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深度聚焦类器官与3D培养论坛，OTC2024论坛合作详询：王晨 180 1628 8769●  　  ●    　●目前全球有约4.6亿糖尿病患者，每年有420万人死于糖尿病，我国有近1.3亿糖尿病患者。在 1 型糖尿病中，胰岛β细胞遭到机体免疫系统无情地破坏，部分或完全失去了分泌胰岛素的功能，造成体内胰岛素绝对缺乏，引起了血糖水平持续升高，于是糖尿病出现了。胰岛移植虽可以改善患者的胰岛素不足问题，但是供源不足，临床上无法大规模开展。近年来，蓬勃发展的干细胞技术解决了一部分细胞来源问题，但也存在局限性——胰岛β细胞的转化率低、稳定性差等。因而建立一个稳定高效的胰岛β细胞制备方案很重要。本文综述了细胞起源、生物材料和用于制造人类胰岛类器官的先进技术的最新进展，并讨论了它们的优点、缺点和未来的挑战。作者望这篇综述能为构建人类胰岛类器官提供一个跨学科的视角，并为组织工程和再生医学提供见解。1胰岛β细胞是目标人类胰岛人体的胰岛素来源胰岛，胰岛是许多大小不等和形状不定的细胞团，散布在胰腺的各处。胰岛中的细胞主要由α细胞，β细胞，δ细胞和pp细胞组成。1型糖尿病是由胰岛β细胞受损，导致胰岛素分泌绝对不足造成的。1型糖尿病发病机制胰岛素是机体内唯一可以降低血糖的激素，由胰岛β细胞分泌而来。针对 1 型糖尿病，想要拯救分泌不足的胰岛素，生产源源不断的可分泌胰岛素的 β细胞是目标。类器官类器官（Organoid），最早定义是通过细胞分离和重聚来模拟器官发生。自2009年，荷兰科学家Clevers团队开发小肠类器官以来，类器官的定义变成了由器官特异性细胞组成的三维（3D）结构，其来源于多能干细胞（PSC）或成人干/祖细胞。类器官organoid被描述为“体外微型器官”或某种程度上的“人造器官”，可模拟体内器官景观，展示体内发现的一系列细胞类型，并展示器官功能的某些方面。Organoid技术已经成为一种工具，可弥合细胞和组织/器官水平的生物模型之间的差距，在保留某些生理功能的同时，更真实地描述体内组织的空间组织以及细胞和细胞外环境之间的相互作用。在过去的十年中，胰岛类器官作为一种很有希望的糖尿病模型引起了越来越多的关注，它可以揭示胰岛相关疾病的机制，并且是一个测试药物效力和毒性的良好平台。例如，胰岛类器官可以填补我们有关早期（8周妊娠）和晚期妊娠人类胰腺组织（妊娠22周）的人类胰腺发育知识的空白，有望成为糖尿病治疗中移植的新胰岛资源。2制造人类胰岛类器官的细胞构建胰岛类器官，需要胰腺内分泌细胞。适合构建胰岛类器官的细胞类型，包括：1）人类多能干细胞来源的胰岛细胞；2）通过去分化和再分化在成人胰岛中富集的胰腺内分泌细胞；3）非胰岛谱系细胞（如导管、腺泡细胞和肝细胞）。不同方案制备胰岛类器官，在结构和功能上存在显著差异。同时，辅助细胞（包括内皮细胞和间充质细胞）在胰岛类器官形成过程中有促进作用（图1）。PSC衍生的胰岛细胞系多能干细胞（PSC），包括胚胎干细胞（ESC）和诱导性多能干细胞（iPSC），都是理想的胰岛细胞来源。从PSC获得β细胞是一种很常见的方法，利用PSC衍生的胰岛内分泌细胞制造3D人类胰岛类器官。早在2001年，hESC系H9通过悬浮培养中形成了类胚体的形态。在分化19天后，这些类胚体平均有1–3%的胰岛素阳性细胞和更复杂的结构（如上皮或内皮样细胞结构）。随后，从PSC中提取的胰腺内分泌细胞可以体外培养富集，形成簇状结构。人ESC来源的胰岛素生成细胞也可以自我聚集成胰岛素阳性簇，并通过移植或与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）混合实现血管化。除了PSC衍生的内分泌细胞外，内胚层祖细胞也可能是胰岛类器官生成的一种有希望的资源，这可能会大大缩短体外培养时间并降低经济成本。来自人类胰岛或非胰岛谱系的胰岛内分泌细胞人类胰岛细胞也是胰岛类器官的一种细胞来源。在研究中，人类胰岛被制成单个细胞，并重新聚集成具有标准尺寸的小胰岛类器官，也被称为假胰岛。重新聚集的人类胰岛的形态与天然胰岛相似，可以改善糖尿病小鼠的糖尿病逆转。由于成熟胰岛内分泌细胞的增殖能力有限，替代方案可能是制备大量的胰岛素生成细胞。在这些研究中，通过扩张成人胰腺组织或从胎儿胰腺消化的胰腺祖细胞成功生成了人类胰岛类器官。此外，来自β细胞去分化的内分泌祖细胞可以分化为NGN3阴性、激素阳性的β（胰岛素）、α（胰高血糖素）和δ（生长抑素）类细胞。另一项研究说明了利用仿生支架构建细胞间和细胞-基质连接，以诱导β细胞去分化，从而进行再分化。或者，内胚层来源的分化细胞的反式分化也应用于胰岛类器官的生成，例如肝脏、胃肠道上皮和外分泌胰腺细胞。然而，脱分化和再分化的不同培养效率因情况而异，胰岛的扩增也存在很多争议，这限制了从成人组织中提取胰岛类器官的发展。因此，人们一直致力于寻找具有向内分泌细胞扩张和分化能力的成年胰岛内分泌祖细胞。有报道在成年小鼠胰腺中发现的新的PRORC阳性内分泌祖细胞可以在成年体内平衡期间生成新的内分泌细胞。在体外，这些PROCR阳性的前体细胞可形成以β细胞为主的功能性胰岛类器官，并被α、δ和PP细胞包围。然而，人类胰岛是否包含对应的祖细胞群仍不清楚。与PSC衍生的内分泌细胞相比，利用成人组织中的细胞可以避免移植后形成畸胎瘤的风险，糖尿病患者的胰腺细胞可以成为生成人类胰岛类器官的更自然的来源。胰岛类器官的辅助细胞内皮细胞和间充质细胞等也对胰岛的存活和功能起支持作用。胰岛有丰富的血管供应，为人类胰岛提供充足的氧气、营养供应、微调血糖传感和调节。内皮细胞可以产生多种因子，如结缔组织生长因子、骨形态发生蛋白2（BMP-2）和BMP-4，可增加人ESC衍生的胰腺祖细胞贴壁培养中胰岛素的表达，并介导胰岛特异性成熟。例如，HUVEC或内皮细胞已与人类胰腺祖细胞或内分泌βH1β细胞混合，以促进胰岛类器官的自我聚集、成熟和血管化[35、39、57]。除了外源性添加内皮细胞外，内皮生长因子还可以诱导人胰岛类器官的血管生成。血管生成素-2已被证明在胰岛类器官内诱导VE钙粘蛋白+内皮细胞和NG2+周细胞的广泛传播。此外，血管生成素-2可以部分补充内皮细胞对β细胞的体内旁分泌刺激，通过促进F-肌动蛋白重塑和调节钙离子内流动力学，使人类胰岛类器官具有天然的葡萄糖刺激胰岛素分泌水平。MSC也参与胰岛样类器官的构建，包括自组织、血管网络的构成和旁分泌功能：（a）间充质细胞触发自凝，这种由肌动球蛋白细胞骨架轴产生的牵引力导致细胞群的定向和剧烈运动。（b） 在肌内人胰岛移植模型中，除了触发自凝聚外，间充质细胞还支持内皮细胞相互作用：人胰岛内皮细胞从移植中心迁移到周围组织，与受体内皮细胞形成嵌合血管；（c） 据报道来自骨髓的大鼠间充质细胞通过释放HGF和TGFβ等营养因子，在水凝胶环境中支持包裹的小鼠胰岛，葡萄糖激发后胰岛素分泌增加。3制造人类胰岛类器官的材料人胰岛类器官中的生物材料可以为细胞提供3D结构的支持、细胞外环境（ECM）的模拟以及在移植后的隔离保护。用于人胰岛类器官构建的天然基质天然基质是细胞外基质（ECM）衍生物或类似物，可模拟体内组织或器官的天然ECM。天然基质分为三大类：多糖材料、蛋白质/肽基材料（如胶原蛋白、明胶、弹性蛋白和纤维蛋白）和脱细胞ECM材料。多糖材料多糖材料由于具有快速凝胶特性，适合在体外制造3D支架。1980年，首次将海藻酸钠应用于生物人工内分泌胰腺的胰岛微囊化。海藻酸钠可以保护胰岛细胞在移植后免受炎症反应的影响。海藻酸钠还可以通过包裹来源于PSC的胰腺内分泌祖细胞，用于生成人类胰岛类器官。缺点是海藻酸钠细胞粘附和细胞相互作用能力较低，无法提供细胞存活所需的细胞锚定。2020年，海藻酸钠和壳聚糖组成的胶囊，用于生成人类胰岛类器官。该胶囊具有高度的均一性，通过包封来自iPSC的胰腺内分泌细胞，为人类胰岛类器官提供3D培养。基于多糖材料在体外支持3D支架和模拟ECM生成人类胰岛类器官方面显示出巨大潜力。蛋白质/肽基材料蛋白质/肽基材料由存在于天然ECM中的基质蛋白制成，包括胶原蛋白、明胶、层粘连蛋白、纤维连接蛋白和弹性蛋白。在这些蛋白质中，胶原蛋白是种类最丰富的结构蛋白，已被广泛用于三维干细胞培养。除了为胰岛类器官构建人工3D结构外，基于蛋白质的材料还将增强胰岛类器官的功能和成熟度。如I型胶原和IV型胶原的高表达被证明有助于人类胰腺的发育，I型胶原和IV型胶原的结合将导致培养的人类胰岛中胰岛素基因的表达高于纤维连接蛋白或层粘连蛋白。V型胶原基质的存在促进了人类胰岛类器官的再生和葡萄糖反应性激素的产生。脱细胞ECM材料脱细胞ECM（dECM）材料从脱细胞组织/器官中获得。dECM材料可以更好地模拟体内组织或器官的生态位。体内ECM具有组织特异性成分，包括特异性生长因子和大分子成分，以及机械性能。因此基于dECM的材料不仅可以作为支架，可用于在体外培养中确定特定的细胞命运。脱细胞胰腺ECM基材料成为改善胰岛细胞微环境的合适基质，并促进人PSC向胰岛细胞分化。在胰腺dECM材料上从PSC分化的细胞显示出与天然胰岛相似的细胞组成，并呈现出胰岛标志物表达增加和更多胰岛素分泌以响应葡萄糖刺激。总的来说，dECM的材料为细胞提供了一个近乎自然的微环境，但有几个限制妨碍了它们的临床应用：a）获得dECM凝胶的过程，包括脱细胞、提取和纯化，既耗时又昂贵；b）原材料资源，尤其是生物质资源的批次间可变性；c）几乎不可能控制生物物理性质和生化成分；d）这些凝胶来自可能遭受细胞相容性和病原体传播的生物体。用于人类胰岛类器官构建的合成基质材料用于药物治疗的合成基质材料通常具有生物相容性和无毒性，具有可控性、再现性、降解性和良好的机械性能等优良特性。常见的合成聚合物包括聚乙二醇（PEG）及其衍生物、聚乳酸（PLA）、聚乳酸-乙醇酸（PLGA）、聚乙烯醇（PVA）、聚己内酯（PCL）。根据具体应用，合成基质可以定制为不同的特性，例如，提供ECM特性以增强体外细胞间的相互作用，并模拟天然胰岛的硬度，这使得合成基质成为一种有前途的基质材料。PCL是一种具有高机械稳定性的生物相容性和生物可降解聚酯，通过将PCL与价格合理、热稳定性高、亲水性强的PVA混合，可以改善其较差的细胞亲和性。基于PEG的基质也是一种多功能工具，用于模拟细胞微环境，并为人类胰岛类器官提供平台。与悬浮培养相比，由PEG/胶原蛋白I混合基质制成的3D培养平台对人类胰岛类器官具有优势：a）能够长期培养胰岛类器官b）保持聚集大小和形态c）不会对胰岛分化产生不利影响d）提供聚集恢复的手段。为了改善合成基质的低细胞-基质相互作用，科学家将天然成分与合成聚合物混合，例如明胶/PLGA和PEG/胶原I基质，它们也被定义为半合成基质材料。4人胰岛样类器官的制备方法3D培养为类胰岛提供一个更真实的环境和结构组织，类似于天然人类胰岛。构建的标准方法包括传统的自聚集法、改良的自聚集法和水凝胶包埋法。还将讨论3D生物打印、脱细胞器官支架和芯片上器官等新出现的方法（图3）。胰岛类器官三维结构的传统细胞自聚集细胞自聚集（自组织），是一个分离的细胞可以自组装成组织样结构的过程。低粘附性培养材料、辅助细胞和软基质等因素，均可促进细胞自聚集。例如，低附着板可以刺激人PSC衍生的游离胰腺祖细胞、内分泌细胞或人β细胞自发聚集成3D胰岛样器官。提供悬浮培养条件的旋转烧瓶可以诱导胰岛类器官的3D结构。将人胚胎干细胞悬浮在旋转瓶中形成类胚体，获得3D结构，然后进行逐步的胰岛内分泌分化。此外，间充质细胞可以帮助启动自我聚集，并改善聚集功能。MSCs触发的自组织胰岛样类器官被放置在3D打印的组织捕捉器中，并植入小鼠体内90天，具有检测血管、更多胰岛素阳性细胞和人类C肽分泌。软基质也有助于细胞的自聚集。因此，传统的体外细胞自聚集可以产生令人印象深刻的类器官微观和功能复杂性。然而，由于缺乏预先定义的外部模式指示，传统的细胞自聚集总是会导致聚集维度变化很大的异质类有机物群体，每个聚集体的细胞数量被认为在细胞簇分化和功能性中发挥作用。胰岛类器官三维结构的改良细胞自聚集确定簇的大小对于人类胰岛类器官的生成非常重要。无论是体外培养还是植入，与小尺寸胰岛相比，大尺寸胰岛都会导致坏死增加和细胞活力降低。小型人类胰岛类器官（250个细胞）的细胞胰岛素含量比大型同类器官（1500个细胞）高2.8倍。为了获得同质大小的类有机物，相应地开发了用于某种程度上受控的细胞自聚集的替代方法，例如悬滴、微接触打印和微孔平台。悬滴法通过重力形成细胞团，通常用于胚状体的形成，完全不接触任何人工支持基质或表面。Montanari及其同事报道通过将单个人类胰岛细胞与悬挂的微滴中的MSC混合而生成胰岛类器官的方法，这些微滴在体内具有功能性胰岛素分泌。通过悬滴，可通过改变细胞悬浮液浓度、液滴体积和培养时间来调节胰岛类器官的大小。然而这种方法是劳动密集型的，不适用于大型工程。Mendelsohn及其同事报告了一种微接触打印策略，通过在玻璃盖玻片上打印共价连接的细胞粘附蛋白层粘连蛋白斑点。这项技术提供了对细胞簇形状和大小的特殊控制，而高速打印使生产β细胞聚集体的高通量方式成为可能。然而，这些细胞簇只有两到三层细胞，甚至不能从基质上移除。因此，它们也不适用于胰岛模型、生物学试验或植入。微孔可能是一种有希望的基于自组织的胰岛类器官生成方法。微孔由多个微米大小的腔室组成，通过光刻或微图案化产生，材料范围广泛，如聚二甲基硅氧烷（PDMS）、聚乙二醇和琼脂糖水凝胶。在琼脂糖微孔平台上，细胞被捕获并聚集成葡萄糖反应的“假胰岛”或大小稳定且均匀的胰岛素产生类器官，这提高了移植后胰岛细胞的存活率。此外，凹形微孔底部较薄，增强了大鼠胰岛球体的透氧性，因为在充足的供氧条件下，胰岛球体呈现出长期可持续性、增强的生存能力和增加的激素分泌。经证明，涂有组合ECM蛋白的薄膜微孔阵列支架可促进人类胰岛功能和存活率。然而微孔仍然存在局限性，例如细胞聚集体的尺寸范围狭窄、微孔制备所需的特殊程序以及细胞分布的低可控性。此外，尽管带有悬浮液的自聚集类有机物显示出极好的营养扩散，但缺乏某些物理化学支持，如自然器官生态位，会降低胰岛类有机物的稳定性和细胞活力。基于水凝胶的人胰岛类器官包埋和封装除自聚集外，将细胞包埋在水凝胶基质中也是建立胰岛类器官三维结构的一种很有前途的方法。在这种方法中，分离的细胞颗粒通常悬浮在聚合物溶液中，直到细胞均匀分布，然后通过聚合物的交联形成水凝胶。水凝胶基质为聚集细胞提供初始指导，并作为胰岛类器官形成的后续物理支持和约束。将人类ESC与I型胶原和基质凝胶溶液的混合物包埋，形成初始半径为8 mm、厚度为2.5mm的3D支架，可建立胰岛类器官。在另一份报告中，人类胎儿胰腺组织的小块被包裹在Matrigel中，并扩展成具有胰岛内分泌命运的类器官。将细胞包埋在水凝胶中建立的胰岛类器官不仅可以形成胰岛细胞的三维结构，提供模拟胰岛自然生态位的细胞-细胞外基质相互作用，而且有助于其长期存活。为了维持移植后胰岛在体内的可持续性，“胰岛包裹”可能是一个很好的策略。包封方法就像一个胶囊，由被基质材料包围的胰岛组成。Stock及其同事用聚乙二醇-马来酰亚胺（PEG-MAL）与二硫代PEG（SH-PEG-SH）交联制成的保形涂层，并辅以PepGel肽和PEG低聚乙硫醚（PEG-OES）纳米纤维，将源自人类干细胞的类胰岛有机物包裹起来。在这项研究中，胰岛样类器官在体外与未包封的胰岛保持相当的胰岛素分泌曲线和刺激指数长达7天，甚至可以防止在海藻酸钠和聚乙二醇-海藻酸钠较大微囊中包封的胰岛中可见的中央坏死。此外，将胰岛类器官移植到糖尿病小鼠体内，使糖尿病得以长期逆转，并在没有免疫抑制的情况下维持正常血糖80天以上。但这种封装应用仍存在一些局限性:由于封装的胰岛较小，植入的胶囊无法固定在精确的位置，也不容易从患者身上完全取出；当包封在更大的配置中时，存在扩散问题，导致氧气扩散不良，严重损害胰岛的生存能力；封装后胰岛的寿命和扩展性仍不足以满足后续医学应用。人胰岛类器官的三维生物打印通过3D生物打印技术构建人体类器官受到了特别关注。通过模仿器官的自然异质结构，类器官形成有望在所需位置定位不同类型的细胞，或在特定位置诱导祖细胞成为所需类型，如打印。3D生物打印技术能够以高精度和可重复性将所有组件打印和模式化为3D结构，包括空间分布的细胞、生物材料（bioink）和生物活性因子。因此，3D生物打印提供了构建类器官的理想策略。在胰岛方面，通过3D打印，PLA和纤维蛋白水凝胶被用于容纳人PSC衍生的β细胞簇。在移植到小鼠体内后，SC-β细胞嵌入3D打印设备可运行12周，可回收，并保持结构完整性。Duin及其同事通过3D挤压生物打印技术制作了具有嵌入大鼠胰岛的大孔水凝胶结构。这种大孔结构可以增加表面与体积的比率，并将胰岛与周围体液/血管之间的距离减少到几百微米以下。在培养过程中，检测到具有特定几何形状的嵌入bioink（褐藻酸盐和甲基纤维素）中的胰岛，其存活率约为80%，葡萄糖反应性长达七天。此外，3D生物打印技术通过其重建复杂形态和多细胞环境的潜力，在制造具有血管结构的胰岛组织样结构方面发挥了独特的作用。基于3D海藻酸钠-明胶生物打印技术，制作了一种具有小鼠胰岛（核心）和内皮祖细胞（保护壳）的同轴结构。在这项工作中，3D生物打印被证明可以精确控制多种细胞类型的分布，这有可能改善血管重建和抑制免疫反应。通过制作微通道，3D生物打印模拟天然血管树，为胰岛灌注充足的氧气和营养供应。通过3D生物打印，胰腺的dECM被证明是一种很有前途的胰岛类器官生物墨水，并且dECM显示出剪切变稀的行为，这有利于嵌入细胞的存活，因为通过打印喷嘴时剪切应力被释放。尽管采用了革命性的生物打印技术方法，人工胰腺制造的改进潜力巨大，但其技术开发的早期阶段阻碍了其生产准备过程。需要解决的是a）合适的bioink：bioink材料的选择受到严格印刷条件的限制，几乎所有水凝胶都很脆弱，不稳定，无法保证胰岛的长期存活。具有良好的生物相容性、适当的生物和物理化学性质的现有标准或商业生物油墨很少b）打印速度：在当前的生物打印技术中，人体大小的组织和器官需要太长的打印时间，从而影响打印细胞的细胞活力。用于胰岛类器官的脱细胞器官支架目前，体外建立的胰岛类器官受到毫米级大小的限制，限制了在移植中的直接使用。为解决这个问题，可以从人类尸体上制备脱细胞支架，并用分离的器官特异性前体或直接用含有实质、血管和其他辅助细胞类型的类器官进行接种。加上生理上合适的培养方法和生物反应器培养，这些支架可以在体外支持更大器官结构的生长。人胰岛器官芯片芯片上器官是一个新的概念。与微流控技术结合，类有机物在提供仿生细胞或组织微环境方面具有显著优势。与静态培养相比，微流控技术引入了一种可促进营养物质、氧气和废物运输的灌流，以模拟血液流动。已经开发了一种器官芯片微流控装置，以促进IPSC和3D胰岛类器官胚胎体的形成，这可以改善胰岛类器官的功能和成熟。Walker及其同事通过悬滴分散人类胰岛细胞，制备了胰岛类器官，并在微流控系统中培养胰岛类器官以促进其存活。在接下来的研究中，Oxy芯片被用于支持具有更好的氧气利用率和胰岛功能的主要人类胰岛类器官，其中芯片孔的聚（甲基丙烯酸甲酯）基底被透氧全氟烷氧基（PFA）膜取代。微流控平台也可用于创建3D模型，不同类型的细胞保持在分离的隔间内，并通过微通道阵列连接。与静态和常规模型（大小不一的天然胰岛）相比，动态条件下的胰岛类器官可能对药物（如甲苯磺丁脲和GLP-1）表现出更高的敏感性。总之，胰岛类器官与微流控系统相结合将是疾病建模、高通量药物分析和再生医学的完美平台。机械刺激在人胰岛类器官构建中的作用机械刺激对细胞的影响已引起广泛关注。据报道，机械信号可能会影响β细胞的分化和功能。在人类胰岛类器官的构建中，机械刺激也起着重要作用。细胞聚集产生的几何结构被认为是胰岛类器官生成过程中最直接的机械刺激。Hogrebe及其同事发现，烧瓶3D旋转培养中的细胞骨架状态不同于2D贴壁培养，这严重影响了β细胞的定向分化。生物材料的存在会对人类胰岛类器官产生多种机械刺激，如硬度、地形和机械压力。生物材料的硬度（杨氏模量）可以调节细胞自聚集，用于人类胰岛类器官构建和β细胞分化。β细胞可以感知地形，并将其转化为生物信号，从而促进体外长期人类胰岛培养。在微流控平台中，剪切应力由流速决定，并影响胰岛类器官的形态和功能。检测到灌注较慢的动态条件可改善大鼠胰岛类器官丰富的微绒毛、紧密的细胞连接和增强的葡萄糖反应性，而灌注较高或静态条件下则相反。总之，细胞聚集、生物材料和构建人类胰岛类器官的技术都可以通过机械刺激影响类器官的存活、分化和功能。目前其机制主要集中在机械损伤引起的细胞死亡，调节YAP、整合素和细胞骨架动力学等机械信号。最适合人类胰岛类器官的最佳机械环境尚未确定。在人类胰腺中，胰岛被外分泌部分和丰富的血管组织包围，这些组织可以为胰岛提供刚度、地形和机械压力。因此，未来人类胰岛类器官构建的研究不仅要关注类器官本身，还要了解天然胰岛的机械环境。5挑战和展望目前人胰岛类器官的发展道路上还存在着三大挑战：类器官中胰岛细胞类型、比例以及空间位置错乱；类器官的批次、个体之间的巨大差异性；受到免疫排斥、缺氧等因素影响，移植后的胰岛类器官存活率低。胰岛类器官可以促进人类胰岛的研究，尤其是在人类胰岛发育、糖尿病疾病模型和胰岛移植领域。自从埃德蒙顿方案首次获得成功以来，胰岛并不是移植的唯一来源。近年来，基于干细胞的糖尿病临床试验已经被提出并实施。2014年，ViaCyte提交了人类ESC源性胰腺祖细胞移植治疗T1D的首次试验（NCT02239354）。2021年1月，SEMMA启动了一项HESC来源的β细胞治疗T1D的临床试验。蓬勃发展的人类胰岛再生无疑将使再生医学更接近糖尿病患者，并有望补充遗体胰岛的临床移植需求。主要参考文献：Lai Jiang, Yiru Shen，Yajing Liu, Lei Zhang，Making human pancreatic islet organoids:          Progresses on the cell origins, biomaterials and three-dimensional technologies，                Theranostics 2022, Vol. 12, Issue 4：: 1537-1556END深度聚焦类器官与3D培养论坛，OTC2024论坛合作详询：王晨 180 1628 8769戳“阅读原文”立即领取限量免费参会名额!

类器官技术始于2009年，荷兰Hubrecht研究所的 Hans Clevers 团队成功的将成体干细胞培养成为小肠的隐窝和绒毛结构。类器官 VS 组织样本 VS 动物模型●  　  ●    　●目 录一、类器官的概念二、类器官的发展历史        三、类器官的培养 四、类器官的应用五、类器官的产业链六、类器官的市场格局七、类器官的挑战八、类器官的未来发展-01-类器官的概念类器官（Organoids）指利用成体干细胞或多能干细胞进行体外三维（3D）培养而形成的具有一定空间结构的组织类似物。尽管类器官并不是真正意义上的人体器官，但能在结构和功能上模拟真实器官，能够最大程度地模拟体内组织结构及功能并能够长期稳定传代培养。目前类器官分为两类：组织来源类器官和多能干细胞来源类器官。相比传统的二维培养模型，类器官代表着一种能够概括整个生物体生理过程的创新技术，具有更接近生理细胞组成和行为、更稳定的基因组、更适合于生物转染和高通量筛选等优势。而与动物模型相比，类器官模型的操作更简单，还能用于研究疾病发生和发展等机理，因而在器官发育、精准医疗、再生医学、药物筛选、基因编辑、疾病建模等领域都有广泛的应用前景。2013年，类器官被《科学》杂志评为年度十大技术。2018年初，类器官被评《自然·方法》评为2017年度方法。在Pubmed上搜索 “类器官” 这一词条，类器官相关文章从2010年的42篇，在短短十年间，跃升到2020年的2097篇。类器官以极迅猛的态势成为研究热点。-02-类器官的发展历史类器官的起源可以追溯到1907年，当时44岁的美国贝克罗莱那大学教授威尔逊 (H. V. Wilson)发现通过机械分离的海绵 (sponge) 细胞可以重新聚集并自组织成为新的具有正常功能的海绵有机体，他的研究结果于1910年发表。威尔逊的研究证明了成年的有机体在无需外界帮助、无需从特定的解剖学阶段开始，也具有完整的信息并可以成功发育成新的有机体。对类器官技术而言，另外一个十分关键的契机是干细胞技术的发展。干细胞想必大家并不陌生，很多人对于干细胞的第一印象都是来源于媒体中对于血液疾病造血干细胞移植疗法的介绍。近年来火热的干细胞研究，主要开始于上世纪末。1987年，A. J. Friedenstein发现间充质干细胞 (Mesenchymal Stem Cell, MSCs)。 1998年，美国生物学家James Thomson首次分离得到人胚胎干细胞。2007年，山中伸弥教授成功制造出人诱导多能干细胞(induced Pluripotent Stem Cells, iPSC)。如今，绝大多数类型的非肿瘤来源的人源类器官均可由MSCs或iPSC发育而来，干细胞研究的飞速进展为类器官研究带来新的活力。类器官发展主要事件数据来源：Am J Physiol Cell Physiol杂志当代类器官的发展成果，主要集中在近十余年。2007年，Hans Clevers 的实验室通过 lineage tracing 验发现小肠和结肠的干细胞为 Lgr5+细胞。2009年，Hans Clevers实验室使用单个鼠LGR5+肠干细胞在体外自组织成为具有肠隐窝-绒毛结构的肠类器官。2011年，由人多能干细胞和原代成体干细胞发育而来的肠类器官被成功制作。同年，由鼠胚胎干细胞培育而来的视网膜类器官被首次成功培育。2012年，由人多能干细胞发育而来的视网膜类器官成功培育。2013年，由人多能干细胞发育而来的脑类器官被成功培育。肝、肾、胰类器官被成功培育。2014年，前列腺、肺类器官被成功培育。2015年，乳腺、输卵管、海马体类器官被成功培育。2020年，蛇毒液腺类器官被成功培育。类器官的研究热点是病人来源的类器官 (Patient-Derived Organoids, PDOs)，因为通常用于肿瘤患者的疾病建模、研究与药物筛选，常常被称为肿瘤类器官。肿瘤类器官的发展开始于2013年，自此之后呈逐年上升趋势。肿瘤类器官是指将患者活检、穿刺或手术切除组织在基质胶中培养数周得到的类器官。肿瘤类器官在高度保持源肿瘤的异质性和患者之间的异质性的同时，类器官个体间形态、尺度保持基本均一，为肿瘤发病机理研究、药物筛选、个性化精准医疗、再生医学等领域提供了快速、优良的技术平台。目前3D类器官培养技术已经成功培养出大量具有部分关键生理结构和功能的类组织器官，比如：肾、肝、肺、肠、脑、前列腺、胰腺和视网膜等。-03-类器官的培养类器官的培养可以利用体细胞、成体干细胞（包括祖细胞）或多能干细胞。2009年，肠道器官模拟技术率先取得突破，研究人员发现，成人肠道干细胞可以在体外增殖和自发组织化。其特征是能够表达LGR5，这是一种编码Wnt激动剂R-spondin受体的基因，同时需要特定的分子围绕在旁（如Wnt、KGF和noggin）。以此为理论基础，研究人员开发了一种三维培养体系，能够在体外重建肠道干细胞的适宜环境，并从肠道上皮细胞或单个LGR5+干细胞分化出具有自我更新能力、保持肠道腺窝绒毛状结构的类器官。该模型可以持续扩增达3个月，稳定的基因组保证了纯化和生产放大等优势，此后这种方法被用于从其它主要器官上皮组织培养各种类器官。成人干细胞衍生的类器官培养，通常是通过将分离的成人干细胞或所需器官培养的单细胞悬浮液，嵌入到细胞外基质（ECM）水凝胶中来建立的。例如肠道器官，从小肠或结肠分离出的隐窝细胞足以培养出类器官，也可以从分离的成人肠干细胞中培养出类器官。上皮类器官培养基是以附加与器官相关的生长因子的培养基为基础的。因此，从其他组织（如呼吸道、肝脏、胰腺、皮肤、膀胱、大脑、心脏）提取的细胞器要求在培养中补充相关生长因子。例如大脑类器官培养过程如下图：诱导多能干细胞（iPSC）衍生细胞在神经诱导介质中生长，产生神经外胚层，嵌入Matrigel中，并在旋转生物反应器或轨道摇床中生长，以更好地扩散，获得三维脑器官。在暴露于维甲酸的情况下，大脑器官通过自我组装模式，形成自缔和组织，形成包括放射状胶质细胞在内的不同种群的神经祖细胞，这些神经祖细胞扩展形成大脑结构。除了成体干细胞，多能干细胞（包括诱导干细胞和胚胎干细胞）也可以利用其自我更新及分化能力来制备类器官。由于从多能干细胞中提取的类器官是通过同质群体定向分化而形成的，因此，必须在一个唤醒胚胎发生的动态过程中重新创造组织特异性细胞类型及其微环境。因此，多能干细胞类器官培养必须在分化过程中提供合适的生态位信号。由于这一过程较复杂，多能干细胞类器官往往含有不同于模型器官的细胞类型，使靶组织的信号环境和自组织复杂化。1、科学研究中的类器官培养1.1 上皮类器官研究上皮细胞-免疫细胞相互作用上皮细胞出现在机体所有和外界接触的边界，比如皮肤，呼吸道，肺，消化道，是机体对抗病原体侵染的第一层屏障，也是第一个对病原性感染作出反应的细胞。为了维持体内平衡，并提供对感染的快速反应，上皮细胞与免疫细胞密切配合。所以在上皮区域，也是全身免疫细胞浓度最高的区域。建立上皮细胞和免疫细胞相互作用的模型，是研究抗感染免疫和损伤后免疫的重要手段。上皮细胞类器官的建立，可以非常精准的模拟机体上皮环境，也被发展起来研究上皮和免疫细胞相互作用。有三种共培养的模式1.用存在于细胞外基质中的重组细胞因子处理类器官，评价免疫细胞衍生细胞因子对于上皮细胞的影响。如IL-4和IL-13促进丛生细胞分化，而IL-22支持干细胞增殖和存活。2.将器官消化到单个细胞，然后在免疫细胞存在的情况下，再生长。用于评估免疫细胞和免疫细胞衍生的细胞因子（可溶性或膜结合）对器官生长和分化的影响，以及上皮细胞对免疫细胞表型的影响。3.在ECM或生长培养基（悬浮培养）中，向完整的类器官中添加（活化的）免疫细胞，如T细胞或固有淋巴样细胞（ILCs），以评估免疫细胞与上皮细胞之间的相互作用。这些检测的读数通常包含消化形成的器官和随后的转录。单细胞RNA测序或定量PCR（QPCR），成像和/或流式细胞术评估上皮细胞和/或免疫细胞表型。在这些共培养中使用的免疫细胞要么直接从小鼠组织（例如，脾细胞、肠上皮内淋巴细胞、固有层T细胞、固有层ILCs或肺ILC2s）中分类，要么直接从人外周血中提取，要么先在体外分化。1.2 胸腺类器官研究T细胞发育胸腺是T细胞成熟和从祖细胞向成熟的幼稚淋巴细胞分化的中心部位。来源于骨髓的T细胞祖细胞在胸腺皮质进行阳性选择，随后在胸腺髓质中进行阴性选择。胸腺的这些区域由两种不同的上皮细胞组成：皮质胸腺上皮细胞（CTECs）和髓质胸腺上皮细胞（MTECs）。3D重建胸腺被证明是模拟其功能的关键，几种胸腺类器官的产生方法：这些器官培养通常是从人类身上建立起来的或胎鼠或新生儿胸腺组织，但也有报道称TEC样细胞与人胚胎干细胞的体外分化，这些培养都产生胸腺样结构。在体外产生活的T细胞，并在移植到裸鼠上时发挥作用。有趣的是，虽然长时间的类似胸腺的培养是可能的（离体培养长达56天），但细胞在连续传代时失去了集落形成能力。重要的是，虽然在成年小鼠中已经发现了一种双能的TEC前体，但含cTECs和mTECs的胸腺器官尚未从单个干细胞中生成。此外，考虑到小鼠体内某些双能TEC前体的生长因子已被发现（例如BMP 4和IL-22），可以尝试这些因子是否可用于维持TEC的祖细胞来源的类器官。2、肿瘤微环境两种主要的方式被使用（以非小细胞肺癌为例）在整体方法（左）中，肿瘤活检组织是在气液界面间环境培养，所有肿瘤细胞类型的细胞悬液，包括内源性免疫细胞和其他非上皮细胞类型，促进肿瘤特异性T细胞的生长。在还原模拟方法（右）中，上皮类器官是从肿瘤活检组织中生长出来的，然后与来自同一患者外周血的自体免疫细胞共培养，以促进肿瘤反应细胞的连续扩张。虽然整体方法允许包括整个肿瘤微环境的肿瘤材料的培养，因此与体内情况非常相似，但不易长时间维持，而还原模拟方法允许肿瘤上皮的长期培养和扩展，这使得更广泛，更长期的研究成为可能。3、药物筛选3.1 促进心肌纤维细胞生长化合物筛选动物模型，主要是老鼠，被广泛用于研究心脏病，提供有价值的结果。然而，由于许多功能和生物学特性的物种差异很大，它们对人类心脏疾病和药物安全性的推断很差。人类多能干细胞（hPSC）可以为生物医学和药物研究提供无限的人类心肌细胞来源，有可能弥合这一鸿沟。然而，传统2D培养中的hPSC源性心肌细胞缺乏功能成熟，，这在某些情况下阻碍了它们准确预测人类生物学和病理生理学的能力。多细胞3D人体类器官提供了更精确的模型，是解决这一问题的潜在方法。澳大利亚昆士兰大学生物医学系的科学家在Cell Stem Cell发表文章，阐述他们基于96孔板，培养心脏心肌类器官，进而进行化合物筛选的新流程。具体流程如下图：基于类器官，将5000种化合物，筛选出不同功能化合物。3.2 特定神经类器官培养及药物筛选等应用首先神经球在不同分化培养基种培养（具体的诱导因子及生长因子见下图），产生大脑，中脑，海马，前脑等不同脑部类器官。（资料来源：干细胞者说）-04-类器官的应用类器官作为一个新兴的技术，在科学研究领域潜力巨大，包括发育生物学、疾病病理学、细胞生物学、再生机制、精准医疗以及药物毒性和药效试验。类器官培养使研究人体发育提供了不受伦理限制的平台，为药物筛选提供了新的平台，也是对现有2D培养方法和动物模型系统的高信息量的互补 。此外，类器官为获取更接近自然人体发育细胞用于细胞治疗成为可能。通过类器官繁殖的干细胞群取代受损或者患病的组织，类器官提供自体和同种异体细胞疗法的可行性，未来这一技术在再生医学领域也拥有巨大的潜力。使用这项技术，采用CRISPR/Cas9能够纠正体外遗传异常并能够将健康的转基因细胞再次回输入患者体内，并在后期整合入组织内。在精准医学应用中，患者衍生的类器官也被证明为有价值的诊断工具。在进行治疗之前，采用从患者样本来源的类器官筛查患者体外药物反应，旨在为癌症和囊胞性纤维症患者的护理提供指导并预测治疗结果。随着类器官培养系统以及其实验开发技术的不断发展，类器官应用到了各大研究领域。1、通过类器官对发育和疾病进行建模研究人员可以通过类器官来模拟人类发育和疾病，因为类器官是从人类干细胞或成年细胞产生的诱导性多能干细胞生长而来的，它们的成分和结构也与原发组织相似，并且易于操作和冷冻保存。这意味着类器官可以用于研究源自干细胞的人体组织且难以通过动物模型模拟的人类疾病分析，研究人员仅需少量的起始物质即可培养类器官。因其与对应的器官拥有类似的空间组织、保持一些关键特性并能够重现部分生理功能，而被认为是检测人类生物学和疾病方面的新模型。相较于细胞系、基因工程鼠和人源化异种移植鼠（patient-derived xenografts, PDX）这些传统的研究模型，类器官模型（鼠源类器官mouse-derived organoids, MDO和人源类器官patient-derived organoids, PDO）不但能够取自正常组织和组织癌变过程中各个阶段的肿瘤组织，而且其培养体系简单易操作，时间和金钱成本较低，且具有较高效率，因而得到广大研究人员的亲赖，被Nature Methods评为2017年生命科学领域年度技术。主要研究模型对比数据来源：Science杂志目前，类器官多用于肿瘤癌症的研究中。观察下图中临床前肿瘤癌症模型的比较，可以发现类器官有着很强的优势：目前，癌症联盟组织如国际癌症基因组联盟（International Cancer Genome Consortium，ICGC）、癌症基因组图谱计划（The Cancer Genome Atlas， TCGA）所使用的大部分样本都取自于原发肿瘤（primary tumors）。相比之下，PDO可以取自肿瘤发展过程中的任何阶段，而且只需要一小部分肿瘤组织即可在体外进行培养和扩增。研究人员已经在肝癌、胰腺癌和结肠癌肝转移组织中，通过穿刺获得活检，成功的在体外进行类器官培养。甚至能够将前列腺癌患者的循环肿瘤细胞在体外培养成类器官。也有研究人员从尿路（urine）和支气管肺泡（bronchial lavage）的正常细胞中成功培养类器官，但是目前还不清楚这些培养方法能否适用于这些组织来源的肿瘤类器官培养。2、干细胞类器官工程干细胞生物工程技术的进步提高了控制细胞类型，组织和相互作用的能力，而类器官工程正需要通过直接修饰干细胞或控制微环境来操纵每个结构层。现在，科学家已经开发了更精确的合成环境，通过用信号蛋白修饰基质的生物惰性区域，可以更好地控制干细胞的活性。类器官工程技术对于一些体内环境成分复杂、需要精确建模的发育研究特别有用。3、类器官与精准医疗类器官技术正在成为个体化治疗的工具，运用类器官技术进行个体化治疗是指，通过体外对类器官进行药物筛选和基因型分析，制定适合这个个体的治疗药物和方法。截至到目前，不同肿瘤PDOs对传统和正在研发的药物所产生的反应是各种各样的。对目前有限的资源研究发现，大部分PDOs所展现的治疗反应和相对应的病人刚开始对治疗的反应是一致的。PDOs也可以用于针对被动或获得性耐受开发新的药物。更重要的是，PDOs对具有细胞毒性的药物敏感性较强，因而可以更好的预测病人使用后的临床反应。接下来，研究人员对大量个体PDOs的药物反应数据进行整合分析，找出共同特征，进而对一类相似病人进行生物标记物开发研究。3.1药物筛选类器官培养物可用于药物筛选，这可将肿瘤的遗传背景与药物反应相关联。来自同一患者健康组织的类器官的建立提供了通过筛选选择性杀死肿瘤细胞而又不损害健康细胞的化合物来开发毒性较小的药物的机会。自我更新的肝细胞类器官培养物可用于测试潜在新药的肝毒性（临床试验中药物失败的原因之一）。药物筛选模型对比3.1.1 类器官药物筛选的优势速度快：类器官构建成功率高以及培养速度快。常规来说，在类器官培养一周之后就可以进行药筛。从样本采集到出具药敏结果的全流程已经可以很好地控制在2周之内。通量高：从可筛查的药物通量来说，利用类器官不仅可以在孔板上进行多种药物的筛查，每个药物还可以测试不同的浓度，多个实验平行开展。临床相关性强：类器官用于癌症药筛的临床相关性和预测有效性在多篇研究中都已经得到了较为充分的证实。Vlachogiannis G团队在Science发表了肿瘤类器官体外药敏测试指导临床用药的里程碑式研究，在71位转移性胃肠道癌提取了110份组织构建了类器官，共测试了55种抗癌药物。研究结果显示，类器官药筛达到了93%的特异性，100%的灵敏度、88%的阳性预测率和100%的阴性预测率，展现了极高的临床相关性。3.1.2 类器官进行药筛的流程药物筛选流程包括类器官的构建、评估、药敏检测三大方面：类器官构建：类器官的样本来源通常为肿瘤组织或者胸腹水等恶性积液，主流的培养方法包括较为常用的正置胶滴法、适用于肿瘤和睾丸类器官培养的倒置胶滴法、适用于有气体接触的黏膜类器官（肠、呼吸道）培养的气液界面法以及需要较大扩增（脑类器官）的生物反应器法等。首先将患者来源的肿瘤样本组织通过机械剪切得到肿瘤细胞团，再将细胞团酶消化成单细胞。分离消化后，将细胞嵌入到基质胶中并在96/384孔板上进行胶滴的种接，再覆盖以培养基和细胞因子培养。类器官培养至直径几百微米的细胞小球即可用于药筛。类器官培养特有的重要试剂包括消化液、培养基（例如Wnt、R-Spondin、Noggin等细胞因子）、基质胶（Matrigel等）。类器官评估：在培养好类器官之后，对于类器官的评估和验证也至关重要。通过基因测序、免疫荧光、HE染色等方法，从形态学、组织病理学以及分子遗传学等多个维度对类器官进行鉴定。评估的目的是确定类器官和原肿瘤具有一致性，这也是进行后续药筛的前提。药物检测：类器官目前可筛选的药物种类包括化疗药、小分子靶向药、抗体药物等。药筛的核心检测检测指标通常为IC50以及细胞抑制率，根据这些指标在筛查的药物中选取对肿瘤抑制效果最佳的药物。在中国的注册临床中，类器官以化疗药的敏感性检测作为主流应用，类器官用于检测靶向药和免疫治疗的敏感性在未来还有极大的发挥空间和应用潜力。3.1.3 类器官药筛的发展方向类器官药筛与二代测序作为组合产品使用，二者在临床上可以有机结合，很好地相辅相成。二代测序从基因层面上检测出患者的靶点突变情况和潜在的药物敏感靶点，为医生和患者提供初步用药选择，但是单凭二代测序结果无法保证完全的临床疗效。部分研究报道和临床案例指出，二代测序筛出的潜在靶向药并没有在实际临床上反应出有效性，这一部分的不确定性通过类器官可以很好排查。3.2 基因型分析来自不同健康器官的类器官的生长，然后对培养物进行全基因组测序，可以分析器官特异性突变谱。通过生长来自同一肿瘤不同区域的类器官，可以用于研究肿瘤内异质性。区域特异性突变谱可以通过类器官的全基因组测序来揭示。使用与上述相似的方法，可以利用类器官来研究特定化合物对健康细胞和肿瘤细胞突变谱的影响。癌症是由致病基因突变的逐渐积累引起的。因此，了解在组织稳态和肿瘤发生过程中活跃的突变过程是很重要的。（资料来源：中君亚泰、干细胞者说）-05-类器官产业链类器官行业的上游公司主要集中在为3D细胞培养提供试剂和材料原料，包括提供细胞支架材料、胞外基质、细胞生长因子、培养基和生物反应器等。其中有比较老牌的试剂厂商ThermoFisher，Sigma-Aldrich（现被Merck收购），也有一批取得较大成就的创业型公司。包括瑞士的提供无支架三维细胞培养产品的InSphero公司，加拿大最大的生物科技公司STEMCELL Technologies提供专业的细胞培养基和细胞分选产品，和提供体内微环境模拟系统的美国公司Xcell Biosciences等。主要的3D细胞培养技术根据Meticulous Research Analysis的资料显示：2016年，3D组织培养在全球细胞分析检测市场占据了约9.3%的份额。2017年市场价值8.181亿美元，在预计期内将以8.7%的年复合增长率增长，2022年达到12.426亿美元。其中，美国在全球3D细胞市场贡献了约34.8%的主要份额，位居全球首位。2016年，中国在全球3D细胞市场占5%的份额，远不及美国，但预计未来五年中国将以11.8%的年复合增长率增长，成为年复合增长率最高的国家，具备市场发展潜力。类器官行业的中下游公司营收点主要在于给各大新药测试公司提供药物体外试验方案和疾病模型，即临床试验外包服务。例如哈佛大学Wyss生物工程学院2013年成立的生物技术公司Emulate，Emulate和FDA将合作，评估和鉴定使用Emulate的“器官芯片（Organs-on-Chips）”技术作为毒理学测试的平台的可能性，并先后宣称与阿斯利康和罗氏形成战略合作；荷兰生物技术公司 Mimetas研发了一种芯片肾，并与几家制药公司达成了应用合作协议将其用于药物筛选；上市公司Organovo宣称研发出第一台生物器官的3D打印机，开发出人造肝﹑人造肾。并于2017年10月宣布与Viscient Biosciences达成合作，以进一步研究肝病。类器官行业尚未在国内形成集中化产业集群。除了传统的国外细胞培养试剂和原料代理商外，中下游的公司较为稀疏。在北京、上海和广州区域先后涌出了几家创业型公司。类器官行业在欧洲国家发展较为迅速，这和欧洲类器官科研最早起步以及积累最多必不可分。类器官的领头人Hans Clevers成立的Hubrecht Organoid Technology（HUB）是类器官最早的研发中心，HUB技术授权促进了Epistem、Cellesce、Crown Biosciences、STEMCELL Technologies在内的一批类器官公司的涌现。中国在类器官领域中，近年来其实也呈现出科研数量大幅度上升的趋势，尤其在2019-2020年这两年间显现出了强劲的发展势头，发表的文献数量在全球的排名从第六位（2009-2019年）跃至第二位（2020年），仅次于美国。参考欧洲的类器官发展模式，可以预计中国基础科研积累的提升将加速类器官产业化的进程，在不远的将来我们也将看到更多类器官公司的涌现。-06-类器官的市场竞争在全球范围内类器官已经显示出其强大的发展潜力，国外已经形成一定的市场竞争格局，多家公司正在快速的发展，例如AIVITA Biomedical、System1 Biosciences、JangoBio等。但国内还未真正形成竞争市场。国内外部分类器官公司数据来源：中君亚泰根据公开资料整理-07-类器官的挑战类器官培养技术目前正处于技术爆发和科研成果井喷的阶段，行业发展具有很大的前景，但也面临较大的挑战。比如如何利用好人体胚胎的干细胞建立持久稳定的体外模型；培养条件和环境刺激如何更真实的模拟还原人体微环境；科研属性的产品如何实现量产，如何转化为临床产品等。类器官作为新型的药筛模型，成本虽然较PDX更低，但还是远高于细胞系。类器官成本占比较高的包括培养使用的基质胶，常用的基质胶为美国BD Biosciences公司的Matrigel®，在行业内处于较为垄断的地位，价格较高。Matrigel可以产生类似于哺乳动物细胞基底膜的生物活性基质材料，帮助多种类型的细胞达到附着和分化。Matrigel的来源是小鼠肉瘤细胞系，除了成本较高的问题，同时批次间存在一定的变异性。且由于是动物来源，对于有机类的药物的检测有局限性。考虑到小鼠来源的细胞外基质对于药物筛选实验结果存在一定的干扰，因此基质的工程技术开发用于合成外源差异较小的、非动物来源的基质胶用于成本下降和性能优化将是类器官产业化需要解决的关键性问题之一。基质胶以外，培养也涉及多种细胞因子组合使用，细胞生长因子通常也价格不菲。选择效果更好的细胞因子以及尝试减少使用细胞因子的数量也可以带来成本下降的空间。目前大多类器官本身并不具备血管化的结构。因此，随着类器官体积的增长，类器官受限于氧气的缺失以及代谢废物的增加，可能导致的组织坏死。已有研究构建血管内皮细胞微环境的肿瘤类器官，将类器官肿瘤细胞和血管内皮细胞在Matrigel上共同培养，生成血管结构以期解决类器官血管化缺失的问题。血管化以外的难点还包括模拟肿瘤和免疫环境的相互作用关系。2019年Nature Protocol 期刊发表了肿瘤类器官和免疫细胞共同培养的相关protocol，可以体现和模拟出肿瘤微环境的部分特征。以上皮类器官和免疫细胞共培养模型为例，可通过在培养基中添加活化的免疫细胞、在组织消化成单细胞后和免疫细胞共同生长、添加ECM中的重组细胞因子等方法重塑类器官和免疫细胞的相互作用。相比于单个类器官，类器官系统的构建能够对药物疗效和潜在毒性做出更完整全面的评估。目前类器官仅能检测出药物对于肿瘤的抑制效果，对于其他器官组织是否存在其他副作用和安全性风险并不能做出预判。为了解决这一问题，2017年Skardal et al.构建了有心脏、肺部、肝脏组成的集成于闭合循环关注体中的类器官系统，以达到全面揭示药物对不同器官的毒性和药效的目的.重复性和一致性 也是类器官发展的重大瓶颈，这很大程度上由于过程控制的欠缺与行业标准的空白。类器官培养过程中人为因素的过多参与、自动化程度低导致因为系统偶然性造成的误差较大。同时，类器官检测手段十分匮乏，活体观察主要集中在形态学观察，断点观察集中在基于荧光的各类指标的检测，能够活体实时对类器官各项指标进行检测的光学、电化学等手段仍较为欠缺。当前，类器官很多研究者致力于制造更新的类器官，做出之前未能做出的类器官，我们可以制作海马体、垂体、腺体、脾、肾的类器官，却难以确定一个符合要求的类器官需要满足那些个体的诸如尺寸、形状、基因表达量等，群体的诸如类器官之间的方差等统计学指标。这将限制类器官的高效研究与向临床研究的转化。对于类器官培养过程中的工程控制也是亟待解决的问题。当前类器官培养大多使用Matrigel水凝胶作为培养基质，Matrigel是康宁生命科学公司生产的Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)小鼠肉瘤细胞分泌的胶状蛋白混合物。Matrigel因其含有外源成分，难以应用在人的很多治疗场景。另一方面，虽然类器官与微流控技术已有一些结合研究的例子，但使用微流控芯片对类器官生存的流体环境进行模拟仍不成熟，如何使用微流控等技术对类器官培养时流体微环境进行控制是亟待解决的问题。同时，现有类器官的直径约在100-500μm之间，虽然具有一定程度的尺度效应，但还是难以模拟真实组织、器官的场景。倘若要制造尺度更大的类器官，类器官的血管化也是十分重要的问题。-08-类器官的未来发展1、国家政策推动2021年1月28日，科技部下发的《关于对“十四五”国家重点研发计划6个重点专项2021年度项目申报指南征求意见的通知》中，把“基于类器官的恶性肿瘤疾病模型”列为“十四五”国家重点研发计划中首批启动重点专项任务。另外，“十四五”国家重点研发计划中重点指出，类器官作为一项重大的技术突破被用于疾病模型的建立中，且可用于研究病理状态下干细胞变异、异质性及其发生机理，挖掘疾病诊疗的新靶标，探索诊疗新策略。类器官技术在未来将有非常大的应用价值和发展前景。数据来源：科技部2、类器官技术发展传统制备法，是一种依赖于生长因子的3D培养技术，有其局限性（比如对类器官及局部环境的控制不够精确）。此外，传统制备法不能很好地复制器官发展过程中复杂又动态的微环境，而这种微环境恰恰是器官形成的有利因素，这就使得获取更完整的类似体内器官发展的类器官过程困难重重。目前最前沿的便是，由器官芯片技术与类器组合成的“类器官芯片”技术。类器官不是唯一，多模型的整合才是王道，基于原位组织和动物模型的研究仍将是生物医学研究的金标准。类器官已经成为一种吸引人、易于从多能干细胞系复制的人体外组织模型，但是，以大脑类器官为例，其与原位细胞类型之间仍存在着很多差异，从而可能会混淆人们对内源性脑功能的认识，并可能提出关于神经病理学的误导性假设，最终可能误导治疗方法。这就需要对原位组织中的每一种细胞特性进行深入的了解和表征，包括通过结合转录组、表观基因组和蛋白质丰度等方法来表征的细胞类型；包括空间组织、形态和物理连接性参数的细胞结构组织；以及包括代谢状态和电生理在内的细胞和组织功能指标。在今天，类器官尚且无法独当一面，而未来，类器官也不需独当一面，多模型的整合才是研究的最佳方案。展望未来，类器官研究前景巨大。类器官高度仿真的疾病模型有望继续在精准医疗、再生医学等领域取得新的进展。同时，“ 类器官+”，有望给类器官研究带来新的增长点。与活体实时成像技术结合的类器官技术有望让人们第一次实时观察到人早期发育过程；与生物3D打印相结合，有望实现基于类器官的功能性治疗；与“人类细胞图谱 (Human Cell Atlas, HCA)”技术结合，类器官细胞图谱将推进病加速包括罕见遗传病、复杂多因素疾病、精准肿瘤治疗等以疾病为中心的研究。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

Researchers have collaborated to refine a cell culture technology platform that grows genetically identical lung buds from human embryonic stem cells. When we're driving to a new destination, we often turn down the stereo as we follow the directions. What had been music suddenly sounds like noise, and it interferes with our focus. Our understanding of how infectious diseases like COVID affect human lungs has been similarly confounded by noise. Data from patient lung tissues greatly varies from person to person, obscuring the basic mechanisms of how, exactly, SARS-Co-V2 first infects lung cells. It's also an after-the-fact analysis -- as if we're trying to map the route the virus took three states back. Turning down the noise of variability by studying genetically identical tissues from the first moment of infection could light up the route the pathogen takes. Which cells are infected, and when? What is the level of infection, and how does it differ depending on cell type? How does it change in different conditions? And what if it were possible to track thousands of these infections at once? It might revolutionize our understanding of both infections and the drug treatments used to combat them. That's the hope for new advanced tech capable of growing mini organs on microchips. The labs of Rockefeller's Ali Brivanlou and Charles M. Rice collaborated to refine a cell culture technology platform that grows genetically identical lung buds -- the embryonic structures that give rise to our breathing organs -- from human embryonic stem cells (hESCs). Their findings were recently published in Stem Cell Reports. When placed on an array of microchips and carefully dosed with a custom cocktail of signaling molecules, the hESCs rapidly organize themselves into "micro lungs" that have full tissue complexity. These buds can be cultured by the thousands, allowing for an unprecedented high-throughput analysis of lung tissue infection without all the noisy variables. The result is unlimited, fast, and scalable access to lung tissue that has the key hallmarks of human lung development and can be used to track lung infections and identify candidate therapeutics. "These lungs are basically clones," says Ali Brivanlou. "They have the exact same DNA signature. That way we don't have to worry about one patient responding differently from another. Quantification allows us to keep the genetic information constant and measure the key variable -- the virus." Building a better mini lung Embryonic stem cells are the Ur-cells of the human body. They can infinitely divide to create more stem cells or to differentiate into any other tissue. Brivanlou's Laboratory of Synthetic Biology has long explored their potential. Brivanlou joined forces with Rockefeller colleague Charles M. Rice during the COVID pandemic: his lab had the microchip technology to grow lung buds, and Rice's lab had the necessary biosafety clearance required to infect them with SARS-Co-V2 and study the outcome. In 2021, first authors Edwin Rosado-Olivieri, a stem cell biologist in Brivanlou's lab, and Brandon Razooky, then a postdoc in Rice's Laboratory of Virology and Infectious Disease, began coaxing the cells to organize into more specialized forms. Stem cells don't just organize on their own. They need a confined space -- such as a microchip well -- and stimuli to spark change. The stimuli come from four main signaling pathways that induce stem cells to differentiate into specific cell types. After about two weeks, the group's lung cells had formed identical buds whose molecular profiles closely matched those seen in the earliest stages of fetal lung development -- including the formation of airways and alveoli, structures known to be damaged in many people with severe COVID. Identifying a key culprit Since then, they've used the platform to understand how SARS-Co-V2 infects different lung cells. Alveoli are tiny sacs at the end of the lung branches that manage the gas exchange performed with every breath: oxygen in, carbon dioxide out. By studying cloned alveoli cells en masse, the researchers discovered that alveoli were more susceptible to SARS-Co-V-2 infection than airway cells, which are the guardians of the organ -- the first defense against all inhaled threats. If the virus got past them, the alveoli were sitting ducks. Another view of virus particles (blue) infecting alveolar and airway tissues (red). They also hit upon a winning combination of signaling proteins for creating the most robust batches of lung buds -- a mix of keratinocyte growth factor (KGF) and bone morphogenetic protein 4 (BMP4). Both contribute to cell differentiation and growth. Interestingly, the BMP pathway has a downside. When they compared infected lung buds to postmortem tissue of COVID patients, they found that the BMP signaling pathway was induced in both and rendered the tissues more vulnerable to infection. Blocking the BMP pathway made the cells less vulnerable. Beyond COVID The researchers note that the platform can also be used to investigate the mechanisms of influenza, RSV, pulmonary diseases, and lung cancer, among other diseases. Moreover, it can be used to screen for new drugs to treat them. And lungs are far from the only organ of interest. "The broader focus of our work is understanding cellular development to make synthetic organs and tissues that we can use to model diseases and find therapeutic mechanisms," says Rosado-Olivieri. The liver, kidney, and pancreas are all likely next targets. "The platform will also allow us to respond to the next pandemic with much more speed and precision," Brivanlou adds. "We can quickly capitalize on this platform to make a virus visible and develop therapies much faster than we did for COVID. It can be used to screen for drugs, compounds, vaccines, monoclonal antibodies, and more directly in human tissue. This technology is ready to confront all kinds of threats that may hit us in the future."