IL-12 x CCL4 x CXCL10

自2017年FDA首次批准以来，被称为CAR-T疗法的嵌合抗原受体（CAR）T细胞已经改变了被诊断为血液恶性肿瘤患者的治疗格局。细胞治疗产品分为自体细胞和异体细胞两类。 自2017年FDA首次批准以来，被称为CAR-T疗法的嵌合抗原受体（CAR）T细胞已经改变了被诊断为血液恶性肿瘤患者的治疗格局。细胞治疗产品分为自体细胞和异体细胞两类。自体细胞是直接从病人自身的细胞中提取的。虽然自体CAR-T细胞减少了免疫排斥的风险，但它需要一个苛刻和漫长的制造过程。除此之外，它也极度依赖病人T细胞的功能适配性，而这种功能适配性往往因疾病或以前的治疗方法而降低。为此，凯特（吉利德科学旗下公司）1、CAR-T 之父Carl June以及耶鲁大学生物医学工程系的樊荣教授团队2各自利用PhenomeX单细胞蛋白质组学技术在细胞治疗前，监测细胞多功能强度3来预测细胞治疗疗效和不良反应如细胞因子风暴4，并证明它是评估CAR-T产品功能的有力工具。 尽管如此，研究人员仍在努力完善这些疗法，以减少不良反应和提高疗效。这包括利用异体免疫细胞制成“现成的”CAR-T产品为潜在的一种替代方案。现成异体CAR-T从健康捐赠者的细胞开始，不但可以减轻病人的负担，减少治疗延误，也可以被进行多种修改和CAR组合，以针对多种肿瘤抗原，避免肿瘤逃逸。虽然有希望，但这种方法确实困难重重，包括较高的排斥风险和缺乏经批准的治疗方法。为了优化CAR-T产品并降低排斥反应的风险，科学家研究了几种不同的方法。传统的基因组编辑技术使用诱导双链断裂（DSB）的核酸酶，可能产生潜在的难以预测的编辑效果，而且可能存在脱靶效应。较新的基因组编辑技术利用了胞嘧啶碱基编辑器（CBE），它可以产生点突变并抑制碱基切除修复，从而使基因组编辑更加精确。虽然这种技术很有前景，但CBE在细胞治疗领域的使用仍然是全新的，在用于细胞治疗之前必须经过临床验证。此时，研究人员可以利用已被证明是评估CAR-T产品功能的有力工具——单细胞蛋白质组学来评估细胞疗法中CBE的效果。 在最近发表在《Blood》上的一项研究5中，研究人员测试了CBE创建用于治疗复发/难治性T细胞急性淋巴细胞白血病（r/r T-ALL）的异体CAR-T产品的效用。这种类型的白血病很难治疗，因为它对化疗反应不佳，而自体CAR-T产品可能已经受到癌细胞的影响。在这项研究中，研究人员利用CBE开发了一种首例针对CD7（一种与T-ALL相关的细胞表面受体）的四倍碱基编辑的异体CAR-T。 由于PD1信号是抑制性的，并会削弱了T细胞的活性，于是作者首先探讨了抑制PD1的表达是否能改善细胞功能。利用来自两个捐赠者的细胞，研究人员创建了7CAR8，一种四重编辑的CAR-T，分别有和没有PD1表达，并在24孔板中用重组人CD7蛋白包板，培养7CAR8细胞。接下来他们使用PhenomeX的单细胞分泌组平台来评估工程细胞的功能表型。研究人员发现，PD1基因敲除增加了一个供体中7CAR8细胞的多功能性，即一个细胞同时分泌两种或以上的细胞因子的能力。但是另一个供体却没有。由于多功能性先前已被证明与临床结果和CAR-T效力有关，研究人员决定将PDCD1抑制编辑纳入随后的7CAR8产品进行体内测试。进一步的实验表明，7CAR8细胞具有抗肿瘤作用，并显著提高了T-ALL小鼠模型的生存率。 除了创建可以针对各种肿瘤抗原的安全的异体免疫细胞，每个病人对T细胞的高剂量需求和病人数量的增加导致了临床对大量异体T细胞的需求。因此，我们需要在扩大制造规模的同时也保持细胞质量。在发表于《Frontiers in Medical Technology》的文献里，Lonza利用PhenomeX的技术评估在搅拌罐生物反应器中扩增后的T细胞功能状态6。他们通过IsoLight平台和IsoCode单细胞多重因子芯片分析了CD4和CD8T细胞的单细胞功能谱--效应型（颗粒酶B、IFN-g、MIP-1a、Perforin、TNF-a、TNF-b），刺激性（GM-CSF、IL-2、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、IL-15和IL-21），调节性（IL-4、IL-10、IL-13、IL-22、TGF-b1，sCD137和sCD40L），趋化性或趋化因子（CCL-11、IP-10、MIP-1b，和RANTES）和炎症性（IL-1b、IL-6、IL-17A、IL-17F、MCP-1和MCP-4）因子组。然后用IsoSpeak软件自动将多功能细胞在细胞群体中的占比和他们分泌的每种功能蛋白因子的平均荧光强度加权相乘，计算出细胞多功能强度指数（PSI）。多功能的T细胞能够在抗原的刺激下产生2种或以上的细胞因子，并被认为是重要的功能特征。 PSI=多功能细胞% × 分泌蛋白的信号强度 在扩增的第14天，T细胞在受到刺激后显示出更多的功能，特别是分泌5+细胞因子的细胞。CD4和CD8 T细胞在扩增后都表现出效应性PSI的增加。研究人员也观察到刺激性PSI的增加，特别是CD8 T细胞。与第0天的细胞相比，第14天的T细胞还分泌了更多种类的细胞因子。 PhenomeX的全自动、端到端解决方案进行的单细胞分析，可提供对包括CAR-T等免疫细胞产品的功能和效力的独特见解。单细胞多功能表型可以帮助优化免疫细胞产品的设计和品质控制。同时在临床试验前评估细胞功能让研究人员获得了宝贵的见解，帮助制定其早期细胞疗法的发展战略。 参考文献 1. Rossi, John et al. “Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL.” Blood vol. 132,8 (2018) 2. Bai, Zhiliang et al. “Single-cell antigen-specific landscape of CAR T infusion product identifies determinants of CD19-positive relapse in patients with ALL.” Science advances vol. 8,23 (2022) 3. 浅谈细胞多功能强度指数—PSI的前世今生 https://zhuanlan.zhihu.com/p/575887245 4. Zurko, Joanna C et al. “Bispecific targeting of CD20 and CD19 increases polyfunctionality of chimeric antigen receptor T-cell products in B-cell malignancies.” Cytotherapy vol. 24,8 (2022) 5. Diorio, Caroline et al. “Cytosine base editing enables quadruple-edited allogeneic CART cells for T-ALL.” Blood vol. 140,6 (2022) 6. Gatla, Himavanth et al. “Enabling Allogeneic T Cell-Based Therapies: Scalable Stirred-Tank Bioreactor Mediated Manufacturing.” Frontiers in medical technology vol. 4 (2022) PhenomeX（NASDAQ: CELL）致力于助力科学家充分探索每个细胞的潜能，推动功能细胞生物学迈向新纪元，以促进人类健康发展。我们为科学家提供揭示细胞功能的完整见解，使其全面了解每个细胞的深度功能表征。我们经过验证的独特高通量工具和服务提供了无与伦比的解决方案，加速了多功能细胞研究发展，成为改善疾病预防和治疗的关键。我们屡获殊荣的平台已获得全球各地研究人员的高度认可，包括全球前15家制药公司的研究人员，以及约85%的美国领先综合性癌症中心的科研人员。 PhenomeX家族的单细胞功能表征平台（原Berkeley Lights）Beacon®基于其特有的光电定位技术 (OptoElectro Positioning, OEP™) 为广大科学家提供了先进的研究手段，对数以万计单细胞的基因信息、功能等进行深入表征，以筛选出满足用户需求的目的细胞。Beacon®应用场景涵盖抗体发现、细胞株开发、传染病研究、免疫学研究、肿瘤生物学研究、细胞疗法开发、基因编辑、农业科学等多个领域，为从事尖端的科研项目及加速企业生物产品的开发提供了前所未有的机遇。 PhenomeX家族的单细胞蛋白质组学平台（原IsoPlexis）是单细胞多组学不可或缺的重要组成部分，在临床科研领域，针对评估和检测人体单细胞免疫能力、筛选癌症治疗方案、预测评估临床疗效及安全性等方面有着丰富的成功经验，为预测病人长期生存、早期筛选治疗获益患者提供了详实的参考数据，帮助世界各地的科研人员在肿瘤免疫、细胞治疗、肿瘤学、抗感染免疫研究及疫苗开发、自身免疫病、移植免疫等方向取得了众多突破性成果，助力加速临床科研、医学和生命科学行业发展。 官网：www.phenomex.com IsoPlexis和Berkeley Lights已合并成立新公司PhenomeX

STEMS是首个评估PMS患者鞘内移植hfNPC治疗安全性和最大耐受剂量的临床试验，并证明了该疗法的可行性和安全性。 多发性硬化（MS）是中枢神经系统最常见的炎性脱髓鞘性疾病，可分为复发缓解型（复发后缓解，每次发作均基本恢复）和进展型（疾病进行性加重）。 现有的治疗方式对于复发缓解型MS效果较好，但进展型MS（PMS）仍缺乏有效的治疗方式[1]。 近日，来自意大利圣拉斐尔科学研究所的Gianvito Martino团队，在《自然·医学》杂志发表了首个评估鞘内移植人胎儿神经前体细胞（hfNPC）治疗PMS的可行性、安全性和耐受性的1期临床试验结果[2] 经过2年的随访，研究人员未发现与hfNPC移植相关的严重不良反应。此外，探索性疗效分析显示，接受最高剂量hfNPC移植治疗的患者脑萎缩发生率较低，且脑脊液中抗炎和神经保护因子的水平较高。 这些结果表明hfNPC移植治疗PMS患者具有较高的可行性和安全性，且可能起到一定的治疗效果，值得在未来更大的队列中进一步评估hfNPC移植治疗PMS的有效性。 论文首页截图 在MS动物模型中，研究人员已证明了移植的神经前体细胞可以分化为成熟的神经细胞，并释放相关细胞因子发挥营养支持和抗炎功能，从而减少脑内脱髓鞘病变、星形胶质细胞增生和轴突损伤[3, 4]。 在此基础上，Gianvito Martino团队开展了前瞻性、开放标签、剂量探索（3+3设计）的1期临床研究（STEMS，NCT03269071，EudraCT2016-002020-86），初步评估了hfNPC移植治疗PMS的可行性和安全性。 研究的主要纳入标准为：年龄在18-55岁，根据修订版McDonald 2010标准和2013 Lublin分型诊断为PMS，且对所有经批准疗法无效/不耐受。 被纳入研究的受试者将通过腰椎穿刺接受鞘内注射hfNPC（由流产的10-12周人胎儿获得），hfNPC的剂量递增分为4档：TC-A，0.7×106/kg；TC-B，1.4×106/kg；TC-C 2.8×106/kg和TC-D 5.7×106/kg。在完成治疗后，将对受试者进行为期96周的随访。研究的主要终点为鞘内注射hfNPC的可行性、安全性和耐受性。 研究流程图 在2017年5月至2019年5月间，共有15名PMS受试者入选，其中12名受试者最终接受了hfNPC移植治疗，2名受试者因禁忌症（无法接受免疫抑制治疗）而退出试验，1名受试者在hfNPC移植前自发退出试验，末次随访时间为2021年6月。 总体来说，受试者对hfNPC移植治疗的耐受性良好，在接近两年的随访内观察到的不良反应大多为1级或2级，且不同治疗剂量之间不良反应的发生率无明显差异，也没有观察到剂量限制毒性（DLT）。 在整个研究期间，未观察到与hfNPC移植治疗相关的严重不良反应（3级或更高），也没有任何明确的与hfNPC移植治疗相关的不良反应。截止末次随访，患者的存活率为100%。 研究中出现的不良反应 紧接着，研究人员探索了hfNPC移植治疗的效果。 在移植治疗的前4年，受试者的临床扩展致残量表评分（EDSS）平均每年增加0.24分，在接受移植治疗的2年内，受试者的EDSS平均每年增加0.13分，虽然相比于移植治疗前，MS的进展变缓慢，但两者无明显统计学差异。 同时，其他的临床评分（9-HPT评分和SDMT评分）以及神经生理学评估结果（如运动诱发电位、感觉诱发电位和周围视网膜神经纤维层厚度）在治疗前后也无明显差异，且与hfNPC的治疗剂量无明显相关性。 受试者神经功能和神经生理学评估结果 磁共振成像（MRI）评估显示，6例（50%）受试者在随访期内出现新的T2病变（T2病变体积增加1.1±0.82 ml/年，3例病变增强扫描出现强化），hfNPC移植剂量与新的T2病变数目、体积以及增强扫描强化数目均无明显相关性。 值得注意的是，hfNPC低剂量组和高剂量组受试者的灰质萎缩速度差异具有统计学意义（P=0.04），接受低剂量hfNPC移植治疗的受试者在移植后2年内脑萎缩快于高剂量组。无论是总脑体积，还是灰质、白质体积，萎缩的速率均与hfNPC的剂量呈负相关。 低剂量（上图）hfNPC移植治疗的受试者在移植后2年内脑萎缩显著快于高剂量组（下图） 接下来，研究人员对受试者的脑脊液成分进行了分析。 在移植后3个月，受试者脑脊液中细胞数量和蛋白质明显增加，hfNPC移植剂量与脑脊液蛋白水平呈正比（P=0.06），而与细胞数量无明显相关性。从5个受试者脑脊液中可提取到足够的DNA进行分析，其中1个受试者脑脊液中可检测到供体来源细胞DNA的存在。 最后，研究人员对受试者脑脊液进行了组学分析。 在检测的46种细胞因子、趋化因子和生长因子中，有17种在基线和移植后均低于可检测的范围（CCL4、CCL11、EGF、G-CSF、IFN-y、IL-1b、IL-5、IL-7、IL-12p40、IL-12p70、IL-17、IL-22、LIF、PDGF-AB、PDGF-BB、RANTES和TGF-B）。 对所有在基线和移植后3个月可检测到的因子进行主成分分析发现，相比于低剂量移植组，高剂量组在移植后各因子的变化程度更大。 低剂量组（左）和高剂量组（右）在移植前后细胞因子主成分分析 在hfNPC移植后，血管生成素-2、CCL-2、CXCL10、FAS配体、GDNF、GM-CSF、IL-10、IL-15、IL-2、MMP9、SCF、TNF-β和VEGF-C（营养因子和免疫相关因子）显著升高，而IL-8水平（促炎）显著下降。 脑脊液的蛋白质组学分析也显示，hfNPC移植后脑脊液蛋白质图谱发生了变化。在低剂量组和高剂量组中检测到的707和714个蛋白质中，分别有63种和78种蛋白质在基线和移植后3个月的脑脊液中存在显著差异（P<0.05）。 这些差异蛋白的基因本体论（GO）分析显示，细胞外基质聚集、细胞迁移和粘附、轴突发育等通路，在低剂量组和高剂量组中均明显富集；此外，低剂量组中还有免疫系统、固有免疫系统和中性粒细胞脱颗粒等通路明显富集（高剂量组未富集），而高剂量组中则是神经元投射形态发生、细胞对生长因子的反应和突触聚集等通路明显富集（低剂量组未富集）。 低剂量（左图）和高剂量（右图）组治疗前后差异蛋白的GO分析 为了更详细地研究脑脊液蛋白质组的变化，研究人员进行了基因集合富集分析（GSEA）。该分析显示，在hfNPC移植后，与固有免疫相关的通路总体上呈下调趋势（中性粒细胞脱颗粒、免疫系统、固有免疫系统），而参与神经系统发育、神经发生和细胞迁移的通路总体上呈上调趋势。 总的来说，STEMS是首个评估PMS患者鞘内移植hfNPC治疗安全性和最大耐受剂量的临床试验，并证明了该疗法的可行性和安全性。 更为重要的事，探索性疗效分析显示hfNPC移植疗法可减缓患者的脑萎缩，且增加脑脊液内抗炎和神经保护因子的水平，值得进行下一阶段的临床研究。 参考文献 1.The Lancet N: Multiple sclerosis under the spotlight. Lancet Neurol 2021, 20(7):497. 2.Genchi A, Brambilla E, Sangalli F, Radaelli M, Bacigaluppi M, Furlan R, Andolfo A, Drago D, Magagnotti C, Scotti GM et al: Neural stem cell transplantation in patients with progressive multiple sclerosis: an open-label, phase 1 study. Nat Med 2023. 3.Pluchino S, Quattrini A, Brambilla E, Gritti A, Salani G, Dina G, Galli R, Del Carro U, Amadio S, Bergami A et al: Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature 2003, 422(6933):688-694. 4.Pluchino S, Gritti A, Blezer E, Amadio S, Brambilla E, Borsellino G, Cossetti C, Del Carro U, Comi G, t Hart B et al: Human neural stem cells ameliorate autoimmune encephalomyelitis in non-human primates. Ann Neurol 2009, 66(3):343-354.

细胞因子释放综合征（Cytokine release syndrome，CRS）在20世纪80年代末首次被描述，在使用抗CD3单克隆抗体治疗移植物排斥反应后，产生全身炎症反应。CRS经常和细胞因子风暴（cytokine storm）互换使用。但二者略有区别，细胞因子风暴被认为是一个更广泛的术语，描述过度炎症引起的各种疾病。CRS现更多用于各类免疫治疗诱发的细胞因子过度释放引起的综合征。发生三级以上的CRS，患者呼吸功能和其他器官功能会有明显损伤，是免疫治疗重点管理的治疗相关副作用。不同重症CRS升高的细胞因子白细胞介素IL1-RA, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10 sgp130, sIL-1R1, sIL-1R2, IL2-RA, sIL-6R趋化因子CCL2, CCL3, CCL4 CXCL9, CXCL10, CX3CL1免疫调节细胞因子IFN-α, IFN-γ, TNF-α生长因子G-CSF, GM-CSF, Flt3-ligand血管调节因子VEGF, Ang-2, von Willebrand factor其他RAGE, Granzyme B相同轻重症无差异的细胞因子白细胞介素IL-1β, IL-2, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-4R趋化因子CCL5, CCL24生长因子EGF, HGF, EGFR, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3部分CRS细胞因子的来源及功能细胞因子主要来源细胞功能IL-1巨噬细胞，上皮细胞；焦亡细胞促炎警报素细胞因子； 致热源功能；巨噬细胞和Th17细胞的活化IL-2T细胞效应T细胞和调节性T细胞生长因子IL-6巨噬细胞，T细胞，内皮细胞促炎细胞因子； 致热源功能；增加抗体的产生；诱导急性期反应物IL-9Th9防止蠕虫感染；肥大细胞的激活；感染性疾病中和；1型IFN相关IL-10Treg、Th9抗炎细胞因子；抑制Th1细胞和Th1型细胞因子的释放IL-12树突状细胞和巨噬细胞Th1通路的激活；诱导Th1细胞、CTL和NK细胞释放IFN-γ；与IL-18协同作用IL-17Th17、NK、ILC3促进中性粒细胞性炎症，防止细菌和真菌感染IL-18单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞促炎警报素细胞因子；Th1通路的激活；与IL-12协同作用IL-33巨噬细胞，树突状细胞，肥大细胞，上皮细胞促炎警报素细胞因子；Th1和Th2细胞的扩增；NK细胞、CTL和肥大细胞的活化TNF巨噬细胞，T细胞，NK细胞，肥大细胞增加血管通透性；致热源功能IFN-γTh1细胞、CTL、ILC1和NK细胞促炎细胞因子；巨噬细胞的活化GM-CSFTh17促炎细胞因子VEGF巨噬细胞血管生成IL-8巨噬细胞，上皮细胞中性粒细胞的招募MIG  (CXCL9)单核细胞，内皮细胞，角质形成细胞干扰素诱导的趋化因子；招募Th1细胞，NK细胞，浆细胞样树突状细胞IP-10  (CXCL10)单核细胞，内皮细胞，角质形成细胞干扰素诱导趋化因子；巨噬细胞、Th1细胞、NK细胞招募MCP-1  (CCL2) 巨噬细胞，树突状细胞，心肌细胞招募Th2细胞，单核细胞，树突状细胞，嗜碱性粒细胞MIP-1α  (CCL3)单核细胞，中性粒细胞，树突状细胞，NK细胞，肥大细胞招募巨噬细胞、Th1细胞、NK细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞；致热源功能MIP-1β  (CCL4)巨噬细胞，中性粒细胞，内皮细胞招募巨噬细胞、Th1细胞、NK细胞、树突状细胞BLC  (CXCL13)B细胞，滤泡树突状细胞招募B细胞，CD4+T细胞，树突状细胞CRP肝细胞单体CRP增加IL-8和MCP-1的分泌；IL-6增加CRP的表达补体肝细胞，其他细胞补体激活有助于细胞因子风暴中的组织损伤；补体抑制可降低细胞因子风暴的免疫病理作用铁蛋白多种细胞细胞中铁储存的主要部位简评：虽然CRS已经在免疫治疗广泛使用，但是对于其准确的定义依旧存在分歧，依然是一个值得细致研究的领域。（No single definition of cytokine storm or the cytokine release syndrome is widely accepted, and there is disagreement about how these disorders differ from an appropriate inflammatory response，David C. Fajgenbaum, M.D., and Carl H. June, M.D，Cytokine Storm，n engl j med 383;23）参考资料Ferrara JL, Abhyankar S, Gilliland DG. Cytokine storm of graft-versus-host disease: a critical effector role for interleukin-1. Transplant Proc 1993;25:1216-7Murthy, H.; Iqbal, M.; Chavez, J.C.; Kharfan-Dabaja, M.A. Cytokine Release Syndrome: Current Perspectives. Immunotargets Ther. 2019, 8, 43–52Tvedt, T.H.A.; Vo, A.K.; Bruserud, Ø.; Reikvam, H. Cytokine Release Syndrome in the Immunotherapy of Hematological Malignancies: The Biology behind and Possible Clinical Consequences. J. Clin. Med. 2021, 10, 5190David C. Fajgenbaum, M.D., and Carl H. June, M.D，Cytokine Storm，n engl j med 383;23