Muc18

摘要：随着人类多能干细胞（hPSCs）特定谱系分化技术的进步，下游细胞分离已成为生产hPSC衍生产品的关键步骤。由于分化过程通常导致异质细胞群的形成，需要进行细胞分离，以富集所需的细胞群或去除不需要的细胞群。本文总结了hPSC衍生细胞分离过程的最新进展，包括标准的分离技术，如磁激活细胞分选，以及基于粘附强度和代谢通量等新型分离策略。特别讨论了下游生物加工流程和不同细胞谱系表面标记的识别。尽管大规模hPSC衍生细胞的下游生物加工仍面临挑战，但应实施合理的质量设计方法，以增强对过程与产品之间关系的理解，并确保所产生细胞的安全性。 1.引言 人类多能干细胞（hPSCs）因其独特的自我更新能力和分化成几乎所有类型细胞的能力，为多种体细胞组织提供了替代细胞来源。hPSC衍生物已在几个I期临床试验中进行了测试，以评估它们作为治疗产品的潜在用途，并且还用于药物发现和疾病建模。最初，hPSC衍生细胞的开发和制造集中在优化分化效率上，即上游生物加工，从而改进了分化协议，允许以高效率和纯度生产特定谱系的细胞。例如，使用基于胚胎体（EB）的协议或通过双重抑制SMAD（小母体抗背足蛋白）信号的单层协议，可以从hPSCs中以70-90%的纯度生成少突胶质细胞前体（OPCs）和神经前体细胞（NPCs），以及使用生长因子或小分子引导的协议可以生产30-90%纯度的心肌细胞。这些高效分化协议的开发显示了上游生物加工在生产hPSC衍生细胞方面的巨大进展。然而，下游生物加工（即细胞分离），作为完成hPSC衍生产品的关键步骤和瓶颈，需要进一步研究。 由于当前从hPSCs分化的过程通常会产生包括残留未分化细胞在内的混合细胞类型，因此需要进行下游生物加工，以选择性纯化所需的细胞群或去除不需要的细胞群（图1A）。例如，最终的干细胞产品不含未分化细胞或不需要的谱系的前体细胞对于减少移植后畸胎瘤形成的风险至关重要。在这里，我们回顾了hPSC衍生物的新兴下游生物加工，包括hPSC扩增和分化后的细胞分离的最新进展。我们提供了识别新型谱系特异性表面标记的例子，这些标记可以用于分离hPSC衍生细胞。此外，我们还讨论了hPSC下游生物加工的方法和实际流程，以及生产神经和心脏细胞面临的特定挑战。 图1 hPSC衍生产品的下游生物加工。(A) 富集和耗竭策略以分离hPSC衍生细胞。(i) 富集：收集所需细胞（适用于低分化效率）。(ii) 耗竭：去除不需要的细胞（适用于高分化效率）。(B) 下游处理的主要步骤。(1) 细胞收获；(2) 离心以去除收获酶；(3) 保持等待所有细胞被收获；(4) 耗竭以去除不需要的细胞；(5) 离心以去除耗竭缓冲液；以及 (6) 填充和完成将细胞转移到冷冻保护缓冲液中进行冷冻保存。如果每个步骤在理想情况下的产量为90%，则这些步骤后的总产量预计为59%。(C) 聚集对大规模细胞标记的影响。(i) 单细胞悬浮液允许用磁性珠进行细胞标记。(ii) 如果发生聚集，目标细胞无法均匀标记，聚集体中未标记的细胞被去除，从而降低了产量。(iii) 具有高聚集倾向的细胞保持在配制的缓冲液中作为单细胞悬浮液，以提高处理效率。本图包含了Servier Medical Art (smart.servier.com)的图像。 2.纯化hPSC衍生产品的技术 在分化过程中，hPSCs及其衍生物在细胞密度、表面标记的表达、代谢需求和粘附强度方面具有阶段特异性。基于这些和其他特征，已经评估了不同类型的干细胞衍生细胞的分离过程，包括基于密度的分离和荧光激活细胞分选（FACS）以及基于特定表面标记的磁激活细胞分选（MACS）等标准分离技术。随着对hPSC属性的更好理解，也开发了基于差异粘附到培养容器的细胞分离和基于不同代谢活性的选择性去除细胞等新型分离策略。 2.1.基于密度的分离 在分化培养中可能会产生具有不同细胞密度的混合细胞类型，可以根据它们的密度进行分离。一个例子是使用Percoll梯度离心来富集hPSC衍生的心肌细胞。从分化培养中收获的细胞被加载到Percoll的两层上，然后进行离心。大多数心肌细胞将出现在Percoll的下层，而非心肌细胞将在其他分数中。从含有大约50%心肌细胞的起始分化培养中可以获得高达95%纯度的心肌细胞。然而，这种方法分辨率低，不适合大规模分离。 2.2.基于细胞生物物理特性的分离 在未分化的hPSCs、部分重编程细胞、体细胞和hPSC衍生的分化细胞之间观察到显著的生物物理特性差异。例如，粘附特性、质膜刚度和光学特性在hPSCs的不同发育阶段表现出不同。这些特性的变化可以作为选择特定承诺群体的目标。 hPSC衍生的心肌细胞显示出来自肌球蛋白杆状体的特定二次谐波信号，这使得它们能够从异质的分化细胞群体中分离出来。或者，从重新培养的分化hESC聚集体中衍生的神经嵴细胞会自发地从主要细胞团中分离出来，这使得它们可以通过形状选择和手动挑选进行隔离。 另一方面，从小鼠诱导多能干细胞（miPSCs）衍生的扩增色素细胞被证明比非色素细胞更具粘附性。这种特性使得它们可以通过调节暴露时间和酶解离的类型来进行纯化：非色素菌落可以通过5分钟的Accutase处理和吹打来回收，而剩余的粘附色素细胞可以用胰蛋白酶二次回收。类似地，在细胞解离前用ROCK（Rho相关蛋白激酶）抑制剂（Y-27632）进行介质补充，可以去除粘附性较低的细胞，从而富集内皮祖细胞。此外，发现退出多能性会增加细胞膜刚度。这些膜流动性和脂质组成的改变可以与分化阶段联系起来。基于这一原理，可以根据膜流动性条件下它们的粘附特性进行细胞分离，以选择各种分化细胞。 人类诱导多能干细胞（hiPSC）菌落可以在4分钟内通过85-125 dynes/cm2的剪切应力在流体流动应用下脱落，而分化细胞由于粘附强度更高而保持附着。这种方法可以从异质重编程培养物和分化的后代中分离出完全重编程的iPSC菌落，纯度超过95%。然而，这种方法尚未评估用于特定谱系分化的细胞。 由于细胞/粘附表面相互作用在分化过程中受到调节，这导致了新型生物材料的开发，用于特定分化表型的细胞隔离。在未分化阶段，iPSC菌落可以从热敏聚合物（PNIPAAm（聚（N-异丙基丙烯酰胺）））在低温（即22°C）下选择性脱落，而承诺的细胞仍然附着在表面。这种方法可以实现未分化干细胞群体的非侵入性富集。类似地，hiPSCs承诺用于心脏谱系，种植在与层粘连蛋白-521涂层的聚（N-异丙基丙烯酰胺）上，其临界溶液温度在8°C，促进心肌细胞的特定脱落。 此外，研究发现，通过高速激光照射光响应聚合物的特定区域（即聚[（甲基丙烯酸甲酯）-共（分散黄7丙烯酸酯）]层）可以消除承诺的细胞。或者，不同亚型的层粘连蛋白促进各种分化细胞类型的不同粘附强度。例如，LN211/332/511E8促进非上皮细胞的粘附，而LN332/511E8则有利于上皮细胞的附着和增殖。细胞与不同层粘连蛋白亚型结合的特异性使角膜上皮细胞能够从异质分化的细胞中纯化。 2.3.基于代谢活性的选择性细胞去除 基于心肌细胞和非心肌细胞在葡萄糖和乳酸代谢上的显著生化差异，可以从hPSC分化培养中获得高纯度（高达99%）的心肌细胞。未分化的hPSCs和主要依赖糖酵解的非心脏细胞在葡萄糖耗尽和乳酸丰富的条件下无法生存，而心肌细胞可以通过使用乳酸作为替代能源而存活。因此，在补充乳酸的葡萄糖耗尽培养基中，心肌细胞更倾向于存活并因此被富集。同样，使用葡萄糖耗尽并补充脂肪酸和3,3′,5-三碘-L-甲状腺素（即促进脂肪酸氧化和线粒体生物发生的分子）的培养基，已报道了心肌细胞的选择和成熟。视网膜上皮细胞（RPE）被发现表达高水平的脂蛋白受体内化AcLDL（乙酰化低密度脂蛋白）。基于这一原理，使用Dil偶联的AcLDL对分化的RPE群体进行特异性标记和富集。另一个例子是靛青绿（ICG）被肝细胞特异性内化。通过修改ICG的荧光发射特性，设计了一种肝细胞纯化剂（HPA，λem = 562 nm），用于标记和体外分选来自hPSCs的纯化肝细胞。 2.4.负选择 与正细胞选择相反，其他方法已经开发出来，通过特异性诱导不需要的细胞类型的凋亡来去除它们，从而提高所需表型的回收率。例如，将PSCs转染与合成微小RNA（miRNA）开关（即在没有目标miRNA的情况下减少相关蛋白的翻译水平），miR-Bim（Bcl-2相互作用的细胞死亡介质）开关，诱导未分化细胞的选择性凋亡，同时保持分化的心肌细胞。或者，凝集素rBC2LCN-PE23被发现能够特异性结合并内化到未分化的干细胞，并诱导它们的凋亡。这种化合物被发现可以有效地降低畸胎瘤形成的风险。 2.5.通过FACS分离 FACS设备可以检测用荧光素偶联抗体标记的细胞的荧光信号。基于标记特征和目标标记（通常是表面抗原），FACS允许将单个细胞根据多个表面标记进行高选择性地排序和分离成不同群体（例如SSEA（阶段特异性胚胎抗原）-4阳性或SSEA-4阴性）。FACS的一个优点是它允许基于多个表面标记进行连续和多参数分离，尽管细胞活性可能会受到排序程序的影响。然而，FACS的通量有限，每秒可排序5×103到7×104个细胞。因此，FACS更适合研究用途的小规模细胞分离。 2.6.通过MACS分离 MACS是一种类似于FACS的技术，但使用带有针对特定细胞表面抗原的抗体的磁性颗粒。在磁场中，磁性标记的细胞将在柱中保留，未标记的细胞将流出。例如，通过针对心肌细胞相关表面标记VCAM1（血管细胞粘附分子1）的MACS，从hPSC分化培养中富集心肌细胞至95%。然而，尽管MACS是一种吸引人的方法，可以从细胞混合物中选择性地去除不需要的细胞，但它也有其局限性。例如，一项建模研究表明，为了从分化和未分化细胞的池中清除SSEA-1阳性的未分化干细胞，需要不切实际数量的重复MACS。然而，磁性珠的亲和力也可以通过新型表面修饰来提高，以提高排序效率。MACS的一个优点是，由于成本较低和商业化的自动化、封闭系统的可用性，它比FACS更适合大规模处理。MACS珠的替代品，SpheriTECH，通过简单的亲和结合在大珠上排序细胞，无需纯化标签，就能纯化来自hiPSCs的光感受器前体细胞。 2.7.使用微流控技术分离 微流控技术最近被证明是hPSC培养、表征和筛选的高效工具。微流控技术也可用于异质分化细胞群体的分离。例如，已制造微流控滚动柱用于选择性分离SSEA-1阳性细胞。滚动柱芯片的边界涂有抗体，降低了SSEA-1阳性细胞的滚动速度，而承诺的细胞则流出通道。因此，SSEA-1阳性细胞在通道内停留的时间更长，从而可以从分化细胞中分离出来。通过在微流控芯片底部覆盖有抗Tra（肿瘤相关抗原）-1-60抗体的脊状图案，也进行了类似的操作，从hiPSCs衍生的心肌细胞中消除未分化细胞。 3.表面标记识别用于分离hPSC衍生细胞 由于FACS和MACS依赖于表面标记的检测，因此识别不同谱系在hPSC分化过程中不同阶段的特异性表面标记非常重要。我们讨论了关于未分化细胞和三个胚层衍生物（包括神经细胞、心肌细胞和胰腺前体）表面标记的研究示例（表1）。 3.1.未分化细胞的表面标记 表面标记如Tra-1-60、Tra-1-81和SSEA-4已被用于识别和去除未分化的hPSCs（小鼠胚胎干细胞，mESCs使用SSEA-1）。例如，FACS和MACS可以从其他细胞中分离出SSEA-4和Tra-1-81标记的hESCs（人类胚胎干细胞），针对SSEA-5、CD（分化群）9和CD90的FACS，这些是多能干细胞的标记，可以从未完全分化的hESC培养物中去除具有畸胎瘤形成潜力的细胞。波达卡林样蛋白-1也在未分化细胞中高度表达，识别波达卡林样蛋白-1的细胞毒性抗体已被用于选择性杀死未分化的hESCs。此外，表面蛋白的特定糖基化可以区分多能细胞和非多能细胞；因此，具有独特结合能力的凝集素已被用于去除hPSCs。 需要注意的是，畸胎瘤也可能起源于仍具有干细胞特征且未完全分化的前体细胞；因此，这些前体细胞也需要从干细胞衍生产品中去除。无论如何，对于安全的细胞治疗来说，确定去除标准和检测未分化干细胞或前体的检测方法的灵敏度至关重要。 3.2.神经分化的表面标记 当前的hPSCs神经分化方法在发育阶段和谱系规范方面导致细胞异质性。CD133、A2B5、CD29、CD146、NCAM（神经细胞黏附分子）（或CD56）和CD271被报道为神经前体细胞（NPCs）的表面标记，CD24和NCAM是神经元的表面标记。通过FACS靶向CD24或NCAM可以分离分化的神经元。NPCs、神经元和胶质细胞的分离也可以通过标记组合实现（例如CD184+/CD271−/CD44−/CD24+用于NPCs；CD271−/CD133+用于神经元），不同的组合可以用来描绘NPCs：CD184+/CD326−、CD133+/CD45−/CD34−，CD133、CD15和GCTM-2的表达，以及CD24、CD15和CD29的表达。最近，使用CORIN（一种地板板标记）来分离人类iPSC衍生的多巴胺能前体。使用LMX1AEGFP（LIM同源框转录因子1-A）报告细胞系，已鉴定出可以从hESCs衍生的多巴胺能神经元中选择性富集的新膜标记，如多唾液酸化的胚胎形式的神经细胞黏附分子（PSA-NCAM）和接触蛋白2（CNTN2）。其他研究已经鉴定出新的表面标记，用于正向富集中脑多巴胺能神经元，如LRTM1（富含亮氨酸重复和跨膜域1）、CORIN和CD166，或在LMX1+ FOXA2（叉头框A2）+细胞分选后去除不需要的细胞（CXCR4，C-X-C基序趋化因子受体4）的标记。 报道的少突胶质细胞前体的表面标记包括NG2（神经/胶质抗原2）、PDGFRα（血小板衍生生长因子受体α）和DLX2（远端缺乏同源框2）或PDGFRα/CD140。然而，由于细胞表型的异质性很大，因此很难仅基于单一标记分离少突胶质细胞。 3.3.心肌细胞分化的表面标记 已经鉴定了心脏前体细胞和成熟心肌细胞的标记。KDR（激酶插入域受体）low/C-KITneg心脏前体细胞表达高水平的心脏转录因子，并且在进一步分化后可以产生>50%的心肌细胞。同样，KDR+/PDGFRα+心脏前体细胞可以分化成>80%的心肌细胞。此外，也已经鉴定出心肌细胞特异性表面标记，包括信号调节蛋白α（SIRPA）、VCAM1和活化的白细胞细胞粘附分子（ALCAM）。从起始培养物中基于SIRPA的选择，这些培养物约有40-50%的心肌肌钙蛋白T阳性（cTnT+），90-98%的细胞对cTnT+呈阳性。通过MACS基于VCAM1的选择可以富集cTnT+细胞高达95%。与这些正向选择方法相比，对于心肌细胞分化效率高（80-90%）的培养物，可能考虑去除不需要的细胞群体。同样，可以使用VCAM1偶联的磁性Dyna珠子或整合素（α1、α5和α6）和N-钙粘蛋白纯化心肌细胞至90%以上纯度。 3.4.内胚层、肝脏、肾脏和胰腺细胞分化的表面标记 hPSC衍生的胰腺细胞是异质性的。CD142被鉴定为胰腺内胚层（PE）细胞的标记，这些细胞能够产生具有葡萄糖反应性的胰岛素分泌细胞，而CD200和CD318是内分泌细胞的标记。因此，靶向如CD142这样的标记可以富集PE细胞，这也被证明可以降低畸胎瘤形成的概率（从46%降低到0%）。GLUT2（葡萄糖转运蛋白2），与PDX-1（胰腺和十二指肠同源盒1）共表达，以及与PDX-1+细胞相关的CD24，也已被评估用于富集来自hPSCs的胰腺前体细胞。此外，在一项针对SOX17以分离hESC衍生内胚层细胞的研究中，已鉴定出表面标记CXCR4、CD49e、CD141和CD238。尽管CD133被报道为小鼠胰腺前体的标记，但它在人类中的表达可能比胰腺PDX-1阳性细胞更广泛。更成熟的内胚层细胞，如源自PSCs的肝细胞，也可以通过特定的膜标记（例如SLC10A1（溶质载体家族10成员1）、CLRN3（Clarin 3）或AADAC（芳基乙酰胺脱乙酰酶）），或ASGR1（即Asialoglycoprotein受体1）进行分离。通过一组膜标记，如CD9−/CD140a+/CD140b+/CD271+细胞，还可以分离出OSR（Odd-Skipped Related Transcription Factor）1+/SIX2（SIX同源框2）+肾脏前体细胞。类似地，通过选择性耗尽CD200+细胞可以选择性地分离角膜上皮细胞。 然而，仍然存在问题，即通过不同标记集识别的细胞群体是否是不同阶段的相同细胞，还是沿着相似发育轨迹的不同细胞。对于生产目的，需要对分离的群体进行全面表征，并证明其对目标应用具有一致的属性。 3.5.用于分离hPSC衍生细胞的非表面标记 除了表达在细胞膜上之外，特定于特定细胞的标记也可以用于分离这些细胞。例如，可以通过分子信标（MBs）检测活细胞中的mRNA，它们是带有荧光团的茎-环（发夹）寡核苷酸探针，另一端带有猝灭剂。针对Oct-4（八聚体结合转录因子4）或Sox2（性别决定区Y盒2）的MBs可以从分化细胞中分离未分化的PSCs；针对心肌细胞标记肌球蛋白重链β（MYH7）的MBs可以富集来自小鼠和人类胚胎干细胞的心肌细胞；针对NPPA（心钠素A型）mRNA的MB，已知与早期工作型心肌细胞相关，可以从心肌细胞分化培养中富集工作型心肌细胞。对于使用MBs进行细胞分离，精心设计并广泛验证针对所需基因的MB探针至关重要。 3.6.敲入报告细胞系 基因组编辑技术（例如CRISPR/Cas9（簇状规律间隔短回文重复/CRISPR相关蛋白9）、TALEN（转录激活因子样效应核酸酶）等）的应用使得构建新型细胞系成为可能，这些细胞系在特定标记表达时发出荧光或通过诱导抗生素抗性而具有特定表型，从而实现纯化。例如，CRISPR/Cas9编辑hiPSCs已实现双报告TBX5（T-Box转录因子5）Clover2和NKX2-5（NK2同源框5）TagRFP细胞的生成，用于纯化心脏细胞亚型，如来自第一心脏领域、心外膜、第二心脏领域和内皮细胞系的细胞。或者，NKX2-5eGFP/w和MLC（肌球蛋白调节轻链）2vmCherry/w报告细胞已被生成以分离心室样细胞。基因组编辑（TALEN）也被用来在肌球蛋白轻链2（MYL2）位点引入选择标记（新霉素）或GFP，用于识别和选择心室心肌细胞。同样，引入在心脏特异性α-肌球蛋白重链（即α-MHC，MYH6）启动子控制下的Zeocin抗性基因已被用于在心肌梗死小鼠模型中纯化iPSC衍生的心肌细胞（iPSC-CMs）。 类似的策略也被用于识别和选择肌源性衍生物。例如，CRISPR/Cas9介导的同源重组方法已被用于选择MYF5（肌源因子5）GFP肌肉前体。构建双报告PAX7（配对盒7）tdTomato和MYF5EGFP使得能够纯化肌肉干细胞（卫星细胞），而诱导PAX7表达系统促进了均匀的骨骼肌源性前体细胞群体的生成。报告细胞也已生成用于纯化神经衍生物。例如，引入驱动mCherry表达的人类囊泡GABA（γ-氨基丁酸）转运蛋白（hVGAT）启动子已实现GABA能神经元的分离，而中脑多巴胺能神经元可以使用酪氨酸羟化酶（TH）RFP构建进行选择。然而，鉴于hPSC衍生物的治疗应用，这些方法可能因基因组修改而增加肿瘤形成的风险。 4.hPSC衍生细胞下游生物加工的工作流程 hPSC衍生细胞生产的下游生物加工涉及多个步骤，这些步骤将累积减少每个步骤的产量（图1B显示了使用MACS耗竭的示例）。主要步骤包括：(1) 细胞收获：将细胞从大量培养容器的粘附表面分离；(2) 离心或浓缩和培养基交换：去除收获酶并洗涤细胞；(3) 保持：收集的细胞在缓冲液中保持，等待所有细胞被收获和离心；(4) 耗竭：去除不需要的杂质细胞；(5) 离心：去除耗竭缓冲液，并在冷冻保护缓冲液中重悬；(6) 细胞配方用于冷冻保存：将细胞转移到冷冻管中并准备冷冻保存。由于这些众多步骤，如果每个步骤的产量为90%（理想情况），最终产量将是50-60%，如果每个步骤的产量为80%（良好情况），最终产量将是30-35%。因此，由于下游加工，可能会损失超过一半的细胞，这通常发生在细胞扩增和分化数月后的一个工作日。 因此，了解每个步骤的操作参数绝对是必要的，以最小化细胞损失的同时保持功能活性细胞。 4.1.细胞收获 从大量容器中收获细胞的关键组成部分是收获酶和洗涤体积。酶的高浓度或不适当的解离溶液或持续时间可能会降低细胞活性和/或无法去除表面上的所有细胞。对于分化培养，胰蛋白酶一直是常用的酶，但其浓度和孵化时间需要针对特定细胞类型进行优化。使用作为高渗溶液配制的柠檬酸钠的新非酶传代方法已被用于分离hPSCs的多细胞聚集体。对于生物加工，希望减少收获体积，这需要在低体积和由于洗涤不足导致的细胞损失之间取得平衡。通过将温度从37°C改变到4°C，使用热响应水凝胶释放hPSCs的新进展已经实现。 4.2.离心 离心过程中的参数包括速度、时间、细胞悬浮液体积和细胞浓度。已经观察到不同细胞收集的沉降变化，这触发了多次离心。收获酶、淬灭缓冲液和等待时间都可能有助于沉降性能。对于大量容器，需要开发大规模离心过程（例如使用袋子）以减少离心步骤的时间。 4.3.保持缓冲液和保持温度 当容器数量高（>100 T- flasks）且处理时间长（长达6-8小时）时，保持过程变得重要。为了将所有细胞一起用于后续处理，首先收获的细胞必须在缓冲液中等待，直到收获步骤完成。因此，需要评估保持缓冲液和保持温度（37°C、25°C或4°C）以维持细胞活性。在制定保持缓冲液时，应考虑细胞聚集。尽管收获的细胞处于单细胞悬浮状态，但细胞可能在保持期间自组装成聚集体。聚集的程度取决于细胞类型、细胞浓度和保持时间。聚集体的形成将影响后续步骤中细胞标记和分离的效率，显著降低细胞产量。 4.4.耗竭缓冲液配方和体积 当细胞群体中有高比例的所需细胞时，耗竭被用来去除少量的杂质细胞。这个过程可以通过MACS针对不需要的细胞表面上的标记来完成。耗竭缓冲液的要求与保持缓冲液相似：维持细胞活性和防止细胞聚集。聚集的细胞不允许与抗体偶联珠均匀标记和容易的细胞-珠分离（图1C）。因此，需要仔细制定耗竭缓冲液。耗竭的细胞浓度和体积影响耗竭规模。首选高细胞浓度（>107细胞/mL）和低体积（<100 mL），同时需要最小化细胞损失。由于可以使用多个标记进行耗竭，因此可能需要重复此步骤以去除不同的细胞群体。 4.5.冷冻保存配方 冷冻保存缓冲液和体积是该步骤的重要参数。一般来说，冷冻保存缓冲液取决于感兴趣的分化细胞类型，冷冻保存的细胞浓度取决于预期的应用。对于移植研究，可能需要高浓度的细胞（每管107-108个细胞），以最小化解冻过程的时间和达到所需细胞剂量的管数。 5.hPSC衍生产品下游加工的挑战 5.1.hPSC衍生神经前体细胞下游加工的挑战 使用MACS已经实现了从PSCs衍生的神经元的大规模纯化，产量高达105-106个神经元（纯度超过90%）。然而，这些特定谱系的下游加工仍然存在特定挑战。在神经前体细胞的情况下，收获的细胞密度相对较低（约每平方厘米1×106个细胞），这可能需要从大量容器中收获细胞。如果能够达到更高的收获密度，那么为了获得所需数量的细胞（每次生产约109个细胞，下游加工体积为50-100 mL），所需的容器数量将显著减少。通过增加播种密度和/或增强细胞增殖来增加收获密度。然而，根据培养系统和细胞表型对密度变化的敏感性，播种密度可能会影响自分泌和旁分泌因子的分泌，这些因子已被证明影响hPSC的自我更新和分化。为了增强细胞增殖，可以考虑改变生长培养基（含有生长因子）和通常涂有层粘连蛋白、Matrigel和纤维连接蛋白等基质蛋白的基质。然而，对培养基和基质所做的任何改变都需要仔细比较。 5.2.hPSC衍生心肌细胞下游加工的挑战 对于心肌细胞来说，下游生物加工的负担比神经前体细胞更为严重。治疗应用所需的细胞数量对心肌细胞来说更高（每次生产约1010个细胞），比神经前体细胞（每次生产约109个）多。在心肌细胞的下游生物加工的所有步骤中，可能需要比神经前体细胞多10倍的浓缩细胞制备或多10倍的悬浮液体积。使用代谢选择方法已经实现了从人类PSCs衍生的心肌细胞的大规模纯化，纯度达到99%，产量高达2×109个功能细胞。心肌细胞也比神经前体细胞更容易形成聚集体，因此耗竭步骤的产量可能会降低。为了有效地用磁性珠标记细胞并分离不同的群体，心肌细胞需要在下游生物加工过程中保持为单细胞悬浮液。因此，需要制定保持缓冲液和耗竭缓冲液（例如抗聚集剂、生物聚合物）以防止细胞聚集（图1C）。鉴于治疗用途所需的数量，hPSC衍生心肌细胞的下游加工规模可能很大。因此，将需要扩大下游生物加工过程中不同步骤的规模（例如大规模离心）。或者，为收获hPSC衍生心肌细胞设计的自动化过程将是有益的。 6.结论和展望 在实现了hPSCs的高效分化后，下游生物加工已成为生产hPSC衍生细胞治疗产品的瓶颈。识别所需谱系的特定标记和去除未分化细胞的策略对于生产安全的细胞治疗至关重要。理想情况下，高细胞纯度，去除不需要的细胞类型将减少下游生物加工的负担。需要开发严格的质量控制系统和高灵敏度的检测方法，以确保细胞分离后产品的一致性。能够预测体内效应的体外检测是可取的，以减少临床前研究的数量。应用质量由设计（QbD）策略来理解过程和产品，更好地控制过程，以生产一致和安全细胞产品应该可能实现hPSCs的潜力。 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 时间：2024年10月16-17日 地点：上海张江（酒店定向通知） 规模：600-800人 主办单位：生物制品圈、抗体圈 演讲支持：Entegris、瑞孚迪、AS ONE CORPORATION 会议费用：免费FREE!（仅收取100元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），先到先得，报完即止！ 报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！ 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 日程安排 更多嘉宾正在邀请中 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

成纤维细胞是维持组织稳态的关键结构细胞，在纤维化、炎症和癌症等疾病状态下呈现出多种表型来影响疾病进程及其治疗抗性[1,2]。肌成纤维细胞（myofibroblasts）因其对肿瘤微环境的关键调控作用，近年来受到广泛关注。研究发现，它们在胰腺癌、乳腺癌和结肠癌等多种癌症中表现出显著的免疫抑制作用[3-5]；然而，肌成纤维细胞的异质性、在不同疾病状态下的分布特征、空间定位及其与其它免疫细胞的互作机制仍有待深入研究。 2024年9月19日，百奥智汇创始人、科学顾问，北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）/深圳湾实验室张泽民院士课题组在Cancer Cell上发表题为Cross-tissue human fibroblast atlas reveals myofibroblast subtypes with distinct roles in immune modulation的研究。该研究基于健康、纤维化、炎症以及癌症等多种疾病状态下的11种组织的单细胞数据，构建了涵盖517个人类样本、269,899个成纤维细胞的图谱，并鉴定出20种成纤维细胞亚型，揭示了成纤维细胞未被充分认识的转录异质性，其中发现了4类具有独特表型的肌成纤维细胞亚型。通过整合空间转录组、多重免疫组化和体外实验，该研究进一步揭示了肌成纤维细胞在肿瘤微环境中的独特免疫调控功能，为开发肿瘤微环境特异性靶向治疗策略提供了新的思路。 这项研究揭示了组织和疾病环境在塑造成纤维细胞表型及其分布中的关键作用。在慢性炎症和纤维化疾病中，肌成纤维细胞亚型逐渐增多，并在癌症进展过程中不断累积，表明肿瘤环境对成纤维细胞表型的重塑作用。通过调控成纤维细胞的信号传导和代谢通路，最终促成了免疫抑制肿瘤微环境的形成。这些发现为成纤维细胞转录可塑性提供了有力证据，支持了成纤维细胞从启动和支持炎症到最终抑制炎症的不同表型之间动态转换的观点[2]。 相比于其他肌成纤维细胞亚型，LRRC15+ 肌成纤维细胞表现出终末分化特征，可能来源于两大细胞亚型——祖细胞样成纤维细胞（PI16+ 和 COL15A1+）以及周细胞（RGS5+）。多重免疫组化染色进一步证实，在肿瘤区域表达周细胞标志物（MCAM+、PDGFRβ+）的LRRC15+ 成纤维细胞，表明其潜在的周细胞来源。而PI16+ 成纤维细胞则位于癌旁间质区域，研究揭示特定细胞因子促进其表型形成。进一步研究这些成纤维细胞亚型与免疫细胞的互作模式和空间定位特征，发现PI16+ 成纤维细胞和LRRC15+ 成纤维细胞在多种癌症类型中参与了不同的空间多细胞模块（CMs）。其中PI16+ 成纤维细胞与CX3CR1+ Temra细胞和LYVE1+ 巨噬细胞相互作用，表现出抗肿瘤免疫特征；而LRRC15+ 成纤维细胞则与SPP1+ 巨噬细胞共定位于癌巢区域，显示出免疫排斥功能。根据成纤维细胞祖细胞或终末分化肌成纤维细胞的丰度对肿瘤患者进行分型，发现其在多个癌种中具有显著预后差异，支持两种成纤维细胞亚型在肿瘤微环境中的不同作用，该发现为患者分型和临床治疗策略提供了新方向。 此外，这项研究还发现了一类具有炎性特征的MMP1+肌成纤维细胞，通过与Treg细胞和LAMP3+树突状细胞共同构建免疫抑制微环境来促进免疫逃逸。MMP1+成纤维细胞可能通过CCL2-CCR4等途径招募Treg细胞，并通过分泌TGF-β和IL-11促进免疫耐受环境的形成，通过分泌MMPs等蛋白参与组织重塑，进一步影响免疫细胞的迁移和功能。MMP1+和LRRC15+成纤维细胞特征在不同癌种的免疫治疗无响应者中显著富集，表明它们在特定癌种中有望成为癌症治疗中的联合治疗靶点。 图1. 人类跨组织成纤维细胞图谱概览图 综上所述，该研究全面探讨了在不同组织和疾病背景下成纤维细胞的表型和分布特征，并揭示了不同肌成纤维细胞在免疫调控中的独特作用。这些发现将进一步深化对疾病相关成纤维细胞的理解，并为患者分型和开发新的联合治疗方案提供重要线索。 深圳湾实验室助理研究员高洋、昌平实验室助理研究员李佳楠、北京大学前沿交叉学科研究院CLS项目博士生程文凤为该论文的并列第一作者，北京大学BIOPIC张泽民院士、广东医科大学附属东莞第一医院的侯文洪博士为该论文的共同通讯作者。研究得到了深圳湾实验室重大项目和深圳湾实验室开放基金、中国博士后科学基金和粤莞联合基金的资助。深圳湾实验室超算中心为该研究提供了计算资源支持。 论文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1535610824003192 参考文献: 1.Biffi, G., and Tuveson, D.A. (2021). Diversity and Biology of Cancer-Associated Fibroblasts. Physiol Rev 101, 147-176. 10.1152/physrev.00048.2019. 2.Davidson, S., Coles, M., Thomas, T., Kollias, G., Ludewig, B., Turley, S., Brenner, M., and Buckley, C.D. (2021). Fibroblasts as immune regulators in infection, inflammation and cancer. Nat Rev Immunol 21, 704-717. 10.1038/s41577-021-00540-z. 3.Krishnamurty, A.T., Shyer, J.A., Thai, M., Gandham, V., Buechler, M.B., Yang, Y.A., Pradhan, R.N., Wang, A.W., Sanchez, P.L., Qu, Y., et al. (2022). LRRC15(+) myofibroblasts dictate the stromal setpoint to suppress tumour immunity. Nature 611, 148-154. 10.1038/s41586-022-05272-1. 4.Foster, D.S., Januszyk, M., Delitto, D., Yost, K.E., Griffin, M., Guo, J., Guardino, N., Delitto, A.E., Chinta, M., Burcham, A.R., et al. (2022). Multiomic analysis reveals conservation of cancer-associated fibroblast phenotypes across species and tissue of origin. Cancer Cell 40, 1392-1406.e1397. 10.1016/j.ccell.2022.09.015. 5.Qi, J., Sun, H., Zhang, Y., Wang, Z., Xun, Z., Li, Z., Ding, X., Bao, R., Hong, L., Jia, W., et al. (2022). Single-cell and spatial analysis reveal interaction of FAP(+) fibroblasts and SPP1(+) macrophages in colorectal cancer. Nat Commun 13, 1742. 10.1038/s41467-022-29366-6. 张泽民，北京大学生物医学前沿创新中心主任，北京大学生命科学学院终身讲席教授，北大-清华生命科学联合中心高级研究员，长江学者，中国科学院院士。张泽民博士的学术经历包括南开大学、CUSBEA项目（中美生物化学联合招生项目）、美国宾夕法尼亚州立大学和加州大学旧金山分校。在 2014 年加入北大以前就任基因泰克/ 罗氏公司（Genentech/Roche）16余年，负责生物信息学和癌症基因组学研究，挖掘抗癌靶点。张泽民课题组致力于用前沿的生物信息和基因组学来解决癌症生物学中的核心问题，专注于研究肿瘤微环境的底层特征，发现了肿瘤在微环境水平的异质性和潜在规律，推进其在药物疗效预测和靶点发现中的应用。张泽民课题组的研究成果曾获得北京市自然科学一等奖、中国生命科学十大进展、中国生物信息十大进展（多次）。他也是几个国际顶尖杂志的编委，包括Cell, Cancer Cell, Cancer Discovery和Cell Research。 张泽民课题组目前主要的研究方向包括：（1）研究肿瘤微环境特别是肿瘤浸润免疫细胞的精确组成、相互作用以及功能状态，并鉴定影响这些细胞功能的调控基因；（2）研究肿瘤微环境的异质性、及其对癌症病人治疗的影响；（3）开发原创的生物信息学工具和数据库，来进行大数据的整合、分析和可视化。 本文来源：北京大学生物医学前沿创新中心 百奥智汇一站式解决方案 关于百奥智汇 百奥智汇成立于2018年，是一家拥有全球视野的生命科学技术公司，致力于将单细胞机理研究平台和生物信息学大数据/AI平台充分应用于癌症等重大人类疾病的诊断和治疗中，充分利用自身强大的科研能力、自有平台和数据，创建人类疾病的精准细胞图谱，寻找具突破性的疾病诊断和治疗靶标、开发颠覆性的治疗方法。 欲了解更多关于百奥智汇的信息或服务，可通过下方的通讯方式联系我们。

摘要：随着人类多能干细胞（hPSCs）特定谱系分化技术的进步，下游细胞分离已成为生产hPSC衍生产品的关键步骤。由于分化过程通常导致异质细胞群的形成，需要进行细胞分离，以富集所需的细胞群或去除不需要的细胞群。本文总结了hPSC衍生细胞分离过程的最新进展，包括标准的分离技术，如磁激活细胞分选，以及基于粘附强度和代谢通量等新型分离策略。特别讨论了下游生物加工流程和不同细胞谱系表面标记的识别。尽管大规模hPSC衍生细胞的下游生物加工仍面临挑战，但应实施合理的质量设计方法，以增强对过程与产品之间关系的理解，并确保所产生细胞的安全性。 1.引言 人类多能干细胞（hPSCs）因其独特的自我更新能力和分化成几乎所有类型细胞的能力，为多种体细胞组织提供了替代细胞来源。hPSC衍生物已在几个I期临床试验中进行了测试，以评估它们作为治疗产品的潜在用途，并且还用于药物发现和疾病建模。最初，hPSC衍生细胞的开发和制造集中在优化分化效率上，即上游生物加工，从而改进了分化协议，允许以高效率和纯度生产特定谱系的细胞。例如，使用基于胚胎体（EB）的协议或通过双重抑制SMAD（小母体抗背足蛋白）信号的单层协议，可以从hPSCs中以70-90%的纯度生成少突胶质细胞前体（OPCs）和神经前体细胞（NPCs），以及使用生长因子或小分子引导的协议可以生产30-90%纯度的心肌细胞。这些高效分化协议的开发显示了上游生物加工在生产hPSC衍生细胞方面的巨大进展。然而，下游生物加工（即细胞分离），作为完成hPSC衍生产品的关键步骤和瓶颈，需要进一步研究。 由于当前从hPSCs分化的过程通常会产生包括残留未分化细胞在内的混合细胞类型，因此需要进行下游生物加工，以选择性纯化所需的细胞群或去除不需要的细胞群（图1A）。例如，最终的干细胞产品不含未分化细胞或不需要的谱系的前体细胞对于减少移植后畸胎瘤形成的风险至关重要。在这里，我们回顾了hPSC衍生物的新兴下游生物加工，包括hPSC扩增和分化后的细胞分离的最新进展。我们提供了识别新型谱系特异性表面标记的例子，这些标记可以用于分离hPSC衍生细胞。此外，我们还讨论了hPSC下游生物加工的方法和实际流程，以及生产神经和心脏细胞面临的特定挑战。 图1 hPSC衍生产品的下游生物加工。(A) 富集和耗竭策略以分离hPSC衍生细胞。(i) 富集：收集所需细胞（适用于低分化效率）。(ii) 耗竭：去除不需要的细胞（适用于高分化效率）。(B) 下游处理的主要步骤。(1) 细胞收获；(2) 离心以去除收获酶；(3) 保持等待所有细胞被收获；(4) 耗竭以去除不需要的细胞；(5) 离心以去除耗竭缓冲液；以及 (6) 填充和完成将细胞转移到冷冻保护缓冲液中进行冷冻保存。如果每个步骤在理想情况下的产量为90%，则这些步骤后的总产量预计为59%。(C) 聚集对大规模细胞标记的影响。(i) 单细胞悬浮液允许用磁性珠进行细胞标记。(ii) 如果发生聚集，目标细胞无法均匀标记，聚集体中未标记的细胞被去除，从而降低了产量。(iii) 具有高聚集倾向的细胞保持在配制的缓冲液中作为单细胞悬浮液，以提高处理效率。本图包含了Servier Medical Art (smart.servier.com)的图像。 2.纯化hPSC衍生产品的技术 在分化过程中，hPSCs及其衍生物在细胞密度、表面标记的表达、代谢需求和粘附强度方面具有阶段特异性。基于这些和其他特征，已经评估了不同类型的干细胞衍生细胞的分离过程，包括基于密度的分离和荧光激活细胞分选（FACS）以及基于特定表面标记的磁激活细胞分选（MACS）等标准分离技术。随着对hPSC属性的更好理解，也开发了基于差异粘附到培养容器的细胞分离和基于不同代谢活性的选择性去除细胞等新型分离策略。 2.1.基于密度的分离 在分化培养中可能会产生具有不同细胞密度的混合细胞类型，可以根据它们的密度进行分离。一个例子是使用Percoll梯度离心来富集hPSC衍生的心肌细胞。从分化培养中收获的细胞被加载到Percoll的两层上，然后进行离心。大多数心肌细胞将出现在Percoll的下层，而非心肌细胞将在其他分数中。从含有大约50%心肌细胞的起始分化培养中可以获得高达95%纯度的心肌细胞。然而，这种方法分辨率低，不适合大规模分离。 2.2.基于细胞生物物理特性的分离 在未分化的hPSCs、部分重编程细胞、体细胞和hPSC衍生的分化细胞之间观察到显著的生物物理特性差异。例如，粘附特性、质膜刚度和光学特性在hPSCs的不同发育阶段表现出不同。这些特性的变化可以作为选择特定承诺群体的目标。 hPSC衍生的心肌细胞显示出来自肌球蛋白杆状体的特定二次谐波信号，这使得它们能够从异质的分化细胞群体中分离出来。或者，从重新培养的分化hESC聚集体中衍生的神经嵴细胞会自发地从主要细胞团中分离出来，这使得它们可以通过形状选择和手动挑选进行隔离。 另一方面，从小鼠诱导多能干细胞（miPSCs）衍生的扩增色素细胞被证明比非色素细胞更具粘附性。这种特性使得它们可以通过调节暴露时间和酶解离的类型来进行纯化：非色素菌落可以通过5分钟的Accutase处理和吹打来回收，而剩余的粘附色素细胞可以用胰蛋白酶二次回收。类似地，在细胞解离前用ROCK（Rho相关蛋白激酶）抑制剂（Y-27632）进行介质补充，可以去除粘附性较低的细胞，从而富集内皮祖细胞。此外，发现退出多能性会增加细胞膜刚度。这些膜流动性和脂质组成的改变可以与分化阶段联系起来。基于这一原理，可以根据膜流动性条件下它们的粘附特性进行细胞分离，以选择各种分化细胞。 人类诱导多能干细胞（hiPSC）菌落可以在4分钟内通过85-125 dynes/cm2的剪切应力在流体流动应用下脱落，而分化细胞由于粘附强度更高而保持附着。这种方法可以从异质重编程培养物和分化的后代中分离出完全重编程的iPSC菌落，纯度超过95%。然而，这种方法尚未评估用于特定谱系分化的细胞。 由于细胞/粘附表面相互作用在分化过程中受到调节，这导致了新型生物材料的开发，用于特定分化表型的细胞隔离。在未分化阶段，iPSC菌落可以从热敏聚合物（PNIPAAm（聚（N-异丙基丙烯酰胺）））在低温（即22°C）下选择性脱落，而承诺的细胞仍然附着在表面。这种方法可以实现未分化干细胞群体的非侵入性富集。类似地，hiPSCs承诺用于心脏谱系，种植在与层粘连蛋白-521涂层的聚（N-异丙基丙烯酰胺）上，其临界溶液温度在8°C，促进心肌细胞的特定脱落。 此外，研究发现，通过高速激光照射光响应聚合物的特定区域（即聚[（甲基丙烯酸甲酯）-共（分散黄7丙烯酸酯）]层）可以消除承诺的细胞。或者，不同亚型的层粘连蛋白促进各种分化细胞类型的不同粘附强度。例如，LN211/332/511E8促进非上皮细胞的粘附，而LN332/511E8则有利于上皮细胞的附着和增殖。细胞与不同层粘连蛋白亚型结合的特异性使角膜上皮细胞能够从异质分化的细胞中纯化。 2.3.基于代谢活性的选择性细胞去除 基于心肌细胞和非心肌细胞在葡萄糖和乳酸代谢上的显著生化差异，可以从hPSC分化培养中获得高纯度（高达99%）的心肌细胞。未分化的hPSCs和主要依赖糖酵解的非心脏细胞在葡萄糖耗尽和乳酸丰富的条件下无法生存，而心肌细胞可以通过使用乳酸作为替代能源而存活。因此，在补充乳酸的葡萄糖耗尽培养基中，心肌细胞更倾向于存活并因此被富集。同样，使用葡萄糖耗尽并补充脂肪酸和3,3′,5-三碘-L-甲状腺素（即促进脂肪酸氧化和线粒体生物发生的分子）的培养基，已报道了心肌细胞的选择和成熟。视网膜上皮细胞（RPE）被发现表达高水平的脂蛋白受体内化AcLDL（乙酰化低密度脂蛋白）。基于这一原理，使用Dil偶联的AcLDL对分化的RPE群体进行特异性标记和富集。另一个例子是靛青绿（ICG）被肝细胞特异性内化。通过修改ICG的荧光发射特性，设计了一种肝细胞纯化剂（HPA，λem = 562 nm），用于标记和体外分选来自hPSCs的纯化肝细胞。 2.4.负选择 与正细胞选择相反，其他方法已经开发出来，通过特异性诱导不需要的细胞类型的凋亡来去除它们，从而提高所需表型的回收率。例如，将PSCs转染与合成微小RNA（miRNA）开关（即在没有目标miRNA的情况下减少相关蛋白的翻译水平），miR-Bim（Bcl-2相互作用的细胞死亡介质）开关，诱导未分化细胞的选择性凋亡，同时保持分化的心肌细胞。或者，凝集素rBC2LCN-PE23被发现能够特异性结合并内化到未分化的干细胞，并诱导它们的凋亡。这种化合物被发现可以有效地降低畸胎瘤形成的风险。 2.5.通过FACS分离 FACS设备可以检测用荧光素偶联抗体标记的细胞的荧光信号。基于标记特征和目标标记（通常是表面抗原），FACS允许将单个细胞根据多个表面标记进行高选择性地排序和分离成不同群体（例如SSEA（阶段特异性胚胎抗原）-4阳性或SSEA-4阴性）。FACS的一个优点是它允许基于多个表面标记进行连续和多参数分离，尽管细胞活性可能会受到排序程序的影响。然而，FACS的通量有限，每秒可排序5×103到7×104个细胞。因此，FACS更适合研究用途的小规模细胞分离。 2.6.通过MACS分离 MACS是一种类似于FACS的技术，但使用带有针对特定细胞表面抗原的抗体的磁性颗粒。在磁场中，磁性标记的细胞将在柱中保留，未标记的细胞将流出。例如，通过针对心肌细胞相关表面标记VCAM1（血管细胞粘附分子1）的MACS，从hPSC分化培养中富集心肌细胞至95%。然而，尽管MACS是一种吸引人的方法，可以从细胞混合物中选择性地去除不需要的细胞，但它也有其局限性。例如，一项建模研究表明，为了从分化和未分化细胞的池中清除SSEA-1阳性的未分化干细胞，需要不切实际数量的重复MACS。然而，磁性珠的亲和力也可以通过新型表面修饰来提高，以提高排序效率。MACS的一个优点是，由于成本较低和商业化的自动化、封闭系统的可用性，它比FACS更适合大规模处理。MACS珠的替代品，SpheriTECH，通过简单的亲和结合在大珠上排序细胞，无需纯化标签，就能纯化来自hiPSCs的光感受器前体细胞。 2.7.使用微流控技术分离 微流控技术最近被证明是hPSC培养、表征和筛选的高效工具。微流控技术也可用于异质分化细胞群体的分离。例如，已制造微流控滚动柱用于选择性分离SSEA-1阳性细胞。滚动柱芯片的边界涂有抗体，降低了SSEA-1阳性细胞的滚动速度，而承诺的细胞则流出通道。因此，SSEA-1阳性细胞在通道内停留的时间更长，从而可以从分化细胞中分离出来。通过在微流控芯片底部覆盖有抗Tra（肿瘤相关抗原）-1-60抗体的脊状图案，也进行了类似的操作，从hiPSCs衍生的心肌细胞中消除未分化细胞。 3.表面标记识别用于分离hPSC衍生细胞 由于FACS和MACS依赖于表面标记的检测，因此识别不同谱系在hPSC分化过程中不同阶段的特异性表面标记非常重要。我们讨论了关于未分化细胞和三个胚层衍生物（包括神经细胞、心肌细胞和胰腺前体）表面标记的研究示例（表1）。 3.1.未分化细胞的表面标记 表面标记如Tra-1-60、Tra-1-81和SSEA-4已被用于识别和去除未分化的hPSCs（小鼠胚胎干细胞，mESCs使用SSEA-1）。例如，FACS和MACS可以从其他细胞中分离出SSEA-4和Tra-1-81标记的hESCs（人类胚胎干细胞），针对SSEA-5、CD（分化群）9和CD90的FACS，这些是多能干细胞的标记，可以从未完全分化的hESC培养物中去除具有畸胎瘤形成潜力的细胞。波达卡林样蛋白-1也在未分化细胞中高度表达，识别波达卡林样蛋白-1的细胞毒性抗体已被用于选择性杀死未分化的hESCs。此外，表面蛋白的特定糖基化可以区分多能细胞和非多能细胞；因此，具有独特结合能力的凝集素已被用于去除hPSCs。 需要注意的是，畸胎瘤也可能起源于仍具有干细胞特征且未完全分化的前体细胞；因此，这些前体细胞也需要从干细胞衍生产品中去除。无论如何，对于安全的细胞治疗来说，确定去除标准和检测未分化干细胞或前体的检测方法的灵敏度至关重要。 3.2.神经分化的表面标记 当前的hPSCs神经分化方法在发育阶段和谱系规范方面导致细胞异质性。CD133、A2B5、CD29、CD146、NCAM（神经细胞黏附分子）（或CD56）和CD271被报道为神经前体细胞（NPCs）的表面标记，CD24和NCAM是神经元的表面标记。通过FACS靶向CD24或NCAM可以分离分化的神经元。NPCs、神经元和胶质细胞的分离也可以通过标记组合实现（例如CD184+/CD271−/CD44−/CD24+用于NPCs；CD271−/CD133+用于神经元），不同的组合可以用来描绘NPCs：CD184+/CD326−、CD133+/CD45−/CD34−，CD133、CD15和GCTM-2的表达，以及CD24、CD15和CD29的表达。最近，使用CORIN（一种地板板标记）来分离人类iPSC衍生的多巴胺能前体。使用LMX1AEGFP（LIM同源框转录因子1-A）报告细胞系，已鉴定出可以从hESCs衍生的多巴胺能神经元中选择性富集的新膜标记，如多唾液酸化的胚胎形式的神经细胞黏附分子（PSA-NCAM）和接触蛋白2（CNTN2）。其他研究已经鉴定出新的表面标记，用于正向富集中脑多巴胺能神经元，如LRTM1（富含亮氨酸重复和跨膜域1）、CORIN和CD166，或在LMX1+ FOXA2（叉头框A2）+细胞分选后去除不需要的细胞（CXCR4，C-X-C基序趋化因子受体4）的标记。 报道的少突胶质细胞前体的表面标记包括NG2（神经/胶质抗原2）、PDGFRα（血小板衍生生长因子受体α）和DLX2（远端缺乏同源框2）或PDGFRα/CD140。然而，由于细胞表型的异质性很大，因此很难仅基于单一标记分离少突胶质细胞。 3.3.心肌细胞分化的表面标记 已经鉴定了心脏前体细胞和成熟心肌细胞的标记。KDR（激酶插入域受体）low/C-KITneg心脏前体细胞表达高水平的心脏转录因子，并且在进一步分化后可以产生>50%的心肌细胞。同样，KDR+/PDGFRα+心脏前体细胞可以分化成>80%的心肌细胞。此外，也已经鉴定出心肌细胞特异性表面标记，包括信号调节蛋白α（SIRPA）、VCAM1和活化的白细胞细胞粘附分子（ALCAM）。从起始培养物中基于SIRPA的选择，这些培养物约有40-50%的心肌肌钙蛋白T阳性（cTnT+），90-98%的细胞对cTnT+呈阳性。通过MACS基于VCAM1的选择可以富集cTnT+细胞高达95%。与这些正向选择方法相比，对于心肌细胞分化效率高（80-90%）的培养物，可能考虑去除不需要的细胞群体。同样，可以使用VCAM1偶联的磁性Dyna珠子或整合素（α1、α5和α6）和N-钙粘蛋白纯化心肌细胞至90%以上纯度。 3.4.内胚层、肝脏、肾脏和胰腺细胞分化的表面标记 hPSC衍生的胰腺细胞是异质性的。CD142被鉴定为胰腺内胚层（PE）细胞的标记，这些细胞能够产生具有葡萄糖反应性的胰岛素分泌细胞，而CD200和CD318是内分泌细胞的标记。因此，靶向如CD142这样的标记可以富集PE细胞，这也被证明可以降低畸胎瘤形成的概率（从46%降低到0%）。GLUT2（葡萄糖转运蛋白2），与PDX-1（胰腺和十二指肠同源盒1）共表达，以及与PDX-1+细胞相关的CD24，也已被评估用于富集来自hPSCs的胰腺前体细胞。此外，在一项针对SOX17以分离hESC衍生内胚层细胞的研究中，已鉴定出表面标记CXCR4、CD49e、CD141和CD238。尽管CD133被报道为小鼠胰腺前体的标记，但它在人类中的表达可能比胰腺PDX-1阳性细胞更广泛。更成熟的内胚层细胞，如源自PSCs的肝细胞，也可以通过特定的膜标记（例如SLC10A1（溶质载体家族10成员1）、CLRN3（Clarin 3）或AADAC（芳基乙酰胺脱乙酰酶）），或ASGR1（即Asialoglycoprotein受体1）进行分离。通过一组膜标记，如CD9−/CD140a+/CD140b+/CD271+细胞，还可以分离出OSR（Odd-Skipped Related Transcription Factor）1+/SIX2（SIX同源框2）+肾脏前体细胞。类似地，通过选择性耗尽CD200+细胞可以选择性地分离角膜上皮细胞。 然而，仍然存在问题，即通过不同标记集识别的细胞群体是否是不同阶段的相同细胞，还是沿着相似发育轨迹的不同细胞。对于生产目的，需要对分离的群体进行全面表征，并证明其对目标应用具有一致的属性。 3.5.用于分离hPSC衍生细胞的非表面标记 除了表达在细胞膜上之外，特定于特定细胞的标记也可以用于分离这些细胞。例如，可以通过分子信标（MBs）检测活细胞中的mRNA，它们是带有荧光团的茎-环（发夹）寡核苷酸探针，另一端带有猝灭剂。针对Oct-4（八聚体结合转录因子4）或Sox2（性别决定区Y盒2）的MBs可以从分化细胞中分离未分化的PSCs；针对心肌细胞标记肌球蛋白重链β（MYH7）的MBs可以富集来自小鼠和人类胚胎干细胞的心肌细胞；针对NPPA（心钠素A型）mRNA的MB，已知与早期工作型心肌细胞相关，可以从心肌细胞分化培养中富集工作型心肌细胞。对于使用MBs进行细胞分离，精心设计并广泛验证针对所需基因的MB探针至关重要。 3.6.敲入报告细胞系 基因组编辑技术（例如CRISPR/Cas9（簇状规律间隔短回文重复/CRISPR相关蛋白9）、TALEN（转录激活因子样效应核酸酶）等）的应用使得构建新型细胞系成为可能，这些细胞系在特定标记表达时发出荧光或通过诱导抗生素抗性而具有特定表型，从而实现纯化。例如，CRISPR/Cas9编辑hiPSCs已实现双报告TBX5（T-Box转录因子5）Clover2和NKX2-5（NK2同源框5）TagRFP细胞的生成，用于纯化心脏细胞亚型，如来自第一心脏领域、心外膜、第二心脏领域和内皮细胞系的细胞。或者，NKX2-5eGFP/w和MLC（肌球蛋白调节轻链）2vmCherry/w报告细胞已被生成以分离心室样细胞。基因组编辑（TALEN）也被用来在肌球蛋白轻链2（MYL2）位点引入选择标记（新霉素）或GFP，用于识别和选择心室心肌细胞。同样，引入在心脏特异性α-肌球蛋白重链（即α-MHC，MYH6）启动子控制下的Zeocin抗性基因已被用于在心肌梗死小鼠模型中纯化iPSC衍生的心肌细胞（iPSC-CMs）。 类似的策略也被用于识别和选择肌源性衍生物。例如，CRISPR/Cas9介导的同源重组方法已被用于选择MYF5（肌源因子5）GFP肌肉前体。构建双报告PAX7（配对盒7）tdTomato和MYF5EGFP使得能够纯化肌肉干细胞（卫星细胞），而诱导PAX7表达系统促进了均匀的骨骼肌源性前体细胞群体的生成。报告细胞也已生成用于纯化神经衍生物。例如，引入驱动mCherry表达的人类囊泡GABA（γ-氨基丁酸）转运蛋白（hVGAT）启动子已实现GABA能神经元的分离，而中脑多巴胺能神经元可以使用酪氨酸羟化酶（TH）RFP构建进行选择。然而，鉴于hPSC衍生物的治疗应用，这些方法可能因基因组修改而增加肿瘤形成的风险。 4.hPSC衍生细胞下游生物加工的工作流程 hPSC衍生细胞生产的下游生物加工涉及多个步骤，这些步骤将累积减少每个步骤的产量（图1B显示了使用MACS耗竭的示例）。主要步骤包括：(1) 细胞收获：将细胞从大量培养容器的粘附表面分离；(2) 离心或浓缩和培养基交换：去除收获酶并洗涤细胞；(3) 保持：收集的细胞在缓冲液中保持，等待所有细胞被收获和离心；(4) 耗竭：去除不需要的杂质细胞；(5) 离心：去除耗竭缓冲液，并在冷冻保护缓冲液中重悬；(6) 细胞配方用于冷冻保存：将细胞转移到冷冻管中并准备冷冻保存。由于这些众多步骤，如果每个步骤的产量为90%（理想情况），最终产量将是50-60%，如果每个步骤的产量为80%（良好情况），最终产量将是30-35%。因此，由于下游加工，可能会损失超过一半的细胞，这通常发生在细胞扩增和分化数月后的一个工作日。 因此，了解每个步骤的操作参数绝对是必要的，以最小化细胞损失的同时保持功能活性细胞。 4.1.细胞收获 从大量容器中收获细胞的关键组成部分是收获酶和洗涤体积。酶的高浓度或不适当的解离溶液或持续时间可能会降低细胞活性和/或无法去除表面上的所有细胞。对于分化培养，胰蛋白酶一直是常用的酶，但其浓度和孵化时间需要针对特定细胞类型进行优化。使用作为高渗溶液配制的柠檬酸钠的新非酶传代方法已被用于分离hPSCs的多细胞聚集体。对于生物加工，希望减少收获体积，这需要在低体积和由于洗涤不足导致的细胞损失之间取得平衡。通过将温度从37°C改变到4°C，使用热响应水凝胶释放hPSCs的新进展已经实现。 4.2.离心 离心过程中的参数包括速度、时间、细胞悬浮液体积和细胞浓度。已经观察到不同细胞收集的沉降变化，这触发了多次离心。收获酶、淬灭缓冲液和等待时间都可能有助于沉降性能。对于大量容器，需要开发大规模离心过程（例如使用袋子）以减少离心步骤的时间。 4.3.保持缓冲液和保持温度 当容器数量高（>100 T- flasks）且处理时间长（长达6-8小时）时，保持过程变得重要。为了将所有细胞一起用于后续处理，首先收获的细胞必须在缓冲液中等待，直到收获步骤完成。因此，需要评估保持缓冲液和保持温度（37°C、25°C或4°C）以维持细胞活性。在制定保持缓冲液时，应考虑细胞聚集。尽管收获的细胞处于单细胞悬浮状态，但细胞可能在保持期间自组装成聚集体。聚集的程度取决于细胞类型、细胞浓度和保持时间。聚集体的形成将影响后续步骤中细胞标记和分离的效率，显著降低细胞产量。 4.4.耗竭缓冲液配方和体积 当细胞群体中有高比例的所需细胞时，耗竭被用来去除少量的杂质细胞。这个过程可以通过MACS针对不需要的细胞表面上的标记来完成。耗竭缓冲液的要求与保持缓冲液相似：维持细胞活性和防止细胞聚集。聚集的细胞不允许与抗体偶联珠均匀标记和容易的细胞-珠分离（图1C）。因此，需要仔细制定耗竭缓冲液。耗竭的细胞浓度和体积影响耗竭规模。首选高细胞浓度（>107细胞/mL）和低体积（<100 mL），同时需要最小化细胞损失。由于可以使用多个标记进行耗竭，因此可能需要重复此步骤以去除不同的细胞群体。 4.5.冷冻保存配方 冷冻保存缓冲液和体积是该步骤的重要参数。一般来说，冷冻保存缓冲液取决于感兴趣的分化细胞类型，冷冻保存的细胞浓度取决于预期的应用。对于移植研究，可能需要高浓度的细胞（每管107-108个细胞），以最小化解冻过程的时间和达到所需细胞剂量的管数。 5.hPSC衍生产品下游加工的挑战 5.1.hPSC衍生神经前体细胞下游加工的挑战 使用MACS已经实现了从PSCs衍生的神经元的大规模纯化，产量高达105-106个神经元（纯度超过90%）。然而，这些特定谱系的下游加工仍然存在特定挑战。在神经前体细胞的情况下，收获的细胞密度相对较低（约每平方厘米1×106个细胞），这可能需要从大量容器中收获细胞。如果能够达到更高的收获密度，那么为了获得所需数量的细胞（每次生产约109个细胞，下游加工体积为50-100 mL），所需的容器数量将显著减少。通过增加播种密度和/或增强细胞增殖来增加收获密度。然而，根据培养系统和细胞表型对密度变化的敏感性，播种密度可能会影响自分泌和旁分泌因子的分泌，这些因子已被证明影响hPSC的自我更新和分化。为了增强细胞增殖，可以考虑改变生长培养基（含有生长因子）和通常涂有层粘连蛋白、Matrigel和纤维连接蛋白等基质蛋白的基质。然而，对培养基和基质所做的任何改变都需要仔细比较。 5.2.hPSC衍生心肌细胞下游加工的挑战 对于心肌细胞来说，下游生物加工的负担比神经前体细胞更为严重。治疗应用所需的细胞数量对心肌细胞来说更高（每次生产约1010个细胞），比神经前体细胞（每次生产约109个）多。在心肌细胞的下游生物加工的所有步骤中，可能需要比神经前体细胞多10倍的浓缩细胞制备或多10倍的悬浮液体积。使用代谢选择方法已经实现了从人类PSCs衍生的心肌细胞的大规模纯化，纯度达到99%，产量高达2×109个功能细胞。心肌细胞也比神经前体细胞更容易形成聚集体，因此耗竭步骤的产量可能会降低。为了有效地用磁性珠标记细胞并分离不同的群体，心肌细胞需要在下游生物加工过程中保持为单细胞悬浮液。因此，需要制定保持缓冲液和耗竭缓冲液（例如抗聚集剂、生物聚合物）以防止细胞聚集（图1C）。鉴于治疗用途所需的数量，hPSC衍生心肌细胞的下游加工规模可能很大。因此，将需要扩大下游生物加工过程中不同步骤的规模（例如大规模离心）。或者，为收获hPSC衍生心肌细胞设计的自动化过程将是有益的。 6.结论和展望 在实现了hPSCs的高效分化后，下游生物加工已成为生产hPSC衍生细胞治疗产品的瓶颈。识别所需谱系的特定标记和去除未分化细胞的策略对于生产安全的细胞治疗至关重要。理想情况下，高细胞纯度，去除不需要的细胞类型将减少下游生物加工的负担。需要开发严格的质量控制系统和高灵敏度的检测方法，以确保细胞分离后产品的一致性。能够预测体内效应的体外检测是可取的，以减少临床前研究的数量。应用质量由设计（QbD）策略来理解过程和产品，更好地控制过程，以生产一致和安全细胞产品应该可能实现hPSCs的潜力。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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