式展示。其中绿色字体高亮的”为文献报道的体外酶、细胞活性测试实验中IC50<100nM的活性分子结构、具体实验、实验结果及实验来源。3.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“原始结构视图”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献具有关于GSK-3β相关实验测试活性的分子以“研发阶段时光轴“的形式展示。4.点击研发进展阶段早期发现（1146个）下面的绿色字体“数据挖掘（1078个）”，可以查看所有早期发现阶段有GSK-3β抑制活性的分子结构。登录方式CyberSAR在电脑浏览器端登录网址：https://data.pharmacodia.com/cybersar/，欢迎猛烈试用。请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程如需进一步沟通，请扫码添加微信联系药渡赵博士或药渡CyberSAR沟通群。

感谢关注转发，欢迎学术交流请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程糖原合成酶激酶-3 （GSK-3）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，调节多种细胞过程并与多种疾病相关。其中，GSK-3β（GSK-3的异构体之一）与阿尔茨海默病相关的神经原纤维缠结的形成有关，这主要是由于Tau蛋白的过度磷酸化导致。本文描述了一系列作为GSK-3β抑制剂的咪唑[1,2-b]哒嗪类衍生物的设计和合成，并指明构效关系。此外，体内研究进一步表明，化合物47具有脑渗透性，口服利用度较高，并将显著降低磷酸化Tau蛋白的水平，这为阿尔兹海默症的治疗提供了新思路。GSK-3在组织中普遍表达，在中枢神经系统（CNS）呈现高表达，分为GSK-3α（51kDa）和GSK-3β（47kDa）两种异构体，二者在催化区域上的同源性高达98%。研究发现，GSK-3β以主要亚型存在于CNS的大多区域。GSK-3β过度激活，一方面将导致tau蛋白的过度磷酸化，进一步导致细胞内神经元纤维缠结（NFTs）的聚集以及β淀粉样蛋白（Aβ）的增加，另一方面，也可能促进β、γ分泌酶活性，导致Aβ肽的累积，从而促进Aβ斑块形成。而Aβ与NFT被认为是阿尔茨海默病等神经退行性疾病的潜在致病原因。由此可见，GSK-3抑制剂具有作为阿尔茨海默病治疗药物的潜力。现阶段被评估用作阿尔茨海默病治疗的GSK-3β抑制剂如图1所示。Tideglusib1是一种非ATP竞争性GSK-3抑制剂，已完成阿尔茨海默病的II期研究。对应地，芳基马来酰亚胺2（SB-216763）则作为一种ATP竞争性GSK-3抑制剂。苯并呋喃化合物3具有脑渗透性，吡唑4具有口服性，化合物5（UDA-680）在小鼠体内的研究表明，它具有显著抑制tau磷酸化的母体结构，氨基吡啶6对激酶表现出良好的选择性。BMS公司首先针对以上发现，系统地探索了相应母核周围的化学空间，在此基础应用构效关系（SAR）研究发现了基于异烟碱酰胺的GSK-3β抑制剂7，不仅表现出良好的激酶选择性，并且具有较好的口服生物利用度。随后展开了一系列基于化合物7的衍生物研究（如化合物8）。图1.代表性GSK-3β抑制剂环丙基羧酰胺部分是该化学型中最受青睐的酰胺之一，具有平衡效力和代谢稳定性的作用。然而，当7的类似物8在小鼠血清中37℃孵育时，在3小时内观察到环丙基羧酰胺基团24%的裂解，在人血清中也检测到微量的裂解。此外，由于一份报告表明，如果环丙羧酸在体内从母体化合物中释放出来，可能会产生特异性毒性，因此是否能够使用其他酰胺或替代基团取代异烟酰胺化学型中的环丙基羧胺部分成为研究新方向。BMS公司在SAR研究与X射线共晶分析时发现：环丙基羧酰胺羰基和上层酰胺NH之间形成的水桥氢键，可能使分子在能量上倾向于生物活性构象，也就是说，环丙基羧酰胺具有平衡效力和代谢稳定性的作用。据此，BMS公司设想将下层酰胺以杂环回接（图2B中红色虚线表示），其中氮取代羰基氧，通过形成更倾向于生物活性构象的内部氢键（图2B中蓝色虚线表示）以及更有利的偶极子排列（图2B蓝色箭头所示）得到新型咪唑[1,2-b]哒嗪环体系，以此作为研发GSK-3β抑制剂的一个有吸引力的杂环支架，见图3。图2.（A）通过分子模拟程序添加氢后，GSK-3β（PDB ID: 8DJD）激酶结构域9的X射线共晶结构。配体以棒状模型表示，绿色的碳原子和黑色虚线表示的氢键。与配体形成氢键的氨基酸残基显示为棒状。在环丙酰胺羰基和酰胺NH之间观察到一个水桥氢键。（B）咪唑[1,2- B]哒嗪基GSK-3β抑制剂支架的原理。红色虚线表示建议的回接以形成一个五元环。蓝色虚线表示内部氢键。所需的酰胺构象与相邻的咪唑[1,2-b]吡啶环系统具有良好的偶极子排列，如蓝色箭头所示。图3.咪唑[1,2-b]哒嗪类GSK-3β抑制剂设计方案构效关系与X射线晶体研究在1型咪唑[1,2-b]哒嗪嘧啶系列中，对吡啶环4位的SAR进行了研究，结果见表1。化合物19对GSK-3β酶的IC50值为220nM。当吡啶在4位上被甲基取代时，效价提高了3.5倍（20），当甲基被异丙醚取代时，效价又提高了10倍（比较21和20）。含有苯基（22）或六元环杂环（23-24）的类似物的效价与化合物21相似。4,4-二氟哌啶基类似物（25）是该组中最有效的类似物（GSK-3β IC50=0.87nM）。总的来说，表1所示化合物对GSK-3β和GSK-3α的效价相差在3倍以内。表3.GSK-3β和GSK-3α对化合物53-57的抑制活性a除非另有说明，数值是两个测定值的平均值。b值是至少三次测定的平均值±SD。化合物22结合在GSK-3β催化结构域的X射线共晶结构如图4所示。蛋白质结晶为二聚体，在每个结合口袋中具有相似的配体相互作用。咪唑[1,2-b]哒嗪吡啶六元环的sp2氮和环丙基甲基胺取代基的氨基在GSK-3β催化结构域的铰链区与Val135（分别为2.5和2.1Å）形成氢键。吡啶部分的sp2氮与Lys85胺形成氢键（1.9Å）。酰胺羰基与Asp200的主链NH之间存在水介导的氢键。苯基占据了核糖结合位点，分子的这个区域提供了一种优化这种化学型效力的方法，因为它与蛋白质有良好的范德华接触。与表1中的化合物19和20相比，类似物21-25的效力有所提高，这可归因于吡啶环上4位取代基与核糖体结合位点上蛋白质的良好相互作用。在咪唑[1,2-b]哒嗪吡啶环体系中，酰胺NH与N1氮之间存在内部氢键。图5. 化合物47的S对映体结合在GSK-3β激酶结构域（PDB ID: 8DJC）的X射线共晶结构。（A）配体以绿色碳原子的棒状模型表示，氢键以黑色虚线表示。与配体相互作用的残基显示为棒状。2-甲基吗啉基团占据了核糖结合位点。（B）与GSK-3β的ATP结合位点结合的S -对映体47蛋白的表面表示。在2型咪唑[1,2-b]哒嗪吡啶环体系的2位与苯基或环丙基取代基结合，探索吡啶环4位的SAR，结果如表2和表3所示。对亲本无取代吡啶基类似物19和36的比较表明，后者的效价是19的11倍（GSK-3β IC50分别为20nM和220nM）。BMS公司发现该系列中R1处的苯基取代类似物的效力比表1中相应的类似物高5-20倍（分别比较37、38、45和47与20、21、23和24）。在吡啶环的4位加入一个甲基（37）得到一个GSK-3β IC50值为3.5nM的化合物。中等较大基团（38-40）的化合物的GSK-3β IC50值为~1nM或更低。在R2（41和42）处含有苯基的类似物被证明是有效的（GSK-3β IC50分别=3.6和1.6nM）。此外，六元杂环取代苯基提供了更高效的化合物，大多数GSK-3β IC50值在亚纳摩尔范围内（43-47）。用手性色谱法将化合物47分离成对映体后，结果表明(S)-47的效价比(R)-47高6倍。在R1的苯基环上加成一个邻甲氧基或对三氟甲氧基取代基是可行的（比较48和49至47以及比较50至45）。还研究了吡啶在R3和R4上的取代。在R3上有甲氧基的类似物比未取代的吡啶类似物的效力低近2倍（比较51和36）。在R4处的氯取代导致效力降低35倍（对比52和44）。表2所示化合物对GSK-3β和GSK-3α具有选择性，其效价差异在3-4倍之内。表2.化合物36-52对GSK-3β和GSK-3α抑制活性a除非另有说明，数值是两个测定值的平均值。b值是至少三次测定的平均值±SD。c值是单次判断的结果。相应地，咪唑[1,2-b]哒嗪吡啶的2位苯基被环丙基取代后，类似物的效力通常与在该位置具有苯基的相应化合物相当（分别比较54和55与44和42），见表3。化合物53的效力略低于47。化合物53和54的效价与表1中相应的类似物相当（分别为24和25），尽管在铰链区域失去了一个与Val135的经典氢键。然而，当去除咪唑[1,2-b]吡啶的2位苯基时（分别比较56和57与47和44），由于苯基失去了与蛋白质邻近氨基酸残基的疏水接触，观察到效力降低了10倍。表3.化合物53-57对GSK-3β和GSK-3α的抑制活性a除非另有说明，数值是两个测定值的平均值。b值是至少三次测定的平均值±SD。化合物47结合在GSK-3β催化位点的X射线共晶结构如图5所示。化合物47的S-对映体与蛋白质的配合作用更强。重要的氢键相互作用的细节如图5A所示。在咪唑[1,2-b]哒嗪的，并与蛋白质进行有利的疏水相互作用，从而增强其效力。在咪唑[1,2-b]哒嗪吡啶环体系中，酰胺NH与N1氮之间存在一个内部氢键。图5.化合物47的S对映体结合在GSK-3β激酶结构域（PDB ID: 8DJC）的X射线共晶结构（A）配体以绿色碳原子的棒状模型表示，氢键以黑色虚线表示。与配体相互作用的残基显示为棒状。2-甲基吗啉基团占据了核糖结合位点。（B）与GSK-3β的ATP结合位点结合的S-对映体47蛋白的表面表示。化合物在细胞试验中进行测试，其中GSK-3β抑制剂在短暂转染Tau蛋白的U2OS细胞中通过高含量成像试验测量其调节Tau蛋白S396磷酸化的能力。化合物25、38、41、44、45、47、(S)-47、(R)-47、48、49、53和54的实验结果见表4。结论如下：（1）在本实验中测试的化合物的pTau IC50值遵循GSK-3β酶实验中观察到的相同趋势；（2）在R2上含有4,4-二氟哌啶或吗啉的化合物在pTau测定中是最有效的（44、45和47）；（3）化合物41（R2=Ph）在R2（例如，45和47）时的效力比含啉基团的类似物低15-20倍；（4）化合物42在pTau测定中的效价无法确定，可能是由于在测定条件下溶解度差；（5）化合物(S)-47是该组中最有效的化合物。表4.咪唑类[1,2-b]哒嗪类GSK-3β抑制剂的pTau抑制活性a值是两个决定的平均数。b值是至少三次测定±SD的平均值。c值是单次测定的结果。体外分析-激酶选择性评估用412种激酶pp (Ambit/DiscoverX/Eurofins)对化合物进行广泛的激酶选择性筛选。单点检测板，设对照组，化合物浓度为1μM，结果如图6所示。对化合物44、45和47的激酶选择性谱的比较表明，与44和45相比，47有提高激酶选择性的趋势。GSK-3和CDKs是CMGC激酶家族的成员。而化合物47对与GSK-3最相似的激酶CDK2（IC50=1.4μM）的选择性超过1900倍，对CDK5（IC50=6.4μM）的选择性超过8700倍。图6.化合物44、45和47的边界径向图每条线表示在1μM测试化合物存在下单个激酶的剩余活性。单个激酶被分成不同的家族，用不同的线条颜色表示。从中心开始，圆圈表示控制绑定剩余的83%、33%和0%。SI33是在1μM的测试化合物存在下，具有≤33%对照结合的激酶的百分比。对于44、45和47,SI33分别= 5.3、5.8和4.1。化合物41、42、44、45、47和53的其他体外分析数据见表5。通过在人和小鼠肝微粒体中共温孵来评估化合物的代谢稳定性，结果表明41和42具有较高的代谢稳定性（10分钟后母体化合物的残留率>75%），而44、45、47和53具有较低的代谢稳定性（10分钟后母体化合物的残留率<50%）。研究表明，这是由于吡啶-2-甲基吗啉部分在自身发生氧化、开环和脱氢反应的同时，也易被肝微粒体氧化和双氧化。实验未观察到谷胱甘肽（GSH）偶联。然而，值得注意的是，在体外代谢稳定性测定中获得的结果并不一定能预测该化学型在小鼠药代动力学研究中化合物的体内分布。尽管这些化合物的血浆蛋白结合率很高，但化合物41、42和44与小鼠0.2-0.3% 无血浆部分的蛋白也表现出较高的结合。化合物45和47在小鼠血浆中的未结合部分也比44高几倍。特别地，用环丙基（53）取代47中的苯基导致未结合部分的额外增加，这可归因于该化合物的亲脂性降低。化合物53在人和小鼠中无血浆含量分别为1.5%和3.1%。平行人工膜透性试验（PAMPA）用于测定膜间被动透性。表5所示的结果表明，这些化合物具有高渗透性。在Caco-2细胞中也测量了通透性，Caco-2细胞中存在转运蛋白和外排蛋白。化合物45、47和53在Caco-2细胞中表现出高通透性，44也表现出高通透性，但比前三种化合物稍差。从B−A/A−B比值（<1）可以看出，这些化合物不是P-糖蛋白（P-gp）底物（表5）。表5中化合物的cLog P值范围为1.6至3.5，tPSA范围为72至85Å，是穿透血脑屏障的理想范围。化合物45、47和53的配体效率（LE）分别为0.43、0.40和0.42，亲脂配体效率（LLE）分别为6.88、6.14和6.98。在pH 1和pH 7.4、禁食状态模拟肠液（FaSSIF，pH 6.5）和进食状态模拟肠液（FeSSIF，pH 5）的溶解度分别为1.22、0.014、0.021和0.788mg/mL。表5.化合物41、42、44、45、47和53的体外分析数据a人（H）和小鼠（M）肝微粒体代谢稳定性；数值为孵育10分钟后母体残留的百分比。ND=未确定。体内药代动力学研究为了解化合物45、47和53在体内的分布，在雄性C57BL6小鼠中进行了药代动力学研究，结果见表6。当以2mg/kg静脉给药时，化合物45和47的清除率较低（分别为10.6和3.8 mL min-1kg-1）。化合物45的半衰期为3.1h，而化合物47的半衰期较长，为5.2h。化合物45和化合物47的分布体积（Vss）超过了体内总水量。当以10mg/kg的剂量作为溶液口服时，化合物45和47都被很好地吸收，并表现出较高的口服生物利用度（F%=~100和64%）。当静脉给药时，化合物53表现出中等清除率（49.5 mL min-1kg-1），半衰期短，为1.1h。当化合物53口服给药时，暴露量低于45和47，口服生物利用度为37%。化合物45、47和53的体外代谢稳定性和体内药代动力学特征之间的脱节可能归因于这些化合物的高血浆蛋白结合。然而，更高的内在清除率会导致更高的体内清除率，因此血浆蛋白结合的程度在体内化合物的清除率中也起着重要作用，并且可以改变相对于体外代谢稳定性结果上可能预期的药代动力学特征。在小鼠体内研究中，较差的水溶性妨碍了对41、42和44的评价。表6.化合物45、47和53在小鼠体内的药动学参数a静脉注射剂量2mg/kg，载体:40%聚乙二醇（PEG）400/35% 50mM柠檬酸盐（pH 4）/15%羟丙基β环糊精（HP-β-CD）/10%二甲基乙酰胺（DMAC，n=3）。b PO剂量10mg/kg，载体:83.3%聚乙二醇400/14.7% 50mM柠檬酸盐（pH 4）/2%聚维酮（PVP）-K30， (n=3)。抑制Tau磷酸化在上述药代动力学研究的3种化合物中，化合物47在小鼠药代动力学研究中清除率最低。进一步对化合物47在LaFerla 3xTg-C57BL6小鼠的三重转基因小鼠阿尔茨海默病模型中进行了评价。LaFerla 3xTg-C57BL6小鼠过度磷酸化的Tau（pTau）蛋白水平升高，并逐渐形成斑块和缠结，证明阿尔茨海默病造模成功。以剂量为250mg/kg （ip）的氯化锂作为阳性对照组，以30mg/kg（n=6）的剂量口服47作为实验组，实验结果显示化合物47导致pTau396减少52%。这种效果与用氯化锂观察到的还原水平相当，见图7。实验结束时（5h）测量了终端血浆和脑暴露，发现化合物47以3.8± 0.8μM的水平浓度暴露在血浆和1.3±0.4μM的浓度存在于脑中，脑-血浆（B/P）比为0.34。小鼠脑组织匀浆中47的未结合分数（fu,b）为0.9%，与小鼠血浆中未结合分数相当，未结合的脑与未结合的血浆比（Kp,uu）为0.34。图7.三转基因小鼠阿尔茨海默病模型的体内实验结果在LaFerla 3xTg-C57BL6小鼠（n=6）中，以30mg/kg剂量（83.4% PEG 400/14.7% 50mM柠檬酸盐（pH 3）/2% PVP-K30）。以250mg/kg（ip）剂量口服氯化锂作为阳性对照，口服化合物47可使pTau396减少52%。在给药后5h得到结果。数据采用方差分析（ANOVA）和Dunnett事后检验进行分析，**与对照比较P<0.01结论抑制GSK-3β是治疗阿尔茨海默病的一种潜在方法。这篇报道描述了一类新的咪唑[1,2-b]哒嗪基GSK-3β抑制剂，并发现了具有亚纳摩尔GSK-3β酶抑制剂效力的高效类似物。SAR研究结合X射线共晶结构结果表明，只需在激酶的铰链结合区与Val135进行一次经典的氢键相互作用，GSK-3β就能获得优异的效价。在X射线共晶结构中，咪唑[1,2-b]吡啶环体系的酰胺NH与N1氮之间存在内部氢键。这种内部氢键以及有利的偶极相互作用使酰胺有利于生物活性构象。该化学型化合物在PAMPA和Caco-2检测中表现出高通透性。在包含412个激酶的Ambit面板和大约30个激酶的内部面板中筛选选定的化合物表明，具有良好的总体激酶选择性，对CDK2具有出色的选择性。在体内对化合物47进行了评估，发现该化合物在小鼠药代动力学研究中具有较高的口服生物利用度，并在三重转基因小鼠阿尔茨海默病模型中显着降低了tau磷酸化。对47的血浆和脑水平的测量表明，该化合物是一种中等脑渗透GSK-3β抑制剂。总之，本研究结果为进一步优化该类GSK-3β抑制剂化合物的物理化学和药代动力学性质提供了基础。文章来源J. Med. Chem. 2023, 66, 4231−4252请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程1.药渡CyberSAR结合药物设计思想，挖掘了文献及专利报道的活性的结构，通过CyberSAR以方便快速获得研发人员兴趣靶向结构，以供开拓思路，就GSK-3β抑制剂举例如下：2.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“聚类结构视图”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献和专利具有关于GSK-3β相关实验测试活性的分子以“母核结构聚类”的形式展示。其中绿色字体“高亮的”为文献报道的体外酶、细胞活性测试实验中IC50<100nM的活性分子结构、具体实验、实验结果及实验来源。3.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“原始结构视图”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献具有关于GSK-3β相关实验测试活性的分子以“研发阶段时光轴“的形式展示。登录方式CyberSAR在电脑浏览器端登录网址：https://data.pharmacodia.com/cybersar/，欢迎猛烈试用。请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程如需进一步沟通，请扫码添加微信联系药渡赵博士或药渡CyberSAR沟通群。