HOXA9

引言 2024年10月22日，北京大学邓宏魁和关景洋课题组合作在Cell Stem Cell杂志在线发表题为Generation of Human Expandable Limb-Bud-like Progenitors via Chemically Induced Dedifferentiation 的研究论文。该研究进一步证明了化学重编程技术可诱导人体细胞去分化(Chemically induced dedifferentiation)，并成功制备可大规模扩增的胚胎肢芽样前体细胞。这一创新成果利用化学小分子精准调控细胞命运的特点，模拟低等动物的再生规律，为制备具有再生潜能和大规模扩增能力的人前体细胞开辟了新途径。 邓宏魁团队多年来一直致力于化学重编程调控细胞命运的研究。2013年在国际上首次报道仅使用化学小分子逆转细胞发育时钟，将小鼠体细胞重编程为多能干细胞。这一原创性成果开辟了一条全新的体细胞重编程的路径（Science，2013；Cell, 2015; Cell Stem Cell, 2018）。2022年该团队又首次实现了利用化学小分子诱导人体细胞成为多能干细胞的技术体系，为人多能干细胞的制备提供了全新的途径，是干细胞领域底层技术的重要突破（Nature，2022）。在此基础上，2023年建立了更加快速、高效、满足临床应用需求的人体细胞化学重编程体系（Cell Stem Cell，2023）。以糖尿病治疗为切入点，邓宏魁团队证明了化学重编程诱导的人多能干细胞可以高效分化为胰岛细胞，并显著改善糖尿病猴的血糖控制 (Nature Medicine, 2022; Nature Metabolism, 2023)。更令人振奋的是,该团队近期首次报道了利用化学重编程诱导多能干细胞制备的胰岛细胞移植, 患者初步实现了1型糖尿病的临床功能性治愈 (Cell | 沈中阳/邓宏魁/王树森团队合作报道首例移植化学重编程多能干细胞制备的胰岛实现1型糖尿病患者功能性治愈，Cell, 2024)。这一系列的研究成果，证明了化学重编程技术在再生医学领域治疗重大疾病方面的巨大潜力和重要应用价值。目前，该团队还成功将化学重编程诱导的人多能干细胞分化为肝脏细胞，iTNK细胞等功能细胞，展现了人化学重编程的广泛应用前景（Cell Proliferation, 2024; Cell Reports Methods, 2024）。 图1. 化学重编程诱导人多能干细胞的广阔应用前景（Credit: Cell Stem Cell） 邓宏魁团队研究发现化学重编程技术与传统重编程技术存在本质的区别。传统的转基因重编程技术依赖于细胞内源的转录因子过表达，直接驱动细胞性质转变，难以实现细胞命运的精准调控。而化学重编程技术则利用化学小分子模拟外界信号刺激，类似自然发育中的细胞命运调控原理，以更加灵活可控的方式，促进细胞命运分阶段有序的调控。2015年的研究中，该团队发现化学重编程诱导小鼠多能干细胞过程中会经历独特的中间阶段 (Cell，2015)。之后，通过单细胞组学技术又构建了小鼠化学重编程体系的完整分子路径（Cell Stem Cell，2018），揭示了化学重编程体系完全不同于转录因子介导的重编程的独特原理和路径。 该团队在2022年的研究中发现，人化学重编程的早期阶段会产生一种独特的高可塑性的中间态细胞，其染色质可及性增强，早期胚胎发育基因激活等特点。有趣的是，通过和低等动物再生去分化过程中的细胞性质比较，发现该阶段激活了与蝾螈断肢再生早期类似的基因表达特征（Nature，2022）。随后，该团队通过表观组学的系统解析，又发现类再生可塑性状态的建立过程与生物体发育成熟过程中再生能力丧失的逆向过程极为相似（Cell Reports，2023）。这一系列的发现提示通过化学重编程技术精准调控细胞的命运，有望实现人体细胞逆向发育，将其诱导回前体细胞状态，从而重启人体细胞的再生潜能。 图2. 左图：蝾螈断肢再生过程中体细胞去分化产生前体细胞(Gerber et al ., Science, 2018）；右图：Waddington model展示细胞分化与去分化过程（Granados et al., Int. J. Mol. Sci. 2020）（Credit: Cell Stem Cell） 在自然界中，部分低等动物如蝾螈等，展现出了惊人的再生能力，其四肢、心脏、大脑等重要组织器官在损伤后可实现完美再生修复。这一神奇的能力主要归功于其体细胞具有的重要潜能——去分化（dedifferentiation），即分化的体细胞可以在损伤等信号刺激下，重新逆转发育为可快速增殖的类胚胎期的前体细胞状态，从而重新分化为功能细胞，修复损伤的组织器官。然而，哺乳动物，尤其是人类，由于其体细胞的命运更加稳固，可塑性下降，导致其再生能力非常有限。组织器官损伤后，人体细胞难以有效启动去分化程序，从而大大限制了受损组织或器官的再生。因此，如何模拟低等动物，有效诱导人体细胞的去分化以重新获得前体细胞，是干细胞与再生医学研究的重要科学问题之一。 在本研究中，邓宏魁团队证实了在化学重编程早期阶段，化学小分子可诱导体细胞去分化为类人胚胎肢芽前体细胞（human Chemically induced Limb Bud-like Progenitors，简称人CiLBP细胞），并在此基础上建立了人CiLBP细胞长期稳定扩增的条件。通过单细胞转录组分析，研究团队发现人CiLBP细胞的转录组与人胚胎肢芽细胞相似。去分化相关基因LIN28A、SALL4等在人CiLBP细胞中高表达，同时体细胞相关基因表达降低，表明体细胞相关特征被擦除并启动再生相关基因网络。人CiLBP细胞高表达MSX1、HOXA9和MEIS2等肢芽发育相关基因，与人类胚胎发育30天左右的肢芽细胞群状态非常类似。 肢芽细胞作为软骨细胞和骨细胞的祖细胞，最终能发育成四肢。相较于未经过化学重编程处理的亲代体细胞，人CiLBP细胞的成软骨和成骨能力显著提升。在成软骨条件诱导下，可高表达软骨相关基因，分泌相关蛋白，并可以形成软骨结节。体内移植实验表明，人CiLBP细胞能在体内自发分化产生软骨和骨样细胞，并在兔股骨髁缺损模型中促进骨损伤修复。重要的是，起始的人脂肪间质细胞或者人皮肤成纤维细胞扩增能力有限，而诱导获得的人CiLBP细胞可以在长达32次传代后，仍保留肢芽前体细胞特性，并保持良好的分化能力。这些特性证明，通过化学重编程诱导体细胞去分化获得的前体样细胞，不仅增强了分化能力，还具备大规模扩增的潜能，为其后续应用于骨和软骨相关疾病的治疗提供了新的细胞来源，具有重要的临床应用价值。 图3.  化学重编程技术诱导体细胞去分化为可大量稳定扩增的肢芽前体细胞（Credit: Cell Stem Cell） 综上所述，邓宏魁团队在本研究中利用化学重编程技术精准调控细胞命运，成功模拟低等动物组织再生中的去分化过程，实现了人体细胞向前体细胞的逆转，这一成果具有重要意义。（1）该研究进一步证明了化学重编程技术不同于传统转基因重编程技术，可通过分阶段有序的调控细胞性质，实现细胞命运的可控逆转，为实现人体细胞的去分化提供了全新的途径；（2）该研究为体外制备可大规模扩增的人前体细胞提供了新的方法，通过诱导去分化获得的人前体细胞具备了更强的分化能力及增殖能力，从而为受损组织和器官的细胞替代治疗提供了更理想的细胞来源；（3）利用化学重编程精准诱导人体细胞去分化的独特优势，有望直接激发体内组织和器官的再生潜能，模拟低等动物在组织和器官完美再生修复方面的神奇能力，为再生医学的发展提供新的可能性。 参考文献 https://www.cell.com/cell-stem-cell/abstract/S1934-5909(24)00363-1 责编|探索君 排版|探索君 来源|BioArt End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

引言 近年来白血病治疗已经取得了显著进展，但是MLL（mixed-lineage leukemia, 也称为MLL1、ALL-1或KMT2A）基因重排引起的白血病仍然难以治疗，患者对现有疗法预后不佳。由于染色体重排导致的MLL基因融合在急性白血病中尤为常见，特别是在婴幼儿急性白血病中。这些重排与极差的预后相关，其中35-50%的儿童急性髓性白血病（AML）病例具有MLL重排的特征。这一患者群体对标准治疗的反应不佳，凸显了发展其他有效疗法的紧急性和必要性。 2017年，闻宏、万里玲等发现ENL（也称为MLLT1或YEATS1），一种组蛋白乙酰化阅读器蛋白对MLL基因重排白血病的生长是必需的【1】。ENL作为转录共激活因子，主要与SEC复合物（Super elongation complex）和DOT1L复合物（组蛋白H3K79甲基转移酶）相结合，在转录延伸过程中发挥关键作用。复合物中的ENL通过其YEATS结构域识别组蛋白H3赖氨酸乙酰化，促进招募和稳定相关的转录机器，进而实现激活目的基因。基因敲除ENL或YEATS结构域突变均显示出抑制MLL基因重排白血病生长的潜力，表明了ENL作为MLL基因重排白血病治疗靶点的前景。 蛋白质降解靶向嵌合体（PROTACs）是一类异双功能小分子，它们通过介导目标蛋白与E3泛素连接酶复合物的结合，从而在蛋白酶体（proteasome）中引发配体依赖性的蛋白质降解【2】。这一技术在生物医学和药物发现领域引起了极大关注。此前关于传统ENL小分子抑制剂的研究为ENL PROTAC降解剂的开发奠定了基础【3, 4】，但ENL PROTAC降解剂这一领域的进展仍然有限。 近日，Van Andel研究所闻宏课题组和西奈山Icahn医学院金坚课题组合作在Science Advances 发表了题为A potent and selective ENL degrader suppresses oncogenic gene expression and leukemia progression的研究论文。该研究开发了一种高效且特异的ENL蛋白PROTAC降解剂MS41，并详细阐述了MS41抑制白血病细胞生长的分子机制。同时，通过小鼠肿瘤模型验证了其在体内的抑制效果。 研究者使用了PFI-6（一种特异性结合ENL/AF9的YEATS结构域的小分子抑制剂）【4】以及VHL E3泛素连接酶的经典配体VHL1-Me进行化合物的设计，开发出ENL蛋白PROTAC降解剂MS41（图1A）。MS41在多种人类白血病细胞系中均可以高效的降解ENL蛋白，在MV4;11和Jurkat细胞系中的半数蛋白降解浓度（DC50) 分别为3.50 nM 和 3.03 nM，最大降解率（Dmax）均超过93% (图1B和1C)。对使用100 nM MS41处理2小时的MV4;11细胞进行定量蛋白质组学分析，结果显示ENL蛋白是唯一显著减少的蛋白，显示出MS41的特异性（图1D）。进而，研究者发现MS41可以显著抑制多种人类MLL重排白血病细胞系的生长（图1E）。MS41在MV4;11和RS4;11细胞中的半数生长抑制浓度（GI50）分别为21.28 nM和25.06 nM。有趣的是，一种携带AML1-ETO易位的白血病细胞系KASUMI对MS41也非常敏感。MS41对不依赖于ENL的白血病细胞系Jurkat和K-562的生长则没有影响，体现了它在细胞水平的特异性。 图1.MS41是高效且特异的ENL蛋白降解剂。（A）MS41的化学结构以及降解ENL蛋白的示意图。（B）在MV4;11和Jurkat细胞中检测ENL和β-Actin表达水平的免疫印迹。（C）MS41在MV4;11和Jurkat细胞中的DC50和Dmax值。（D）MV4;11细胞中的定量蛋白质组学分析。（E）MS41在人类白血病细胞系中的生长抑制曲线。（Credit: Science Advances） 研究者进一步探索了MS41抑制白血病细胞生长的分子机制。对MS41处理后的MV4;11细胞进行RNA-seq，分析结果显示关键癌基因（如MYC）和白血病干细胞基因（如HOXA9、HOXA10、MEIS1和MYB）的表达显著降低，而髓系分化标志物（如CD11B）的表达增加。ENL通过与多个染色质相关蛋白复合物相互作用来发挥转录调控功能，特别是SEC复合物和DOT1L复合物。这两个复合物都与MLL重排引起的白血病相关，研究者之前的研究表明，ENL在将这些复合物招募到染色质上的过程中发挥了关键作用【1】。为了研究MS41介导的ENL降解是否影响这些转录相关复合物在染色质上的结合，研究者对SEC（AFF1和CDK9）、DOT1L以及延伸型RNA聚合酶（Pol II S2P）进行了ChIP-seq。分析结果表明，SEC 和 DOT1L复合物成分以及延伸型RNA Pol II在染色质上的结合与ENL在染色质上的结合高度正相关，它们在ENL结合密集的基因上也结合更为密集。在MS41处理之后，这些转录相关蛋白在染色质上的结合均明显减少，在ENL结合密集基因上的减少尤为显著。最后，研究者使用白血病异种移植（xenograft）的小鼠模型验证了MS41在体内的作用效果。MS41处理显著延迟了异种移植小鼠的白血病进展，并延长了生存期。小鼠的中位生存期从对照组的37天延长至MS41组的49.5天。 综上所述，该研究开发出了一种高效且特异的降解ENL蛋白的PROTAC降解剂MS41,进而在细胞中和小鼠模型中验证了MS41抑制白血病细胞生长的分子机制。该研究结果强调了药物性降解ENL在治疗ENL依赖性癌症中的治疗潜力。因此，MS41不仅是一个有价值的化学探针，还可能成为进一步开发的抗癌治疗药物。 参考文献 1. Wan L, Wen H, Li Y, Lyu J, Xi Y, Hoshii T, Joseph JK, Wang X, Loh YE, Erb MA, Souza AL, Bradner JE, Shen L, Li W, Li H, Allis CD, Armstrong SA, and Shi X. ENL links histone acetylation to oncogenic gene expression in acute myeloid leukaemia. Nature, 2017; 832 543, 265-269. 2. Dale B, Cheng M, Park KS, Kaniskan HÜ, Xiong Y and Jin J. 2021. Advancing targeted protein degradation for cancer therapy. Nature Reviews Cancer, 2021; 21(10), pp.638-654. 3. Ma XR, Xu L, Xu S, Klein BJ, Wang H, Das S, Li K, Yang KS, Sohail S, Chapman A, Kutateladze TG, Shi X, Liu WR, and Wen H. Discovery of selective small-molecule inhibitors for the ENL YEATS domain. Journal of medicinal chemistry, 2021; 64(15), pp.10997-11013. 4. Raux B, Buchan KA, Bennett J, Christott T, Dowling MS, Farnie G, Fedorov O, Gamble V, Gileadi C, Giroud C, Huber KVM, Korczynska M, Limberakis C, Narayanan A, Owen DR, Saez LD, Stock IA, and Londregan AT. Discovery of PFI-6, a small-molecule chemical probe for the YEATS domain of MLLT1 and MLLT3. 2023; Bioorg Med Chem Lett, 129546. https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.ado1432 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

引言 三阴性乳腺癌（TNBC）是一种高度异质性的疾病，展现出极高的侵袭性【1】，常规的内分泌治疗或化疗对此类癌症通常无效【2】。之前的基因组、转录组和蛋白质组分析发现TNBC缺乏有效的生物标志物来指导治疗决策和预测治疗反应【3】，因此从新的角度深入理解TNBC病理生物学特性尤为重要。 三维染色质结构指的是染色质在细胞核中的空间排列，包括染色质区域如何折叠、聚集以及它们如何与核小体和其他核内结构相互作用。在肿瘤中，染色质结构的异常重组可能导致染色质可及性变化，进而使原本静默的致癌基因被激活，或者抑癌基因被抑制。染色质结构的改变也可以影响染色体上的表观遗传标记，进而影响基因表达。尽管三维染色质结构对肿瘤表型的影响非常关键，但TNBC染色质结构的调控机制仍知之甚少。 2024年8月28日，广东省人民医院、中山大学、广州市妇女儿童中心、桂林医科大学附属医院及顺德医院的联合科研团队，以赵蔚和李杰两位 教授为通讯作者，在Nature Cancer上发表了题为Phase separation of phospho-HDAC6 drives aberrant chromatin architecture in triple-negative breast cancer的论文。该研究发现磷酸化形式的HDAC6蛋白在TNBC细胞的核内转录活跃区域形成了液液相分离（LLPS）凝聚体，而在非TNBC中这种现象较少见。研究还鉴定出Nexturastat A作为磷酸化HDAC6 LLPS抑制剂，显示出能够导致染色质结构重塑和转录谱改变，有效抑制TNBC的肿瘤生长。该论文首次揭示了TNBC中存在磷酸化形式的HDAC6蛋白，并且干预磷酸化HDAC6的相分离可能为开发TNBC的治疗的新策略。 该研究显示与非TNBC及相邻非癌组织相比，TNBC中HDAC6在细胞核表达显著增加，且主要以磷酸化形式存在。通过对HDAC6的潜在磷酸化位点进行突变分析，发现特定位点Ser22的磷酸化对其核内定位至关重要，这种磷酸化状态与肿瘤的分期及转移显著相关，并与患者的总生存期负相关。超分辨率显微镜观察发现，TNBC细胞中磷酸化HDAC6倾向于在细胞核中形成LLPS的凝聚体，这些凝聚体主要分布在活跃的染色质区域，并与转录活跃相关的标记物共定位。此外，实验还观察到表皮生长因子（EGF）能通过特定的激酶GRK2显著增加磷酸化HDAC6的水平和凝聚体形成。 接下来，研究团队探讨了HDAC6的两个主要固有无序区域（IDRs）在相分离作用。研究发现，HDAC6的第一个无序区域（IDR1）的删除显著减少了磷酸化HDAC6的相分离，而第二个无序区域（IDR2）的删除则对相分离没有显著影响。此外，IDR1内Ser22位点的磷酸化状态对其相分离能力有重要影响。进一步的实验表明，HDAC6的特定结构域，如核输出信号（NES）域的删除，显著增强了HDAC6在核内的定位和相分离能力。 探究肿瘤中异常LLPS凝聚体形成的机制不仅有助于理解染色质结构在基因表达调控中的角色，而且可能为开发新的治疗策略提供线索。例如，NUP98-HOXA9的LLPS有助于形成广泛的超级增强子（SE）样结合模式，从而促进白血病基因的转录激活4。此外，赵蔚团队之前的研究发现，HOXB8和FOSL1在染色质的SE位点形成的LLPS导致了骨肉瘤中转录的失调5。尽管LLPS在癌症中具有重要作用，但如何特异性破坏癌症中LLPS凝聚体仍有待探索。 研究团队通过基于相分离蛋白的筛选，发现了一种名为Nexturastat A的HDAC6抑制剂，该抑制剂能有效地抑制TNBC中磷酸化HDAC6凝聚体的形成。相比之下，另一种HDAC6抑制剂HPOB则未能达到相同的效果。实验表明，Nexturastat A通过降低磷酸化HDAC6的LLPS，从而抑制TNBC细胞的增殖、瘤球形成能力和侵袭性，同时促进细胞凋亡。Nexturastat A在体内显著抑制了TNBC的生长。此外，Nexturastat A显示出极低的非癌细胞毒性，表明其具有良好的安全性。 Nexturastat A能够显著改变HDAC6与其相互作用蛋白之间的互作，尤其是降低与14-3-3θ的结合，后者是已知的LLPS的潜在参与因子。Nexturastat A的处理还减少了磷酸化HDAC6与进出核运输蛋白Importin β的相互作用，这一过程依赖于HDAC6的S22位点。此外，研究还揭示了NUP153在磷酸化HDAC6进入细胞核过程中的关键作用。 随后，研究团队详细探讨了Nexturastat A对TNBC染色质结构的影响。通过Hi-C分析发现，Nexturastat A处理后，TNBC细胞的全基因组染色质相互作用发生了显著变化，特别是在开放和封闭染色质区域的重新分布。此外，Nexturastat A的治疗还促进了新的染色质环结构的形成，这些新环结构富含RNA聚合酶II（Pol II）特异性DNA结合和免疫系统过程通路，显示出Nexturastat A对染色质动态具有深远的影响。 通过对Nexturastat A处理的TNBC细胞进行RNA-seq和Pol II ChIP-seq分析，揭示了Nexturastat A处理主要导致染色质结构的变化和转录模式的重新编程，这体现在染色质的增加可及性和Pol II的增加结合。此外，通过ATAC-seq研究发现Nexturastat A处理能够促使肿瘤抑制基因的表达上调，原癌基因表达下调，并且激活了与免疫反应相关的基因。 最后，Nexturastat A通过改变HDAC6的结合模式和H3全乙酰化修饰，显著影响了染色质结构，尤其是在转录起始位点（TSS）周围。特别地，研究团队识别出一组基因显示HDAC6结合和H3全乙酰化的一致变化，这些基因主要富集在内质网应激和TP53信号通路中，包括肿瘤抑制基因ATF3。此外，ATF3敲减实验表明，ATF3是HDAC6的一个重要下游靶标，其敲减降低了细胞对Nexturastat A治疗的敏感性，影响了细胞的生存和侵袭能力。 综上，本研究揭示了磷酸化HDAC6在TNBC中的全新作用，特别是它在转录活跃区域形成的相分离凝聚体对染色质结构的影响。通过与14-3-3θ共凝聚，磷酸化HDAC6不仅改变了染色质的物理结构，还促进了特定的组蛋白乙酰化修饰和转录谱的重编程，从而推动了TNBC的恶性表型发展。这一发现不仅为我们提供了对TNBC中染色质动态复杂性的更深层理解，还可能指明了新的治疗策略，即通过调控磷酸化HDAC6来干预TNBC的染色质结构和细胞命运。 参考文献 1. Shi, Y., Jin, J., Ji, W. & Guan, X. Therapeutic landscape in mutational triple negative breast cancer. Mol Cancer 17, 99 (2018). 2. Garrido-Castro, A.C., Lin, N.U. & Polyak, K. Insights into Molecular Classifications of Triple-Negative Breast Cancer: Improving Patient Selection for Treatment. Cancer Discov 9, 176-198 (2019). 3. Derakhshan, F. & Reis-Filho, J.S. Pathogenesis of Triple-Negative Breast Cancer. Annu Rev Pathol 17, 181-204 (2022). 4. Ahn, J.H. et al. Phase separation drives aberrant chromatin looping and cancer development. Nature 595, 591-595 (2021). 5. Lu, B. et al. Pharmacological Inhibition of Core Regulatory Circuitry Liquid-liquid Phase Separation Suppresses Metastasis and Chemoresistance in Osteosarcoma. Adv Sci (Weinh) 8, e2101895 (2021). https://www.nature.com/articles/s43018-024-00816-y 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述