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摘要：腺相关病毒（AAV）因其极低的致病性以及在不同组织中建立长期基因表达的能力，已经成为临床基因治疗中的关键传递工具。重组腺相关病毒（rAAV）经过工程改造以增强特异性，并被开发为治疗各种疾病的工具。然而，随着rAAV作为治疗方法的更广泛应用，需求的增加为现有的生产方法带来了挑战。目前有七种基于rAAV的基因治疗产品获得了监管机构的批准，但人们仍然担心在人类中安全使用高剂量病毒疗法，包括免疫反应和不良反应，如基因毒性、肝毒性、血栓性微血管病变和神经毒性。在这篇综述中，我们探讨了AAV生物学，重点介绍了当前的载体工程策略和制造技术。我们讨论了rAAV在眼部、神经系统、代谢、血液学、神经肌肉和心血管疾病以及癌症的临床试验中的应用。我们概述了rAAV引发的免疫反应，处理了相关的副作用，并讨论了减轻这些反应的策略。我们希望讨论该领域的最新进展和当前挑战，能为研究人员和临床医生提供指导，帮助他们了解不断发展的基于rAAV的基因治疗领域。 1.引言 基因治疗代表了一种开创性的方法，用于解决遗传疾病，它采用非病毒或病毒载体在目标细胞内修改基因表达的一系列策略。一种常见的策略是基因替代疗法，将有缺陷基因的功能副本引入活细胞中。2017年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了首个基因治疗产品Luxturna，这是针对勒伯先天性黑蒙2型（LCA2）的基因替代疗法，这一策略达到了一个重要的里程碑。或者，基因沉默疗法旨在抑制或沉默目标基因，主要是通过RNA干扰。例如，Patisiran是一种小干扰RNA，用于治疗遗传性转甲状腺素淀粉样变性。另一种策略是基因组编辑，可以通过基于CRISPR的技术开发，允许直接修改体细胞基因组。正在开发可以执行RNA编辑的修改CRISPR系统。此外，基因表达可以通过DNA甲基化、组蛋白修饰和微小RNA调节来表观遗传地改变。这种方法具有可逆性和多功能性的优势，使其能够根据疾病进展和治疗反应进行调整。创新策略，如利用抑制tRNAs来实现过早终止密码子的读通，为挽救病理性无义突变并恢复基因功能提供了途径，这是在内源性调节下进行的。无论选择哪种策略，基因治疗都可以在体外或体内实施。体外基因治疗涉及提取患者细胞，对其进行基因修饰，然后将它们重新引入患者体内。相比之下，体内基因治疗直接将遗传物质传递到目标组织。到目前为止，共有14种体外和29种体内基因治疗获得了批准，主要是通过FDA（图1）。在这些批准的基因治疗中，有17种是非病毒基础的，而26种是病毒基础的。已经研究了各种病毒载体用于体内基因治疗，包括腺病毒（Ad）、逆转录病毒、慢病毒和单纯疱疹病毒（HSV）。腺相关病毒（AAV）载体已经成为临床试验和FDA批准应用的首选（图1）。这是因为它们具有广泛的组织嗜性、相对良好的安全概况以及多样化的制造过程。重要的是，AAV是非致病性的，很少整合到宿主基因组中，并且可以维持长期的转基因表达。此外，基于某些AAV血清型的载体天生能够高效地进入细胞和转基因表达，这增强了转导效率。 图1 获批的基因治疗产品和递送平台。基因治疗产品通常针对1) 体外基因治疗，受影响的患者细胞被分离，在细胞培养中进行遗传修饰、扩增、富集，然后重新输回患者体内，作为活性药物（例如，CAR-T细胞，Lyfgenia，Casgevy）；2) 体内基因治疗，直接给患者施用以实现治疗效果（例如，Gendicine，Kynamaro，Imlygic，Luxturna，Onpattro）。基因治疗药物的递送平台主要分为两组：病毒载体和非病毒载体。病毒载体基因治疗利用病毒作为基因递送载体，包括AAV、腺病毒、逆转录病毒、慢病毒和单纯疱疹病毒。非病毒载体基因治疗包括反义寡核苷酸、siRNA和基于细胞的CRISPR基因组编辑。CAR-T是嵌合抗原受体（CAR）T细胞治疗，SMA是脊髓性肌肉萎缩症，AADC是芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症，DMD是杜氏肌营养不良症，LCA2是莱伯先天性黑蒙症2型，hATTR是遗传性转甲状腺素淀粉样变性。*表示非FDA批准的基因治疗。图表由Biorender.com创建。 最初在20世纪60年代中期作为Ad制剂的污染物被发现，野生型AAV（wtAAV）是一种非包膜病毒，包含一个带有两端倒置末端重复序列（ITRs）的单链DNA（ssDNA）基因组（图2）。AAV生物学的研究导致了成功克隆和测序wtAAV2基因组。在1990年代和2000年代，发现了具有不同组织嗜性的多种AAV血清型，从而引入了靶向基因传递方法的途径。研究报告称wtAAV基因组可以整合到宿主染色体中，促进稳定、长期的转基因表达。在2000年代，进行了工程AAV衣壳的工作，以增强组织特异性和转导效率，以及提高重组AAV（rAAV）的安全性。这已经推进了基于rAAV的临床试验的成功，特别是对于单基因罕见疾病，导致rAAV基因治疗产品的监管批准。同时，开发了各种方法来扩大rAAV制造，引起了对基于rAAV的基因治疗的兴趣。最近，CRISPR技术的出现彻底改变了基因治疗的格局，通过rAAV将精确的基因编辑传递到细胞中。基于rAAV的基因治疗因其独特的属性而成为一种潜在的治疗方法，可以治愈以前无法治疗的遗传疾病，包括其小尺寸、非致病性、多功能组织嗜性、稳定的转基因表达、复制无能、可工程化的衣壳以及适应多种有效载荷传递的多功能性。尽管取得了一些早期成功，但许多问题和挑战限制了其广泛应用，特别是对于复杂疾病。这些问题包括有限的货物容量、对高系统剂量的免疫反应、潜在的基因毒性、实现组织特异性的挑战以及制造复杂性。在这里，我们描述了rAAV基因治疗的基础AAV生物学和工程，讨论了AAV载体学的关键原则和当前的制造方法，并概述了rAAV基因治疗的临床应用和挑战，用于治疗广泛的人类疾病。最后，我们确定了我们当前理解中的空白，提出了解决持续挑战的潜在解决方案，并概述了这个快速发展领域的未来方向。 图2 AAV生物学研究和基因治疗发展的历史里程碑。数十年对AAV生物学的研究带来了对其结构、生物学、载体学和基因治疗应用理解的关键进展。AAV研究和发展的历史里程碑按时间顺序总结如下。这些进展为成功的临床试验和监管批准rAAV基因治疗药物铺平了道路，以治疗各种人类疾病。图表由Biorender.com创建。 2.AAV生物学和载体工程 2.1.作为自然病毒的AAV 结构和基因组。AAV具有由60-mer亚基组成的二十面体衣壳和由每个末端145 bp T形ITRs包围的4.7 kb ssDNA基因组。衣壳由病毒蛋白（VPs）VP1、VP2和VP3以1:1:10的比例组装而成。VP3由保守的β-链组成，这些链通过表面暴露的可变环连接。这些结构塑造了AAV表面形态，并决定了AAV血清型特异性功能。AAV衣壳在每个五倍轴上有一个带有孔状开口的通道，三倍轴周围有突出物，二倍轴上有一个凹陷。 wtAAV基因组包含两个主要的开放阅读框，编码四个非结构复制基因（Rep）和三个结构衣壳基因（Cap），以及一个参与衣壳组装的组装激活蛋白的ORF。此外，编码在Cap基因内不同阅读框内的膜相关附属蛋白（MAAP）的功能仍然不清楚。ITRs主要作为病毒复制的起点，并提供包装信号。 血清学调查和非致病性。不同的wtAAV血清型以VPs和ITRs的变化为特征，主要从人类和非人灵长类动物（NHPs）中分离出来。人类血清学调查表明，相当比例的人群对多种AAV血清型具有中和抗体（NAbs）。一项对888名健康志愿者的人类血清样本的研究发现，对AAV2的NAbs最普遍，其次是AAV1、AAV7和AAV8。另一项研究显示，对血清中除AAV2外的其他血清型的NAbs最普遍的是AAV1（74.9%）、AAV6（70.1%）、AAV5（63.9%）、AAV8（60.4%）和AAV9（57.8%）。 作为Parvoviridae家族中的Dependoparvovirus，野生型AAV需要来自辅助病毒（如Ad或HSV）的必需基因来促进其基因组的复制和转录，包括Ad E1、E2a、E4和VA RNA基因。因此，野生型AAV不能独立复制并产生新的病毒颗粒，但可以通过作为环状单体或串联体的染色体外DNA在宿主细胞中建立潜伏感染。值得注意的是，在体外感染中，大约0.1%的野生型AAV2基因组整合到19号染色体长臂上一个特定区域（19q13-qter），称为AAVS1位点。尽管AAV被认为是非致病性的，但最近的研究报道AAV2与全球儿童中未解释的急性肝炎有关。没有直接证据表明AAV2如何引发肝炎的机制，但有建议认为对AAV2的异常免疫反应可能会介导肝毒性。然而，这些研究承认COVID-19感染可能是一个促成因素，并报告称大多数急性肝炎病例在没有长期免疫抑制的情况下得到解决。 2.2.作为基因治疗的传递载体 载体学和组织嗜性。自然存在的野生型AAV正在迅速进化，产生了作为病毒“类群”的广泛基因组多样性。在过去的二十年中，至少从Ad库存、人类/NHP组织和其他哺乳动物或非哺乳动物物种中鉴定出12种AAV血清型和1000多个变体。这些血清型对各种细胞或组织有不同的偏好，这被称为嗜性（表1）。AAV血清型之间的基因组差异主要发现在病毒衣壳序列的可变区域，特别是VP3，这在决定嗜性中起着至关重要的作用。然而，许多其他过程和与宿主蛋白的相互作用可能会影响嗜性，包括细胞表面受体、细胞内摄取、细胞内转运、核输入、病毒脱壳、第二链DNA合成以及基因组环化和串联化。 野生型AAV2基因组最初在1980年代被克隆，作为rAAV的模板。rAAV具有与野生型AAV相同的衣壳序列和结构，但不包含任何野生型AAV蛋白编码序列，而是包含在4.7 kb包装能力内的治疗效果基因表达盒。rAAV基因组中唯一的病毒元素是ITRs。rAAV主要由瞬时转染的HEK293细胞中转补Rep/Cap和Ad辅助基因生产。具有AAV2 ITRs的rAAV基因组可以与不同AAV血清型的衣壳进行转包装，以改变其转导特性。转导途径。尽管对野生型AAV生物学的理解有所提高，但rAAV与细胞表面相互作用并将转基因传递到宿主细胞核的机制仍然知之甚少。越来越多的研究表明，病毒衣壳最初通过主要受体（如糖苷、糖蛋白或唾液酸）粘附到细胞表面，然后与共受体蛋白相互作用。例如，rAAV2与硫酸肝素蛋白多糖（HSPG）结合，rAAV1、rAAV4和rAAV5主要与唾液酸相互作用，rAAV9与N-连接的半乳糖相互作用。衣壳上不同的结合位点被认为决定了其嗜性，因此正在努力在这些位点上工程化AAV变体，以增强特定细胞或组织的转导能力。最近的全基因组筛选研究发现了新的宿主蛋白促进rAAV转导，包括被指定为AAV受体（AAVR）的I型跨膜蛋白KIAA0319L。另一个普遍存在的宿主蛋白，G蛋白偶联受体108（GPR108），在几种rAAV血清型的转导中起作用。尽管在体内敲除AAVR和GPR108会减少转导，但细胞表面结合在很大程度上不受影响，这表明这些宿主蛋白主要有助于附着后的转导过程。 在与细胞表面结合后，rAAV通过内吞作用内化，其机制可能因细胞类型和rAAV血清型而异。内吞体内的rAAV颗粒经历pH依赖的构象变化，然后通过跨高尔基网络转运。rAAV颗粒从内吞体和跨高尔基网络中逸出，然后通过核孔复合体进入细胞核。一旦病毒颗粒进入细胞核，ssDNA基因组被释放并通过称为第二链合成的过程转化为双链DNA（dsDNA）。从基因组3′端的自引导ITR开始启动转录。通过突变内部ITR基序可以将基因组制成dsDNA结构，这允许与单链rAAV（ssAAV）基因组相比，更快的复制和增强的转导。然而，这种自互补AAV（scAAV）基因组设计将包装能力减半。dsDNA基因组随后经历环化和串联化，稳定载体基因组，使其在有丝分裂后细胞中以染色体外方式持续存在。值得注意的是，ITR序列也可以作为重组元件，促进载体基因组重组。rAAV转导途径涉及多个细胞事件，可能在任何步骤失败或被宿主破坏，削弱或阻止转导。因此，充分理解这一途径将有助于识别影响rAAV转导效率的其他关键宿主因素。 2.3.rAAV工程 rAAV衣壳序列和基因组DNA货物，包括启动子、转基因、增强子和ITRs，都在进行深入研究。本节介绍几种工程策略，以修改rAAV以获得更好的转导效率和组织特异性。衣壳工程用于转基因传递。衣壳工程是为不同临床应用开发rAAV的主要策略。它主要包括三种方法：分离自然发生的AAV变体、合理设计和定向进化（图3）。最近，使用生物信息预测和机器学习（ML）的基于计算机的方法已成为协助衣壳工程的新工具（图3）。自然发生的AAV变体：在AAV开发的早期，人体组织是发现新AAV的关键来源。从1965年到2004年，只有有限数量的AAV主要来自人类临床样本，随后被载体化并进行测试。AAV9最初在人类肝脏组织中被发现，但它具有强烈的大脑嗜性，因为它能够穿过血脑屏障（BBB），使其成为中枢神经系统（CNS）转导的常见选择。AAV7和AAV8是从恒河猴的心脏和淋巴结中分离出来的，表现出在骨骼肌和肝脏中的卓越嗜性。研究表明，40-80%的人对已知野生型AAV血清型有抗体，这突出了发现更多血清学上不同的AAV的必要性。在人类和NHP以外的物种中筛选AAV血清型，以找到可以避免遇到针对人类AAV的预先存在的抗体的中和效应的衣壳，但这些在人类中的转导可能有限。因此，发现人类衍生的AAV变体并筛选具有增强转导和特定组织嗜性的候选物一直是一种常见的方法。AAVv66，一种通过长读序列从人类样本中分离出来的AAV2变体，与AAV2相比，显示出增强的生产和CNS转导。这些发现表明，自然变体可以为改善组织特异性转导提供有价值的工具。虽然只有少数团体继续评估自然衣壳变体作为基因治疗的潜在载体，但来自自然AAV的rAAV仍然是当前临床研究中的主导选择。 图3 开发新型AAV变体的策略。a 可以从人类和非人灵长类动物（NHP）组织中通过高循环PCR和高通量测序分离出自然发生的AAV变体。b 合理设计利用AAV生物学的知识来修改AAV衣壳中的相关氨基酸，以增强转导能力或逃避免疫监视。c 定向进化是一种工程方法，用于开发具有指定特异性的新型AAV变体，包括随机或定义的肽段插入、衣壳重组、易错PCR和饱和突变。d 通过计算机方法利用已知的衣壳序列重建祖先AAV序列。机器学习被用来预测AAV基因组中特定序列与包装能力及组织嗜性之间的关系，通过使用大量用经过诱变的AAV基因组转导的样本数据集。图表由Biorender.com创建。 理性设计：理性设计方法试图基于对rAAV结构和生物学的理解，在rAAV衣壳的特定位点进行结构修改。通常采用三种关键方法：遗传突变、插入非病毒结构域以修改组织亲和力和化学修饰。 研究探索了rAAV转导效率中特定氨基酸残基的贡献，发现rAAV2衣壳上表面酪氨酸残基的磷酸化导致它们在核输入前降解。将这些残基修改为苯丙氨酸（Y444F/Y500F/Y730F）增加了中枢神经系统中的基因传递。虽然rAAV2不能通过玻璃体内注射转导光感受器，但包含特定残基替换（Y272F/Y444F/Y500F/Y730F/T491V）的变体实现了高达25%的光感受器细胞的转导。此外，改变表面暴露的残基可能实现组织去靶向，从而提高安全性。例如，在黑猩猩组织样本中发现的H527Y和R533S替换被引入rAAV9衣壳，导致在新生小鼠和一种致命的儿科白质营养不良小鼠模型中血管内注射后外周组织的转导减少。 另一种理性设计方法是将功能结构域插入rAAV衣壳的特定位点。一项研究插入了人类黄体生成激素受体（LH-R）的15-mer结合域，成功地通过LH-R以HSPG独立的方式转导卵巢癌细胞。通过将细胞穿透肽插入rAAV9衣壳，一项研究发现了两种变体，它们能够在系统给药后穿过血脑屏障，改善中枢神经系统的转导。rAAV诱导有效和长期转基因表达的主要障碍是宿主免疫反应。结构研究表明，rAAV衣壳上的NAbs识别位点可能是保守的。工程化的rAAV变体能够通过冷冻电镜（cryo-EM）图像的结构信息，逃避小鼠、NHP和人类血清中的NAbs。将rAAV衣壳与生物素-聚乙二醇（PEG）和N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）结合可能有助于逃避NAbs，尽管这可能是以改变组织嗜性和降低转导效率为代价的。一项研究使用域交换产生了27个rAAV2和rAAV8的嵌合Cap，并证明rAAV8实现的肝脏嗜性与环IV域有关。此外，在AAVrh10的可变区域VIII中插入精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）整合素结合基序，改善了心脏特异性转导并减少了肝脏分布。 化学修饰而不改变rAAV衣壳的氨基酸组成为衣壳工程提供了一种有前景的方法。对表面氨基酸的微小修改可以改变受体结合亲和力，从而影响转导和嗜性。一项研究使用带有亲电琥珀酰亚胺丙酸功能团的PEG-N-羟基琥珀酰亚胺与rAAV2衣壳上的赖氨酸残基进行交联，以实现NAb逃避。糖基化的rAAV2发现与肝素和单克隆抗体A20的结合减少，导致肌肉中转基因表达显著提高。一项研究将针对骨骼肌特异性蛋白CACNG1的抗体共价结合到rAAV9衣壳的可变区域，导致工程化的衣壳能够在小鼠肌管中特异性表达转基因，与未结合的rAAV9相比，肝脏靶向减少。类似地，另一项研究工程化了一个rAAV9和rAAVrh74的杂交衣壳，可以特异性结合骨骼肌富集的受体整合素αVβ（AVB6）。一个产生的变体，LICA1，在人类肌管和小鼠杜氏肌营养不良症（DMD）模型的骨骼肌中具有显著增强的感染力。或者，可以通过基因密码扩展实现衣壳的化学修饰，这是一个多功能平台，可以在感兴趣的基因的特定位点将所需的非规范氨基酸（ncAAs）整合到蛋白质中。最近的一项研究使用这种方法通过工程化的正交原核tRNA/tRNA合成酶插入单个ncAAs，工程化了一类新型rAAV，称为Nε-AAVs。这些突变的Nε-AAVs成功地与功能分子结合。体内研究表明，与Nε-AAVs结合的功能分子导致异种移植动物模型中目标细胞的高度特异性摄取。另一项研究还表明，在AAV5衣壳的D374处整合ncAA导致在小鼠肺中特异性增强转导。尽管取得了这些进展，但理性设计方法受到我们对rAAV结构和生物学理解不完整的限制。 定向进化：定向进化是一种选择压力形式，用于分离具有优势属性的衣壳变体，例如增加的rAAV产量、增强的转导、免疫反应逃避或特定细胞/组织嗜性。一种定向进化策略涉及诱导随机、无偏的突变，并对衣壳施加病毒适应性的选择压力。这已经通过使用错误倾向PCR然后通过交错延伸过程来实现，以生成Cap突变体库的VP1-3，以识别具有改变对肝素亲和力的变体，用于免疫逃逸。此外，已经使用基于DNA重组的方法来生成多样化和广泛的随机嵌合体库，通过结合来自各种亲本AAV血清型的衣壳。这种技术导致了新变体的创建，这些变体在体外和体内都显示出广泛的细胞嗜性。对不同抗原足迹的饱和突变也用于工程化AAV8衍生的衣壳，以逃避NAbs并改善肝脏嗜性。 在AAV衣壳上表面泛化随机肽是定向进化的另一种方法。例如，基于Cre重组的AAV靶向进化（CREATE）系统允许将短肽附着到rAAV9衣壳上，以工程化其属性。CREATE被用来生成AAV-PHP.B，这是一种能够穿过血脑屏障在C57BL/6小鼠中转导中枢神经系统的AAV9变体。然而，后续研究表明，PHP.B衣壳的属性并未转化为其他小鼠品系或NHPs，这表明工程化衣壳和宿主因素之间存在复杂的相互作用，这些因素在不同物种之间可能有所不同。 随后，开发了一种名为TRACER（通过细胞类型特异性表达RNA重新定向AAV的嗜性）的新型rAAV进化平台。这个平台基于从动物组织中以细胞类型特异性方式表达的大量衣壳库中恢复病毒RNA，该衣壳库带有随机肽插入。在小鼠中使用肽库显示在rAAV9衣壳上的研究确定了十个领先的变体，与亲本rAAV9相比，在系统给药后大脑转导高达400倍。同一小组最近报告称，VCAP-102，一种TRACER工程化的rAAV9变体，在NHPs的不同大脑区域的转导比rAAV9增加了20-90倍。VCAP-102的迭代进化导致了衣壳变体，与BBB穿透性相比进一步改善了6-7倍。同样，TRACER开发的VCAP-100衍生物在NHPs中肝脏去靶向高达300倍，大脑转导比其亲本AAV5高出六倍。 利用体内转基因RNA表达（DELIVER）定向进化rAAV衣壳是另一种里程碑式的方法，这导致了在小鼠和NHPs中识别出高度功能性的肌肉嗜性衣壳。在小鼠和NHPs中肌肉嗜性变体衣壳序列的交叉比较中发现了一个常见的RGD基序。进一步的分析表明，目标细胞中表达的与RGD结合的整合素异二聚体与含有RGD基序的病毒变体有很强的相互作用。研究人员最近生成了一个嵌入RGD的7-mer肽库，插入衣壳的可变区域VIII，并鉴定了与基准衣壳相比，在骨骼肌转导中增强了20多倍的变体。 定向进化是一个强大的工具，用于生成和识别具有特定属性的变体，但这些属性并不总是在灵长类动物中跨物种转化。例如，AAV-PHP.B在小鼠中显示出增强的中枢神经系统转导，但在狨猴中与AAV9相比则没有，这表明在衣壳工程中需要跨物种进化。然而，一项研究通过多个物种顺序进化rAAV衣壳库，鉴定了rAAV.cc47作为一种强大的跨物种变体，与NHP大脑和心脏中的rAAV9相比，具有增强的转导能力。7m8是一种AAV2变体，通过7-mer插入强烈转导外层视网膜层，如光感受器和视网膜色素上皮（RPE）细胞，主要通过玻璃体内注射在小鼠中。使用ADVM-022（AAV.7m8-aflibercept）治疗糖尿病黄斑水肿（DME）的II期临床试验（NCT04418427）因在接受高剂量（6.0 × 1011 vector genomes (vgs)/eye）后16-36周内几名患者出现严重不良反应（包括难治性眼内压降低）而暂停，这强调了工程化衣壳领域的转化挑战。 基于计算机或基于机器学习（ML）的设计：计算机辅助rAAV工程代表了一种尖端方法，利用计算工具增强rAAV的设计和优化。研究探索了rAAV的多样性属性，从其进化谱系出发，并使用预测的祖先基因组重建来创建新的衣壳变体。两项类似的研究通过理性设计或采用定向进化计算建立了祖先衣壳库。这两项研究都产生了具有增加的热稳定性的衣壳变体，这是血清型身份的指标，并且具有临床应用所需的有前途的生物学属性。在这些变体中，Anc80L65,作为与内耳或眼睛相关疾病基因治疗的有前途的载体出现了。 ML在生物医学研究中广泛使用，包括医学图像分析、遗传学和药物发现。一项开创性的研究将ML应用于理解rAAV2衣壳。他们仔细研究了衣壳的适应性景观，描述了单密码子替换，并使用ML设计精确的多突变变体，基于它们对目标组织的影响。此外，深度学习已被用于多样化rAAV2衣壳变体，准确预测其活力。这种方法揭示了在衣壳之外工程化rAAV基因组的新可能性，这在未来rAAV开发中具有有前途的创新应用。 转基因表达的rAAV基因组顺式调控元件工程化。rAAV基因组由ITRs和由感兴趣基因和调控元件组成的转基因表达盒组成。工程化rAAV基因组的策略包括修改ITRs或内含子以及插入组织特异性启动子进行转录调控和/或使用可诱导表达系统、密码子优化和转基因cDNA的CpG基序减少以及microRNA（miRNA）介导的转录后调控重定向。每个组成部分都有其自身的功能，它们的单独和集体行动决定了转基因表达、细胞类型特异性、安全性和rAAV转导的持久性。 工程化rAAV ITRs：传统的rAAV携带单链载体基因组。其转导效率和速率取决于mRNA转录发生之前载体DNA的第二链合成，这是速率限制步骤。为了增加转导效率，采用了突变一个ITR的策略，产生带有双链载体基因组的scAAV。这允许scAAV绕过dsDNA合成的速率限制步骤，从而更快速、高效地转导目标细胞。然而，使用scAAV有明显的局限性：较小的包装能力（scAAV为2.5 kb，ssAAV为4.7 kb）和由于转基因产物快速积累而增加的免疫反应风险。 ITRs可以被改变，以选择性地限制包装载体基因组的正义或负义链。这是通过选择性地从两个侧翼ITRs中的一个中移除D序列来实现的。ITRs还包含CpG基序，可以向toll样受体（TLR）-9发出信号并诱导炎症反应。完全移除ITRs中的CpG对治疗动物中载体基因组拷贝数或转基因表达没有不利影响。然而，它导致rAAV滴度降低，并且它是否减少了对rAAV的炎症反应仍然不清楚。总体而言，ITRs自然容易发生突变，并且由于它们的回文性质、高GC含量和二级结构而可能异质。优化ITRs中的GC含量可能是一个潜在的工程化策略，最终改善rAAV属性。 优化启动子：转基因表达盒中的启动子被选择和优化以满足特定需求，如组织特异性和表达水平。巨细胞病毒（CMV）或鸡β-actin（CBA）启动子通常被使用，因为它们提供强大且广泛表达，而组织特异性启动子如CK8或MHCK7在肌肉中提供有针对性的基因表达。在目标组织内转基因表达的特异性对于实现低剂量下的足够转导效率并最小化非目标效应至关重要。例如，一项研究采用了携带内源性人类存活运动神经元1（SMN1）启动子的scAA9载体，以在神经元中特异性驱动SMN1表达。这种方法展示了显著的安全性概况，显著降低了肝脏毒性，并在患有脊髓性肌肉萎缩症（SMA）的SMNdelta7小鼠中增强了治疗效果。这一结果超过了Zolgensma（一种使用CMV/CBA启动子的FDA批准治疗）的性能，因此强调了组织特异性启动子的优势。 额外的调控元件如上游增强子可以被工程化以提高表达活性和特异性。许多增强子已被设计在临床基因治疗载体中，目标是增加转基因表达，从而减少病毒载荷。另一项研究报告称，小鼠甲基CpG结合蛋白2启动子片段在神经元中特别实现了强大的长期表达。基于ML的多组学数据允许设计组织特异性启动子，导致转基因活性在目标和非目标组织之间动态增加超过1000倍。 转基因表达调控：转录调控：感兴趣基因或蛋白的表达可以上调或下调，以优化和微调所需的效果。四环素诱导系统是一种广泛使用的策略，用于实现特定水平的表达，尽管由于潜在的免疫原性问题，它不太可能被转化为人类。或者，开发了一个系统，使用免疫抑制药物雷帕霉素激活由两个单独的rAAVs传递的响应性转录因子。这种策略随后被优化，现在只需要一个rAAV。这已被用于实现对雷帕霉素处理的可诱导剂量反应表达，以长期表达所需的转基因。重要的是，在没有给予雷帕霉素的情况下，转基因表达只有最小的，这表明这可能提供一个特定和安全的调控系统。 转录后调控：另一种策略是使用核糖开关，这是一种非编码RNA，能够结合特定代谢物并控制基因表达。核糖开关自然存在，配体介导的基因调控原理正被利用于工程化适体酶，以改善哺乳动物系统的调控范围。与其它调控系统相比，使用核糖开关具有与FDA批准的药物兼容、RNA尺寸小以及几乎没有免疫原性等优点。重要的是，核糖开关序列非常短，这与rAAV有限的包装能力相结合时尤其重要，使其成为调控rAAV基因治疗的强大系统。 非编码RNA是转基因调控中极具多功能性的工具，这一点通过将具有可切割聚腺苷酸信号（PAS）的RNA适体纳入转基因的5'-非翻译区（UTR）进一步得到强调。在没有小分子的情况下，PAS切割会导致mRNA降解，从而沉默转基因表达。添加小分子通过维持mRNA的完整性导致转基因表达，这可以与替代剪接相结合，以更精确地控制基因表达。 一些调控系统需要外源添加或共表达特定元素才能正确工作。利用药物诱导剪接作为基因表达调控机制的方法已被探索以减轻这一问题。这种方法涉及传递一个包含过早终止密码子的基因，以防止蛋白质的翻译。添加小分子剪接诱导剂有助于将一个特设计定的外显子包含到成熟转录本中，并排除终止密码子，从而实现感兴趣蛋白质的翻译。启动子的强度和小分子诱导剂的剂量允许精确激活目标基因的表达水平。然而，当前技术依赖于内在蛋白质周转机制来降低目标蛋白质水平。 翻译后调控：调节感兴趣蛋白质半衰期的一种策略是使用蛋白质降解系统（degron）。这允许对蛋白质移除和恢复进行可逆和快速响应。已在体外建立几种这些系统，但将其转化为体内系统的尝试发现了高水平的毒性。然而，优化已产生了更新的、有前景的体内应用系统，例如在感兴趣蛋白质上结合一个SMAsh标签。然后引入一种已经批准用于人类使用的小分子药物，以防止SMAsh标签的分离，从而导致蛋白质降解。结合可诱导表达系统、替代剪接策略和蛋白质降解方法，有可能实现对目标蛋白质表达水平的精细控制。 优化转基因（转录后水平）：表达盒工程中的一种常见方法涉及密码子优化，即使用计算机算法识别转基因中的罕见或次优密码子，并用首选密码子替换。研究已经证明，在小鼠模型中，密码子优化的转基因（如FVIII和人类囊性纤维化跨膜传导调节器（CFTR]）表达水平显著更高。此外，优化密码子的天冬氨酸酰化酶（ASPA）转基因（Canavan病的致病基因）显著恢复了ASPA蛋白表达，并在小鼠模型中挽救了致命疾病表型。虽然密码子优化是提高rAAV递送转基因表达的有效策略，但这种效果可能取决于特定的转基因和宿主生物。 密码子优化方法可能引入意外的免疫原性和毒性，以及损害其他特性，如嗜性。事实上，研究发现密码子优化将大量CpG基序引入基于rAAV8的FIX Padua基因治疗，用于血友病B患者，这可能导致先天免疫反应。开发了一种新型的基于递归神经网络的工具，用于优化特定细胞类型的密码子使用，使用来自小鼠心肌细胞、神经元和肝细胞的数据。这种方法提高了蛋白质表达并减少了CpG二核苷酸，为提高组织特异性基因治疗效率提供了希望。 修改其他顺式调控元件：可以在表达盒中修改其他顺式调控元件，以调整基因表达和特异性。例如，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）是一个约600 bp的RNA元素，通常添加在转基因下游。WPRE可以通过增加独立于转基因的转录mRNA数量，在体外和体内增加转基因表达。研究谨慎地报告了在小鼠中传递的慢病毒载体中WPRE的潜在致癌活性。然而，通过从原始WPRE中移除致癌序列，可以降低这种风险。 在转基因表达盒中包含一个内含子也可以改善动物中的基因表达。这一点得到了另一项研究的支持，该研究表明内含子在体内增加了40-100倍的转基因表达。然而，内含子对基因表达的影响可能是复杂的，并取决于多种因素，如内含子的大小和位置以及特定的目标细胞。选择合适的polyA信号对于优化转基因表达和稳定性至关重要（例如，β-珠蛋白、SV40或牛生长激素（BGH]）。比较研究发现，在小鼠大脑中，修改后的较短版本的SV40晚期polyA（135 bp）显示出与BGH polyA（223 bp）相当的转基因表达。此外，包含Kozak序列可以进一步增强转基因表达。 确保将转基因表达限制在目标组织对于避免毒性过表达和免疫毒性至关重要。rAAV设计采用细胞特异性启动子作为目标表达的主要策略，然后开发微调策略，如在3'-UTR中添加miRNA结合位点，以抑制在表达互补miRNA的细胞中表达。例如，据报道在rAAV9中添加miR-122结合位点可以实现中枢神经系统表达，同时重新靶向肝脏、心脏和骨骼肌。当rAAV携带外来转基因或在内源副本中具有空突变的患者中编码替代基因时，转基因产物可能被抗原呈递细胞（APCs）视为非自身抗原，然后APCs处理转基因以进行主要组织相容性复合体（MHC）呈递和免疫清除。减轻转基因免疫的一种策略是在rAAV的表达盒中结合APC特异性miRNA结合位点，如miR-142和miR-652，以从APCs中去靶向转基因表达。结果显示，在小鼠中转基因特异性免疫反应减少，并在目标细胞中持续转基因表达。这种策略已在NHPs中转化，其中通过rAAV传递后，广泛针对人类免疫缺陷病毒的NAbs得到持久表达，从而突出了这种策略在临床转化中的潜力。 扩大rAAV包装能力。rAAV应用中的另一个重大挑战是递送超过其4.7 kb包装能力的转基因。例如，治疗性转基因如Leber先天性黑蒙10型的中心体蛋白（CEP290）（约7.5 kb），或基于CRISPR的工具如胞嘧啶碱基编辑器或主要编辑器2（>5 kb）。出现了各种策略来克服这一障碍，通过将大转基因分成两部分，每部分都封装在rAAV衣壳中。这些分割的转基因在同一细胞中共引入，导致全长转基因和蛋白质的重构。这种重构可以在遗传信息流的不同阶段发生。在DNA水平上，通过rAAV ITRs、部分转基因序列或优化的重组元件在两个rAAV基因组中存在，促进了载体间DNA重组。重叠序列可以通过特别设计的剪接信号在转录后切除，产生成熟的全长mRNA，然后翻译成所需的蛋白质。在RNA水平上，通过每个转录本中存在的剪接供体和受体介导的两个转录本之间的跨剪接，产生全长转录本和蛋白质。在蛋白质水平上，通过分裂内含子实现了蛋白质重构，内含子是能够切除自身并将附近的蛋白质片段连接起来的天然多肽。 3.rAAV生产 3.1.方法论 rAAV的临床应用突显了对生产和纯化系统迫切需求，这些系统能够生产大量且高质量的rAAV，以满足安全、有效、稳定和成本要求（每次治疗1.0 ×1015– 1.0 ×1016 vgs）。由于rAAV无法通过再感染自我复制，其生产需要同时表达辅助病毒基因和rAAV特异性Rep和Cap基因，以复制和包装ITR-环绕的载体基因组。主要有两种策略开发了rAAV生产方法：瞬时转染和病毒感染。基于转染的rAAV生产中，向HEK293细胞共转染质粒是最广泛使用的系统，由Xiao等人首次开创。29 通过病毒感染的rAAV生产涉及使用三种不同的病毒，包括AAV的自然辅助病毒、Ad和HSV，以及使用杆状病毒。rAAV生产还涉及哺乳动物细胞（例如，HeLa、A549和HEK293）或昆虫细胞（例如，Spodoptera frugiperda，Sf9）（图4）。新开发的四环素激活自沉默Ad（TESSA）代表了另一种基于感染的系统，用于在HEK293细胞中大规模、高产率生产rAAV。这些方法在灵活性、质量和可扩展性方面都有其独特的优点和缺点，下面将更详细地讨论。为了纯化各种方法生产的rAAV，使用铯氯或碘克沙醇梯度超速离心的梯度沉淀是小规模rAAV准备常用的通用程序。对于大规模载体生产，尤其是对质量更高、数量更多的临床级载体，需要亲和性和/或离子交换柱色谱。最后，正在积极开发稳定的包装和生产细胞系作为下一代rAAV生产平台，因为它们可以轻松扩展大规模生产，成本更低。 在HEK293细胞中瞬时转染。传统的rAAV生产涉及将携带载体基因组、AAV Rep/Cap基因和Ad辅助基因（VA RNA、E2A和E4OEF6）的三个质粒，通常以等摩尔比共转染到HEK293细胞中。另一个基本的Ad辅助基因E1a/b在HEK293细胞中固有表达。这种三重转染协议随后被优化为双质粒共转染系统，涉及一个质粒用于rAAV基因组，另一个用于Rep/Cap和Ad辅助基因。当前方法可以实现大约80%的细胞转染率，转染后48-72小时病毒产量达到峰值。 病毒载体生产中存在许多挑战，导致批次间质量、滴度和纯度不一致，并且这个过程非常劳动密集。最近的研究集中在质粒水平上修改标准生产工艺，以提高产量和纯度，降低成本。一项值得注意的最近研究表明，低共转染三重转染（1%或10%共质粒）显著减少了转基因质粒的使用，与标准三重转染（100%共质粒）相比，并提高了体内转导效率。重要的是，这种方法使得抑制产量的转基因包装，并减少了小共rAAV制剂和小鼠组织中的质粒骨架污染。其他人开发了一种名为AAVone的新全合一rAAV生产系统，将Rep/Cap和Ad辅助基因与rAAV基因组结合到一个单一质粒中。AAVone的产量高于三重转染方法，批次间变化较小，复制能力AAV（rcAAV）水平降低。它还需要较少的质粒DNA，并消除了比例优化步骤的需要。 瞬时转染方法具有灵活性，可以轻松快速地生产具有不同转基因和衣壳的rAAV。它在一定程度上是可扩展的，当使用悬浮细胞时，可以通过增加培养体积简单地增加产量。此外，瞬时转染方法灵活多变，不需要建立和维护特定载体产品的稳定生产细胞系的耗时过程。这有助于从载体设计到生产的更快周转时间。值得注意的是，这种方法受到可扩展性有限和成本高的困扰。 杆状病毒生产系统。第一个上市的rAAV基因治疗产品（uniQure的Glybera， alipogene tiparvovec；现已退出市场）实际上使用了杆状病毒表达载体系统（BEVS），其中编码Rep和Cap基因的杆状病毒感染昆虫细胞，如Sf9，以生产rAAV。这个系统最初针对大规模蛋白质生产进行了优化，但已经取得了显著进展，以适应rAAV生产。第一代BEVS涉及将Rep基因分割成两个由不同启动子控制的盒式磁带，并修改Cap基因以包含非典型起始密码子（ACG而不是AUG）。这些遗传改变的AAV病毒序列被合并到三个单独的杆状病毒构建中，需要在同一细胞中同时超感染所有三个。然而，这种方法最初成功用于rAAV1生产，但对其他rAAV血清型的产量要少得多。第二代BEVS适用于其他rAAV血清型，并减少了杆状病毒的数量至两个，一个携带Rep/Cap基因（Bac-CapRep），另一个携带rAAV基因组（Bac-Transgene）。随后，在BEVS中引入了减弱的Kozak序列和泄漏性核糖体扫描，以确保适当的AAV基因表达，从而产生生物学效力显著提高的rAAV。 BEVS的一个缺点是杆状病毒的遗传不稳定性。杆状病毒在复制过程中自然去除其基因组的部分，从而产生突变病毒，其中一些可能成为有缺陷的干扰颗粒。在细胞培养的放大过程中，这些突变体可能在竞争中胜过具有完整基因组的杆状病毒，从而可能降低rAAV产量。然而，通过删除特定基因或将转基因插入杆状病毒基因组中的稳定位点，可以潜在地改善杆状病毒的遗传不稳定性。此外，BEVS本身无法将衣壳蛋白组装成AAV病毒，VP1、VP2和VP3的比例为1:1:10，导致产生的rAAVs转导效力降低。一项研究表明，在rAAV序列中插入人工内含子，例如使用杆状病毒多角体启动子的那些，可以产生高滴度的各种血清型感染性rAAV，最高可达1.0 × 1014 vgs/L。此外，一项研究系统比较了BEVS生产的rAAV（Sf9-rAAV）与瞬时转染生产的rAAV（HEK-rAAV）使用大规模悬浮培养，发现Sf9-rAAV可能因其优越的产量、满/空比率、可扩展性和成本效益而受到青睐。然而，需要进一步研究杆状病毒的遗传学和生物学，以便利用BEVS平台的优势（图4），例如其高可扩展性。 图4 目前rAAV的生产方法。目前，有两种主要平台用于rAAV生产：转染和病毒感染的方法。对HEK293细胞进行质粒瞬时转染仍然是最广泛使用的方法，而稳定细胞系、杆状病毒（BV）系统和I型单纯疱疹病毒（HSV）系统为大规模生产提供了可扩展的替代方案。已经开发出无需转染的辅助病毒系统TESSA来生产高产量的rAAV。药物诱导型全能细胞系可能代表下一代rAAV基因治疗药物的最佳生产平台。BHK为小鼠胚肾细胞。图表由Biorender.com创建。 哺乳动物稳定细胞系和Ad-AAV杂交用于rAAV生产。用于载体生产的稳定细胞系提供了显著的优势，包括易于产品特性、可扩展性以及能够以提高的重复性和降低的成本产生更高产量。有两种类型的稳定细胞系用于基于Ad感染的rAAV生产：包装和生产细胞系。包装细胞系稳定整合了AAV Rep/Cap基因。使用包装细胞系生产rAAV的一个主要挑战是，细胞首先需要被AAV的自然辅助病毒，野生型Ad感染，以启动内源性Rep/Cap表达，然后二次感染Ad-AAV杂交病毒，从中rAAV基因组将被挽救、复制和包装。相比之下，生产细胞系在宿主基因组中稳定整合了Rep/Cap和Ad辅助基因以及rAAV基因组。在这种情况下，野生型Ad的感染将激活Rep/Cap基因表达，促进rAAV基因组的挽救、复制和包装。源自A549和HEK293细胞的稳定细胞系已适应悬浮培养，用于可扩展的rAAV生产。 几种基于HeLa的细胞系，如C12、H44和B50，通过内源性表达Rep/Cap产生了高滴度的传染性和无rcAAV的rAAV。还报道了表达Rep/Cap的A549衍生稳定细胞系和K209细胞系，每细胞产生高产量的传染性rAAV。 稳定细胞系和基于Ad感染的rAAV生产系统存在几个缺点。首先，创建稳定细胞系通常是一个复杂、耗时、血清型和载体基因组特异性的过程。第二，确保这些细胞系的特性和稳定性可能具有挑战性，与传递历史对生长动力学的影响相关的潜在风险。此外，为确保最终基因治疗产品的安全性，必须进行强大的下游纯化程序，以消除任何致病性Ad污染物和致癌HeLa DNA。 用于rAAV生产的重组单纯疱疹病毒（rHSV）系统。rHSV是另一种能够为rAAV生产提供辅助功能的天然辅助病毒。为了使用rHSV系统生产rAAV，创建了两个不同的携带AAV Rep/Cap基因和rAAV基因组的rHSV，用于顺序感染HEK293或仓鼠肾细胞，然后进行下游处理和纯化。第一个使用rAAV1治疗α1-抗胰蛋白酶缺乏症的临床试验是使用rHSV生产的。 使用基于rHSV的系统进行rAAV生产的主要缺点包括产生足够数量的rHSV颗粒，以及需要专门的纯化步骤，以有效消除神经营养性和神经毒性rHSVs和其他与最终rAAV制剂相关的污染物。 四环素激活自沉默腺病毒（TESSA）系统。典型的rAAV生产方法涉及无辅助质粒转染或使用辅助病毒。然而，无辅助系统在放大时面临挑战，辅助病毒方法需要更强大的下游处理和纯化，以消除污染性辅助病毒和高度免疫原性VPs。最近的创新引入了一种辅助Ad，设计用来抑制其主要晚期启动子（MLP），从而限制其复制，并有效克服这些限制。这是通过在MLP中引入诱导型四环素抑制剂结合位点来实现的。这种修改后的Ad在存在多西环素时正常运作，但在没有多西环素的情况下限制在基因组扩增和早期基因表达（称为辅助功能）上。通过利用这种自调节Ad，研究人员成功地促进了必需的腺病毒辅助功能、Rep/Cap基因和rAAV基因组的传递，显著提高了rAAV产量，几乎完全消除了污染性Ad。以前，多次尝试在HEK293细胞中产生在基因上稳定的表达AAV Rep基因的重组Ad均失败，因为即使在非常低水平的泄漏表达下，Rep蛋白也具有细胞毒性和重组性。然而，TESSA系统严格调节Rep基因的表达，仅在rAAV基因组挽救、复制和包装过程中激活其表达，这是一个重大突破。该系统提高了HEK293和U87细胞中各种rAAV血清型的生产，包括rAAV2、rAAV6、rAAV8和rAAV9。 此外，该系统可以放大到生产rAAV2和rAAV6，与瞬时转染方法相比，载体产量显著提高。 3.1.1.下一代制造平台技术 选择使用哪种生产系统涉及平衡灵活性、可扩展性和质量，所有这些都在开发安全有效的rAAV产品中发挥着至关重要的作用，以满足临床应用的需求、安全性和有效性要求。为了进一步提高瞬时转染方法，至关重要的是在生产和纯化过程中优化多个因素，以增加产量并减少空rAAV。最小化空载体增强了载体效力，允许使用较低的注射剂量，从而减少免疫毒性。正在进行的努力是为了优化rAAV生产的上游过程，以提高rAAV产量。例如，通过将共质粒比例调整为1%或10%，可以实现与传统三重转染相当的rAAV产量。这种方法使得以前无法包装的转基因得以包装，同时还减少了骨架质粒污染，并被证明是一种成本效益策略。 使用三重转染的机制建模研究已经确定了rAAV生产的几个关键瓶颈，包括质粒传递到细胞核的效率不高，以及衣壳合成和病毒基因组复制的时间协调不佳导致空衣壳。解决这些问题的策略包括确保病毒DNA复制发生在衣壳生产之前或与之并行，例如早期表达Rep蛋白或晚期表达Cap蛋白。 还做出了努力，以识别可以促进rAAV生产的小分子化学添加剂。已经组装了一个包含超过130种小分子的库，以瞬时拮抗广泛的细胞先天抗病毒途径，有效地增加大规模病毒生产。基于咪唑的小分子已被证明可以通过多个信号传导途径改善大规模rAAV生产。 修改宿主因子也会影响生产。通过全基因组筛选策略，研究发现了几个增益或丧失功能靶标，这些靶标可以显著影响rAAV生产。的确，对宿主细胞对瞬时质粒转染的转录反应的系统分析揭示了宿主细胞积极感知rAAV生产作为一种感染性侮辱，并上调炎症和抗病毒反应。 为了减少空AAV颗粒，一项研究创建了一个来自不同AAV血清型的混合Rep基因，与AAV2 Rep基因的3'端，导致非AAV2血清型的完整衣壳增加了2-4倍，表明增强Rep功能可能会提高rAAV生产。 优化下游纯化过程的努力也导致了在去除空衣壳方面的改进。该行业已经从超速离心转向基于柱的色谱法，以有效纯化大规模生产中的rAAV颗粒。阴离子交换色谱法已成为该领域的一个主要焦点，修改各种过程参数，包括pH值、各种洗脱盐、辅料、表面活性剂、稳定剂和渗透剂，以提高纯化效率。 未来的制造方法应该优先考虑最大的灵活性、可扩展性和质量，同时消除对质粒转染、病毒感染和化学诱导的需求。许多努力都指向创建一个稳定且可诱导的生产细胞系，这些细胞系具有这些基本特征。一个值得注意的研究通过将所有rAAV生产所需的组成部分整合到HEK293细胞中，包括rAAV基因组、Rep/Cap基因和辅助编码序列，这些序列由多个可诱导启动子复杂控制。产生的合成细胞系在诱导后产生传染性rAAV。这种全合一生产细胞系方法允许独立控制复制和包装活动，确保高质量的rAAV生产。随后的工作进一步优化了这个生产细胞系，通过减少感兴趣基因的过度表达、优化诱导曲线和通过蛋白酶体抑制剂减轻衣壳蛋白的蛋白酶体降解来提高生产力。对于大规模载体生产，另一个用于生成稳定且可诱导的生产细胞系的两步平台已经开发出来。最初，基于专有CAP人类细胞系或悬浮HEK293细胞创建一个α细胞系，这些细胞系稳定整合了Rep和辅助基因。其次是整合Cap基因和感兴趣基因，产生多克隆生产池，然后进行单细胞克隆过程、克隆筛选和选择表现最好的克隆。在这个系统中，通过多西环素诱导rAAV生产。在一个概念验证细胞系中，使用灌注生物处理法进行rAAV8-GFP生产，每个细胞的rAAV产量提高了8倍，与常规批处理过程相比，完整颗粒的产量显著增加（30-40%）。 增强载体基因组完整性是提高载体效力的另一种策略。一项使用长读序列平台和生物信息学管道的研究从scAAV制剂中识别出不同的载体基因组群体。结果表明，载体基因组设计中固有的强大DNA二级结构可能导致显著的截断，影响生产和载体效力。另一项研究报告了截断基因组的存在，以及一种独特的基因组物种，起源于一个可切割的ITR，它包含一小部分有效载荷和与质粒骨架连接的嵌合序列。这种异质性也观察到在带有尾对尾配置的双单导向RNA表达盒的载体基因组设计中。有趣的是，同一组发现人类和昆虫细胞产生的rAAV在基因组异质性方面存在显著差异。这些发现强调了迫切需要审查载体基因组设计和异质性生成，以有效生产高度有效的rAAV制剂，特别是临床载体。 4.基因治疗效力和临床应用 4.1.rAAV基因治疗的当前临床试验概述 在过去几十年中，rAAV在临床应用方面取得了显著发展，突显了其在治疗各种遗传和获得性疾病方面的潜力。事实上，在FDA批准Luxturna后的相对较短的时间内，又有五种rAAV基因治疗产品上市（图1）。尽管基于rAAV的疗法在一些临床试验中显示出令人印象深刻的结果，但许多方面需要进一步研究，包括载体免疫原性、剂量优化和长期安全性。尽管对于大多数单基因疾病来说，满足高产量生产挑战可能不是当务之急，但随着更多的rAAV基因治疗被开发用于治疗慢性普遍人类疾病，大规模生产rAAV可能成为瓶颈。此外，基因治疗的监管框架正在快速变化。在本节中，我们将探讨rAAV在主要人类疾病（图5）的临床应用中的最新进展，包括眼部、神经系统、代谢、血液学、神经肌肉、心血管和肿瘤疾病。补充表1中提供了238项基于rAAV的基因治疗临床试验的总结。 图5 rAAV在主要人类疾病中的当前临床应用。rAAV在一系列重大人类疾病中的临床应用，包括眼科、神经系统、代谢、血液学、神经肌肉、心血管疾病和肿瘤学。有关使用rAAV基因治疗的238项临床试验的完整列表，请参考补充表1。图表由Biorender.com创建。 眼部疾病。由于几个原因，眼部疾病是rAAV基因治疗的最前沿。眼睛的免疫特权地位减少了对rAAV的免疫反应。它的小体积需要低rAAV剂量。许多眼部疾病是单基因的，使它们适合基因治疗。此外，眼睛的相对容易接近允许各种rAAV给药途径。在这里，我们强调几种基于rAAV的眼部基因治疗，专注于治疗单基因和获得性眼部疾病。 Leber先天性黑蒙2型（LCA2）：Voretigene neparvovec-rzyl（Luxturna）是一种治疗LCA2的基因治疗，LCA2是由RPE65突变引起的一种罕见的遗传性视网膜疾病（IRD）。这种治疗传递了一个功能性的RPE65基因副本，纠正了RPE细胞的缺陷，这些细胞对视力至关重要。在一项具有里程碑意义的III期临床试验中，29名确认有双等位基因RPE65突变的LCA患者随机接受Luxturna或无治疗作为对照组，随后进行多亮度移动测试，通过要求参与者在特定光照水平下导航障碍课程来测量视觉功能。结果表明，与对照组（平均0.2光级）相比，Luxturna显著改善了功能性视力（平均1.8光级）在一年内。此外，全视场敏感度阈值测试显示，干预组在第30天的改善超过100倍，这一改善在一年内得以维持。这种有益的改善在随后的随访研究中持续了3-4年。由于在这项III期试验中观察到的有利结果，Luxturna于2017年获得FDA批准，用于治疗双等位基因RPE65缺乏相关视网膜疾病，作为第一种遗传病基因治疗。 视网膜色素变性（RP）：鉴于RP病因突变的异质性，已经对这种常见的IRD应用了各种基因治疗策略。MERTK的丧失，这是一个控制RPE中吞噬作用的信号通路中的关键组成部分，导致光感受器退化，最终导致RP。这种疾病表型是常染色体隐性的，占RP病例的约3%。一项I期临床试验评估了6名MERTK相关RP患者接受rAAV2-VMD2-hMERTK玻璃体注射。虽然三名患者显示出视力改善，但在两年内只有一个患者观察到持续的视力增益，这表明需要长期调查。 视网膜色素变性GTPase调节蛋白（RPGR）基因突变是X连锁视网膜色素变性（XLRP）的常见原因，主要影响男性。这是RP最严重的形式，其特点是由于光感受器和RPE细胞功能障碍而逐渐失去视力。已经进行了三项临床试验，以评估基于rAAV的基因治疗对RPGR突变患者的安全性和有效性。其中一项试验的早期结果令人鼓舞，一些患者在接受治疗后显示出视觉功能改善和视网膜结构稳定性。对XLRP的基因治疗临床试验（XIRIUS）和自然病史研究（XOLARIS）的事后分析显示，接受最高剂量的cotretigene toliparvovec（BIIB112/rAAV8-RPGR）的四名参与者在第12个月的视网膜敏感性和低亮度视力有早期改善。然而，在一项II/III期研究中，这种基因治疗没有达到治疗眼的光敏感性统计学显著改善的主要终点。 大约15%的RP病例是由常染色体显性增益功能视紫红质（RHO）突变引起的。基因沉默或敲除策略可以用于这种类型的突变。在NHPs中进行了一项临床前研究，使用EDIT-103,这是一种研究性基因治疗产品，包含两个rAAV5载体，通过CRISPR/Cas9去除内源性RHO，并插入一个对目标Cas9切割有抗性的密码子优化RHO表达盒，以恢复功能性RHO表达。早期结果已经显示出在RHO表达和视觉功能方面的令人鼓舞的改善。然而，其在人类中的效力尚未评估。 除了基因替代或编辑方法外，还研究了其他创新策略，如光遗传学，用于独立于遗传突变治疗RP。光遗传学使用光来操纵带有光敏蛋白的基因修饰细胞。一项IIb期临床试验的初步评估得出结论，对于RP患者，通过玻璃体内注射MCO-010（一种在rAAV2中编码的多特征视蛋白，专门针对ON视网膜双极细胞），可以改善视力，没有严重的眼部或系统性不良事件。 年龄相关性黄斑变性（AMD）：AMD是发达国家致盲的最常见原因。它是一种进行性视网膜疾病，以晚期的地理萎缩和新生血管为特征。治疗的主要目标是针对血管内皮生长因子（VEGF），这是参与新生血管病理生理的主要血管生成因子。虽然抗VEGF治疗已被证明在减轻疾病进展和改善一些患者的视力方面是有效的，但它们需要每月注射，因此治疗负担重，同时对很大一部分患者来说并不成功。基因治疗能够长期、内源性地生产治疗蛋白，解决了抗VEGF药物的许多限制，如其短半衰期。因此，越来越多的临床试验使用rAAV传递基因，用于治疗地理萎缩和新生血管AMD。 GT005（Gyroscope）是一种基于rAAV2的一次性基因治疗产品，通过玻璃体注射传递，用于治疗由AMD引起的地理萎缩。GT005旨在通过增加补体因子I（CFI）蛋白的表达，减轻老年视网膜中过度反应的补体系统引起的视网膜退化，这是一种基因添加策略，以减少炎症并缓解视网膜细胞的退化。EXPLORE和HORIZON是两项II期、多中心、随机和对照（治疗与未治疗患者）试验，评估GT005在两组不同地理萎缩患者中的安全性和有效性（EXPLORE：由AMD引起的地理萎缩和由于CFI变体导致CFI表达低的患者；HORIZON：仅有由AMD引起的地理萎缩的患者）。中期数据显示，治疗实现了玻璃体CFI水平的持续增加和CFI下游蛋白的减少。治疗效果局限于眼睛，没有观察到CFI水平的系统性增加。然而，赞助商最近停止了GT005的进一步开发，因为已经满足了无效标准。 sFlt-1是一种由Flt-1（VEGF受体-1）的第2域与人类免疫球蛋白G1重链Fc片段偶联的嵌合VEGF抑制蛋白。使用编码sFlt-1的rAAV2进行新生血管AMD的基因治疗已通过玻璃体和视网膜下给药进行研究。在I期临床试验中，通过玻璃体内注射rAAV2-sFlt-1被报告是安全且耐受性良好的，而sFlt-1的表达水平和治疗效果是可变的。238 同样，同样的载体通过视网膜下注射在老年人中耐受性良好。然而，没有观察到显著的视力改善，尽管这一结果不是研究的主要终点。 RGX-314（Regenxbio）正在开发作为一种新生血管AMD的视网膜下治疗，由编码抗VEGF单克隆抗体片段的rAAV8组成，类似于ranibizumab。来自I期临床试验（ASCENT）的初步评估显示，治疗是安全且耐受性良好的。治疗效果是剂量依赖性的，一些患者在长达18个月内不需要额外的抗VEGF注射。 ADVM-022（Adverum Biotechnologies）是一种基因治疗产品，利用来自rAAV2的工程化7m8载体编码aflibercept，用于治疗新生血管AMD。在I期临床试验（OPTIC）中，单次玻璃体内注射ADVM-022在随访期间的长达92周内，超过80%的患者减少了对额外抗VEGF注射的需求。 神经系统疾病。目前FDA批准的用于神经系统疾病的rAAV基因治疗使用两种基本不同的传递途径，用于局部与广泛转基因传递：立体定向、解剖学限制的rAAV传递或通过静脉内（i.v.）传递实现广泛的中枢神经系统转导。 芳香族L-氨基酸脱羧酶（AADC）缺乏症（AADCD）：AADCD是一种由多巴脱羧酶基因突变引起的常染色体隐性遗传疾病，导致AADC酶缺乏。AADC催化血清素和多巴胺合成的最后一步，多巴胺是去甲肾上腺素和肾上腺素的前体。这导致血清素、多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素的联合缺乏。 患者在生命的头几个月出现肌肉张力减退、肌张力障碍、眼球运动危机、发育迟缓和自主功能障碍。报告了症状发作（2.7个月）和诊断（3.5年）之间的显著延迟。在最严重的形式中，患者错过了所有的发育里程碑，缺乏头部控制，从未学会站立或坐着，并在10岁之前死亡。 帕金森病（PD）和AADCD有不同的病因（神经元丧失与酶缺乏），但导致纹状体多巴胺缺乏作为共同的治疗目标。这导致了一种治疗载体可以同时惠及两种疾病的理念。2008年在PD患者中测试了第一种尝试传递内腔（豆状核是纹状体的一部分）rAAV表达AADC（rAAV.AADC）。总体而言，该疗法耐受性良好，与程序相关的不良效应较少，提供了关于立体定向颅内rAAV.AADC传递的安全性和可行性的关键数据。同样与临床改善相关的rAAV.AADC传递。受到PD试验的鼓舞，这种方法在2012年在台湾扩展到AADCD儿童。四名儿童，其中最大的在治疗时六岁，接受了双侧豆状核内注射rAAV2.AADC，总剂量为1.6 × 1011 vgs。所有患者都显示出运动评分的改善，并主观报告情绪稳定性改善。有趣的是，患者在灌注后经历了短暂的不自主运动。 2019年，日本的一个小组在一项I/II期试验中用相同的方法和类似的载体和剂量（2 × 1011 vgs）治疗了六名患者。然而，患者群体在突变和治疗年龄方面更加多样化，其中最大的患者治疗时19岁。与2017年台湾的研究类似，患者在灌注后经历了短暂的不协调的口腔和四肢运动。令人鼓舞的是，所有患者在运动表现和口腔进食方面都有所改善。 解剖学目标是基于PD病理定义的，即多巴胺能神经元的丧失。然而，在AADCD中，多巴胺缺乏的多巴胺能神经元似乎仍然存在。最近在一项安全性和有效性试验中评估了靶向黑质和腹侧被盖区的这些多巴胺能神经元，以模拟生理多巴胺合成。 七名4至9岁的患者被分配到两个剂量队列（总剂量8.3 × 1011和2.6 × 1012 vgs）。所有患者的运动功能和情绪都有所改善。在6/7的患者中，眼球运动危机完全停止。这种临床改善与PET成像结果一致，提示AADC酶活性。与大多数试验一样，灌注后观察到短暂的不自主运动。不幸的是，目前很难直接比较这两种方法，并需要进一步的研究。 最近，台湾试验的长期随访结果显示，26名患者的运动功能有显著改善，其中三名患者能够行走。有趣的是，治疗年龄与运动评分呈负相关，而剂量则没有。最常见的治疗相关不良效应（TEAE）是发热和不自主运动。除一名患者外，所有患者的不自主运动都得到了解决。值得注意的是，不自主运动的严重程度/持续时间与治疗年龄之间存在正相关。这种相关性可能是理解年龄风险效益的关键观察，也可能在其他CNS疾病中找到等效物。该疗法（Eladocagene Exuparvovec）最终获得许可，并最近被欧洲药品管理局批准用于18个月以上的患者（Upstaza）。 脊髓性肌肉萎缩症（SMA）：SMA是模型疾病，通过静脉rAAV基因治疗靶向大脑和脊髓的广泛病理。迄今为止，已有超过3000名患者接受治疗，为有效性和安全性提供了关键见解。SMA被分类为I-IV型变体。I型是最严重的类型，症状在生命最初6个月内开始，2岁前死亡。其特征是虚弱、运动发育退化，并发展为呼吸衰竭和死亡。SMA I是常染色体隐性的，由SMN1基因的丧失功能突变引起。SMN2是与SMN1同源的基因，产生SMN1的短版本。SMN2拷贝数与疾病的严重程度呈负相关。发病率根据国家和种族而异，但估计低至1/7829。 SMA I的第一批临床试验结果于2017年发表。259 15名患者接受了6.7 × 1013 vgs/kg或2 × 1014 vgs/kg的静脉注射rAAV9表达SMN1（rAAV.SMN1），由CB启动子控制，带有CMV增强子。低剂量组的平均年龄为6.3个月，高剂量组为3.4个月。主要发现是患者对呼吸机支持的需求减少，运动评分提高。11/12的患者在几秒钟内能够独立坐下并学会说话。虽然该疗法耐受性良好，但常见肝酶升高，但皮质类固醇治疗后降低。 在美国（STR1VE）和欧盟（STR1VE-EU）进行的两项III期后续研究中，分别又有22名和33名患者入组，并接受了1.1 × 1014 vgs/kg的静脉注射。这两项研究中的平均给药年龄是可比的（3.7 vs. 4.1个月）。美国研究的共同主要终点是无需辅助至少坐30秒和无呼吸机存活，而欧盟研究将主要终点定义为无需辅助至少坐10秒，无呼吸机存活作为次要终点。这两项研究都采用了强的松龙方案。在STR1VE中，22名患者中有13名实现了至少30秒的独立坐姿，在STR1VE-EU中，20名患者中有14名实现了至少10秒的独立坐姿，其中一名达到了30秒。值得注意的是，欧盟试验的纳入标准更广泛，一些患者显示出更晚期疾病的征兆，限制了这两项研究的直接比较。此外，两项试验都报告了灌注后肝酶升高和血小板减少。 2021年报告了最初的START试验的长期随访结果。最长的随访时间为6.2年，患者在初始试验期间获得的运动技能得以保持。令人鼓舞的是，两名患者获得了新的运动里程碑，并能够在辅助下站立。安全性概况仍然非常好，没有报告TEAEs。 批准疗法的可用性允许将该疾病纳入新生儿筛查，这可能识别出无症状患者。这提出了预防性治疗的可能性。 SPR1NT试验研究了在14名有两个SMN2拷贝的患者（中位年龄：21天）和15名有三个SMN2拷贝的患者（中位年龄：32天）中预防性治疗Onasemnogene abeparvovec（Zolgensma）1.1 × 1014 vgs/kg的治疗效果。预防性地给予强的松龙，并在治疗后给予。所有有两个SMN2拷贝的患者都实现了主要终点，即独立坐姿超过30秒。11/14的患者在正常发育窗口内达到了这一里程碑，独立站立的结果也类似。在理解可能有不同的行走定义的情况下，9-10/14的儿童能够独立行走，其中4-5在预期的发育窗口内实现了这一点。重要的是，所有患者在研究结束时都没有永久性通气并存活。报告了肝酶升高、心脏血清标志物、血小板减少但没有血栓性微血管病（TMA）和短暂的无反射/低反射，这些在除一名患者外的所有患者中都得到了解决，并被归类为与治疗无关。 有三个SMN2拷贝的患者表现出较轻的疾病，这反映在14/15的儿童至少独立站立3秒和至少行走五步。15名患者中有14名达到了站立，11名达到了行走，都在预期的发育窗口内。与两个SMN2拷贝组类似，所有有三个SMN2拷贝的患者在研究结束时都存活且没有永久性通气。报告的TEAEs与两个SMN2拷贝组相似。 这两个队列的结果强调了早期无症状治疗的好处，这种好处在以前使用Zolgensma时没有观察到临床改善的程度。它还强调了治疗的有利安全性概况，尽管有更严重的肝毒性甚至死亡的报告。Zolgensma于2019年获得FDA批准，截至2023年3月20日，已有超过3000名患者接受了Zolgensma治疗，据诺华公司称。已完成或正在进行的研究目前正在探索新的方面，包括联合疗法或将患者从传统疗法转变为Zolgensma。 代谢疾病。导致代谢障碍的遗传缺陷可能具有全身性或器官特异性表现，对载体设计和给药途径（例如，以CNS表现为主要的溶酶体贮积病）有影响。在这里，泰萨克斯病（TSD）、桑霍病（SD）和卡纳万病（CD）将作为目前活跃的临床试验（NCT04669535、NCT04798235、NCT04833907和NCT04998396）的神经代谢疾病的示例。 TSD和SD是溶酶体贮积病，被归类为GM2神经节苷脂沉积症，由在广泛表达的基因编码β-N-乙酰己糖胺酶（HEX）中的常染色体隐性、丧失功能突变引起。HEX由α和β（HEXA）亚基、β和β（HEXB）亚基或α和α（HEXS）亚基组成的二聚体。TSD和SD分别由编码α-和β亚基的基因突变引起。在临床上，两种疾病都以婴儿型、少年型和成人型出现，这些类型在发病和严重程度上有所不同。 一个挑战是需要α-和β-亚基的化学计量平衡，以实现HEX二聚体的最佳功能。鉴于rAAV的有限包装能力，一种策略是使用两个单独的载体同时传递α-和β-亚基。或者，已经开发了一种双顺反子rAAV，以共同表达α-和β-亚基。 2022年，在两名TSD患者的扩大访问试验中，证明了鞘内（i.t.）输注两种表达α和β亚基的rAAV.rh8载体的安全性。患者年龄分别为30个月（1.0 × 1014vgs；i.t.）和7个月（4.05 × 1013 vgs；双侧丘脑内和i.t.联合），并接受利妥昔单抗、西罗莫司和强的松龙的免疫抑制。该程序和载体耐受性良好。尽管功能结果不是研究终点的一部分，但两名患者均显示出疾病稳定的征兆。这项首次人类TSD rAAV基因治疗研究是评估丘脑内给药的里程碑，并为正在进行的临床试验铺平了道路。 目前，加拿大（NCT04798235）和美国（NCT04669535）有两项临床试验正在进行。加拿大的I/II期试验使用rAAV9通过单次i.t.剂量向婴儿TSD或SD患者传递HEXA和HEXB转基因。相比之下，美国的试验设计为通过双侧丘脑内途径和i.t./小脑延髓池联合给药的四种不同载体剂量的剂量递增研究。该研究使用两种rAAV.rh8载体传递HEXA或HEXB转基因。这两项试验的结果尚未公布。 CD是一种常染色体隐性遗传性进行性神经退行性疾病，其特征是海绵状变性和N-乙酰天冬氨酸（NAA）水平升高。ASPA酶的功能丧失突变导致CNS和尿液中NAA的积累。受影响的儿童通常永远不会学会走路、说话、控制头部运动或获得任何程度的独立性。许多患者在生命的最初几年内就会死于该病。一项临床试验首次评估了颅内rAAV给药治疗CD的安全性。在这次临床试验之后，优化载体设计的研究可以在小鼠中实现不同程度的年龄依赖性预防和疾病逆转。很可能载体设计和给药途径的差异可能解释了临床前研究报告的不同结果。 在早期的单一患者试验中，采用了脑室内（i.c.v.）和静脉内（i.v.）给药途径的组合，以减少总体载体剂量。然而，需要进行比较研究来评估这种策略。 目前，有两项临床试验正在进行中，其中一项在撰写本文时正在积极招募（NCT04833907和NCT04998396）。这两项试验使用不同的载体设计和给药途径（颅内给药与i.v.输注）。这种给药途径的差异需要不同的剂量。两项试验的数据已在科学会议上提出，看起来很有前景。鉴于这两项试验都在进行中，目前无法进行直接比较。 血液病。非肿瘤性血液病可分为细胞性或非细胞性疾病，意味着遗传突变影响细胞功能（例如，镰状细胞病）或血液成分（例如，血友病），分别。这种区别对于基因治疗至关重要，因为它决定了目标细胞/器官。 在细胞性血液病中，目标是细胞性血液成分，通常是骨髓。血液细胞的半衰期很短，因此直接通过rAAV靶向它们会很快失去治疗效果，因为细胞会更新。相比之下，骨髓干细胞不断分裂产生新细胞，这会稀释rAAV基因组。尽管如此，如果宿主基因组可以被编辑，或者基因治疗表达的细胞获得竞争优势，这可能是一个理想的效果。相比之下，非细胞成分是由细胞释放到血流中的。这为在任何可以将蛋白质分泌到血流中的细胞类型中表达转基因提供了机会。 血友病A和B是血液病的典型例子，由分泌性非细胞血液成分的缺乏引起。血友病A和B的估计患病率分别为~12:100,000和4:100,000。血友病A和B分别由因子VIII（FVIII）和因子XI（FXI）缺乏引起，均为隐性X连锁病。FVIII在内皮细胞中合成，而FIX在肝细胞中产生。 血友病A和B患者的出血风险显著增加，无论是自发性还是轻微创伤，导致高发病率和死亡率（例如，颅内出血）。此外，反复出血会导致局部反应和致残性细胞退化（例如，血友病性关节病）。值得注意的是，与普通人群相比，患者的总体生存率降低。 在基因治疗之前，治疗严重的血友病A或B需要反复给药缺乏的因子或药物以调节凝血级联反应。这些药物的医疗支出一直在上升，到2019年在美国达到约15亿美元。由于其潜在的持久效果和临床知识（即，自然病史）在诊断和治疗血友病方面，基因治疗作为一种理想的模式出现，这在超罕见病的基因治疗开发中经常缺失。此外，FVIII和FIX是分泌的，这意味着在组织中的异位表达可以产生因子（例如，肌肉）。根据血浆FVIII或FIX活性对血友病的严重程度进行分类：严重<1%，中等1-5%，正常5-40%。这为实现部分（>1%）或完全（>5%）疾病矫正提供了明确的目标水平。在其他疾病中，这种有意义的阈值很少存在或已知。 首次尝试使用病毒递送平台开发血友病基因治疗的尝试早于rAAV的成功。这些早期非rAAV研究无法实现持久的治疗因子水平或触发针对病毒载体的免疫反应。1997年，两项研究通过肌肉内（i.m.）或肝门静脉（肝脏导向）注射使用rAAV（rAAV.hFIX）证明了持久的人类FIX（hFIX）表达。 可能出现的挑战可能来自FIX活性抑制抗体，这些抗体在i.m. rAAV.hFIX后被发现。然而，使用物种特异性转基因可能会改善这种抗体或其他免疫反应的形成，如在利用犬FIX（cFIX）的血友病B犬研究中所证明的。虽然肝门静脉给药是侵入性的，犬在手术前需要FIX输血，但与i.m.研究相比，观察到略高的cFIX血浆水平。然而，由于研究参数的差异，包括载体剂量，这一结论不可靠。 在2000年，一项使用肌肉内（i.m.）给药的rAAV.hFIX的I期试验报告了有利的安全性概况，这一结果在三年后研究完成时得到了确认。值得注意的是，没有检测到抗FIX抑制性或非抑制性抗体，这归因于患者选择（仅有错义突变）和限制每个部位的总rAAV剂量，这在动物模型中被识别与抑制性抗FIX抗体的形成相关。然而，患者的FIX血清水平仍然低于1%，这被认为是最低的治疗目标。另一项I/II期试验通过肝动脉给药给予rAAV2.hFIX，只实现了短暂的FIX表达，可能是由于抗-AAV衣壳细胞免疫反应导致肝细胞破坏和转基因丢失。这一发现引领了对rAAV免疫学及其对临床安全性和有效性影响的主要关注。为了达到治疗效力，随后通过优化几个参数来增加FIX表达的努力，包括使用新发现的rAAV衣壳、转基因密码子优化、启动子选择、给药途径和免疫抑制。额外的创新来自于2009年发现的Padua变异体FIX，它具有超生理活性。首先，一项I期试验结合静脉内（i.v.）给药的亲肝rAAV8和密码子优化的hFIX转基因，实现了2-12%的FIX活性，没有使用免疫抑制。正如预期的那样，观察到了针对AAV8衣壳的体液和T细胞介导的免疫反应。T细胞反应通常与剂量相关，但并非普遍如此，这表明患者特定因素。这项试验的患者被包括在一项后续研究中，该研究有四名新患者在接受高剂量组治疗，结果显示在平均3.2年的时间内FIX活性为1-6%。虽然安全性概况有利，但高剂量组的一些患者在没有使用免疫抑制的情况下，经历了与FIX活性下降相关的肝酶水平延迟升高，这在糖皮质激素给药后得到解决。 虽然改变rAAV8衣壳和转基因密码子优化显示出有希望的改进，但它并没有一致地实现治疗性FIX活性。为了克服这些挑战，设计了一种具有增加肝脏嗜性的新工程衣壳和密码子优化的Padua FIX变体。值得注意的是，剂量（5.0 × 1011 vgs/kg）比2011年和2014年试验中的高剂量（2.0 × 1012 vgs/kg）低4倍。尽管剂量减少，但FIX活性达到了平均33.7%（范围14-81%）。没有给予预防性免疫抑制，只有两名患者需要强的松龙治疗短暂的肝酶升高，突出了卓越的安全性概况。在临床上，年化出血率从平均11.1显著下降到0.4。总体而言，Padua变体的增加活性被证明是非常有益的，并在随后的临床试验中得到利用。 血友病B试验揭示了几个在人类中未预料到的rAAV基因治疗方面，包括转基因表达的逐渐减少和免疫反应。目前，FDA批准的血友病B基因治疗（静脉内rAAV5 Padua，Hemgenix，Etranacogene dezaparvovec）已经上市，而其他rAAV产品（verbrinacogene setparvovec (FLT180a) 使用rAAVS3衣壳和Fidanacogene elaparvovec，以前称为SPK-9001和PF-06838435）正在进行临床试验，但正在等待FDA批准。 血友病A的一个显著挑战是大约7 kb的FVIII转基因，超出了rAAV的包装能力，311 需要使用截短形式。通过静脉内rAAV5传递密码子优化的FVIII变体（FVIIISQ；缺失B域）评估了截短FVIII的治疗效力。不同剂量组（6.0 × 1012 vs. 2.0 × 1013 vs. 6.0 × 1013 vgs/kg）的结果表明，最高剂量在52周的研究期间实现了治疗性FVIII活性。令人鼓舞的是，只有高剂量患者接受了免疫抑制，没有发现临床上的不良反应。然而，转基因表达随时间减少。 另一项试验评估了rAAV3衍生的工程衣壳在18名患者中表达FVIIISQ，剂量范围从5.0 × 1011到2.0 × 1012 vgs/kg。虽然它实现了治疗效益，但18名患者中有2名完全失去了转基因表达，这是由于针对rAAV衣壳的免疫反应，尽管使用了糖皮质激素。值得注意的是，试图让几名患者停止使用糖皮质激素导致细胞免疫反应。尽管Savita等人的试验和George等人的试验之间的载体特性可能解释了转基因表达和维持的差异，但有人假设高表达水平可能触发未折叠蛋白反应，随后导致FVIII丢失。 后续的III期试验使用rAAV5hFVIIISQ招募了134名患者，接受了单次6.0 × 1013vgs/kg静脉内剂量。315 这种一次性治疗显著增加了FVIII活性并减少了外源性FVIII的使用，与外源性FVIII预防相比，年度出血事件有所改善。肝酶在中位8周时升高，96.2%的患者在使用糖皮质激素治疗后降低。两年的随访数据显示与之前的I/II期试验类似的趋势，年度出血率和外源性FVIII使用减少。然而，转基因表达随时间减少的观察也是如此。出乎意料的是，III期试验中的FVIII水平低于I/II期试验在一年和两年随访时的水平。这种治疗载体最近获得了FDA批准（roctavian，Valoctocogene Roxaparvovec，rAAV5hFVIIISQ），进行后续临床研究以确定其持久性至关重要。 神经肌肉疾病。神经肌肉疾病包括影响神经元和肌细胞的疾病，其中肌营养不良症主要影响肌细胞。DMD是最常见的营养不良症，并且FDA最近批准了基于rAAV的基因治疗。DMD是一种罕见的X连锁和进行性疾病，患病率约为~15.9–19.5/100,000，主要影响男性，尽管也有报道罕见的女性病例。它是由dystrophin基因的突变引起的，导致不存在或功能失调的dystrophin蛋白。它表现为肌无力、失去行走能力、呼吸功能受损和心肌病，后两者通常是患者死亡的原因。 dystrophin基因由八个启动子和79个外显子组成，产生大约11.4 kb的cDNA和427 kDa肌肉同型蛋白。突变通常导致DMD患者蛋白截断。大的dystrophin cDNA大小对基于rAAV的基因替代治疗构成了主要挑战，因为它超出了包装能力，因此策略集中在识别最小必需的蛋白序列。已经开发了两种不同的dystrophin转基因：~6-8 kb的小型dystrophin和~4 kb的微型dystrophin。小型dystrophin需要通过两个rAAVs传递，而微型dystrophin适合一个rAAV。其他使用rAAV的策略包括外显子跳跃，329 GALGT2传递330（已显示在小鼠中预防肌肉病理学），以及使用CRISPR纠正dystrophin基因或激活非肌肉dystrophin同型使用基因编辑。重点介绍已经转化为人类应用的策略。 2006年，一项试验评估了一种混合rAAV2.5表达微型dystrophin，通过肌肉内注射在6名5-11岁的患者中。患者被分为两个剂量组：2 ×1010和1.0 × 1011 vgs/kg。虽然在治疗后第42天在2/6患者中发现了微型dystrophin阳性的肌纤维，但在后来的时间点没有发现dystrophin阳性细胞，这可能指向免疫介导的过程。这也得到了转基因特异性T细胞的发现的支持。令人惊讶的是，2/6患者在接受基因治疗之前对微型dystrophin基因的一个域有T细胞阳性，这表明突变的内源性dystrophin可能不足以诱导免疫耐受。 为了实现全身受影响肌细胞的广泛靶向，一项试验评估了静脉注射2.0 × 1014 vgs/kg rAAV.rh74.micro-dystrophin在四名平均年龄为4.8岁的患者的安全性和治疗效力。令人鼓舞的是，这项I/II期试验中的所有患者从临床和组织病理学上都有所改善，这与治疗时的年龄和疾病严重程度相关。与2010年早期试验结果相比，没有检测到针对micro-dystrophin蛋白的T细胞活性。肝酶水平在rAAV输注后上升，但保持温和，并通过糖皮质激素治疗正常化。没有发现TMA的迹象。334 一项随机、双盲、安慰剂对照的临床试验（NCT03769116，delandistrogene moxeparvovec）刚刚完成，涉及41名患者。值得注意的是，这种疗法在2023年获得了FDA的批准。 替代基因替代疗法的另一种策略涉及使用疾病修饰基因。在2022年，首个人体试验治疗了两名患者（分别为6.9岁和8.9岁），他们通过双侧股静脉隔离肢体灌注，分别接受了5.0 ×1013和2.5 ×1013 vgs/kg每条腿的rAAV.rh47表达GALGT2。隔离肢体灌注在动物中已广泛评估，作为提高肌肉转导但同时减少总剂量的尝试。GALGT2作为β1,4 N-乙酰半乳糖胺基转移酶在肌肉中糖基化α-肌聚糖，并已显示出对肌肉病理学的积极影响。尽管检测到针对rAAV衣壳的抗体和针对rAAV和GALGT2蛋白的轻度T细胞活性，但没有报告相关肝毒性。虽然患者数量太少，无法得出有意义的结论，但值得注意的是，接受较高剂量的年轻患者显示出更大的改善。 其他正在进行的试验仍在进行中，但不在招募中，包括Solid Bioscience的随机I/II期试验（NCT03368742）和Pfizer的非随机Ib期试验（NCT03362502），这两项试验都使用rAAV9在肌肉特异性启动子的控制下表达截断的dystrophin。这些试验评估了增加的静脉内剂量，并包括儿童和青少年，但排除了心脏和呼吸功能严重受损的患者。 定义资格标准可能特别具有挑战性，并突出了当前在理解和预测rAAV基因治疗与疾病之间相互作用方面的空白。最近一项使用静脉内rAAV9在1.0 × 1014 vgs/kg表达与VP64连接的dCas9以激活皮质dystrophin表达的单一患者DMD试验以致命告终。该患者在接受剂量时无法行走并患有晚期疾病，在给药后第五天心脏功能恶化，第六天出现急性呼吸窘迫综合征，导致在治疗后第八天心脏骤停和死亡。最终评估得出的假设是患者发展为细胞因子介导的毛细血管渗漏综合征，因为针对rAAV衣壳或转基因的体液或细胞免疫反应的检测为阴性。也没有发现TMA的迹象，这在高剂量DMD试验中已经观察到。 心血管疾病。心力衰竭是由心室充盈或排空的结构或功能改变定义的综合征。它在美国约有600万人受到影响，非常普遍。钙在心脏功能中至关重要，也是传统药物开发的靶标。一种在临床前成功的策略是过度表达ATPase Sarcoplasmic/Endoplasmic Reticulum Ca2+ Transporting 2 (SERCA2a)，它在心脏舒张过程中将钙泵入肌浆网（SR）。 CUPID试验评估了使用rAAV1过度表达SERCA2a（rAAV1.SERCA2a）。342,343 它被设计为I/II期试验，I期部分是一个开放标签的顺序剂量递增研究342，II期是随机、双盲和安慰剂对照的。在I期研究中，评估了单次冠状动脉内给药用于心脏导向的rAAV1.SERAC2a传递，剂量为1.4 × 1011、6.0 × 1011和3.0 × 1013 vgs（每组3名患者）。所有接受治疗的患者在接受治疗时都有纽约心脏协会（NYHA）III类心力衰竭。一些患者显示出症状改善，并很好地耐受治疗。一名患者死亡，这被确定与治疗无关。总体而言，有利的安全性概况鼓励了向研究的II期过渡，该期招募了25名接受治疗的患者和14名接受安慰剂的患者。剂量分配给三个队列，6.0 × 1011（n = 8）、3.0 × 1012（n = 8）和1.0 × 1013 vgs（n = 9）。所有患者在II期研究开始时都有NYHA III类心力衰竭。总体而言，观察到接受治疗的患者与安慰剂相比有所改善的趋势；然而，大多数结果标准没有达到统计学意义，除了左室舒张末期容积。该研究确认了在I期观察到的有利安全性概况。 CUPID II期的三年随访结果无法证明生存率的显著改善。然而，非终末事件的累积分析达到了统计学意义，鼓励了CUPID 2。CUPID 2总共分配了250名患者接受治疗（n = 123）或安慰剂组（n = 127）。与之前的试验类似，关键结果措施没有显示出显著差异（例如，生存率）。有趣的是，干预组的早期终末事件显著增加。其他研究调查了rAAV1.SERCA2a对左室舒张末期容积（AGENT-HF）的益处或在接受左室辅助装置（LVAD）的患者中的安全性（SERCALVAD）以及循环NAbs的影响。这两项试验在令人沮丧的CUPID 2试验结果出现后被终止。 尽管这些试验没有在结果上取得临床上显著的改善，但它们突出了rAAV基因治疗在心脏疾病中的潜力。正在开发新的、有前景的心脏基因治疗使用rAAV，包括使用rAAV9表达LAMP2B治疗Danon病，这是一种导致严重心肌病的X连锁疾病。I期（NCT03882437）试验已完成招募，中期结果表明安全性有利和临床改善，TMA和急性肾损伤的发生通过治疗得到解决。对应的II期（NCT06092034）研究正在积极招募至少8岁的男性，作为单臂研究进行单次静脉注射。该试验预计将在2025年完成。 癌症。rAAV在临床前研究中对癌症显示出前景，但其在人类中的应用受到限制。在撰写本文时，只有一项使用rAAV进行胃癌体外基因治疗的试验正在进行中（NCT02496273）。因此，本节重点介绍临床前成就和基于rAAV的癌症治疗策略。有关更详细的理解，我们建议读者参考几篇深入的综述。 使用rAAV的抗肿瘤策略与常规抗肿瘤方案具有相似的目标和概念。然而，基因治疗提供了特定优势，如调节或敲除基因表达。rAAV转导分裂和非分裂细胞，使得在异质性肿瘤组织内广泛靶向细胞成为可能。这一特性可以用来向肿瘤细胞传递细胞因子转基因，以招募免疫细胞并引发抗肿瘤免疫反应。 一项概念验证研究表明，rAAV介导的干扰素β（IFNβ）表达在异种移植小鼠模型中抑制了结直肠癌细胞。在一项非随机、非盲、回顾性人类研究中，将IFNβ添加到替莫唑胺治疗中延长了胶质母细胞瘤（GBM）患者的生存期。通过rAAV转导（rAAV.IFNβ）的肿瘤细胞表达IFNβ可以克服IFNβ的短半衰期并增强治疗效果，这在一项侵袭性原位异种移植GBM小鼠模型中得到证实，其中颅内给药几乎使总体生存率翻倍。 利用rAAV可适应的衣壳，肿瘤定向衣壳工程可以提高转导效率和特异性，同时减轻可能的不良反应。事实上，展示Her2配体的rAAV显示出增加的转导特异性。HSV胸苷激酶的表达将更昔洛韦转化为有毒产物，随后并入肿瘤DNA中以诱导细胞死亡。这种基因的传递减少了肿瘤负担，并与接受批准的抗癌药物赫赛汀治疗的动物组相比延长了生存期。 尽管通过工程化衣壳传递癌症治疗剂提供了高度特异性，但这种方法耗时且劳动密集。另一种方法是筛选现有的rAAV衣壳库，以确定最佳的组合。例如，在小鼠中发现rAAV7和九型能够高度转导前列腺组织。这种增强的前列腺组织转导可以用于敲低与前列腺癌相关的miRNA，这在小鼠前列腺癌模型中被发现可以减缓疾病进展。 这些概念验证研究突出了使用rAAV的有前途的抗癌策略。然而，在人类应用可行之前，必须解决一些关键问题。有关持续治疗性转基因表达的安全性存在担忧，特别是在肿瘤消除或复发后。与传统化疗类似，复发肿瘤可能对治疗产生耐药性或能够逃避治疗，使持续的转基因表达变得无效。鉴于细胞因子治疗通常具有显著的副作用，未受调控的转基因表达可能会导致额外的并发症。需要开发改进的调控基因治疗策略，并结合对肿瘤生物学的理解。 4.1.1.将基于rAAV的基因治疗转化为临床实践的挑战和局限性 rAAV衣壳的性能与给药途径密切相关，这促使探索不同的传递途径，包括血管内、直接组织内注射和传递到现有的体腔或液体空间。每种途径和衣壳选择必须根据疾病、目标区域、器官系统以及其他因素（如患者年龄）来确定（表2）。 一个经典的例子是保护CNS的血脑屏障，它提出了基因治疗需要克服的障碍。一些rAAV衣壳能够有效地穿过血脑屏障。通过系统性静脉内给药靶向CNS并非最佳选择，如果治疗目标仅仅是大脑的一个小区域，因为所需的载体剂量和可能的副作用会很高，而没有实现对目标区域的优越转导。在这种情况下，直接和局部给药至关重要，如AADC所示。然而，即使在有限的给药区域内，也必须仔细选择衣壳。rAAV9显示出相当大的组织扩散和相对广泛的嗜性，即使在局部给药时也是如此，而像rAAV2这样的血清型转导能力则更为有限。 另一个挑战是从临床前到临床研究的转化。为了减轻载体成本和高剂量带来的风险，如在静脉内给药中使用的，通常广泛使用脑脊液空间给药以实现广泛的CNS转导。将小鼠、大鼠甚至更大动物大脑的研究结果外推到人类是令人生畏的挑战。例如，rAAV9可以在小鼠中实现全脑转导，其中侧脑室和皮层之间的距离仅为几毫米。在人类中，这一距离跨越了几厘米。因此，使用脑脊液给药在人类中实现广泛CNS转导的临床试验必须证明这种给药方式的可转化性。 4.1.2.rAAV的免疫原性 除了物理屏障外，rAAV还面临免疫系统设立的许多生物学屏障，包括预先存在的免疫、补体激活、先天模式和危险受体以及适应性B细胞和T细胞免疫（图6）。在这里，我们讨论每个免疫学屏障如何对载体转导产生负面影响，以及可用的潜在解决方案。 图6 rAAV基因治疗中的免疫反应 a. 预先存在的AAV特异性抗体可以与rAAV相互作用，阻止其进入目标细胞。来源于细菌的内肽酶IdeS及其同源物可以裂解完整抗体为Fab和Fc片段，从而减少其在循环中的半衰期并消除Fc介导的功能。或者，可以通过修改衣壳或通过EVs封装来防止抗体识别。 b. 在给予高剂量rAAV时观察到补体激活。尽管确切机制尚不清楚，但一个主要假设是rAAV附着在细胞表面通过与补体C1q结合激活经典途径，这会裂解C4和C2形成C3转化酶C4b2b。然后C3被裂解并形成C5转化酶，裂解C5成C5b，与C6-9结合形成膜攻击复合物（MAC），直接导致细胞溶解，造成肝脏或肾脏损伤。补体激活介导内皮损伤、血栓性微血管病（TMA）和非典型溶血性尿毒症综合征（aHUS）。环肽APL-9是C1抑制剂（C1inh），依库珠单抗是C1、C3和C5的抑制剂，可能会抑制补体激活级联反应。 c. 先天受体，包括TLR2（病毒衣壳）、TLR9（未甲基化CpG）和RIG-I/MDA5（dsRNA），已被证明可以促进炎症。通过一系列信号传导事件，IRF3、IRF7和NF-κB将被磷酸化并转移到细胞核，在那里它们激活I型干扰素（IFN-I）、干扰素刺激基因（ISGs）和促炎细胞因子，介导抗病毒免疫并传播炎症。许多途径组分可以被药理学抑制剂靶向。此外，端粒衍生的io2序列可以抑制TLR9介导的转基因识别。 d. 转基因和衣壳可以被蛋白酶体处理成肽段，由MHC-I或MHC-II分子呈递。识别这些肽段的CD8和CD4 T细胞将被激活。CD8 T细胞可能直接杀死被rAAV转导的细胞，而CD4 T细胞可以帮助CD8 T细胞和B细胞增强它们的效应功能。具有特异性的B细胞可以释放抗体，消除未来重新给药的可能性。工程化的miRNA结合位点与细胞miRNA相互作用，导致转录本降解。在抗原呈递细胞中，这种设计可以防止转基因衍生肽段呈递给T细胞。此外，抗CD20抗体利妥昔单抗和mTOR抑制剂雷帕霉素可用于减少适应性反应。图表由Biorender.com创建。 预先存在的免疫。针对rAAV衣壳的预先存在的体液反应，以rAAV特异性NAbs测量，可能来自于过去与wtAAV的免疫记忆。新生儿在前六个月内携带母体AAV NAbs。之后，中和滴度下降，但在7-9个月大时重新出现。总体血清阳性率范围从低于10%到超过90%，这取决于血清型和地理位置。这是对rAAV基因治疗最有害的负担，因为即使是低水平的血清阳性也会显著降低转基因表达，如果载体通过静脉内给药。 在与外来抗原的积极接触中，一些表达IgG的B细胞将分化为长寿命的浆细胞，主要居住在骨髓中，并在感染解决后很长一段时间内继续表达抗原特异性IgG。虽然IgM水平在感染解决后急剧下降，但IgG水平可以维持相当长的时间，构成了有效感染的主要体液屏障。 NAbs在重新给药方面也构成了最重大的挑战。因为rAAV基因组通常作为环状的染色体外DNA维持，它们在每次宿主细胞分裂时平均数量减少一半，当宿主细胞死亡时丢失因此，可能需要在患者的一生中重新给药，特别是对于靶向具有活跃细胞周转的器官的基因治疗，如肝脏。然而，重新给药受到第一剂产生的NAbs的抑制。 rAAV衣壳-抗体相互作用尤其对于基因治疗：通过cryo-EM或肽扫描可以捕获抗体的互补决定区（即抗体接触抗原的地方）在AAV衣壳表面的足迹。已经识别出一些抗原“热点”区域，如二十面体的三重轴、五重轴和2/5重墙。最近在接受Zolgensma治疗的患者中进行的一项研究发现，约75%的抗体结合在二重表面。虽然这些发现有助于指导衣壳工程以逃避由抗体引起的预先存在的免疫，但重要的是要记住，与抗体相比，rAAV相当小，以至于几个抗体结合到病毒上就足以覆盖病毒表面并阻止其细胞进入。 对局部与系统给药途径的影响：静脉内输注最容易受到rAAV特异性循环抗体的影响。对于免疫特权器官的局部注射途径，如眼睛和CNS，rAAV特异性抗体的限制不那么严重，并且有可能重新给药。尽管玻璃体中的预先存在的NAbs远低于血清，但玻璃体中的NAb水平与血脑屏障的完整性负相关，这是评估眼科基因治疗潜在影响的一个重要指标。在通过玻璃体内途径接受ADVM-022的NHPs中，一只眼睛的注射导致血清和注射眼中的NAbs，但未注射的眼睛中没有。2个月后对另一只眼睛进行玻璃体注射并未导致加剧的炎症。与第一只眼睛相比，第二只眼睛中的转基因表达趋势较低，但在预测范围内。 有趣的是，这种对循环中和抗体的差异敏感性可以作为一种策略来探索，以限制载体在非靶组织的转导。当进行丘脑内或脑室内注射时，中和抗体的存在阻止了基因传递到肝脏，但并未阻止传递到中枢神经系统。筛选预先存在的免疫：可以使用酶联免疫吸附测定来测量rAAV衣壳特异性总抗体（TAb）水平。为了确定患者是否有资格参加临床试验，许多试验采用基于细胞的转导抑制（TI）测定来测量患者的血清需要稀释多少倍才能允许最佳的rAAV转导。有时血清是TAb阳性和TI阴性，表明并非所有的AAV特异性抗体都抑制转导。更有趣的是，有些血清是TAb阴性和TI阳性，表明存在非抗体的抑制性血清成分。 预先存在的免疫逃避策略：CD20是一种高度表达的B细胞特异性分子，可以用利妥昔单抗作为靶点，利妥昔单抗在几个基因治疗试验中与其他免疫抑制剂（如类固醇和雷帕霉素）联合使用，以减少一般炎症以及B细胞和T细胞介导的免疫。然而，利妥昔单抗并不能有效预防预先存在的体液免疫，因为长寿的浆细胞不表达CD20。 包装在细胞外囊泡（EVs）中的rAAV可能允许部分逃避中和抗体。EVs可以涂覆免疫抑制分子，如CTLA-4，以进一步抑制免疫。将rAAV包装在EVs内可能会改变组织的嗜性，这可能需要对EV进行额外的修改，类似于上述对rAAV衣壳的修改，是逃避预先存在的免疫的另一种流行方法。 最近，已经探索了能够裂解人类抗体的细菌内肽酶。IdeS是一种来自化脓性链球菌的IgG降解酶，已被证明可以耗尽总IgG，并允许在rAAV血清阳性的NHPs中显著改善载体转导。其同源物IdeZ来自马链球菌亚种，显示出类似的效果。IdeXork是一种专有的IgG降解酶，正在进入基于rAAV的迟发性庞贝病的临床试验。在多项研究中，IdeS型酶似乎可以提供一个无IgG的窗口期5-7天。一个潜在的警告是，IdeS在中和滴度只有中等水平时（对于NHP中的AAV3B约为1:108）效果最好。在一个起始中和滴度为1:696的NHP中，IdeS将滴度降低到1:88，这仍然抑制了转基因表达。此外，对IdeS的适应性免疫反应可能会抵消其效力。借鉴移植研究，第二次使用IdeS可能只允许一个24小时的治疗窗口，因为产生了抗IdeS抗体。 还有来自猪链球菌的IgM裂解酶（IceM）和IceMG，它们是从IceM工程改造而来，可以裂解IgM和IgG。除了裂解血清中的游离形式IgM/G外，这些酶还可以从B细胞表面裂解IgM并阻断rAAV9体外介导的补体激活。这些是否能够转化为临床效益还有待研究。 补体激活。补体系统由一系列高丰度的血清蛋白及其相关的细胞受体组成。许多接受高剂量（约1.0×1014vg/kg）rAAV基因治疗的患者发展出与补体激活相关的TEAEs，包括血小板减少症、溶血性贫血、TMA、肝酶升高、急性肝损伤和类似aHUS的肾脏损伤。已经记录了与补体激活相关的死亡病例。值得注意的是，截至2022年1月13日，在超过1400名接受Zolgensma治疗的患者中，记录了9例TMA病例（约0.6%）。 补体激活机制：补体激活可能通过三种途径之一发生：经典途径（IgM/IgG、C1q和C4）、替代途径（C3自发水解）和凝集素途径（甘露糖结合凝集素）。这三条途径汇聚形成C3转化酶、C5转化酶，最终形成杀死细胞的膜攻击复合物。 rAAV输注期间补体激活的机制尚未阐明。AAV2衣壳可以直接免疫沉淀C3及其裂解产物C3b和iC3b，但在体外在没有IgG的情况下，相当于1×1014 vg/kg剂量的rAAV颗粒并未激活C3。体外实验表明，只有当存在抗-AAV抗体时，AAV在全血中才激活补体。多个临床试验注意到rAAV接受者中补体C4的减少。此外，最近一项关于接受Zolgensma治疗的患者的研究显示，单独接受类固醇的患者TMA的发生率更高，AAV9特异性IgM和IgG滴度更高，而同时接受利妥昔单抗和雷帕霉素的患者抗体滴度更低，补体激活最小。综合证据似乎表明，rAAV输注期间的补体激活是通过经典途径发生的。然而，两个观察结果揭示了与这一假设未解决的冲突。首先，在AAVnaïve患者中，在发展出rAAV特异性IgM和IgG之前，记录到较低的C4水平。其次，患者预先筛选为特定AAV血清型的血清阴性。 在rAAV给药后，小鼠和NHPs似乎并没有表现出在人类中观察到的补体激活特征。在NHPs中，即使在检测到AAV特异性IgM之前，也在给药后第3天短暂检测到补体激活，并表现为Bb和sC5b-9的增加，而不是C4b。在小鼠中，我们未发表的结果显示，如果在相当于2.5×1014 vg/kg剂量给AAV，补体激活非常轻微。最近在小鼠中的一项研究表明，在3.0×1014 vg/kg时，血清中的C3b和肝脏中的C5b-9染色变得可检测，并且在7.0×1014 vg/kg的超临床剂量下，可以检测到轻度的血小板减少症，补体激活的峰值出现在第3天。 补体抑制策略：几种补体抑制剂正在测试用于rAAV基因治疗，包括阻断C5的单克隆抗体依库珠单抗。依库珠单抗已经用于aHUS，并且已经给予TMA后的基因治疗接受者。虽然大多数患者从TMA中恢复，但一名患者最终因新发的金黄色葡萄球菌表皮感染而死于急性肾损伤。依库珠单抗降低了血清sC5b-9并轻微增加了血小板计数，但没有挽救患者，因为补体在防御细菌方面是必不可少的。 由于C3与rAAV衣壳的相互作用促进了病毒在小鼠巨噬细胞中的摄取，补体抑制可能会影响rAAV转导效率。这在体外实验中显示为APL-9降低了在NAb高血清中人类血白细胞的rAAV摄取，但在NAb低血清中没有。然而，C1-inh分别在非免疫小鼠和免疫小鼠中增加了约33%和28%的肝脏转导。 先天免疫。无数的细胞表面、内质体和细胞质受体检测与病原体通常相关的分子特征，作为细胞防御机制的警报系统，并启动炎症反应。先天传感器的激活通常发生在几分钟或几小时内。由于rAAV是基于病毒的，它的一些固有特征可能会被这些先天受体检测到。免疫反应触发的细胞因子分泌已被证明显著降低转基因表达并促进适应性反应。 与rAAV相互作用的先天免疫受体包括TLR-2、TLR-9、MDA5和RIG-I。TLR-2是一种细胞表面受体，能够识别与微生物相关的多种配体，如脂蛋白、肽聚糖和糖脂。它可以通过与TLR-1和TLR-6形成异源二聚体来进一步扩展其配体识别范围。rAAV2和rAAV8都以TLR-2依赖的方式激活人肝细胞中NF-κB介导的细胞因子表达。TLR-9是一种内质体膜附着受体，负责识别微生物DNA中的未甲基化CpG基序。rAAV中TLR-9的激活不仅导致细胞因子（如IL-6和TNF-α）的急性表达，这些细胞因子直接下游于TLR信号传导，而且还促进细胞毒性CD8+ T细胞的浸润，导致转导目标细胞的丢失。从基于rAAV8的载体中去除CpG基序以治疗血友病B，导致NAb发展减少。 MDA5和RIG-I是dsRNA的细胞质传感器。rAAV的3' ITR区域可能具有合成负链RNA的启动子活性，这些RNA可以与正义链转录本退火形成双链RNA。人肝细胞和灵长类视网膜表达高水平的MDA5和RIG-I，这些细胞在体外rAAV感染后介导IFN-β的产生。 最近的一项研究表明，IL-1受体（IL-1R）-MyD88信号传导是rAAV检测的关键组分，因为IL-1R−/−和MyD88−/−小鼠在rAAV8.OVA注射后没有显示出转基因特异性T细胞反应。IL-1R的配体是IL-1α和IL-1β，它们在炎症体激活后被激活，而MyD88在TLRs和IL-1R下游起作用。有趣的是，TLR2/3/4/9、NLRP1/3、AIM2或Caspase-1缺陷的小鼠显示出正常或只有轻微减少的转基因特异性T细胞反应，这表明rAAV被一个尚未确定的先天免疫传感器检测到。 减轻先天受体信号传导的策略：为了减少TLR-9信号传导，可以通过修改密码子来去除rAAV载体中的CpG基序。这种方法的一个担忧是tRNA分子的丰度存在差异，因此改变它们的使用可能会潜在地改变蛋白质折叠动态并增加错误折叠的机会。因此，在rAAV生产过程中加入甲基转移酶可能是一个很好的替代方案。另一种可能性是加入TLR-9抑制序列。一种来自哺乳动物端粒的ODN TTAGGG重复序列可以形成G-四联体，这些四联体可以与TLR-9结合以抑制其二聚体形成和信号传导。带有这种序列的rAAV显示出减少的免疫刺激性能力，导致在各种动物模型中肝脏、肌肉和视网膜的T细胞浸润减少。 药理学抑制先天信号传导途径是另一种选择。阻断IL-1（炎症体细胞因子）减少了转基因特异性CD8+ T细胞的频率，而抑制IL-6（TLR细胞因子）导致对rAAV衣壳的抗体反应减少。抑制IRAK4（TLR激酶）在体外导致TLR-9细胞因子表达降低，体内测试正在进行中。 适应性免疫。适应性免疫指的是抗原特异性B细胞和T细胞反应。B细胞可以产生针对rAAV衣壳的抗体，这消除了重新给药的可能性。细胞毒性CD8+ T细胞可以识别来自转基因和rAAV衣壳的外来肽段，并启动转导细胞的杀伤。CD4+ T细胞可以通过分泌Th1、Th2或Th17型细胞因子来帮助B细胞和细胞毒性T细胞反应。适应性B细胞反应的形成机制与预先存在的体液免疫相同，因此本节将主要关注T细胞反应。 T细胞介导的不良反应：背根神经节（DRG）是位于脊髓沿线的一群感觉神经元，它们在传递感觉信息中起着至关重要的作用。NHP、啮齿动物和小猪模型显示出DRG损伤的高发病率，并且与剂量相关。在一名人类患者中观察到包括感觉变化、疼痛和MRI上的DRG增强在内的DRG毒性症状。部分损伤可能是转基因诱导的，认为其持续时间和范围有限，而严重的DRG毒性与CD8+ T细胞的涌入有关，并且不受类固醇影响。 心肌炎在NHPs中系统性rAAV转移后归因于转基因特异性细胞毒性T细胞反应，因为在心肌损伤的后期出现，严重心肌炎中CD8+ T细胞的高度浸润，以及通过酶联免疫吸附点试验识别的高转基因特异性。 已经证明了针对衣壳的T细胞反应。一名接受2.0×1012 vg/kg AAV2-FIX治疗的血友病B患者没有显示出针对转基因的T细胞反应，但显示出针对AAV2衣壳的T细胞反应。这可能与该患者的人类白细胞抗原（HLA）-B*0702等位基因有关，该等位基因预计与rAAV2衣壳肽段VPQYGYLTL具有高亲和力结合。在另一项使用scAAV2/8治疗血友病B的试验中，六名入选患者中没有一个显示出针对转基因的反应。然而，在接受6.0×1011 vg/kg或更高剂量的患者中，针对衣壳的T细胞反应明显存在。在两名患者中，针对衣壳的T细胞反应水平似乎与丙氨酸转氨酶水平的突然增加相关。 减少适应性免疫的策略：miRNA是能够与mRNA转录本结合并催化转录本降解的小RNA分子。细胞自然表达某些miRNA分子以调节mRNA转录本的丰度。例如，miR-142由APCs高度表达。通过在转基因的3'-UTR中工程化一个miR-142结合位点（BS），其翻译可以在APCs中选择性地被抑制，从而减少抗原呈递给T细胞。应用同样的原则，miRNA-183-BS，它与DRG富集的miR-183结合，显著减少了DRG中的转基因表达并降低了DRG毒性。 另一种可能的缓解策略是针对肽处理和MHC呈递途径。已知转基因和衣壳序列，并且可以确定患者的HLA类型，因此正在开发预测程序来分析潜在的相互作用。如果需要，可以重新设计转基因和衣壳序列，以去免疫化免疫优势肽段，从而降低MHC呈递的可能性。 抑制先天免疫反应也可以减少适应性反应的强度。mTOR是一种激酶，作用于多个细胞受体下游。mTOR抑制剂雷帕霉素及其衍生物显著抑制适应性B细胞和T细胞反应，允许在小鼠模型中更好地转基因表达和重新给药。目前，还没有一种普遍的策略来以抗原特异性的方式抑制B细胞和T细胞反应。类固醇抑制先天和适应性免疫，并在rAAV基因治疗中广泛使用。尽管研究表明类固醇可以增加转基因持久性，但其他报告称某些针对转基因的T细胞反应对类固醇没有反应。 当前的免疫抑制药物：许多试验现在使用包括类固醇、利妥昔单抗和雷帕霉素在内的三重免疫抑制方案。目前用于或正在研究中用于抑制rAAV临床试验中免疫反应的药物，最初是为其他疾病开发的，如自身免疫疾病、移植和肿瘤。这些疾病与基于rAAV的基因治疗之间的生理学可能存在很大差异，这要求在rAAV的背景下进一步开发特定药物。 在推进我们对rAAV免疫学的理解方面，有三个关键领域需要注意。首先，对野生型AAV的基本免疫学研究存在明显差距，这在很大程度上与直到最近，野生型AAV被认为不会引起疾病有关。其次，免疫学研究倾向于关注初级免疫细胞、来自免疫细胞的细胞系或肿瘤细胞。这忽略了rAAV基因治疗在体内靶向的多种体细胞（例如，中枢神经系统细胞、视网膜细胞、肝细胞、肌细胞），每种细胞都具有不同的免疫学特征。第三，从动物模型中获得的见解可能并不总是反映临床试验中观察到的人类免疫反应。解决这些挑战可能涉及改进的体外建模系统，如混合细胞培养、3D类器官和诱导多能干细胞。此外，CRISPR筛选技术的进步可能有助于揭示参与基于rAAV的基因传递的细胞因子。创新的体内系统也在开发中，如植入人类骨髓、肝脏和胸腺的小鼠（BLT）系统，这可能有助于监测人类先天传感器的激活和人类适应性免疫的发展。 4.2.不良反应/毒性和管理策略 安全性仍然是治疗开发的主要关注点。尽管由于其安全性概况，rAAV在当前可用的病毒载体中受到青睐，但它并非没有风险。本节重点介绍在临床上引起关注的rAAV副作用。 基因毒性（插入突变）。野生型AAV可以在诸如Rep蛋白等元素的帮助下整合到哺乳动物基因组中。然而，ITR是rAAV中唯一存在的野生型AAV元素，这应该降低了基因组整合的风险。然而，动物模型中的数据表明，病毒基因组整合的机会在野生型AAV和rAAV之间是相似的。肝脏似乎是AAV整合的热点，但也在其他器官如心脏中发现了病毒基因组整合。除非破坏肿瘤抑制基因或激活致癌基因，否则基因组整合并非不利。肝脏高度转导，特别是当AAV通过静脉注射给药时。因此，肝细胞癌（HCC）是特别关注的问题，并且在动物研究中已被广泛描述。有趣的是，诸如动物年龄或潜在肝病等易发因素与动物中HCC的发生相关。相比之下，尚未描述NHPs或狗的基因毒性。尽管在人类中发现了野生型AAV基因组整合，但尚未确定其在肿瘤发展中的致病作用。同样，治疗性rAAV在人类基因组整合中的作用及其致癌能力尚不清楚。基因组编辑工具的使用不断增加，特别是CRISPR，导致在动物模型中CRISPR诱导的双链断裂后rAAV基因组整合的增加，这给安全性带来了另一个挑战。推测影响病毒基因组整合的其他因素包括rAAV血清型、启动子/增强子元素和病毒杂质。总的来说，治疗性基因组整合的可能性和风险及其在人类患者中肿瘤形成的作用尚不清楚。 肝毒性。通过静脉注射高剂量的rAAV是一种策略，以实现不同器官（例如，肌肉和CNS）的广泛转导。然而，这种方法可能会导致肝脏毒性，因为大量的病毒颗粒在进入循环时通过肝脏。肝毒性的早期迹象是肝酶升高，通过血液检测监测，可能在临床上保持沉默或发展为肝损伤、衰竭甚至死亡的迹象。预防性和给药后增加皮质类固醇已被证明可以减轻肝毒性。静脉注射后的肝毒性通常在治疗后几周至几个月发生，这表明免疫反应是造成这种效果的原因。这也得到了血友病B早期报告的支持，在这些报告中，转基因表达的减少与针对rAAV衣壳的T细胞反应和肝酶升高有关。TMA。TMA被认为是由内皮细胞损伤伴随血小板聚集引起的，导致微血栓的形成、血小板减少、通过缺血引起终末器官损伤和可能的死亡。它可以是获得性的或遗传性的，并且它与rAAV基因治疗的关联直到最近才变得明显。尽管机制尚未完全理解，但已经推测rAAV输注后补体激活失调。除了密切监测患者外，当前策略侧重于预防性免疫抑制。已经报道了使用支持性护理、皮质类固醇、依库珠单抗和血浆置换成功治疗TMA。大多数与rAAV相关的TMA病例已报道为Zolgensma和DMD试验。目前尚不清楚哪些因素可能导致rAAV给药后容易发生TMA。可能的患者特定因素，如疾病表型和潜在疾病的进程，开始出现。 4.2.1.神经毒性 DRG毒性：DRG毒性引起感觉神经节的炎症和神经元丢失，可能扩展到背侧脊髓柱，是最近注意到的与rAAV相关的副作用。目前的数据主要来自啮齿动物、猴子和小猪的临床前研究，其中rAAV的静脉和鞘内注射与炎症浸润和神经元退化有关。DRG毒性在临床前可能是无症状的，但研究描述了动物本体感觉缺陷和共济失调。组织病理学和临床变化通常发生，但可能会延迟，这表明毒性与转基因表达有关，而不是衣壳。支持这一点的是，一项研究报告称，在给予非表达型rAAV9载体后，没有观察到DRG毒性。最近，血清神经丝蛋白（NF）水平被提出作为标记物，尽管血清NF变化与DRG毒性的临床相关性尚不清楚。此外，血清NF变化可能与疾病相关，并可能是自然病史的一部分，这将使NF水平的解释复杂化。 另一个挑战是对人类患者DRG毒性的信息有限。在一个试验中，两名患者接受了4.2×1014 vg的rAAV9鞘内注射，其中一名患者出现了手臂刺痛和左脚剧痛，这与电生理变化和MRI上DRG对比增强相关。第二名患者接受了比第一名患者更高水平的免疫抑制，并且没有出现DRG毒性的临床表现。随着越来越多的患者接受rAAV治疗，必须阐明神经毒性的机制、诊断、预防和治疗，以提高安全性和患者结果。 MRI发现：随着医疗技术的发展，增加的灵敏度有助于识别以前无法检测到的细胞变化。这在如何解释这些发现以及确定它们是否具有临床相关性方面带来了新的挑战。一个例子是脑内注射rAAV后检测到的脑MRI变化。 在临床前研究中，直接脑内rAAV传递与血管周围空间的淋巴细胞聚集（淋巴浆细胞性血管周围套管）、小胶质细胞变化和神经元肿胀有关，这些变化发生在载体给药区域。有趣的是，在一项研究中，对照组也发现了变化。然而，剂量增加导致T细胞和B细胞浸润区域的比例增加，表明变化是由程序和载体引起的。尽管在载体和对照组都发现了MRI变化，但这些特征可能表明不同的病因。值得注意的是，这项研究中没有观察到临床变化。 在一项Batten病的人类试验中，rAAV.rh10给药表达CLN2与输注后MRI变化相关，这些变化在大多数受试者中持续存在至输注后12个月。重要的是，没有明显的临床迹象归因于这些MRI发现。目前尚不清楚输注后MRI变化的意义，特别是在神经退行性疾病中，可能很难区分与疾病相关的变化和与程序及载体相关的影响。然而，了解潜在的分子和细胞机制对于患者安全和基因治疗成功至关重要。 5.当前知识空白和潜在解决方案 5.1.持久性 基因治疗作为一次性治疗终身疗效的承诺取决于rAAV的持久性。虽然这里排除了免疫介导的rAAV基因组或表达转基因的丢失（在rAAV免疫反应部分讨论），但与rAAV和患者相关的两个因素是表达盒的调节元素和细胞更新/存活。 内源性基因在时空上受到严格调控，这意味着特定基因在不同器官甚至同一器官内不同细胞中在给定时间点的表达水平不同。广泛使用的通用启动子无法适应这种基因调控差异。转基因表达的丢失归因于rAAV表达盒设计中使用的启动子和其他调节元素的失活。此外，没有细胞或器官特异性的启动子可能对安全性构成挑战。可能的解决方案是使用来自治疗性转基因内源性启动子的启动子和调节元素。然而，内源性调节元素通常超过rAAV的包装限制，因此需要修剪，可能排除了基本元素。一个有希望的例子是使用缩短的SMN启动子治疗SMA，这在小鼠中显示出改善的疗效和降低的毒性。 使用部分启动子的一个挑战可能是在有机体或患者发育过程中转基因表达的波动，如果它反映了内源基因表达，可能是期望的，但如果它损害了治疗效果，可能会成为治疗问题。因此，更好地理解治疗基因的生理调控至关重要。 从宿主的角度来看，rAAV基因组的持久性和转基因表达取决于细胞的半衰期。这可以在两个例子中得到强调：神经元和肝脏。神经元被认为是终末分化的，这意味着转导的神经元在细胞的一生中都含有rAAV基因组。由于一生中神经元的数量不会显著增加，因此rAAV基因组不太可能因细胞增殖而稀释或丢失。然而，部分治疗的神经退行性疾病可能会持续神经元丢失，最终失去rAAV基因组，因此转基因表达。 相比之下，肝脏的细胞行为是动态的。肝细胞可以持续增殖，单个肝细胞的寿命约为三年。这可能会极大地稀释rAAV基因组，甚至导致转基因表达丢失，随后治疗效果下降。 对于大多数疾病，这些方面尚未完全了解，强调了更好地了解分子和细胞疾病对于成功和持久的基因治疗的必要性。虽然目前人类中的rAAV治疗已经显示出令人鼓舞的结果和改变生活的结果，但重要的是要认识到基因治疗是一个相对年轻的领域。接受rAAV基因治疗的患者数量众多是最近才取得的成就。现在就治疗效果持久性和需要管理逐渐减弱的治疗效果的问题下结论可能为时过早，可能通过重新给药或与细胞治疗结合等策略进行管理。 5.2.疾病特异性需求 多年来，我们对rAAV转导的机制理解有了很大的提高。然而，不同病理学中的分子和细胞变化如何影响rAAV性能的问题仍然知之甚少。例如，疾病状况可能会改变细胞谱系，从而影响目标细胞群。另一个复杂因素是，控制转基因表达的调节元素也可能存在类似的动态变化。 基因疗法的目标是让每个患者都能受益，无论他们的疾病阶段和进展如何。患者试验资格基于临床、生化和放射学评估。这种方法只能近似疾病阶段，但在预测疾病进展或对治疗的反应方面存在局限性。尽管目前人类数据强调早期治疗与更好结果相关，但在定义疾病阶段及其与进展和基因治疗反应相关性的局限性可能会排除许多本可以有良好结果的患者。例如，提出了两种不同的假设来解释两项独立的DMD rAAV试验中的致命结果。这表明我们对于理解疾病动态，特别是在基因治疗管理方面的理解仍然有限。 克服这些挑战对于继续在疾病机制理解和改进rAAV方面取得进展至关重要。例如，对于DMD来说，只有通过静脉给药才可能实现对肌肉组织的广泛靶向。修改rAAV衣壳以增强特异性和减少剂量对于使用这种给药方法提高安全性和有效性至关重要。虽然孤立肢体灌注可以作为替代方法，但它不太可能足以达到整个疾病病理。然而，给药途径的组合可能有助于利用优势，同时减少劣势。 另一个例子是广泛的CNS靶向。尽管正在测试将rAAV限制在CNS空间（即，鞘内、脑室内）的新给药途径，但广泛的CNS转导似乎受益于CNS精细分支的血管供应，这是静脉rAAV给药所利用的。然而，新的衣壳可能有助于实质穿透和内实质扩散，从而减少静脉给药的劣势，同时实现广泛的细胞转导。 6.结论 总之，我们讨论了AAV生物学和制造的当前理解，重点是rAAV基因治疗的临床试验以及将rAAV应用于各种疾病时面临的挑战。该领域目前正在经历重大进展，这在学术界和工业界都取得了进展。在治疗单基因疾病方面的早期成功已经证明了基于rAAV的基因治疗的安全性和有效性。然而，仍然存在必须解决的挑战，以便更广泛地治疗疾病。一个突出的挑战是有效地将rAAV输送到目标组织，其中给药途径的选择可以极大地影响治疗的成功。解决与特定细胞/组织靶向相关的担忧和克服物理障碍对于扩大目标疾病范围至关重要。rAAV的免疫原性是另一个挑战，它影响着基因治疗的安全性、持久性和有效性。调节和减轻免疫反应的策略，包括患者预先存在的免疫、载体管理后的先天免疫反应、病毒衣壳和转基因诱导的适应性免疫反应，对于患者安全至关重要。了解免疫反应的长期后果及其对重复给药的潜在影响至关重要。最后，更好地理解rAAV整合将通知其对肿瘤形成的潜在影响，需要解决与高剂量rAAV相关的新检测到的不良反应，以提高安全性和患者对这种有前途的治疗领域的可及性。 尽管存在这些挑战，但有几个令人鼓舞的方向可以推进rAAV基因治疗的发展。研究rAAV-宿主相互作用对于指导载体工程和增强转基因表达至关重要。实现长期转基因表达的策略，包括免疫逃避或免疫抑制方案，可以延长治疗效果并减少重复干预的需求。根据疾病特定需求定制rAAV基因疗法，如定制组织、细胞和基因特异性启动子、优化转基因设计以及工程衣壳变体具有特定组织嗜性，代表了另一个激动人心的方向。这些新工程化的rAAV必须在物种间表现出兼容性，同时展示增强的属性和安全性。将rAAV与基于CRISPR的工具整合，随着基因编辑技术的进步，为精确和针对性的基因修饰提供了巨大潜力。这些进步承诺加速更有效的治疗，跨越一系列疾病，从单基因疾病到复杂、多因素疾病。克服当前挑战并拥抱这些未来方向，有望将基因治疗变成解决众多人类疾病的革命性力量。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：佐剂是疫苗不可或缺的组成部分。尽管在疫苗中广泛使用，但其作用机制尚未完全清楚。随着对先天免疫反应如何控制抗原特异性反应机制的更深入了解，佐剂的作用机制开始被阐明。佐剂可分为免疫刺激剂和递送系统。免疫刺激剂是危险信号分子，通过靶向Toll样受体（TLRs）和其他模式识别受体（PRRs），促进抗原信号和共刺激信号的产生，从而增强适应性免疫反应，导致抗原呈递细胞（APCs）的成熟和激活。另一方面，递送系统是载体材料，通过延长装载抗原的生物可用性，以及将抗原靶向淋巴结或APCs，促进抗原呈递。本文综述的开头系统总结了佐剂的作用机制。随后介绍了经典疫苗佐剂的机制、特性和进展。此外，由于一些正在研究的佐剂显示出比经典佐剂更大的免疫激活潜力，这可能弥补经典佐剂的不足，因此随后总结了正在研究的佐剂平台。值得注意的是，我们强调了这些佐剂平台的不同作用机制和免疫学特性，这将为不同疫苗的合理设计提供广泛的选择。在此基础上，本综述指出了疫苗佐剂的发展前景和未来应注意的问题。 1.引言 佐剂被定义为与疫苗抗原联合使用时增强疫苗免疫原性的各种成分（图1）。佐剂可以是合成的小分子化合物，也可以是复杂的天然提取物和颗粒材料。佐剂的第一个证据出现在1926年，当时亚历山大·格伦尼发现将铝盐与抗原混合并注射到豚鼠体内比单独给予抗原诱导出更多的抗体（图2）。随后，在20世纪40年代，弗伦德及其同事开发了水包油乳液，导致了弗伦德佐剂的创建。然而，由于对人类有毒，弗伦德佐剂并未获准用于人类疫苗。与弗伦德佐剂类似，由于局部和系统性副作用，细菌脂多糖（LPS）佐剂在人类疫苗中的使用受到限制。实际上，从20世纪20年代到90年代，尽管努力开发新的人类疫苗佐剂，但只有铝佐剂获得了许可。直到1997年，水包油乳液MF59才作为流感疫苗的佐剂在欧洲获得许可。在接下来的20年里，另外四种佐剂（AS04、AS03、AS01和CpG ODN 1018）获准用于疫苗，改变了人类疫苗佐剂的单调性。此外，在此期间，许多其他不同类别的化合物作为佐剂进行了评估，包括矿物盐、微生物产品、乳液、皂苷、合成小分子激动剂、聚合物、纳米颗粒和脂质体。它们在临床前和临床研究中显示出增强免疫反应的强度、广度和持久性。 图1 佐剂增强疫苗的免疫原性。a 无佐剂的疫苗诱导产生适度的T辅助细胞极化细胞因子、抗体和活化T细胞。b 相比之下，含佐剂的疫苗促进更多APCs（抗原呈递细胞）的成熟，增加APCs与T细胞之间的相互作用，促进产生更多数量和更多类型的T辅助细胞极化细胞因子、多功能T细胞和抗体，从而导致广泛和持久的免疫力，以及剂量和抗原的节省。这张图是用BioRender（https://biorender.com/）创建的。 图2 疫苗佐剂研究历史中主要事件的时间线。这张图是用BioRender（https://biorender.com/）创建的。 尽管佐剂在疫苗中已广泛使用很长时间，但它们增强免疫反应的机制尚未得到很好的表征。直到揭示了先天免疫反应如何控制适应性免疫反应的机制，科学家们才开始理解佐剂的作用机制。佐剂通过靶向先天免疫细胞并激活模式识别受体（PRRs）信号通路，引导和增强特定的适应性免疫反应。随后，发现一些递送材料也可以通过模仿自然病原体的大小或空间结构，通过促进抗原呈递细胞（APCs）摄取和呈递抗原，作为佐剂通过增强适应性免疫反应发挥作用。尽管在佐剂开发方面取得了上述进展，但由于它们的定义广泛和机制复杂，对佐剂的作用机制缺乏系统的概括和总结。此外，由于缺乏对当前佐剂平台的机制、特性、免疫效果和应用场景的系统深入理解，很难为特定疫苗匹配和设计合适的佐剂。这导致当前疫苗在使用中逐渐显示出不足，例如无法提供长期保护性免疫、老年人群的免疫弱和无法提供有效的细胞免疫。因此，为了解决这些问题，本综述尝试首先总结佐剂的机制。然后，总结了具有潜在发展价值的经典佐剂平台和正在研究的佐剂平台的机制、特性和应用进展。在本文的最后一部分，讨论了佐剂可能的未来发展方向。本综述希望能为佐剂机制的进一步研究、现有佐剂的合理使用以及新佐剂的设计和开发提供有效的参考。 2.佐剂的作用机制 佐剂已广泛用于疫苗中，以促进疫苗接种的成功。佐剂通过激活先天免疫细胞增强疫苗的适应性免疫。核心概念是佐剂通过激活APCs促进抗原呈递信号（信号1）和共刺激信号（信号2）的产生（图3）。抗原呈递信号是抗原肽-主要组织相容性复合体（MHC），在抗原被摄取和处理后呈现在APCs表面。共刺激信号包括APCs表面表达的共刺激分子（例如CD40、CD80、CD86）和分泌的炎症细胞因子（例如IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α）。这两种信号的产生可以强烈诱导初始T细胞的激活，导致增强的适应性免疫反应。免疫刺激剂，如病原体相关分子模式（PAMPs）、损伤相关分子模式（DAMPs）和化学合成的TLRs小分子激动剂，可以通过APCs产生信号1和信号2。递送系统，如脂质纳米颗粒（LNPs）、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）和笼状蛋白纳米颗粒，通过促进MHC分子上的抗原呈递（信号1）发挥作用。值得注意的是，一些研究表明，许多纳米颗粒递送系统可以直接靶向B细胞以诱导最佳有效的抗体反应。接下来，我们详细描述免疫刺激剂和递送系统发挥佐剂效力的具体机制。 图3 佐剂作用机制的核心。佐剂被分类为免疫刺激剂和递送系统。像PAMPs（病原体相关分子模式）、DAMPs（损伤相关分子模式）和化学合成的小分子激动剂这样的免疫刺激剂，提供危险信号（信号0），激活APCs（抗原呈递细胞）上的PRRs（模式识别受体），从而增强MHC分子上的抗原呈递（信号1）。此外，PRRs的激活导致细胞因子和共刺激分子表达上调，这导致共刺激信号增强（信号2）。像LNPs（脂质纳米颗粒）、PLGA（聚乳酸-羟基乙酸共聚物）和自组装蛋白纳米颗粒这样的递送系统，通过促进MHC分子上抗原的呈递（信号1）发挥作用。这张图是用BioRender（https://biorender.com/）创建的。 2.1.免疫刺激剂的作用机制 根据作用机制，佐剂可分为免疫刺激剂和递送系统。免疫刺激剂是危险信号分子，通过靶向APCs细胞上特定受体导致APCs的成熟和激活。具体来说，免疫刺激剂作为PAMPs、DAMPs或其模拟物，可以与APCs上的PRRs相互作用，触发先天免疫反应，导致APCs的激活和成熟。成熟的APCs终止其吞噬抗原活性，并增强其呈递抗原和表达高水平共刺激信号和细胞因子的能力。这导致适应性免疫反应的启动和增强。此外，值得注意的是，不同类型的免疫刺激剂将通过不同的PRRs发出信号，并导致不同的细胞因子分泌，这是适应性免疫反应的主要决定因素（图4）。 图4 免疫刺激剂通过激活模式识别受体(PRRs)调节适应性免疫反应的简化图。不同类型的免疫刺激剂通过不同的PRRs发送信号，导致不同细胞因子的分泌，从而诱导不同的适应性免疫反应。免疫刺激剂通过靶向和激活a TLRs；b cGAS-STING；c CLRs；d 其他PRRs来诱导和调节适应性免疫反应。这张图是用BioRender（https://biorender.com/）创建的。 靶向TLRs途径。最初发现，免疫刺激剂通过与APCs上的TLRs相互作用来发挥其作用（图4）。作为佐剂的TLRs激动剂通过激活TLRs，增强抗原呈递、上调共刺激信号和细胞因子表达，最终增强适应性免疫反应，显示出有希望的结果。值得注意的是，不同类型的免疫刺激剂通过与不同的TLRs信号传导，介导不同的适应性免疫反应。总体而言，由于TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6表达在细胞表面，它们主要识别微生物膜成分，如脂质、脂蛋白和蛋白质。因此，相应的免疫刺激剂激活APCs表面的TLRs通常会导致产生促炎细胞因子，如IL-1β、TNF-α和IL-6，并最终导致产生Th1或Th2型免疫反应。TLR3、TLR7、TLR8和TLR9是细胞内TLRs，它们在细胞内囊泡中表达并与核酸反应。这些细胞内TLRs被相应的免疫刺激剂激活通常会导致产生I型干扰素。I型干扰素可以促进Th1细胞的分化并调节其功能。此外，I型干扰素通过常规树突状细胞（DCs）促进抗原交叉呈递给CD8+ T细胞，并可能直接刺激CD8+ T细胞的增殖。免疫刺激剂通过TLRs发挥作用的具体机制如下：(1)与TLR2异源二聚体（TLR2/1或TLR2/6）结合的免疫刺激剂通过髓样分化初级反应88（MyD88）途径启动信号传导并激活NF-κB，从而诱导产生促炎细胞因子如IL12。IL-12参与将初始T细胞分化为Th1细胞。此外，靶向TLR2的免疫刺激剂还导致增强的细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）信号传导，结果增强c-Fos蛋白的表达，这将抑制IL-12表达并增强IL-10表达。这推动初始T细胞极化为Th2型细胞。因此，靶向TLR2的免疫刺激剂主要诱导Th2型适应性免疫反应。(2)与TLR3结合的免疫刺激剂通过toll/白介素-1受体结构域包含的适配体诱导干扰素-β（TRIF）途径启动信号传导，激活干扰素调节因子3（IRF3）并刺激APCs产生I型干扰素。这最终导致Th1型反应和细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的产生。(3)与TLR4和TLR5结合的免疫刺激剂通过MyD88途径启动信号传导以激活NF-κB，这诱导促炎细胞因子分泌并推动初始T细胞向Th1型细胞极化。此外，值得注意的是，通过TLR4触发适应性免疫的免疫刺激剂也可以通过TRIF信号传导，导致IRF3的激活，从而产生少量I型干扰素。(4)靶向位于内质体的TLR7/8/9的免疫刺激剂通过MyD88途径激活NF-κB和干扰素调节因子7（IRF7），触发APCs产生促炎细胞因子和I型干扰素，并诱导强烈的Th1和CTLs反应。 靶向cGAS-STING途径。随着环鸟苷酸-腺苷酸合成酶-干扰素基因刺激因子（cGAS-STING）途径在协调先天和适应性免疫中独特作用的揭示，科学家们越来越有兴趣尝试将cGAS-STING途径的激动剂作为疫苗佐剂。cGAS是一种胞质DNA受体，可被双链DNA激活。cGAS激活后，将胞质腺苷酸和鸟苷酸环化成环鸟苷酸-腺苷酸（cGAMP）。随后，cGAMP锁定到STING二聚体的V形结合口袋中，引起构象变化、聚集和STING的激活。之后，NF-κB和IRF3将被激活，这反过来促进促炎细胞因子和I型干扰素的产生。I型干扰素如IFN-α/β可以诱导APCs的成熟，上调共刺激信号并增强其呈递或交叉呈递抗原的能力。因此，靶向cGAS-STING途径的免疫刺激剂不仅将初始T细胞极化为Th1型细胞，还促进CTLs的产生。靶向cGAS-STING的免疫刺激剂包括核苷酸小分子激动剂和非核苷酸小分子激动剂。其中，核苷酸小分子激动剂通常是基于环二核苷酸（CDNs）的天然配体分子，如环二鸟苷酸（c-di-GMP）、环二腺苷酸（c-di-AMP）、2’,3’-cGAMP和3’,3’-cGAMP。非核苷酸小分子激动剂的例子是DMXAA和CF501。此外，值得注意的是，胞质中的线粒体DNA（mtDNA）也可以被cGAS感知，从而激活STING途径。 靶向CLRs途径。C型凝集素受体（CLRs）是一个包括Dectin-1、Dectin-2、MINCLE、DC-SIGN、CD206、CD205等的超家族。CLRs主要定位在细胞膜上，作为抗原受体参与捕获和呈递抗原。具有碳水化合物结构的免疫刺激剂通常激活CLRs，随后诱导APCs启动内吞、处理和呈递抗原，以增强适应性免疫反应的发展。此外，一些免疫刺激剂可以激活CLRs，触发不同的信号传导途径，诱导特定细胞因子的表达，从而控制初始T细胞的极化方向。例如，β-葡聚糖通过Dectin-1的激活导致Syk激酶的磷酸化，进而激活NF-κB，导致制造促炎细胞因子IL12、IL-1β、IL6和IL23，从而诱导初始T细胞分化为Th1和Th17细胞。Th1型细胞诱导强烈的CTLs反应以及驱动B细胞中的免疫球蛋白转换为IgG2a。Th17效应细胞以产生IL-17、IL-17F和IL-22为特征，并通过招募中性粒细胞触发大规模炎症反应。免疫刺激剂激活Dectin-2和MINCLE以及DC-SIGN也可以导致NF-κB激活和促炎细胞因子的产生。然而，由于Dectin-2和MINCLE不具有免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAMs），它们需要与携带ITAM的FcRγ结合，才能发生信号传导。值得注意的是，多糖配体对DEC-205和CD206的刺激通常偏向于诱导增强的吞噬作用和抗原呈递，而不是细胞内信号传导。 靶向其他PRRs。在后续研究中，科学家发现免疫刺激剂也可以激活许多其他PRRs，如核苷酸结合寡聚化结构域1（NOD1）、核苷酸结合寡聚化结构域2（NOD2）、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）、视黄酸诱导基因I（RIG-I）和黑素瘤分化相关基因5（MDA5）。NOD1、NOD2和NLRP3是核苷酸结合寡聚化结构域样受体（NLRs）家族的成员。佐剂通过激活它们将导致APCs上调MHC II并有助于增强抗原呈递。此外，这些NLRs的激活将导致产生促炎细胞因子，如IL-1β和IL-18，驱动初始T细胞偏向极化为Th2型细胞。 Muramyl dipeptide (MDP) 或完全弗伦德佐剂 (CFA) 可以激活NOD1和NOD2，随后刺激NF-κB的转录激活，产生IL1、IL18和IL33的前体。随后，在激活的NLRP3炎症体复合体存在下，caspase1将这些因子切割成其活性形式。NLRP3炎症体复合体由NLRP3蛋白、凋亡相关斑点蛋白（ASC）、cardinal和caspase1蛋白组成。总的来说，NOD1、NOD2和NLRP3的激活将导致主要产生Th2型的免疫反应。RIG-I和MDA5是视黄酸诱导基因I样受体（RLRs）家族的成员，主要识别RNA。大多数TLR3激动剂，如polyI:C，也会在APCs中激活MDA5。RIG-I和MDA5的激活导致IRF3和IRF7的激活，进而诱导I型干扰素的表达。因此，靶向这两个受体的免疫刺激剂最终偏向于导致Th1细胞和CTLs的产生。 2.2.递送系统的作用机制 递送系统被定义为装载抗原的载体材料，并增加APCs对抗原的摄取和呈递。换句话说，递送系统的主要功能是促进抗原呈递。抗原呈递过程涉及APCs对抗原的识别、摄取和内吞，然后由MHC在APCs表面装载和呈递。递送系统可以通过一种或多种方式增加APCs表面呈递的抗原信号。 延长抗原的生物可用性。递送系统通过(1)允许抗原持续释放，(2)形成免疫微环境，和(3)为抗原提供货物保护来实现延长抗原的生物可用性。延长的抗原生物可用性将确保有足够的抗原可供APCs使用。因此，这将导致更多的MHC-抗原肽信号产生。 递送系统可以通过持续释放抗原来延长免疫系统中抗原的生物可用性。例如，纳米乳液递送系统（例如，MF59、AS03）的作用机制之一被认为是持续的抗原释放。最近，一些正在研究的递送系统也被发现具有缓慢释放抗原的能力，如可注射水凝胶。可注射水凝胶允许APCs通过缓慢释放持续呈递抗原，这有助于生发中心B细胞经历多轮亲和力选择，最终导致产生更大量和高亲和力的抗体。值得注意的是，通过调整水凝胶网格的大小，可以控制疫苗成分在水凝胶中持续释放的时间，从而调节释放时间窗口。此外，由生物可降解的PLGA或聚醚酸聚合物制成的固体聚合物颗粒可以包裹抗原，并在几天到几个月的时间内缓慢释放亚单位抗原。我们也注意到，具有大孔结构的自组装支架也具有缓慢释放抗原的能力。不仅如此，自组装支架除了抗原外，还可以通过装载免疫刺激剂来释放炎症信号，并增强血清抗体水平和CTLs水平。总之，使用持续释放技术来延长抗原和佐剂在免疫系统中的暴露时间和生物可用性，可以提高适应性免疫反应的效力、持久性和质量。 此外，一些递送系统可以通过在注射部位形成抗原库/免疫微环境来实现更高的免疫激活。以这种方式工作的递送系统不仅延长了抗原在免疫系统中的保留时间，还招募了更多的免疫细胞渗透到注射部位，这将增加抗原的摄取并提供局部炎症线索以激活随后的适应性免疫反应。已证明能够产生炎症免疫微环境的递送系统显著延长了抗原的生物可用性，增加了抗原的摄取，招募了免疫细胞，并增强了抗体滴度和细胞免疫反应。渗透到注射部位的先天免疫细胞的浸润使得形成微环境的递送材料比单独使用持续释放技术制备的递送材料具有更大的免疫激活能力。为了使免疫细胞渗透到递送系统中，可以将一些细胞因子并入递送系统并缓慢释放，从而增加细胞迁移。最常用的细胞因子是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。最近，Sun等人开发了一种可注射的聚（己内酯）-聚（乙二醇）-聚（己内酯）热敏水凝胶，包裹GM-CSF和卵清蛋白，增加了注射部位DCs的招募并提高了抗原的摄取效率。 此外，封装一些免疫刺激剂如TLR激动剂也可以促进先天免疫细胞的招募和渗透。研究发现，一些自佐剂递送材料也可以促进免疫细胞的渗透。例如，介孔硅棒是一种自佐剂递送材料，可以激活NLRP3先天免疫途径。当注射到小鼠体内时，它增加了先天免疫细胞对注射部位的渗透并增强了免疫反应。 此外，递送系统还可以通过保护抗原（特别是DNA和mRNA）免受体内酶的分解，从而维持其生物活性来延长抗原的生物可用性。例如，mRNA抗原容易受到细胞外血清中RNA酶的降解。因此，它们需要被包裹在密封的载体中以避免酶促水解，并确保mRNA顺利递送到目标细胞。LNPs是一种被证明有效的mRNA递送系统，其基本功能之一是包裹mRNA并保护其免受降解RNA酶的侵害。 值得注意的是，由于佐剂具有多种机制，延长抗原的生物可用性只是佐剂作用机制之一，它占所有作用机制的比例需要仔细研究。例如，通过形成“抗原库”来延长抗原的保留和生物可用性被认为是铝佐剂的关键作用机制。然而，随着研究的深入，一些研究人员发现，在铝佐剂给药后移除“抗原库”并没有显著减少抗原特异性T和B细胞反应的产生。这意味着形成抗原库以保留抗原的机制可能不是铝佐剂的关键作用机制，应该全面准确地理解佐剂的作用机制，以更合理地使用佐剂和开发新型佐剂。 APCs靶向。递送系统可以通过以下两种方法靶向APCs，并使APCs有效摄取抗原（图5）。增加抗原摄取量，反过来又增加了APCs表面呈递的MHC-抗原肽的数量，从而导致更强的适应性免疫反应。 图5 递送系统的的作用机制图。递送系统通过以下方式促进增强的抗原呈递或抗原交叉呈递，以增强适应性免疫反应：a 延长抗原的生物利用度；b 将抗原靶向到抗原呈递细胞(APCs)；c 直接将抗原运送到淋巴结；d 促进内质网逃逸。这张图是用BioRender（https://biorender.com/）创建的。 递送系统的第一种方法是通过模仿病原体的尺寸和空间结构来促进APCs对抗原的摄取。由于病毒和细菌是纳米到微米大小的颗粒，免疫系统已经演化出识别和响应颗粒性抗原的能力。微米或纳米材料已被用于递送抗原，增加了抗原的大小，从而在一定程度上改善了APCs的摄取。例如，与可溶性抗原相比，用脂质纳米颗粒封装抗原可以提高APCs对抗原的识别和内吞作用，从而增加抗原呈递并诱导产生更高幅度和更高亲和力的抗体。另一个例子是，装载H5N1流感抗原的新型水凝胶微粒递送系统可以改善体液反应并增强T细胞激活。这一现象的原因之一是水凝胶微粒增加了抗原的大小，进而提高了APCs对抗原的识别和摄取。此外，高度有序和重复的空间结构是病原体的固有特征，免疫系统已经演化出对这类结构高度敏感的识别和响应能力。自组装蛋白纳米颗粒和其他多价颗粒递送系统通过模仿病原体的高度有序和重复的空间结构，向APCs展示多价抗原，增加了APCs摄取抗原的概率。研究发现，即使在没有其他免疫刺激剂补充的情况下，这些递送系统也能引发强烈的体液和细胞免疫反应。值得注意的是，递送系统的有序和重复的空间结构非常有利于B细胞受体（BCRs）的共聚集，这可以导致B细胞的强烈激活，最终产生高亲和力抗体和记忆B细胞。 此外，递送系统通过直接靶向APCs上特定的受体（例如，Fc受体、CLRs）来促进更有效的抗原摄取。许多研究表明，靶向APCs上Fc受体的递送系统可以选择性地增强体外和体内的抗原摄取和细胞免疫。此外，CLRs是一类特定于DCs亚群的PRRs。这个家族的成员包括DEC-205、DC-SIGN和甘露糖受体等。使用CLRs配体（通常是碳水化合物）来修饰递送系统将导致抗原更直接地靶向特定的DCs，从而增强抗原摄取。例如，甘露糖修饰的聚合物用于递送黑色素瘤抗原肽，在黑色素瘤模型中强烈诱导预防性和治疗性抗肿瘤免疫反应。另一个例子是CDX-1401，它是一种疫苗，由特异性结合DEC-205的单克隆抗体与全长肿瘤抗原NY-ESO-1融合而成。研究表明，这种疫苗通过特异性靶向DEC-205受体的DCs，增加了抗原的摄取和呈递，从而增强了抗肿瘤效果。它在与其他药物联合使用时也显示出了有希望的临床价值。 考虑到与淋巴结相关的不同亚群的DCs可能在诱导不同类型的T细胞反应中具有不同的功能，递送系统的靶向免疫细胞群体（尤其是纳米颗粒）是疫苗递送系统开发中的关键考虑因素。从上述对APCs靶向的描述中可以看出，纳米颗粒递送系统的表面可以被特异性修饰以主动靶向特定的细胞群体。首先，纳米颗粒可以通过与功能化配体的耦合来靶向特定的细胞群体。例如，通过将针对CD169的抗体耦合到纳米颗粒的表面，纳米颗粒可以靶向至被膜下窦巨噬细胞。其次，调整纳米颗粒的大小也是靶向特定细胞群体的策略。当纳米颗粒被设计为保持在50-100纳米时，它们将优先靶向滤泡树突状细胞（FDCs）并被保留在FDCs中。这对于产生高亲和力和持久的抗体免疫反应很重要。此外，增加纳米颗粒的抗原价和纳米颗粒的糖基化修饰也将使纳米颗粒优先靶向FDCs。纳米颗粒还可以被设计为展示多价抗原蛋白以靶向和激活B细胞。总之，这些方法允许纳米颗粒主动靶向不同的细胞群体。 淋巴结迁移。大量的先天免疫细胞和淋巴细胞在淋巴结中积累，淋巴结是初始免疫反应的场所。因此，淋巴结是递送系统的关键靶标。一些递送系统可以直接促进抗原迁移到淋巴结，从而增加抗原在淋巴结中遇到APCs的机会，导致APCs摄取和呈递更多的抗原，增加抗原呈递信号。递送系统以两种方式直接将抗原运输到淋巴结。第一种方法是，递送系统通过被动扩散直接运输到淋巴结。具有适当尺寸和表面特性（如电荷和疏水性）的递送系统可以通过被动扩散进入传入淋巴管，随后进入淋巴结。研究表明，最佳尺寸在5到100纳米之间。如果递送系统的尺寸太小，它倾向于进入毛细血管。然而，如果递送载体佐剂的尺寸太大，它可能无法通过传入淋巴管内皮细胞之间的间隙，因此无法进入传入淋巴管。此外，在这种方法中，递送系统最好带净负电荷，而不是净正电荷，因为传入淋巴管的间质基质主要由胶原纤维和带负电荷的糖胺聚糖组成。此外，递送系统的亲水性影响其在传入淋巴管之间运输疫苗的效率。例如，与非PEG修饰颗粒相比，PEG修饰的50纳米聚合物在大鼠皮下注射后在大鼠淋巴结中的颗粒积累更多。 第二种方法是所谓的白蛋白搭车。由于内源性白蛋白在淋巴系统中循环，如果抗原能够与内源性白蛋白结合，它们就可以通过搭乘白蛋白列车被运输到淋巴结。目前，我们知道白蛋白是脂肪酸分子的转运蛋白，可以捕获并结合一些脂质分子。利用这一机制，研究人员设计了一种带有亲脂尾部的肿瘤肽疫苗。实验结果表明，疫苗与白蛋白结合，并在淋巴结中大量积累，导致T细胞产生增加30倍，并在小鼠注射后显著增强抗肿瘤效果。另一个例子是1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DSPE），它已被证明可以与内源性白蛋白高效结合，具有高亲和力。秦等人构建了一个基于DSPE的递送系统，装载OVA抗原肽和聚I:C，使疫苗成分能够直接靶向淋巴结，并在淋巴结中大量积累，导致体内产生强烈的CD8+ T细胞反应，从而在小鼠中实现更有效的治疗和延长中位生存时间。此外，内源性白蛋白还可以与一些染料结合，如Evans蓝染料。利用这一特性，朱等人使用临床安全的Evans蓝衍生物与抗原耦合，发现疫苗有效地与白蛋白结合，并随白蛋白的回流被输送到淋巴结。通过体内实验发现，疫苗显著抑制了小鼠原发性或转移性肿瘤的生长。 促进抗原交叉呈递。抗原交叉呈递是外源性抗原通过MHC I分子呈递给CD8+ T细胞的过程。这对于针对病毒感染疫苗和癌症疫苗的接种至关重要。然而，在正常情况下，外源性抗原通常只被APCs内吞并由MHC II分子呈递给CD4+ T细胞，而不会发生任何交叉呈递。已经开发了几种递送系统，通过促进抗原从内体或溶酶体逃逸，然后由MHC I分子装载，从而实现抗原交叉呈递。这些递送系统主要通过三种方式实现这一目标。 第一种是质子海绵效应。当一些带有可质子化的胺基的阳离子聚合物或脂质递送系统被APCs内吞时，它们会吸收大量质子以缓冲APCs内体或溶酶体的酸性环境。这导致大量氯离子和水分从细胞质流入内体或溶酶体，引起内体膨胀和破裂。这一过程导致抗原释放到细胞质中，促进了MHC I分子的抗原交叉呈递。例如，在内体酸性条件下，聚乙烯亚胺（PEI）通过其可质子化的氨基吸收质子，导致内体膨胀和破裂。有研究报告称，用PEI修饰的氢氧化铝纳米颗粒显著增加了抗原交叉呈递。今天，其他阳离子聚合物和阳离子脂质体也被发现可以通过质子海绵效应增加抗原交叉呈递。 第二种，一些递送系统通过与内体/溶酶体膜融合或结合来破坏膜的稳定性，从而将抗原释放到细胞质中。通过Pickering乳液（PAPE）颗粒的阳离子颗粒铝佐剂在传递SARS-CoV-2 RBD疫苗抗原时，与铝佐剂组相比，诱导了3倍多的IFN-γ+ T细胞。这表明这种颗粒具有强大的激活细胞免疫反应的能力。这部分是因为它能够与内体/溶酶体膜结合，破坏内体/溶酶体膜的稳定性，导致抗原释放到细胞质中，并呈递给CD8+ T细胞。 第三种方法是光化学内化释放技术。这种技术提供了一种新兴的技术，通过使用光敏剂基于光诱导破坏内体膜，将内吞物质路由到细胞质中。具体来说，光敏剂被纳入递送系统中与抗原一起递送，随后光敏剂在暴露于特定光源后被激发形成单线态氧，这导致脂质过氧化和内体膜的破坏，从而将抗原释放到细胞质中。在一项研究中，Ji等人使用基于精氨酸和苯丙氨酸的聚酯酰胺作为原料制备阳离子纳米颗粒，这些纳米颗粒随后被进一步用于与光敏剂AlPcS2a形成静电复合物并递送抗原。当在660纳米光源下应用时，它显著促进了抗原从内体/溶酶体逃逸到细胞质，并增强了CD8+ T细胞介导的免疫反应。 3.经典佐剂平台 氢氧化铝佐剂、MF59、AS01、AS03、AS04和CpG ODN 1018是人类疫苗的经典佐剂。它们已被广泛批准用于多种疫苗，并用于增加疫苗抗体滴度和增强细胞免疫反应。 3.1.氢氧化铝佐剂 氢氧化铝佐剂是第一个被批准用于人类疫苗的佐剂。在许可疫苗中常用的两种基于铝的佐剂是氢氧化铝和磷酸铝。氢氧化铝佐剂通过促进Th2细胞反应增强IgG1和IgE抗体的产生。然而，氢氧化铝佐剂的作用机制复杂，学术界仍存在持续的争论。目前有两个方面得到了广泛认可。首先，氢氧化铝佐剂作为递送系统与抗原紧密结合并持续释放抗原，从而延长抗原的生物可用性并增加抗原呈递。其次，氢氧化铝佐剂也可以作为免疫刺激剂，诱导DAMPs的产生，从而激活先天免疫途径的PRRs，导致产生IL-1β等细胞因子和Th2型免疫反应。近年来，一些研究表明，由注射部位的氢氧化铝佐剂诱导的宿主细胞死亡释放的宿主DNA或尿酸可作为内源性危险信号。这些内源性危险信号可以作为DAMPs诱导先天免疫途径的激活。关于氢氧化铝佐剂靶向的PRR，一些科学家认为是NLRP3，而一些人持怀疑态度。然而，这并不妨碍氢氧化铝佐剂成为疫苗行业的佐剂首选，因为其公认的安全性和可靠性。含铝佐剂广泛用于预防和治疗各种疾病，包括白喉、破伤风、脑膜炎和乙型肝炎病毒（HBV）疫苗，已获食品药品监督管理局（FDA）批准。此外，铝也是新临床开发疫苗的候选佐剂，如SARS-CoV-2疫苗。然而，氢氧化铝佐剂也有一些缺点，包括难以诱导强烈的细胞免疫反应和可能的不良反应（红斑、过敏反应）。出于这些原因，通过改进配方或将其制备为纳米铝佐剂，可以使氢氧化铝佐剂更有效。 3.2.乳液佐剂 MF59和AS03都是经典的水包油乳液佐剂。MF59由角鲨烯、Tween 80和Span 85组成。MF59作为流感疫苗的佐剂于1997年获得许可，成为第一个被批准用于人类疫苗的非铝佐剂。MF59乳液具有抗原递送和免疫刺激的双重功能。MF59可以作为乳液递送系统，与抗原共递送时，它可以延长抗原与免疫系统的相互作用时间，并通过在淋巴结中缓慢释放抗原来增加抗原呈递。这导致APCs表面呈递更多的抗原信号，因此，身体对抗原产生更强的特异性免疫反应。此外，MF59还作为免疫刺激剂。MF59可以靶向特定的PRRs并通过诱导产生内源性危险信号来激活先天免疫细胞。MF59在肌肉中的给药激活了巨噬细胞和DCs等先天免疫细胞，并促进了CCL2、CCL4、CCL5和CXCL8等趋化因子的产生。这些趋化因子反过来招募更多的先天免疫细胞到注射部位以进一步放大免疫反应，并促进这些招募的先天免疫细胞迁移到引流淋巴结以激活B细胞和T细胞。然而，值得注意的是，MF59的确切靶向PRR仍然不清楚，除了MF59可能通过NLRP3独立的ASC激活途径和TLR独立的MyD88激活途径发挥作用。（图6） 图6 经典佐剂主要信号通路的简化图。这张图是用BioRender（https://biorender.com/）创建的。 总之，使用MF59佐剂的疫苗接种会导致体内偏向于Th2的免疫反应，并弱化Th1反应的诱导。目前，MF59已被广泛用于多种人类疫苗，并显示出良好的安全性和有效性。AS03是另一种水包油乳液佐剂，由α-生育酚、角鲨烯和Tween 80组成。AS03和MF59的佐剂效果相似。首先，它作为抗原递送系统，通过缓慢释放来增强APCs表面的抗原信号呈递。其次，AS03也具有免疫刺激作用，因为它也含有角鲨烯。和MF59一样，AS03通过NLRP3非依赖性ASC激活途径和TLR非依赖性MyD88激活途径发挥免疫刺激作用。此外，AS03还包含α-生育酚作为额外的免疫刺激成分。研究表明，α-生育酚参与调节某些趋化因子和细胞因子的表达，如CCL2、CCL3、白细胞介素6和CXCL1，这些因子增强APCs对抗原的摄取，并增加引流淋巴结处募集的先天免疫细胞数量。像MF59一样，AS03通常主要诱导偏向于Th2的免疫反应，对Th1反应的诱导较弱。AS03在2009年H1N1大流行期间被欧盟许可用于流感疫苗（Pandemrix, TM,GSK）。随后，在2013年，AS03被美国FDA许可用于H5N1禽流感疫苗，并显示出令人满意的安全性、反应原性和免疫原性。AS03主要用于各种流感疫苗，以增加抗体的滴度和持久性。最近，AS03在COVID-19疫苗（NCT04450004, NCT04405908）的开发中也显示出良好的临床效益。 3.3.基于TLR激动剂分子的佐剂 AS04和CpG ODN 1018都是经典的基于TLR激动剂分子的佐剂。AS04是通过氢氧化铝吸附TLR4激动剂分子制备的。由于AS04包含氢氧化铝佐剂，它也具有免疫刺激和递送抗原的功能。然而，AS04的免疫刺激功能比氢氧化铝佐剂更强。这是因为AS04包含一种更强效的免疫刺激分子，称为单磷酸脂质A（MPLA）。MPLA是从LPS中分离出的低毒性衍生物，可以特异性激活APCs上的TLR4，导致NK-κB激活和促炎细胞因子的表达，从而产生更强的Th1细胞反应。此外，当比较补充AS04的疫苗与仅补充氢氧化铝佐剂的疫苗时，发现补充AS04的疫苗诱导了更高水平的抗体。这证明TLR4激动剂MPLA在AS04中发挥重要作用。总的来说，AS04比氢氧化铝佐剂产生更强的抗体反应和Th1细胞反应，并诱导更平衡的Th1/Th2免疫反应。AS04目前主要用于人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗（Cervarix）和乙型肝炎病毒（HBV）疫苗（Fendrix），以增加抗体产生和激活抗原特异性T细胞。 CpG ODN 1018是一种合成的单链DNA分子，已被广泛研究作为TLR激动剂。CpG ODN 1018特异性激活TLR9，导致TRF7激活，进而导致促炎细胞因子和I型干扰素的产生，最终导致强烈的Th1型细胞反应和细胞毒性T细胞的产生。这使得它比氢氧化铝佐剂产生更好的细胞免疫反应。CpG ODN 1018最初被批准用于乙型肝炎病毒（HBV）疫苗。CpG ODN 1018目前正在临床试验中作为COVID-19疫苗的潜在佐剂进行评估。最近，一种用CpG ODN 1018佐剂的COVID-19疫苗（SCB-2019）已被评估用于紧急使用。 3.4.颗粒佐剂系统 AS01是一种经典的颗粒佐剂系统，是一种含有免疫刺激剂MPLA和从Quillaja Saponaria树皮中提取的活性成分QS-21的脂质体佐剂。AS01具有抗原呈递和免疫刺激的双重功能。AS01的抗原呈递功能由脂质体执行。脂质体是一种中空的磷脂双层人工膜，可用于封装和递送抗原。脂质体可以保护抗原免受降解并延长其生物可用性，从而使APCs能够捕获更多的抗原信号。AS01的免疫刺激功能由MPLA和QS-21贡献。MPLA通过TLR4激活先天免疫系统，导致Th1型反应增加。QS-21激活APCs中的NLRP3，随后激活caspase 1以促进细胞因子IL1β、IL18和IL33的活性形式的产生。此外，QS-21还被发现可以促进内体逃逸并促进交叉呈递。总的来说，这两种免疫刺激成分协同作用，使AS01诱导以Th1为主的免疫反应，并促进CTLs的产生。AS01是已许可的疟疾和带状疱疹疫苗的一部分，促进抗原特异性抗体产生并增强细胞免疫反应。最近，AS01也已应用于新型结核肽疫苗（M72/AS01E）的开发，并已显示出对健康成年人的安全性、有效性和预防结核病的前景。 总之，佐剂是疫苗的重要组成部分。经典佐剂为其他新疫苗的开发提供了相对可翻译的平台。这些佐剂可以优先选择用于新疫苗的临床试验，以便快速获得市场批准。然而，这些佐剂也揭示了一些问题。例如，它们增强疫苗免疫的能力较弱，不提供长期保护性免疫，并且在老年人群中效果较差。此外，大多数这些批准的佐剂只能诱导抗体反应，并且诱导CD8+ T细胞介导的细胞免疫的能力较弱，这对于针对病毒感染性疾病和癌症疫苗至关重要。最后，大多数许可的佐剂的作用机制仍然不清楚，这可能导致这些佐剂的不当使用和不可控制的副作用。因此，需要新型佐剂来解决这些问题。 4.正在研究的佐剂平台 由于佐剂在疫苗中的突出作用，近年来佐剂科学经历了快速发展。一些正在研究的免疫刺激剂和递送系统显示出良好的佐剂效果。接下来，我们将总结和描述它们。 4.1.正在研究的免疫刺激剂平台 近年来，随着对佐剂的深入研究，一些正在研究的免疫刺激剂显示出良好的佐剂效果。在本节中，我们将总结和描述这些正在研究的免疫刺激剂的作用机制、特性和应用进展。 合成双链RNA（dsRNAs）。合成双链RNA（dsRNAs）能够靶向并激活APCs上的TLR3和MDA5，导致产生IL-12等促炎细胞因子和I型干扰素，促进产生强烈的偏向Th1的免疫反应和CTLs。Poly-I:C及其改良变体Poly-ICLC是最研究的合成dsRNA免疫刺激剂。体外研究表明，poly-I:C和poly-ICLC诱导人外周血单核细胞衍生的DCs成熟，导致分泌IFN-β和促炎细胞因子IL-6和IL-12，从而促进外源性抗原与CD8+ T细胞的交叉呈递，并触发偏向Th1的免疫反应。临床前和临床研究均表明，poly-I:C和poly-ICLC是增强抗体产生和CD8+ T细胞免疫反应的有前景的佐剂。在人类的一项测试显示，将poly-ICLC与靶向DC的疫苗结合使用，诱导了与活病毒疫苗相似的先天免疫反应，进一步强调了poly-I:C/poly-ICLC作为疫苗佐剂的有效性。此外，我们注意到poly-I:C和poly-ICLC在临床上用于肽疫苗、DC疫苗和全细胞疫苗，主要用于各种癌症疫苗。将poly-I:C或poly-ICLC添加到癌症疫苗中，增强了疫苗诱导的抗肿瘤T细胞和NK细胞反应，从而有助于肿瘤的消退或根除。然而，值得注意的是，poly-I:C/poly-ICLC可能会有剂量依赖性全身发热和凝血异常等副作用，除了其触发强大免疫反应的功能外。因此，应考虑合理的递送系统来保护它免受降解，并将更多的poly-I:C/poly-ICLC靶向到APCs，以确保尽可能低的剂量激活APCs并减少副作用。 GLA及其衍生物。葡萄糖基脂质A（GLA）是一种合成的LPS模拟物，是MPLA的替代品。GLA可以通过激活APCs上的TLR4在体内诱导Th1型免疫反应。为了增强GLA的免疫效果，通常将其制备成制剂使用。GLA通常被制备成葡萄糖基脂质A-水性纳米悬浮液（GLA-AF）、葡萄糖基脂质A-稳定乳液（GLA-SE）、葡萄糖基脂质A-脂质体（GLA-LS）和葡萄糖基脂质A-氢氧化铝（GLA-alum）。其中，GLA-SE在临床前和临床研究中研究最多。当Clegg等人使用GLA-SE作为H5N1亚单位疫苗的佐剂时，他们发现它诱导产生了抗原特异性Th1型CD4+ T细胞和更高滴度的Th1型抗体，并保护小鼠和雪貂免受H5N1病毒挑战。在非人灵长类动物中，GLA-SE作为流感疫苗佐剂使用时诱导产生更多的Th1型细胞因子，并诱导产生针对多种流感病毒变种的中和抗体，大大提高了疫苗的保护性免疫效果。除了改善疫苗的体液免疫反应外，在一项II期临床试验中，当使用GLA-SE作为H5N1流感疫苗的佐剂时，显示出剂量节省效应，这在大流行性流感情况下特别有益。在几项临床试验中，当GLA-SE作为TB疫苗的佐剂并针对ID93重组蛋白进行测试时，疫苗被发现诱导产生高滴度的抗原特异性抗体产生和CD4+ T细胞反应，在接种人群中展现出良好的安全性和免疫原性。此外，GLA-SE已在临床上作为疟疾疫苗、肿瘤疫苗、HIV疫苗、内脏利什曼病疫苗和血吸虫病疫苗的疫苗佐剂进行评估。这些临床试验似乎表明，GLA-SE是一种有效且安全的疫苗佐剂，有潜力成为下一代疫苗佐剂。GLA-AF是GLA家族中另一个研究得很好的产品。GLA-AF也已在临床前和临床测试中作为几种疫苗的佐剂候选进行了评估。 咪唑喹啉类。咪唑喹啉类能够激活TLR 7/8，导致NF-κB和IRF7激活，促进产生促炎细胞因子和I型干扰素，这将导致强烈的Th1细胞和CTLs产生。伊马克莫德（R837）、雷西莫德（R848）和3M-052（也称为特拉托利莫德）是作为佐剂在临床前和临床环境中研究最多的咪唑喹啉类。大量证据表明，R837在黑色素瘤、HPV、乳腺癌和T细胞淋巴瘤疫苗中表现出强大的佐剂作用。与R848结合的病毒疫苗和肿瘤疫苗显示出更强的体液反应和CD8+ T细胞免疫反应。 3M-052是一种结构类似于R848的咪唑喹啉化合物。3M-052的18-C脂肪酸链赋予了化合物增强的疏水性，从而提高了免疫部位的生物利用度并降低了系统传播的可能性。此外，这种脂化使3M-052更容易纳入基于脂质的制剂中，如乳液或脂质体。用PLGA纳米颗粒或氢氧化铝包裹的3M-052配制的HIV疫苗已被证明能诱导高水平和持续的抗体反应和T细胞反应。基于氢氧化铝-3M-052佐剂的HIV疫苗已在人类I期临床试验中进行了研究。此外，3M-052也用于灭活SARS-CoV-2疫苗。印度III期临床试验的中期结果显示，该疫苗总体估计有效率为77.8%，表明该疫苗耐受性良好。COVAXIN目前已被世界卫生组织（WHO）批准紧急使用。 这些咪唑喹啉类作为疫苗佐剂的使用增强了免疫效果，但也存在一些不足。具体来说，它们经常从注射部位系统扩散，从而远离抗原，降低效果，并诱导系统性副作用。因此，这些咪唑喹啉需要与合成聚合物支架、纳米凝胶、基于脂质的纳米颗粒或其他递送材料结合，以增强其免疫效果并减少副作用。 CpG ODNs。CpG ODNs是合成的单链DNA分子，作为TLR9激动剂已得到广泛研究。其中，最常用作疫苗佐剂的是CpG ODN 1018、CpG ODN 7909和IC31。它们可以导致TRF7的转录激活，进而导致细胞因子IL-12和I型干扰素的产生，最终诱导强烈的Th1型细胞反应和CTLs产生。CpG ODN 1018是在临床前和临床试验中研究最多的CpG ODN，并在前一节中有所描述。除了CpG ODN 1018，CpG ODN 7909是研究最多的CpG ODN。当CpG ODN 7909添加到HBV疫苗中时，CpG ODN 7909在健康人群中诱导出更显著和快速的HBsAg特异性体液反应。CpG ODN 7909还可以改善HIV阳性患者对疫苗的反应率，展示了与CpG ODN 7909配制的疫苗在提高免疫受损个体疫苗反应率方面的潜力。一项随机、双盲对照试验测试了CpG ODN 7909作为HBV疫苗（Engerix-B）佐剂的免疫刺激效果。试验结果表明，添加CpG ODN 7909实现了快速、更高和持续的血清保护，并增加了与单独Engerix-B相比的HBV特异性Th反应。除了与HBV的使用外，CpG ODN 7909(表1, NCT00889616)还用于疟疾疫苗。一项基于蛋白质的疟疾疫苗BSAM2的I期临床试验显示，添加CpG ODN 7909的剂量节省效应。这一特性在资源匮乏的环境中特别有价值。 IC31是TLR9的另一种激动剂，它包含CpG ODN和带正电的抗菌肽成分。它通过TLR9/MyD88依赖途径信号细胞和体液免疫反应。此外，IC31的两个组分之间通过离子和疏水相互作用形成的稳定复合物可以在注射部位形成抗原库，提供抗原的缓慢释放并延长抗原的生物可用性。IC31可以增加APCs的抗原呈递，并显著提高CpG ODN的免疫效果。基于小鼠的研究表明，IC31有助于诱导强大的抗原特异性CTLs和强烈的抗原特异性体液反应。IC31已作为各种亚单位疫苗的候选佐剂在临床前和临床试验中得到广泛评估。结果表明，IC31是一种有效的疫苗佐剂，具有临床转化的潜力。 环二核苷酸（CDNs）。CDNs能够靶向并激活cGAS-STING途径，导致IRF3和NF-κB的激活，诱导产生I型干扰素和促炎细胞因子。I型干扰素选择性刺激抗原交叉呈递并动员CD8+ T细胞。因此，CDNs产生强烈的Th1型细胞反应和CTLs反应。CDNs包括天然CDNs和合成CDNs。天然CDNs包括2',3'-cGAMP、3',3'-cGAMP、c-di-GMP和c-di-AMP，它们是细菌和哺乳动物的第二信使，具有强大的免疫调节功能。基于天然CDNs的佐剂已在多种疫苗中得到评估，并显示出有希望的结果。例如，当2',3'-cGAMP被包裹在肺表面活性剂模拟脂质体中时，它增强了H1N1流感疫苗诱导的体液和CD8+ T细胞反应，并在小鼠和雪貂中诱导了对异型病毒的长期交叉保护免疫反应。Junkins等人将3'3'-cGAMP包裹在酸敏感的乙醛缩聚右旋糖（Ace-DEX）聚合物颗粒中，并与流感疫苗一起给小鼠注射。测试结果表明，与常规氢氧化铝疫苗组相比，抗体滴度高出60至600倍，并且未观察到明显的毒性效应。Lin等人将c-di-GMP包裹在PLGA中，并将MERS疫苗抗原外部耦合形成纳米疫苗。这种疫苗不仅触发了有效的中和抗体和抗原特异性T细胞反应，而且还优先靶向引流淋巴结，产生局部免疫并减少系统反应。当Ebensen将c-di-AMP作为H5N1流感疫苗的粘膜佐剂时，发现它能有效诱导小鼠对H5N1流感的保护性免疫。c-di-AMP作为HPV疫苗佐剂的I期临床试验目前正在进行中。 由于天然CDNs的半衰期短和APCs的摄取效率低，一些具有化学修饰的合成CDNs应运而生，以增强其免疫效果，如ADU S100、MK-1454、BMS-986301、SB-11285、IMSA-101。然而，这些合成CDNs作为疫苗佐剂的具体应用实例尚无。值得注意的是，由于这些合成CDNs在临床前和临床试验中显示出显著增强机体免疫反应的能力，我们相信使用这些合成CDNs作为疫苗佐剂的愿望很快就会实现。 此外，值得注意的是，随着纳米技术的出现，基于纳米颗粒的递送系统，如脂质体、乳液、类病毒颗粒（VLPs）和可生物降解聚合物，已受到显著关注。它们可以持续释放货物并改善货物的生物可用性。因此，使用纳米颗粒包裹CDNs被视为提高体内CDNs利用效率的策略。 代谢佐剂。近年来，一些靶向代谢途径的小分子调节剂被发现是新型疫苗佐剂。甲羟戊酸途径是各种细胞过程的核心代谢途径，包括胆固醇生物合成和蛋白质翻译后香叶基化。研究人员发现，亲脂性他汀类药物和合理设计的双膦酸盐可以通过靶向甲羟戊酸途径中的酶抑制下游代谢产物香叶基焦磷酸（GGPP）的形成。这一结果导致APCs中小型GTPases（例如Rab5）的香叶基化受阻，减缓了抗原从内体到溶酶体的运输并防止了抗原的快速降解。这延长了抗原保留时间，从而增强了抗原呈递。这些靶向甲羟戊酸途径的小分子抑制剂在增加抗体滴度和增强小鼠和猕猴的细胞免疫反应中显示出佐剂效果。 此外，最近的研究发现，雷帕霉素（mTOR）复合体，作为中心代谢调节因子，在调节免疫细胞中起着重要作用。首先，mTOR复合体可以调节浆细胞样DCs中I型干扰素的分泌。抑制mTOR复合体会严重减少产生的干扰素α。此外，mTOR复合体是效应T细胞扩增和生发中心B细胞反应产生的必需调节因子。除了mTOR，氨基酸传感器一般控制非压抑性2（GCN2）也在调节DCs等免疫细胞中发挥作用。研究表明，GCN2的激活导致DCs的自噬增强，从而增强了抗原呈递。这些结果表明，细胞代谢途径的酶或调节剂可能是设计和开发新型佐剂的潜在靶标。 锰佐剂及其衍生物。最近，锰（Mn）及其衍生物被发现具有潜在的佐剂活性。它们作为cGAS的激活剂，直接激活cGAS并诱导非规范的催化合成2'3'-cGAMP。通过这种方式，锰激活cGAS-STING先天免疫途径，诱导产生I型干扰素，增强抗原呈递和交叉呈递，促进抗体产生并增加CD8+ T细胞免疫反应的产生。据报道，Mn2+诱导的小鼠骨髓来源的DCs产生大量IFNβ和IFNα，并在体外实验中导致共刺激分子（例如CD80和CD86）和趋化因子（例如CCL2和CCL3）的显著上调。这表明Mn2+具有诱导DCs成熟和增强抗原呈递的佐剂活性。为了进一步验证其佐剂活性，研究人员将含有Mn2+的溶液与抗原一起注射到小鼠体内，发现它导致抗体滴度增加。为了防止Mn2+在溶液中聚集并失去佐剂活性，研究人员开发了一系列基于Mn2+的纳米佐剂来稳定Mn2+的佐剂活性。 例如，纳米级锰果冻（MnJ），它不仅具有作为免疫刺激剂激活cGAS-STING途径并诱导产生I型干扰素的能力，而且还作为递送系统携带抗原，从而产生强烈的体液和细胞反应。当通过鼻腔给药时，MnJ还作为粘膜佐剂诱导高水平的IgA抗体。王等人开发了另一种名为MnARK的锰佐剂。他们发现，即使在抗原剂量低5倍且注射次数减少的情况下，用含有MnARK佐剂的RBD疫苗接种的小鼠与用含有氢氧化铝佐剂的RBD疫苗接种的小鼠相比，显示出更大的中和假病毒（约270倍）和活冠状病毒（8倍）的感染能力。孙等人使用化学工程策略制造了一种基于Mn2+的纳米锰佐剂，称为nanoMn。以nanoMn为佐剂的冠状病毒疫苗在体内诱导了强烈的CD8+ T细胞免疫反应，并显示出良好的安全性。此外，一些其他基于Mn2+的纳米佐剂也显示出激活cGAS-STING途径和改善疫苗免疫反应的效果。这些结果表明，锰作为新型疫苗佐剂的开发具有巨大潜力。 许多具有不同特性的免疫刺激剂已在临床前和临床试验中得到评估。总体而言，靶向TLRs的免疫刺激剂在临床前和临床研究中仍然是最受欢迎的。另一方面，将多种PRRs激动剂结合起来，并将其配制成水包油乳液或使用其他递送系统进行装载，以增强其靶向APCs(NCT02126579, NCT01585350, NCT01008527, NCT02126579)的趋势日益增加。 4.2.正在调查的交付系统平台 近年来，随着工程材料科学的发展，基于工程材料的多种疫苗递送系统已经被开发出来。新型水包油纳米乳液、脂质纳米颗粒(LNPs)、聚合物纳米颗粒、类病毒颗粒(VLPs)、笼状蛋白纳米颗粒和无机纳米载体是一些重要的递送系统平台。不同类型的递送系统具有不同的机制和物理化学特性，相应地影响疫苗接种的效果。在这里，我们总结并描述了这些递送系统平台的机制、特性和应用。 新型水包油纳米乳液。Montanide ISA 51和Montanide ISA 720是两种在临床试验中测试的新型水包油乳液递送系统。Montanide ISA 51是用矿物油和甘露单油酸酯乳化的，而Montanide ISA 720是用非矿物油和甘露单油酸酯乳化的。此外，它们具有不同的油水比。这两种佐剂的作用机制是形成抗原库和缓慢释放抗原，以延长抗原的生物利用度。临床前和临床测试结果表明，Montanide ISA 51和Montanide ISA 720佐剂增强了血清抗体的产生和细胞毒性T细胞(CTLs)的产生。目前，Montanide ISA 51和Montanide ISA 720正在作为流感、疟疾、黑色素瘤和其他癌症疫苗的佐剂在临床试验中进行评估。此外，Montanide ISA 51在古巴获得了治疗性肺癌疫苗的许可。我们注意到，Montanide ISA 51和Montanide ISA 720通常用作乳化免疫刺激佐剂，以增强免疫刺激剂的效力。 脂质纳米颗粒(LNPs)。LNPs是一种多功能、非病毒性的纳米级脂质囊泡递送系统，由离子化脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇修饰的脂质组成。离子化脂质是LNPs的主要成分。磷脂和胆固醇有助于LNPs的结构完整性，而聚乙二醇修饰有助于维持LNPs的稳定性。LNPs的作用机制主要包括(1)为抗原提供有效的货物保护并延长其生物利用度；(2)增加抗原的粒径以针对抗原呈递细胞(APCs)并促进其被APCs摄取；(3)通过膜融合促进抗原从内质网逃逸，从而引发CD8+ T细胞免疫反应。经过多年的研究，LNPs已被用于各种疫苗的递送，并显示出强烈增强体液和细胞免疫反应的能力。Alameh及其同事发现，LNPs通过诱导强大的T滤泡辅助细胞、生发中心B细胞、长寿命浆细胞和记忆B细胞的增殖，增强了对mRNA和蛋白质亚单位疫苗的体液免疫反应。Oberli及其同事在使用LNPs递送mRNA疫苗治疗B16F10黑色素瘤时，激活了CD8+ T细胞，导致肿瘤缩小并延长了小鼠的总体存活率。近年来，LNPs作为有前景的mRNA疫苗递送系统，在COVID-19疫苗、肿瘤疫苗、流感疫苗等的临床试验中得到了广泛测试。2020年，辉瑞的BNT162b2疫苗(商品名为Comirnaty)和Moderna的mRNA-1273疫苗(商品名为Spikevax)，这两种使用LNPs递送mRNA抗原的疫苗，获得了紧急上市许可。这两种mRNA疫苗在抗击COVID-19方面做出了重要贡献。 聚合物颗粒。聚合物颗粒通常分为天然聚合物和合成聚合物颗粒。它们通常通过缓慢释放抗原来发挥作用。疫苗递送中最常用的天然聚合物是壳聚糖。壳聚糖具有高阳离子电荷和生物粘附特性。因此，壳聚糖可以通过静电相互作用与阴离子核酸形成紧密复合物。此外，壳聚糖的生物粘附特性使其能够长时间保持与粘膜表面的接触，促使抗原持续刺激免疫细胞。这表明壳聚糖可能是核酸疫苗和粘膜疫苗的一个有前景的递送系统。Sawaengsak等人通过将壳聚糖与三聚磷酸钠交联来封装灭活的流感病毒抗原，制备了一种纳米颗粒疫苗，并发现通过鼻内接种两剂这种疫苗的小鼠能够产生更多的抗原特异性抗体和IFNγ+ T细胞。这导致接种疫苗的小鼠100%抵御流感病毒攻击。最近，壳聚糖也被测试为Neocrown DNA疫苗的递送系统。鼻内免疫后，在小鼠体内检测到高水平的中和抗体，并且各种冠状病毒及其突变假病毒被有效中和。此外，壳聚糖最近还被发现通过激活DNA感受器cGAS-STING途径诱导I型干扰素的产生，以促进CD8+ T细胞免疫。 合成聚合物颗粒通常具有比天然聚合物更高的可重复性和更可控的缓慢释放速率。PLGA，一种合成聚合物颗粒材料，现在被广泛用作疫苗递送的载体。在临床前研究中，Kim等人将疫苗成分(包括抗原和免疫刺激剂)封装在PLGA中，以增加DCs对抗原的摄取和呈递，这使得免疫刺激剂能够针对淋巴结中的DCs，而不是系统性传播。Koerner等人设计了一种封装抗原和dsRNA佐剂的PLGA颗粒。这种颗粒疫苗被发现显示出理想的释放曲线，增加了目标淋巴结的数量，并被DCs有效吞噬和呈递。最终产生了有效且持久的抗癌免疫反应。PLGA也被用来递送其他癌症疫苗和HBV疫苗，并增强它们的免疫治疗效果。目前，PLGA颗粒已作为癌症疫苗的递送系统在临床上进行了测试。值得注意的是，PLGA已被FDA批准用于药物递送。因此，我们相信基于PLGA的疫苗递送系统将在未来不久被批准用于人类。 类病毒颗粒(VLPs)。VLPs是由病毒衣壳蛋白的外套蛋白通过蛋白单体的自组装形成的具有固定形状的聚合物颗粒。VLPs的优异粒径和几何形状使其成为递送疫苗抗原的有效平台。VLPs通常直径在20到100纳米之间，因此容易进入淋巴管并靶向淋巴结，由专门的APCs摄取。此外，由于它们高度重复和刚性的结构，VLPs可以在其表面展示多价抗原表位，因此可以广泛交联BCRs，从而刺激B细胞并诱导强烈且持久的抗体反应。目前，基于VLPs的疫苗已经成功并已经广泛上市，如用于HPV的Cervarix®和Gardasil®，用于肝炎病毒的Sci-B-Vac™，以及RTS, S VLP疫苗。VLPs不仅可以递送内源性病毒抗原，还可以递送通过化学偶联或基因融合修饰在VLPs上的异源抗原。例如，一种将HER2抗原表位附着在30纳米二十面体豇豆花叶病毒(CPMV)上的乳腺癌VLP疫苗，能够有效诱导抗原特异性反应和肿瘤保护。此外，肿瘤相关糖抗原MUC1可以共价连接到Qβ，这是一种自组装的二十面体壳VLP，直径为25纳米。这种MUC1 VLP疫苗诱导产生更高水平的特异性抗体，并延长了荷瘤小鼠的存活时间。几种基于VLPs的疫苗已成功进入临床试验，包括基孔肯雅疫苗、流感疫苗、Neocon疫苗、癌症、脑炎等疫苗。值得注意的是，由于VLPs的高度有序和重复的空间结构，非常有利于交联BCRs，即使在没有T辅助(Th)细胞的情况下，VLPs疫苗也能强烈激活B细胞。(表2) 笼状蛋白纳米颗粒。笼状蛋白纳米颗粒通常由一系列重复的图案组成，这些图案允许将抗原表位或抗原并入它们的亚单位结构中，使得这些并入的抗原表位或抗原在组装好的颗粒表面展示出来。与类病毒颗粒类似，笼状蛋白纳米颗粒具有高度有序和重复的空间结构以及适合淋巴结转运的最优尺寸。然而，与类病毒颗粒不同，笼状蛋白纳米颗粒是非病毒来源的。如热休克蛋白、蛋白金库和铁蛋白等笼状蛋白纳米颗粒已被广泛研究作为疫苗的递送平台。在上述蛋白纳米颗粒中，铁蛋白是最常应用的。铁蛋白是由24个亚单位自组装形成的具有八面体对称结构的蛋白，每个亚单位由四个α螺旋束组成。Kanekiyo等人通过将H1N1流感病毒的血凝素抗原与幽门螺杆菌来源的铁蛋白进行遗传融合，并将血凝素抗原插入铁蛋白亚单位并在其表面展示，构建了一种抗体滴度超过许可灭活疫苗10倍以上的纳米流感疫苗。这一设计的有希望的结果帮助开发了三种针对其他流感亚型的疫苗，这些疫苗现在正处于1期临床试验中。在上述三个1期临床试验中，NCT03186781试验已完成。结果显示，无论作为单独还是加强方案，流感疫苗H2HA-铁蛋白都是安全且耐受性良好的，并且可以产生广泛的中和抗体反应。最近，张和他的同事开发了一种基于铁蛋白的SARS-CoV-2纳米颗粒疫苗，该疫苗引发了有效的保护性免疫反应。此外，基于铁蛋白纳米颗粒的乙型肝炎疫苗可以递送乙型肝炎病毒抗原preS1到特定的抗原呈递细胞，激活强烈的免疫反应，并诱导高水平的持续抗体反应。此外，铁蛋白纳米颗粒可以有效递送肿瘤特异性抗原到淋巴结，导致特定的细胞毒性CD8+ T细胞反应和显著抑制肿瘤生长。值得注意的是，一种基于计算机设计的新型笼状蛋白纳米颗粒I53-50最近作为展示多价抗原的强大且多功能平台显示出令人兴奋的结果。基于I53-50的SARS-CoV-2疫苗展示了60个SARS-CoV-2刺突受体结合域在高度免疫原性图案中，产生了比对照疫苗高10倍的中和抗体滴度。同样，一种基于I53-50的纳米颗粒疫苗可以展示20个呼吸道合胞病毒DS-Cav1三聚体抗原，诱导的中和抗体反应比单独的DS-Cav1三聚体抗原高出约10倍。 无机纳米材料。金纳米颗粒是常用的无机纳米材料递送系统之一。由于金纳米颗粒的组成、尺寸、形态、疏水性、表面电荷、均质性和分布等物理化学特性可以通过材料合成和表面化学修饰精确调节以形成特定的免疫类型，因此近年来金纳米颗粒作为有前景的抗原递送系统被研究。金纳米颗粒通过(1)保护抗原免于降解和(2)形成合理粒径的纳米疫苗以促进直接将抗原运送到淋巴结来促进抗原呈递并增强适应性免疫反应。此外，Zhu等人报告称，金纳米颗粒可以通过激活NLRP3炎症体并促进Th2型细胞因子的产生来增强抗原特异性抗体的产生。当金纳米颗粒用作SARS-CoV-2蛋白疫苗的佐剂时，也发现它们可以促进抗原特异性IgG的产生，但未能诱导足够的细胞免疫反应来对抗病毒感染。因此，为了扩大金纳米颗粒的使用，它们通常与其他免疫刺激剂联合使用或表面修饰，以增强它们的T细胞免疫反应。Xu等人制备了修饰有PEI的金纳米颗粒，发现这些纳米颗粒通过激活抗原呈递细胞显著促进了T细胞的增殖。Wang等人将重组流感病毒血凝素与金纳米颗粒偶联，然后将其与TLR5激动剂鞭毛蛋白偶联作为颗粒佐剂系统。用这种疫苗通过鼻内接种小鼠，发现它增加了抗原特异性IgA和IgG水平，并增加了细胞因子IFN-γ的分泌和CD8+ T细胞的激活。在临床上，使用金纳米颗粒作为佐剂的登革热和SARS-CoV-2疫苗正在测试中。 与金纳米颗粒类似，介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNs)也具有强大的装载能力和易于表面修饰的特点。修饰后的MSNs已被研究作为有效的疫苗递送系统。Lee等人通过将MSNs与氧化铁纳米颗粒组装，形成了具有超大介孔的空心MSNs。然后使用PEI进行表面修饰，使得修饰后的MSNs内部的空隙允许有效装载不同大小的各种模型蛋白，并能增强抗原呈递和交叉呈递。当用作癌症疫苗递送系统时，它增加了抗原特异性CTLs的产生，抑制了小鼠的肿瘤生长，并提高了荷瘤小鼠的存活率。Li等人报告了一种以结核菌素纯化蛋白衍生物为佐剂的介孔二氧化硅/钙磷酸盐复合纳米颗粒的例子。结果表明，复合颗粒能够显著抑制肿瘤的生长。MSNs基材料也已在其他抗原的递送系统中进行了测试。值得注意的是，MSNs作为其他药物的载体已慢慢开始临床试验。由于MSNs在临床前研究中已显示出作为疫苗递送系统的效力，我们相信基于MSNs作为递送系统的疫苗也将在未来不久获得临床试验许可。 随着材料科学的发展，基于材料的递送系统迅速发展。现在可以通过递送系统保护疫苗成分并将其靶向到抗原呈递细胞或特定淋巴组织来增强疫苗接种的适应性免疫反应。然而，与免疫刺激剂相比，相对较少的递送系统进入了临床测试。这可能部分是由于递送系统的安全性问题尚未解决。因此，递送系统与宿主免疫细胞或器官之间的具体相互作用机制仍需要进一步研究以阐明其有效性和副作用，以便更好地平衡和控制两者之间的关系。 5.结论与展望 近年来，新型冠状病毒的出现和传播给全球公共卫生在疾病预防控制方面带来了巨大挑战，这再次凸显了疫苗开发的重要性。疫苗开发中不可忽视的一个话题是佐剂，因为它们能显著增强疫苗的适应性免疫反应。在综述的开头，我们总结了佐剂的作用机制，并对其进行了描述。根据作用机制，佐剂可分为免疫刺激剂和递送系统。免疫刺激剂通过靶向特定的模式识别受体(PRRs)激活抗原呈递细胞(APCs)，从而增强抗原呈递和共刺激信号，导致适应性免疫增强。递送系统通过延长抗原的生物利用度，将抗原靶向到APCs或淋巴结，增强APCs对抗原的摄取和呈递，从而增强适应性免疫反应。随后，本综述详细阐述了经典佐剂平台以及正在研究中的佐剂平台，希望为开发特定疫苗时合理选择佐剂提供信息。为了促进佐剂领域的更好发展，我们认为以下几点可能需要关注。 首先，选择正确的佐剂以协助抗原并改善免疫反应是新疫苗开发中的一个重要问题。然而，这个问题复杂且具有挑战性。这是因为免疫系统对给定疫苗和佐剂的反应高度依赖于具体情况，没有任何一种佐剂适用于所有情况下的抗原。结合本综述中对佐剂的描述，我们在此提出，在为新疫苗开发选择佐剂时，需要考虑以下因素。例如，给药途径（如肌肉内、粘膜、腹膜内）、所需免疫反应的类型（抗体偏向或CD8+ T细胞偏向，或两者兼有）、病原体类型、抗原类型（亚单位抗原或mRNA抗原）以及疾病阶段。此外，疫苗接种者的生物学特征也可能很重要，包括物种、种族、年龄、医疗史和遗传组成等。此外，佐剂的安全性和经济性也需要考虑。所有这些因素都可能影响疫苗佐剂的有效性。 此外，考虑到目前免疫刺激剂（主要是PRRs激动剂）和递送系统（尤其是纳米颗粒递送系统）的结合用于佐剂开发，以实现更高的免疫激活。在这里，需要仔细考虑一些问题。首先，通过我们对黄热病病毒疫苗的了解，我们知道同时激活多个先天受体比激活单个受体更有效。因此，非常需要阐明不同PRRs之间的信号交互作用，以更好地筛选更有效的PRRs组合。此外，鉴于抗原和PRR激动剂之间以及不同PRR激动剂之间的物理化学特性差异，递送系统需要更合理地设计，以足够灵活和兼容，同时递送多种疫苗成分。 最后，我们也想提及一点关于经典佐剂的问题。经典佐剂在历史使用中已显示出良好的生物安全性。此外，成熟的研发技术和完善的制造条件和设备为新疫苗的开发转化提供了相对容易的平台。然而，经典佐剂的缺点是它们的免疫刺激能力有限。鉴于此，迫切需要新佐剂来弥补经典佐剂的不足。然而，临床前开发和临床试验的成本和时间限制了新佐剂的转化。因此，我们认为，在促进新佐剂的开发和转化的同时，对经典佐剂进行一些性能优化和配方改进，如表面修饰、颗粒化，以及与其他提高其免疫效力的佐剂结合，可能是具有临床价值的研究课题。 在本综述中，我们系统总结了佐剂的作用机制，并根据其机制介绍和讨论了不同类型佐剂的特点和应用场景。我们期望这篇综述能为佐剂作用机制的进一步研究、现有佐剂的合理使用以及新佐剂的设计与开发提供参考价值。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：先天免疫系统是抵御流感病毒的第一道防线，流感病毒会导致严重的呼吸道炎症，每年在全球造成超过65万人死亡。信使RNA（mRNA）疫苗是传统疫苗方法的有希望的替代品，因为它们具有安全剂量、低成本制造、快速开发能力和高效率。在这篇综述中，我们提供了我们对使用模式识别受体检测和响应mRNA疫苗的先天免疫反应的当前理解。我们还提供了mRNA疫苗的概述，并讨论了推进这一有前途的治疗方法的未来方向和挑战。 关键词：mRNA、疫苗、流感病毒、先天免疫、炎症体、细胞因子、炎症 1.引言 先天免疫系统是宿主对病原体的第一反应线，也是针对病毒疫苗（包括减毒或灭活病毒）的第一道防线，用于预防传染病。接种疫苗后，先天免疫系统识别并清除接种细胞，同时协调适应性免疫反应，以抗原特异性反应的形式，从而维持对病毒感染的长期保护。为了快速检测和防御各种病毒，免疫细胞已经进化出获得多种模式识别受体（PRRs），如Toll样受体（TLRs）、视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体（RLRs）和核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体家族蛋白（NLRs）。通过这些受体，先天免疫系统以严格调节的方式激活，同时保留适应性免疫反应，但不会引发过度的先天免疫反应，这些反应可能导致组织损伤和全身性炎症，对宿主有害。在本篇综述中，我们讨论了先天免疫识别、炎症体的激活以及对流感病毒感染及其mRNA疫苗的细胞因子分泌反应。我们还强调了mRNA疫苗作为预防和控制流感病毒疾病的有前途的工具。 2.迄今为止流感疫苗的简要历史 流感病毒是人类最严重的呼吸道传染病原之一。季节性流感病毒流行估计每年在全球导致29万至65万人死亡。流感病毒是包膜的、负义单链RNA（ssRNA）病毒，具有分节段的基因组。例如，流感A病毒（IAV）包含八个RNA片段，编码RNA聚合酶亚基[聚合酶酸性蛋白（PA）、聚合酶基础蛋白1（PB1）、聚合酶基础蛋白2（PB2）]、病毒糖蛋白[血凝素（HA），促进病毒进入；神经氨酸酶（NA），促进病毒释放]、病毒核蛋白（NP）、基质蛋白（M1）、膜蛋白（M2）和非结构蛋白1（NS1）（图1A）。IAV通过内质网摄取和释放感染细胞，病毒核糖核蛋白（vRNPs）进入细胞核进行mRNA转录和复制，通过正义互补核糖核蛋白（cRNP）中间体。病毒mRNA然后在细胞质中转化为病毒蛋白，这些蛋白被组装成新的病毒颗粒并从细胞中释放出来（图1B）。 图1 | 流感A病毒结构和复制。(A) 流感A病毒（IAV）基因组由八个分节段的单链负义RNA（vRNA）组成。每个节段都被核蛋白（NP）包裹，并通过RNA聚合酶介导，形成病毒核糖核蛋白（vRNP）复合体（PB1、PB2、PA和NP），这是转录和复制的基本单位。(B) 感染的vRNP被运输到细胞核中，在那里发生病毒转录和复制，随后产生后代vRNP。后代vRNP被运输到细胞质后，病毒开始组装。HA，血凝素；M1，基质蛋白；M2，膜蛋白；NA，神经氨酸酶；NS1，非结构蛋白1；PA，聚合酶酸性蛋白；PB1，聚合酶基础蛋白1；PB2，聚合酶基础蛋白2。 季节性流感病毒有四种不同类型：A型、B型、C型和D型。A型和B型流感病毒目前在人群中共同循环，并引起季节性流行：IAV的H1N1和H3N2亚型，以及流感B病毒（IBV）的两个不同谱系（山形谱系和维多利亚谱系）。通过世界卫生组织全球流感监测网络的协调，每年设计季节性流感病毒疫苗，配方包含两种IAV株和两种IBV株；然而，季节性流感病毒疫苗的有效性在每个流感季节都有很大差异。在季节性流感疫苗注射后，先天免疫细胞，包括存在于肌肉中的巨噬细胞和树突状细胞（DCs），会引起趋化因子释放的增加，这导致更多免疫细胞从血液中招募到疫苗接种部位。分化的DCs作为抗原呈递细胞，迁移到淋巴结，导致T细胞和B细胞的激活，以产生抗体（图2）。然而，疫苗诱导的免疫反应狭窄且特定于株，需要不断更新（几乎每年），由于点突变的高频率，这最终是一个复杂、昂贵且耗时的过程。此外，包括禽类和猪类在内的各种流感病毒株已经获得了在人类中高效生长的能力，跨越物种障碍从动物宿主传播，并在人群中传播，对人类构成严重威胁。除了季节性流行，流感大流行每隔几十年发生一次，由猪源H1N1 IAVs引起，这些病毒以前从未循环过，并且可以迅速在人类中传播。1918年的H1N1流感大流行在全球造成约4000万人死亡。自那时以来，流感大流行由1957年的H2N2、1968年的H3N2和2009年的H1N1pdm09引起。考虑到季节性流感病毒疫苗诱导的株特异性免疫可能无法对大流行性流感病毒提供强大的保护，因此需要开发新型流感疫苗，以诱导不专注于相应疫苗株的广泛免疫。 图2 | 宿主对mRNA疫苗的免疫反应。自复制RNA（saRNA）疫苗可以以类病毒RNA颗粒、体外转录RNA和质粒DNA的形式传递。树突状细胞（DCs）在肌肉中识别saRNA并分化。分化的DCs作为抗原呈递细胞，迁移到淋巴结，导致T细胞和B细胞激活以产生抗体。 在1980年代之前，已经建立了灭活疫苗和减毒活疫苗来保护人类免受致病微生物的侵害。灭活疫苗是通过化学或热处理制造的，而减毒活疫苗通常在动物或细胞系中开发。使用杀死的整个生物体疫苗或减毒活疫苗在减少包括麻疹、腮腺炎、风疹和脊髓灰质炎在内的病毒感染以及根除天花感染方面取得了巨大成功。尽管取得了成功，但传统疫苗策略仍然存在主要问题。流感病毒等传染性病原体能够逃避适应性免疫反应，而且通常很难开发减毒或杀死的整个生物体疫苗。在目前的流感病毒疫苗的情况下，主要挑战是其在老年人（65岁及以上）中的低效性，他们比儿童和成年人更容易感染流感病毒。灭活流感病毒疫苗的其他缺点通常归因于流感病毒表面抗原的突变。关于流感病毒减毒活疫苗的其他担忧包括可能引起全身性炎症和死亡，可能是由于回突变、获得补偿性突变或与循环传播的野生型株重组。 通常，流感病毒通过鼻腔或口腔腔感染宿主，首先与呼吸道上皮细胞接触，类似于通过鼻腔内给药的减毒活流感疫苗。感染呼吸道上皮细胞后，病毒或鼻腔内流感疫苗可以诱导全身和粘膜免疫反应。先天免疫细胞的防御机制，特别是DCs，是流感病毒的强大屏障。在不同的粘膜表面存在特定的免疫系统来抵抗流感病毒的入侵。存在于感染细胞内的病毒RNA被各种模式识别受体（PRRs）识别为非自身，导致促炎细胞因子、趋化因子和I型干扰素（IFNs）的释放。巨噬细胞、肺泡细胞、DCs和浆细胞样DCs产生I型IFNs，进而刺激邻近细胞中IFN刺激基因（ISGs）的表达，诱导抗病毒状态。 与流感病毒感染或鼻内流感疫苗不同，基于mRNA的疫苗包含编码病毒蛋白和免疫调节蛋白作为佐剂的mRNA，这些佐剂增强了免疫刺激性特性。当mRNA进入宿主细胞时，内质网（例如，TLR3、TLR7和TLR8）和细胞质先天免疫传感器（例如，RIG-I、PKR、NOD2、OAS和MDA5）识别mRNA，包括单链RNA（ssRNA）和双链RNA（dsRNA）。随后，免疫细胞被激活并产生I型IFN和多种炎症细胞因子。然而，疫苗中的单链mRNA通过体外转录过程适当纯化，以消除与先天免疫传感器的相互作用，这些相互作用会诱导过度分泌I型IFN及其细胞功能障碍。此外，佐剂刺激先天免疫反应，并在不引起可能引发严重副作用的全身性炎症的情况下，推动抗原特异性T细胞反应。此外，注射部位（例如，皮下、肌肉内、皮内和静脉内）和mRNA疫苗递送配方（例如脂质纳米颗粒）影响免疫反应的效力。例如，脂质纳米颗粒载体系统进一步保护mRNA免受核酸酶的侵害，并通过肌肉内注射靶向淋巴管并促进淋巴结中的蛋白质翻译。与鼻内mRNA介导的先天免疫反应相比，肌肉内mRNA主要被非免疫细胞摄取，包括局部肌细胞。一旦进入淋巴结，脂质纳米颗粒最终被DCs吞噬，从而产生并呈递抗原给T细胞以促进适应性免疫反应。mRNA疫苗诱导细胞内产生抗原蛋白以及先天免疫反应的能力必须促使CD8+和CD4+ T细胞分化为效应和记忆亚群，以保护免受感染。 体外转录的mRNA在哺乳动物中的有效使用首次报告于1990年，将报告基因mRNA注射到小鼠体内诱导了目标蛋白的产生。随后的研究表明，在下丘脑中施用编码血管加压素的mRNA可以在大鼠中诱导生理反应。然而，这些早期的有希望的结果并没有导致对mRNA疫苗开发的显著投资，因为人们担心mRNA的不稳定性、严重的先天免疫反应和体内递送无效。然而，在过去的十年中，重大的技术革新和研究投资使mRNA成为一种有前途的疫苗工具。与亚单位、灭活和减毒活病毒相比，mRNA疫苗的使用具有多种优势。由于mRNA是一种非传染性和非整合性平台，因此没有感染或插入突变的潜在风险。此外，mRNA通过正常的细胞过程降解，各种修饰和递送方法可以调节其在体内的半衰期。将mRNA配方成载体分子有助于在细胞质中快速摄取和表达，在那里它是稳定的并且高度可翻译的。此外，由于体外转录反应的高产量，mRNA疫苗具有快速、廉价且可堆叠的制造潜力。此外，已经使用非人灵长类动物模型进行了几项优雅的流感mRNA疫苗研究。在猴子中免疫修饰的非复制型mRNA编码流感H10包裹在脂质纳米颗粒中后，针对血凝素的抗体保护水平显著增加，与人类季节性流感疫苗接种后的观察结果类似。使用一种新的成像技术（正电子发射断层扫描-计算机断层扫描，PET-CT），标记有探针的mRNA疫苗被运送以评估猴子中的生物分布，提供了疫苗接种后先天和适应性免疫反应机制的见解，这些反应在接种部位和引流淋巴结转化为保护性免疫。 3.先天免疫对流感病毒的反应 IAV被包括TLRs、RLRs和NLRs在内的PRRs识别为外来物质，导致程序性细胞死亡、I型IFN的分泌和促炎细胞因子的分泌，从而引发过度炎症。 3.1.与流感病毒识别相关的TLR和RLR TLR和RLR介导的流感病毒信号诱导I型IFN的释放，并刺激感染细胞和附近细胞表达ISGs以诱导抗病毒状态。此外，TLR和RLR信号还诱导促炎细胞因子的释放，如白细胞介素（IL）-6和IL-8。TLR3在内质网中感应dsRNA。尽管感染流感病毒的细胞不产生dsRNA，但Tlr3−/−小鼠在致命流感病毒感染后比野生型小鼠寿命更长，这表明TLR3在病毒感染后识别了未知的RNA结构。此外，Tlr3−/−小鼠在流感病毒感染后产生正常的抗体，以及CD4+和CD8+ T细胞反应，表明TLR3对于产生T细胞免疫是可有可无的。在浆细胞样DCs中，TLR7识别流感病毒的ssRNA基因组。TLR7通过适配器髓系分化初级反应88（MYD88）信号传导，导致激活包括核因子-κB（NF-κB）和干扰素调节因子7（IRF7）在内的转录因子，从而诱导产生I型IFN和促炎细胞因子。RIG-I是一种细胞质PRR，通常识别5'ppp双链RNA（dsRNA）。RIG-I还感应流感病毒复制后产生的5'ppp病毒ssRNA。在检测到流感病毒RNA后，RIG-I的解旋酶结构域与ATP相互作用，这有助于卡斯帕酶募集结构域（CARD）发生构象变化，与信号适配器线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）相互作用，以产生I型IFN。 3.2.炎症体介导的对流感病毒的反应 NLRs在抗病毒免疫反应、炎症反应和细胞因子诱导中发挥重要作用。促炎信号诱导免疫细胞（如巨噬细胞和中性粒细胞）的招募，以消除病原体和病原体衍生分子。IL-1β和IL-18是关键的促炎细胞因子，对抵御IAV感染很重要。IL-1β和IL-18的分泌需要分别通过炎症体介导的pro-IL-1β和pro-IL-18的蛋白水解成熟。炎症体是由caspase-1、ASC和PRRs（如NOD样受体家族蛋白3（NLRP3））组成的多蛋白复合体。在病毒配体感应后，PRRs诱导自聚合并结合到炎症体适配蛋白ASC，ASC由N末端pyrin结构域（PYD）和C末端CARD组成。ASC通过PYD结构域的同型相互作用寡聚化，然后通过CARD与caspase-1结合以形成炎症体，最终诱导炎症性细胞死亡。 在巨噬细胞中，流感病毒诱导的NLRP3炎症体激活需要Z-DNA结合蛋白1（ZBP1）形成ZBP1-NLRP3炎症体。当复制时，IAV产生Z-RNAs，这是RNA双螺旋的转化版本，被ZBP1感应并与受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸激酶3（RIPK3）和caspase-8结合以激活ZBP1-NLRP3炎症体。最近，研究表明caspase-6促进RHIM依赖性RIPK3与ZBP1的结合，促进ZBP1介导的NLRP3炎症体激活。在呼吸道上皮细胞中，MxA充当炎症体传感器，识别流感病毒蛋白NP并以NLRP3独立的方式诱导IL-1β和IL-18的释放。 NLRP3和MxA炎症体激活已被证明是对抗流感病毒的重要先天免疫防御。在流感病毒株A/Puerto Rico/8/34（PR8）感染后，发现NLRP3对白细胞迁移到肺部和保护宿主免受感染很重要。在人类MxA转基因小鼠的流感病毒感染期间，呼吸道上皮中MxA炎症体的快速激活显示出抑制病毒从细支气管传播到远端肺泡区域。这些研究表明，最佳的炎症体激活对宿主有益；然而，异常激活可能导致有害结果。 4.适应性免疫对流感病毒 先天和适应性免疫反应显著保护宿主免受流感病毒侵害，并对产生强烈的抗体反应很重要。流感病毒感染后，先天免疫系统对于识别和清除接种细胞至关重要，同时也通过抗原特异性抗体反应协调适应性免疫，并提供长期保护。 在识别病毒抗原和与认知CD4+ T细胞相互作用后，幼稚B细胞被激活。一些激活的B细胞迅速分化为短寿命的浆细胞。尽管其他激活的B细胞迁移到二级淋巴组织的滤泡并经历生发中心反应，但浆细胞在人类中产生第一波病毒特异性抗体。如果浆细胞来自记忆B细胞，那么在感染后约7天，浆细胞的数量在外围达到峰值。然而，少数激活的B细胞只会分化为长寿命的浆细胞，它们迁移并居住在骨髓中产生抗体，提供长期血清抗体水平，并与抵御病原体感染和疾病的防御相关。另一部分主要激活的B细胞分化为记忆B细胞，它们不释放抗体并留在外围进行免疫监视，但它们是长寿命的，可以在感染期间重新激活成为浆细胞，以产生新的抗体和进一步的记忆B细胞。总体而言，适应性免疫衍生的抗体反应对流感病毒感染相对广泛且持久；然而，由于高突变率和抗原灵活性，流感病毒有时会偏离适应性免疫反应。需要进一步研究自然病毒感染如何诱导长期免疫反应，以开发下一代流感病毒疫苗。 5.传统的季节性流感病毒疫苗 季节性流感病毒疫苗是使用基于鸡蛋、细胞和蛋白质的技术生产的，整个过程通常需要6~8个月。针对IAVs和IBVs的流感疫苗在1940年代发明，这些全病毒灭活疫苗是在胚蛋中产生的，由甲醛和苯汞硝酸盐灭活的粗提纯全病毒组成。2012年，含有基于细胞的病毒的疫苗作为生产灭活和减毒活疫苗的替代方法出现。三价灭活和减毒活流感疫苗的有效性分别约为成人和儿童的65%和83%。通常使用的减毒活流感病毒疫苗通常是冷适应和温度敏感的，在上呼吸道而不是下呼吸道有效复制。总体而言，这些研究表明季节性流感病毒疫苗对流感病毒感染提供了良好的保护。 然而，也有关于这些疫苗的负面报告。成人75%的疫苗效力在老年人中突然下降，老年人更容易感染流感病毒。此外，疫苗和循环株之间的不匹配有时也会发生，通常与较低的疫苗效率有关。根据美国病毒学监测和美国流感疫苗效力（Flu VE）网络数据，2019-2020年流感季节所有年龄组对IAV或IBV的估计疫苗效力（VE）降至29%（2010-2018年平均VE为44.1%），由于抗原漂移的IAV（H3N2）的传播，这引发了对疫苗株选择的担忧（https://www.cdc.gov/flu/vaccines-work/past-seasons-estimates.html）。此外，保护的持续时间有时很短。为了在老年人中诱导更强、更持久的免疫反应，已经测试了高剂量疫苗或包括MF59和AS03在内的先进佐剂疫苗。高剂量疫苗的剂量是三价灭活疫苗的4倍，可以比标准剂量疫苗诱导更多的抗体。MF59佐剂季节性疫苗已在25多个国家获得许可并针对老年人群市场。AS03佐剂流感病毒疫苗也在考虑用于老年人群。 6.传统大流行流感病毒疫苗 IAV通常在一种动物种群内传播，但有时它们可以跨越并导致另一种物种生病。在后一种情况下，与在人类中循环的季节性IAV相比，表现出更显著的遗传变化。如果新型IAV具有传染性并在人类中容易传播，则被认为是流感病毒大流行。由于大多数人口对新型流感病毒株没有或只有有限的自然免疫力，因此已经使用多种生产平台开发了大流行IAV疫苗候选物。带有佐剂的灭活分裂流感病毒疫苗平台进展最远，其他平台，包括核酸（DNA和mRNA）、载体、重组蛋白（VLP；类病毒颗粒）、活病毒仍在开发中。H5N1禽流感病毒疫苗是第一个获得美国FDA批准用于人类人口的疫苗，因为对高致病性H5N1病毒可能引起流感大流行的潜力提出了关注。 流感大流行管理面临的挑战之一是在全球疫苗生产能力在爆发后的几个月内。在针对H5N1株的疫苗的情况下，使用反向遗传学生成了种子株，以去除HA的多基本裂解位点，并将背景更改为高生长PR8 H1N1株，后者表现出相对较少的致病性。这些修改有助于生产更安全的疫苗株，并大量生产，因为高致病性IAV经常杀死胚蛋，导致产量低。已经对H5N1和H7N9疫苗在人类中进行了测试，需要高抗原剂量或使用佐剂以诱导可靠的血凝抑制滴度。一项H7N9疫苗的临床试验尽管使用了佐剂，但产生了大约60%的效力，这表明为了实现足够的疫苗效力，需要佐剂和多次接种。 7.针对流感病毒的信使RNA疫苗策略 mRNA疫苗通过实验方法进行了广泛表征，这些方法改善了mRNA的稳定性和传递以及蛋白质生产。这些方法涉及开发纳米颗粒运输技术，这些技术可以稳定mRNA，增强细胞摄取，并在mRNA进入细胞时提高生物可用性。mRNA疫苗的一个明显优势是它不需要进入细胞核来促进抗原表达。 7.1.针对流感病毒的自复制mRNA疫苗 自复制RNA（saRNA）疫苗可以以质粒DNA、类病毒RNA颗粒和体外转录RNA的形式携带（图3）。基于DNA质粒的saRNA疫苗结合了更稳定的DNA核酸产品和更高水平的抗原表达的优势。saRNA疫苗在临床前模型中引起了强烈的免疫反应。saRNA疫苗源自阿尔法病毒的基因组骨架，其中编码病毒RNA复制机制的基因是完整的。 图3 | 通过自复制RNA疫苗获得抗原表达。展示了自复制RNA（saRNA）传递的三条途径。这些包括：1） 类病毒RNA颗粒通过受体介导的内吞作用将saRNA传递到细胞质；2） 直接将体外转录的复制子saRNA以生理盐水或合成配方的形式传递给细胞；3） 携带复制酶基因和转基因的质粒DNA进入细胞核，在那里转录生成复制子saRNA，然后运输到细胞质。三条saRNA疫苗途径最终产生信使RNA（mRNA），通过核糖体翻译产生疫苗抗原。 有几份报告使用了针对流感病毒的saRNA疫苗。用编码PR8 H1N1 IAV HA的10 mg saRNA疫苗免疫，在小鼠中产生了抗体反应，并在致命的同源病毒挑战中提供了保护。另一项研究表明，开发了saRNA疫苗，其中A/California/07/2009（H1N1）或A/Shanghai/2/2013（H7N9）IAV HA编码的saRNA被配制在脂质纳米颗粒中，小剂量在小鼠中两次肌肉注射后诱导了保护水平的血凝抑制滴度。与这一发现一致，另一组表明，肌肉注射0.1或0.2 mg PR8 H1N1 IAV NP、M1或联合NP+M1自复制RNA-脂质纳米颗粒疫苗在小鼠中引起了强烈的抗原特异性T细胞反应和对同源病毒感染的保护。IAV HA和NP复制子RNA与含壳聚糖的脂质纳米颗粒或聚乙烯亚胺（PEI）复合后，在小鼠皮下给药后引起了T细胞和B细胞免疫反应。最近的一项研究揭示了一种由化学修饰的阳离子树状分子复合成的脂质纳米颗粒组成的递送平台。使用这个平台，肌肉注射编码A/WSN/33（H1N1）IAV HA的RNA复制子成功地保护了小鼠免受致命同源病毒挑战。最近的一项研究显示了自复制mRNA和非复制mRNA免疫后在小鼠中免疫反应和保护效力的直接比较。动物在首次疫苗接种后八周内两次肌肉注射不同剂量的PR8 H1N1 IAV HA编码未配方自复制mRNA或未修改非复制mRNA，并进行了挑战。两个平台都引起了对同源流感病毒感染的保护。 7.2.非复制型流感病毒mRNA疫苗 非复制型mRNA疫苗可以通过结合各种修饰的核苷酸来制造，并且在开发直接可注射的非复制型mRNA疫苗方面投入了大量的努力。有几项针对流感病毒的非复制型mRNA疫苗的研究。在脂质体中复合的IAV NP编码mRNA的给药在小鼠中诱导了细胞毒性T细胞反应。用各种IAV HA、NP和NA编码的RNActive疫苗在小鼠、雪貂和猪中进行皮内免疫，单次免疫后产生了保护性免疫反应。使用PR8 H1N1 IAV HA编码未修改mRNA-脂质复合物的小鼠静脉内免疫显示单剂量给药后T细胞激活增加。总之，确定这些发现是否以及如何转化为临床试验和疫苗接种将是重要的。 7.3.先天免疫对mRNA疫苗的反应 先天免疫系统作为宿主对mRNA疫苗接种的第一反应线。在mRNA疫苗接种期间，mRNA可被各种PRRs识别，包括TLRs、RLRs和NLRs，以产生IFNs和促炎细胞因子。典型地，IFNs和促炎细胞因子对宿主大有裨益，触发IFN诱导基因的诱导和免疫细胞的浸润，以清除接种细胞。然而，失调的IFNs和促炎细胞因子会抑制mRNA疫苗的效力，导致有害的全身性超炎症和组织损伤。因此，体外转录mRNA的适当纯化对于最大化免疫原产生和避免不必要的先天免疫激活至关重要。 TLR3感应超过45个碱基对的dsRNA和来自ssRNA形成二级结构或来自病毒复制中间体的dsRNA。TLR7可以识别dsRNA和ssRNA，而TLR8只感应ssRNA。TLR7的激活可以刺激抗原呈递、细胞因子释放并诱导B细胞反应。特别是，RIG-I感应带有5'-三磷酸的ssRNA和dsRNA并刺激IFN产生。 mRNA疫苗通过RNA传感器产生的IFN产生依赖于体外转录mRNA的质量、传递载体和给药途径。体外转录mRNA被dsRNA污染的识别会导致快速的I型IFN诱导，这上调了蛋白激酶R（PKR）和2'-5'-联腺苷酸合成酶（OAS）的表达和激活。这导致翻译抑制和细胞mRNA、核糖体RNA和体外转录mRNA的降解（图4）。通过包括反向相快速蛋白液相色谱或高性能液相色谱在内的色谱方法，可以有效地从体外转录mRNA中去除污染的dsRNA。这些方法的纯化已被证明可以增加人类DCs中体外转录mRNA的抗原蛋白产生高达约1000倍。除了dsRNA污染物外，单链mRNA分子被识别为PAMP并被TLR7和TLR8检测，导致I型IFN产生和体外转录mRNA的抗原蛋白产生减少。 图4 | 失调的先天免疫阻止mRNA疫苗的效力 在mRNA疫苗接种时，进入的自复制RNA（saRNA）被Toll样受体（TLR）3、TLR7和视黄酸诱导基因I（RIG-I）识别，这促进了它们的下游信号传导和随之而来的产生I型干扰素（IFN）。体外转录mRNA被dsRNA污染的识别会导致快速的I型IFN产生，这会诱导蛋白激酶R（PKR）和2'-5'-联腺苷酸合成酶（OAS）的表达和激活。这将抑制翻译并诱导细胞mRNA、核糖体RNA和体外转录mRNA的降解。EIF2a，真核生物启动因子2a；IFNAR，干扰素α受体。 鉴于减少I型IFN信号传导对mRNA疫苗策略至关重要，几项研究揭示了减少I型IFN信号传导的修饰mRNA的开发。包括天然存在的化学修饰核苷，包括假尿苷和1-甲基假尿苷，防止TLR7、TLR8和其他先天免疫传感器的激活，从而减少I型IFN信号传导。另一项研究还表明，与未修饰的mRNA相比，核苷修饰的mRNA在体外和体内（特别是在小鼠中）在原代DCs中的翻译更好。总之，mRNA疫苗与先天免疫反应之间的平衡对于潜在的疫苗方法至关重要；这种平衡必须精细控制，以减少过度的先天免疫反应，同时在DCs中保持最大的免疫原产生。 注意，虽然依赖炎症体的IL-1β和IL-18的释放触发了DCs中进一步的产生，以诱导流感病毒特异性CD8+ T细胞启动，体外转录mRNA是否可以被炎症体传感器识别在很大程度上仍然未知。未来的研究需要全面检查驱动炎症体适应性免疫反应所需的因素。 7.4.基于mRNA的流感病毒疫苗开发 mRNA疫苗最近吸引了大量关注，涉及大规模的学术和工业投资，生物技术公司已成功筹集资金用于开发创新的RNA疫苗。Moderna Therapeutics（美国）的科学家开发了第一种直接可注射的针对H10N8和H7N9的流感RNA疫苗，证明了用可接受的耐受性概况诱导保护性免疫原性的可能性。对于第一种人类季节性流感病毒RNA疫苗试验，CureVac AG公司（德国）开发了一种序列工程化的mRNA-脂质纳米颗粒策略，该策略在不使用修饰核苷酸的情况下实现了非凡的体内蛋白质翻译水平。使用这种策略，最近的一项研究表明，单次肌肉注射10 mg A/Netherlands/602/2009（H1N1）HA编码mRNA-脂质纳米颗粒在非人灵长类动物中诱导了保护范围内的血凝抑制滴度（≥1:40）。此外，第二次剂量接种有效地增强了免疫反应，并在所有接种动物中使血凝抑制滴度≥1:160超过1年。CureVac AG科学家提供的证据表明，两次免疫接种mRNA-脂质纳米颗粒编码的HA来自A/Hong Kong/4801/2014（H3N2）比许可的MF59佐剂三价灭活IAV疫苗诱导更强的T细胞和B细胞免疫反应。 7.5.mRNA疫苗的局限性 通常不常观察到与mRNA疫苗相关的超敏反应。同样，严重的急性发作，假定为免疫球蛋白E（IgE）或免疫球蛋白G（IgG）介导的，以及补体介导的过敏性或严重的迟发性T细胞介导的全身反应被认为是非常罕见的。疫苗的活性抗原也可以发展超敏性。疫苗接种后的急性超敏反应包括自限性的局部副作用，系统反应可以从荨麻疹/血管性水肿到全系统多系统涉及的全身性过敏性反应。过敏性反应是一种罕见的危及生命的过敏反应，通常在接种后几分钟到几小时内发生。疫苗诱导的过敏性反应通常很少见。2019年冠状病毒病（COVID-19）大流行突显了通过脂质纳米颗粒中的mRNA疫苗进行强大疫苗生产的需求。出乎意料的是，由于公共疫苗引起的严重过敏反应较少，因此，围绕特应性个体的相当大的公众关注。以前的疫苗相关过敏性反应的免疫机制研究集中在明胶、乳胶和鸡蛋蛋白的存在上，最近更多地关注聚山梨酯80，这是一种广泛存在于许多疫苗中的表面活性剂。然而，上述所有辅料都没有包含在辉瑞-BioNTech COVID-19 mRNA疫苗中，而且在大规模2/3期临床试验中没有观察到过敏性反应病例；因此，这些事件是出乎意料的。因此，初次接触COVID-19疫苗时发生的过敏性反应是指预先存在的抗体介导的免疫（过敏）或与以前暴露无关的假过敏反应。已知过敏原引起的过敏性反应最好通过与肥大细胞和嗜碱细胞的结晶片段（Fc）ϵ受体交联的IgE的经典范式来理解，但包括抗体依赖性补体激活或IgG相关肥大细胞/粒细胞/血小板/嗜碱细胞介导的肥大细胞/粒细胞/血小板/嗜碱细胞激活通过Fcg受体的非经典途径已在动物模型和人类对药物的过敏反应中描述。不幸的是，关于疫苗潜在用途的信息用于测试以确认病理病因或预测反应风险仍然很少。在公共卫生危机期间，需要对经历过敏性疫苗反应的患者进行快速彻底的基于研究的评估，并在处于风险中的个体中进行前瞻性临床试验，以解决这些问题。 8.结论和未来研究方向 我们已经强调了IAV mRNA疫苗接种期间先天免疫系统的反应。最佳的先天免疫感应和炎症细胞因子释放对于T细胞和B细胞免疫反应至关重要。然而，过度的宿主先天免疫反应可能导致细胞因子风暴和/或组织损伤，抑制流感病毒mRNA疫苗的效力。因此，必须控制mRNA诱导的先天免疫，以减少过度炎症，同时保持抗体产生。 在过去的十年中，流感病毒mRNA疫苗领域取得了明显的突破，证明了在临床前和临床环境中的概念验证。然而，减少mRNA的先天免疫感应和将有希望的动物数据最大化转化为人类仍然是一个挑战。需要进一步的临床试验来检查长期安全性和免疫原性，以评估RNA疫苗对流感病毒疫苗领域的影响。 目前，COVID-19大流行继续在全球蔓延，迫切需要有效的疫苗来对抗它。FDA批准的mRNA疫苗在工作年龄成人中预防SARS-CoV-2感染方面非常有效，疫苗减轻了突破性感染者的病毒RNA负荷、发热症状风险和病程，尽管接种了疫苗。mRNA疫苗领域的未来是潜力无限的，相关公司和其他学术机构提供的临床数据和资源可能会显著地建立和加强基于mRNA的疫苗的基础研究。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。