CD69

来源：同写意 在全球首款CAR-T细胞产品Kymriah上市刚好七年的今天，CAR系列疗法依然一刻不停地频繁变革。 光CAR-T就已更迭到第五代——通用型CAR-T，试图突破个体限制，实现规模化生产和治疗，使用BBIR CAR或SUPRA CAR等方式降低成本；CAR-NK，还在验证阶段，但已有创新者率先探索CAR-NKT的可行性；CAR-M，巨噬细胞也在近两年正式加入CAR疗法行列，有效性和安全性仍有待在临床治疗中验证。 在每个月好几场的行业大会中，上述疗法或多或少均有探讨，不算太新鲜。但实验室里悄悄发生的变化，正以更惊人的速度改变人类战胜癌症的征途。 7月30日，Nature Biotechnology的一篇论文描述，Dana-Farber癌症研究所的科学家们创造了一种CAR-Enhancer（简称CAR-E）疗法，可以根除肿瘤细胞并增强CAR-T细胞的记忆。该研究成果或将解决CAR-T疗法使用后癌症复发的问题。 具体作用机制是，通过增强CAR-T细胞的活跃度，延长在体内的持续时间，使它们能够保持战斗模式，直到所有肿瘤细胞都被消除（如果癌症复发，它们就重新发挥作用）。这种技术被命名为CAR-E，在一些患者来源的癌细胞系实验和其他研究中，CAR-E确实联合CAR-T成功根除了所有肿瘤细胞。 那么，这种CAR-E如何设计与开发？对CAR-T有怎样的作用？是否还有其他增强方案？下文将详细探讨。 1 CAR-E对CAR-T的作用 研究人员构建了一种融合蛋白，该融合蛋白由人BCMA蛋白胞外结构域与低亲和力突变人IL-2二聚体（称为“mutIL-2”）融合而成。 mutIL-2分子包含两个取代（H16A和F42A），可降低其对人IL-2Rβ的亲和力（3倍；K型D~610 nM）和IL-2Rα（CD25）（110倍；K型D~1200 nM）（见下图）。因此，BCMA-mutIL-2融合蛋白通过抗原与CAR特异性结合，优先将低亲和力的IL-2分子递送至CAR-T细胞表面，从而最大限度地减少对正常T细胞、调节性T细胞或全身毒性的影响。 图a CAR-E治疗平台示意图。左图：CAR-E的总体设计。右图：开发的BCMA-mutIL-2 CAR-E的结构。 图b BCMA-mutIL-2 CAR-E与BCMA CAR-T细胞结合，具有高特异性和亲和力。 为改善药代动力学和增强稳定性，研究者在抗原和mutIL-2分子之间整合了人免疫球蛋白G1（IgG1）的CH3结构域（大小约为14kDa）。 该研究中，研究者评估了BCMA CAR-E对BCMA CAR-T细胞的功能影响。 结果表明，CAR-T细胞上CD69的表达呈剂量依赖性和选择性增加，而对非转导的T细胞没有观察到影响。此外，与VHH-mutIL-2、BCMA-CH3或其组合相比，BCMA CAR-E处理导致CD69表达显著增加，这表明观察到的效果仅在低亲和力IL-2分子与抗原融合时才明显。 同时，BCMA CAR-E不抑制CAR-T细胞的杀伤效果。研究者在不同浓度的BCMA CAR-E存在下，使用CAR-T细胞和患者来源的BCMA OPM2癌细胞进行了杀伤试验。结果表明，即使在CAR-E的最高测试浓度（100 nM）下，也不会抑制杀伤效果。 综上，BCMA CAR-E通过顺式递送低亲和力IL-2对靶向CAR-T细胞产生影响，其作用由抗原与CAR结合介导。 紧接着，该研究通过MM异种移植小鼠模型，探究CAR-E治疗对CAR-T细胞体内持久性的影响。CAR-E治疗不仅增强了CAR-T细胞的持久性，而且还改善了肿瘤细胞的消除。 在接受BCMA CAR-T细胞治疗的患者中，复发仍然是一个主要问题。可以看到，这一研究将增强分子递送给CAR-T细胞，由BCMA胞外域与低亲和力IL-2融合的BCMA CAR-E增强了BCMA CAR-T细胞的活性和持久性。 CAR-E可以指导CAR-T细胞发育具有不同表型的记忆细胞，并不依靠肿瘤细胞的存在实现这一作用。CAR-E导致产生一系列不同的记忆亚型，包括干细胞记忆群体。这种多样性可能是观察到的CAR-T细胞长期持续存在的原因，这些CAR-T细胞在再刺激时保留了重新扩增的能力。CAR-E的这种能力可能归因于其作用机制，同时参与IL-2R和CAR（4-1BB–CD3ζ）内域。 该研究通过多种方式证明CAR-E选择性地增强了CAR-T细胞的功能和持久性。这种方法提供了一种现成的治疗选择，使得产业应用层面可以优化剂量和治疗计划。 2 引导变革的增强子 在该研究之前，解决复发问题的研究许多都集中在重新设计CAR-T细胞本身，例如引入或消除基因使细胞保持更长时间的活性，但仍未出现有效的临床证明。 Dana-Farber的研究员们没有试图改变CAR-T细胞的内部运作，而是开发了一种从外部起作用的方法——将一种分子输送到细胞面前，延长细胞的寿命并促使它们形成记忆。 实验发现，CAR-E疗法不仅能够促使CAR-T细胞增殖，而且能够产生具有不同特性的不同类型的CAR-T细胞。 “它不仅产生了大多数患者已经拥有的效应T细胞，而且还产生了干细胞样记忆T细胞，中央记忆T细胞，效应记忆T细胞——对癌症产生有效免疫反应所需的T细胞种类的完整库，”Dana-Farber的Mohammad Rashidian解释道，在骨髓瘤细胞的实验室培养和该疾病的动物模型中，CAR-E疗法实现了肿瘤细胞的完全清除。 研究者还发现，该疗法产生的长效CAR-T细胞可以通过重新给予CAR-E来重新刺激。这表明，CAR-T细胞治疗后复发的患者可以通过额外剂量的CAR-E治疗得到有效治疗。 此外，CAR-E还提出了一种可能性，即患者可以用比目前更少的CAR-T细胞数量进行治疗。目前，使CAR-T细胞繁殖成数亿个的做法，往往耗时、昂贵，需要大量资源，且患者需要等待数周才能接受细胞注射。大剂量往往容易造成CAR-T细胞疗法最常见的副作用之一——细胞因子释放综合征，过度激进的免疫反应会导致发烧、恶心、心跳加快、神经系统问题或其他问题。 Rashidian博士认为，使用CAR-E，可以完全跳过CAR-T细胞扩增过程，简单地制造CAR-T细胞并将其注入患者体内，然后用CAR-E治疗。 目前，CAR-E疗法临床试验的首要目标，是确保安全性并确定最佳剂量和给药时间周期。最初，他们预计CAR-E治疗将在患者输注CAR-T细胞后大约一个月开始，每周一次，持续三到四周。 可以看出，这种疗法的一个好处是，可以轻松地整合到目前已接受CAR-T细胞疗法的患者的护理中，对于解决CAR-T细胞耗竭问题也是一种解决方案。或许我们能尽快在临床试验中看见CAR-E的身影。 3 增强CAR-T的6种策略 在CAR-E出现之前，增强CAR-T效果一直是科研界的热门话题。公认的策略是将CAR-T细胞与其他现有疗法相结合，开发能增强CAR-T疗效、减轻毒性、扩大治疗范围的联合疗法。 被誉为“CAR-T之父”的Carl June，今年7月25日在Cancer Cell发布了一篇综述，详细介绍了在临床试验阶段的CAR-T联合治疗策略。其中增强CAR-T疗效的联用方案如下： 01 靶向免疫检查点的抗体 将免疫检查点抑制剂（ICI）与CAR-T疗法结合，提高TME内CAR-T细胞的寿命和功效。目前，在B细胞淋巴瘤等血液癌中，CAR-T细胞与ICI联合的临床试验展现了高反应率和可控的毒性水平。但应用时机对于治疗效果来说至关重要，有试验表明，在CAR-T细胞输注前启动抗PD-L1抗体疗法，整体的治疗效果不佳。 02 肿瘤靶向抗体及BiTE 这一策略的核心思路在于双靶向或多靶向，意图将靶向CD20（或CD3/CD20）的抗体与靶向CD19/BCMA的获批CAR-T产品相结合，有效地根除肿瘤细胞并降低抗原逃逸风险。目前，利妥昔单抗与CAR-T联合使用的多项临床实验正在开展，展现出初步的良好结果。 03 小分子药物 已有小分子药物获批用于治疗血液癌症和实体瘤，其中一些与CAR-T联合使用的临床试验正在进行中。比如，伊布替尼与CAR-T联合使用的临床试验初步结果表明，这种联合方法对TP53突变的慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者收益明显。靶向蛋白质降解剂来那度胺（lenalidomide）和CAR-T的联合疗法在最近的临床试验中显示，治疗多发性骨髓瘤的耐受性良好，总体反应率达到100%。 04 癌症疫苗 癌症疫苗可以激活免疫系统以对抗癌细胞，在与CAR-T联用时，有可能增强CAR-T细胞的活化、增殖和持久性。在最近的一项I/II期临床试验中，利用RNA疫苗增强CAR-T细胞的策略展现出良好的初步结果——21名实体瘤患者的疾病控制率为67%，表现出使用癌症疫苗增强CAR-T细胞持久性的潜力。 05 溶瘤病毒 溶瘤病毒能够在肿瘤细胞中选择性复制，同时保留健康细胞。将溶瘤病毒与CAR-T联合使用时，临床前研究已经显示出克服肿瘤免疫抑制的潜力。目前，临床试验正在评估这种组合方法在实体瘤中的疗效。 06 放射性疗法 放射性治疗广泛适用于不同类型的肿瘤、非侵入性以及消除肿瘤细胞。在一项针对复发性或难治性弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的CAR-T疗法II期临床试验中，在CAR-T细胞治疗之前接受放疗的患者实现了100%的反应率。这一结果表明，放射性治疗可以作为CAR-T治疗前的减瘤和桥接方案，以及复发后治疗的选择。 此外，该论文还介绍了细胞因子在增强CAR-T疗效中的潜力。CAR-T细胞经过改造可以表达细胞因子，提高疗效和持久性。分泌IL-12、IL-15、IL-18、IL-21等细胞因子的CAR-T细胞临床试验目前已在进行中。 然而，上述这些联用方案和本文开头介绍的CAR-E增强子方案，都还需要进一步探索如何降低毒性，并找到最佳的给药方案。 参考资料： 1.A Novel Way to Prevent Relapse After CAR-T Therapy to Treat Cancer；Cancer Health 2.Rakhshandehroo, T., Mantri, S.R., Moravej, H. et al. A CAR enhancer increases the activity and persistence of CAR T cells. Nat Biotechnol (2024).  3.Ugur Uslu et al., CAR T cell combination therapies to treat cancer. Cancer Cell (2024).

摘要：近几十年来，疫苗一直是预防病原体传播和癌症的非凡资源。即使它们可以由单一抗原形成，但添加一个或多个佐剂是增强免疫信号对抗原反应的关键，从而加速并增加保护效果的持续时间和效力。它们的使用对于脆弱人群，如老年人或免疫功能低下的人尤其重要。尽管佐剂非常重要，但只是在过去的四十年里，对新型佐剂的寻找才有所增加，发现了新的免疫增强剂和免疫调节剂类别。由于涉及免疫信号激活的级联反应的复杂性，它们的作用机制仍然不甚了解，即使得益于重组技术和代谢组学，最近已经取得了显著的发现。本综述着重于研究中的佐剂类别、近期作用机制研究，以及纳米输送系统和可以化学操纵以创造新型小分子佐剂的新型佐剂类别。 1.引言 佐剂——根据该词的拉丁语词源（adjuvare，意为“帮助”）——被定义为添加到疫苗中以增强免疫系统对抗原的反应并延长其持续时间的物质。在疫苗开发中使用佐剂利用了这些物质可以提供的许多好处，例如减少每次接种剂量所需的抗原量和加强接种的频率，或通过延长其半衰期改善抗原成分的稳定性，从而增强其免疫原性。佐剂可以根据其作用机制、化学性质或来源（合成、天然、内源性）进行分类。佐剂超级家族包括许多不同的物质，特别是能够激活或增强免疫信号或传递系统的小分子或大分子。免疫增强剂是能够在成人或脆弱人群中激活免疫信号的化合物；其中包括模式识别受体（PRRs）的激动剂，如RIG-I样受体（RLR）、干扰素基因（STING）、Toll样受体（TLR）和NOD样受体（NLRs）。传递系统是能够改善和延长疫苗保护的佐剂，如乳液和纳米制剂，类似于脂质体、病毒样颗粒和病毒体。根据所需的免疫反应类型，抗原应与适当的佐剂或佐剂组合正确配制，以获得尽可能少的副作用的最佳反应。到目前为止，已经开发出适当的配方，特别是通过结合不同的佐剂家族，尤其是铝盐与脂质体或乳液。确定适当的佐剂组合可能极为重要，目前许多临床研究正在进行中，以研究它们在不同病理情况下的疗效，特别是在癌症方面。由于佐剂的应用范围从病原体到过敏、自身免疫性疾病和癌症，需要正确理解关键机制，以便只针对特定途径，避免潜在的毒性。即使疫苗试验遵循严格的指导方针，多年来也出现了许多关于其安全性的担忧，特别是在COVID-19疫苗接种活动期间。疫苗的潜在毒性有时归因于所含佐剂。最近还对最成熟和最安全的佐剂，如铝衍生物的潜在毒性表示担忧。即使铝含量在许可的佐剂中每剂从0.8到0.125毫克不等，但近年来出现了关于神经毒性和自闭症的担忧。相比之下，其他研究表明铝的神经毒性是在长期服用后发生的，监管机构将铝在食品中的可容忍周摄入量（TWI）限制在每公斤体重1毫克。有趣的是，有时佐剂由脂质构成，如纳米制剂的脂质体，或其他内源性无风险大分子。EMA和FDA已经批准了47种疫苗，但这些制剂中包含的大多数佐剂是最早的铝佐剂类成员，或脂质体制剂。这种选择可能是由于这些佐剂类的已知耐受性，以及寻找新化合物的相关成本。事实上，近年来发现了不同类别的小分子免疫增强剂；然而，与药物一样，这些化合物需要适当的、耗时的临床前和临床试验来评估它们的疗效和安全性。在最近和最有趣的类别中，报告了几种PRR激动剂，对成人群体具有有希望的结果。最近的研究表明，能够通过线粒体应激途径激活免疫反应的小分子具有通过PRR途径激活免疫反应的效力。本综述着重于作用机制，开发的佐剂类别，特别强调可以针对的新的途径，以创建新的佐剂。 2.佐剂作用机制 尽管佐剂通常用于数十亿剂疫苗的配方中，但其作用机制仍然不甚了解。因此，深入理解作用方式和参与免疫系统对病原体反应的免疫机制是开发新佐剂的关键步骤。最近，人们非常关注更深入地理解疫苗佐剂如何刺激免疫反应。由于最近在免疫学研究方面的进展，已经有可能阐明佐剂作用的一些机制，如储存效应和细胞因子和趋化因子的释放，免疫细胞在注射部位的动员，适应性免疫反应的诱导，增加抗原免疫原性，以及抗原呈递细胞（APCs）的激活。阐明佐剂发挥作用的所有机制将提供关于自适应免疫如何由先天免疫促进的关键信息，并有助于开发新的强效疫苗。可以使用广泛因素对佐剂进行分类，包括它们的物理化学特性、起源和作用模式；最受欢迎的分类方案将疫苗佐剂分为两组，传递系统和免疫刺激剂。另一类佐剂由粘膜佐剂组成，可以作为传递载体或免疫刺激化合物，如壳聚糖及其衍生物（N-三甲基和单-N-羧甲基壳聚糖）、霍乱毒素（CT）和热敏肠毒素（LTK3和LTR72）。表1中报告了新的传递系统佐剂。传统上，传递载体仅作为免疫刺激佐剂的储存库，以激活先天免疫系统的细胞。由于现在有证据表明一些传递机制可以激活先天免疫，这种分类不再准确。事实上，传递载体佐剂既作为抗原载体，又通过激活先天免疫系统引起局部促炎反应，导致免疫细胞被招募到注射部位。抗原-佐剂复合物通过作为病原体相关分子模式（PAMPs）激活模式识别受体（PRR）途径。这些现象导致先天免疫细胞的激活，导致细胞因子和趋化因子的释放，这是免疫增强剂佐剂利用的相同作用模式。免疫佐剂（表1）是通过直接刺激先天免疫系统来增强抗体产生的免疫增强剂化合物。此外，作为免疫调节剂的佐剂可以刺激特定类型的细胞因子的产生，从而增强免疫系统的反应。例如，铝盐、弗氏佐剂和CpG寡脱氧核苷酸已被报道能够诱导产生和释放一些参与调节先天和适应性免疫的细胞因子，如干扰素（IFNs）、干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素（IL2和IL12）。已有几种细胞因子被报道作为免疫增强剂佐剂，刺激抗原特异性血清/粘膜抗体和细胞介导的免疫。在这类物质中，最知名的细胞因子佐剂是粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、IFN、趋化因子和一些白细胞介素（IL-1, IL-2, IL-12-IL-15, IL-18）[15]。此外，免疫刺激剂对于招募免疫细胞（如巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞（DCs））、激活APCs以及疫苗在注射部位的长期积累非常有用。最近的研究将Toll样受体（TLR）与自身免疫系统联系起来，发现了TLR激活先天免疫系统导致适应性免疫和炎症反应诱导的机制，确保了持久保护。 佐剂可以作为传递系统，捕获、吸附或聚集抗原，并随时间缓慢释放它们。这种被称为"贮存效应"（图1a）的机制发生在注射部位，佐剂通过防止由于肝脏清除导致的抗原移除，增强了疫苗的半衰期，并确保了免疫系统的持续刺激，从而产生高抗体滴度。多年来，许多通过贮存效应发挥作用的佐剂被描述出来，如脂质体、乳液（油包水和水包油）、病毒体，以及脂质或聚合物纳米颗粒（NPs）。其中一些已被开发来模拟病原体膜，以运输、保存和释放抗原，并同时增强其免疫原性功能。几种类型的脂质体，如传统的脂质体、多层囊泡（MLVs）或固体核心脂质体，也通过促进贮存效应发挥作用。油包水乳液，如完全弗氏佐剂（CFA），以及一些NPs也通过确保持久免疫反应的贮存效应发挥作用。 图1. (a) 贮存效应及细胞因子和趋化因子的募集。(b) 免疫细胞的募集和炎症体的激活。 颗粒佐剂可以通过利用几种机制诱导免疫反应，例如上调细胞因子和趋化因子的释放，诱导注射部位的炎症状态，激活炎症级联反应，并招募先天免疫细胞。例如，油包水（o/w）乳液MF59和AS03刺激免疫细胞（中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞）的募集，这些细胞将抗原和佐剂运输到更接近的淋巴结。免疫细胞在注射部位的募集诱导半胱氨酸蛋白酶的激活，导致进一步释放趋化因子（IL-18、IL-33、IL-1β），吸引其他树突细胞并延长这一现象（图1b）。此外，MF59和AS03在注射部位增加了CCR2、白细胞募集趋化因子（例如CCL2、CCL3和CCL5）以及集落刺激因子3（CSF3）的表达。同样，明矾在注射后诱导局部促炎微环境，引发补体级联反应，导致从血液流中招募免疫细胞。炎症体是先天免疫系统的重要组成部分。它们是针对病原体的有效免疫反应所必需的。当炎症体被激活时，细胞分泌促炎细胞因子，如IL-18、IL-33和IL-1β，这些细胞因子增强适应性免疫反应（图1b）。炎症体是由工作成分组成的细胞质蛋白信号通路，如富含亮氨酸的重复（LRR）C末端或DNA结合域（HIN200）、caspase-1效应物和适配蛋白ASC，这些蛋白激活炎症caspases。粒细胞、T细胞和B细胞、单核细胞、肝细胞、神经元、小胶质细胞和朗格汉斯细胞都表达炎症体，负责识别病原体并启动先天免疫反应。当炎症体被激活时，它蛋白水解裂解前caspase 1，释放活性形式，将前IL-1β和前IL-18转化为活性物种。ILs从细胞释放后，启动炎症并诱导保护免受病原体侵害的免疫反应。此外，IL-18激活淋巴细胞并刺激T细胞和B细胞的增殖，自然杀伤细胞（NKs）的活性，以及IFN-γ、TNF、IL-1和IL-2的分泌。因此，作为炎症体激活剂的佐剂是增强和维持免疫反应强度的成功策略。这些佐剂通过类似的机制激活炎症体，包括溶酶体降解、cathepsin释放和活性氧（ROS）的形成。在炎症体激活剂中，可以找到如铝盐、壳聚糖、皂素、鞭毛蛋白和合成阳离子聚合物等佐剂。铝盐诱导溶酶体损伤，诱导参与炎症体形成的cathepsin B的产生，特别是NOD样受体蛋白3（NLRP3）；活性炎症体触发caspase-1并刺激细胞因子的释放。壳聚糖和由合成阳离子聚合物制成的纳米颗粒激活NLRP3炎症体，并增强多种白细胞介素（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A和TNF）、IFN和IgG滴度的分泌，增强细胞和体液免疫反应。 佐剂可以通过一系列机制增强疫苗的免疫反应，如贮存效应和刺激先天免疫。先天免疫代表了针对病原体的第一道防线。事实上，早期识别病原体是发展适应性免疫反应的关键步骤。佐剂可以通过激活细胞模式识别受体（PRRs），识别PAMPs和损伤相关分子模式（DAMPs），刺激抗原呈递细胞（APCs）。由于在先天免疫系统中的中心作用，PRRs代表了新佐剂的战略目标。在PRRs超家族中，区分为表面和内体受体的Toll样受体（TLRs）是很有前途的佐剂目标，因为它们可以诱导信号通路，从而诱导关键转录因子的产生，如核因子-B（NF-B）。佐剂也可以用于靶向内体PRRs，如寡聚化结构域样受体（NLRs）和视黄酸诱导基因I样受体（RLRs）（图2a）。定位与它们的性质密切相关；事实上，血浆TLR识别病原体蛋白和脂质，而内体受体则由核酸激活。TLR通过MyD88途径诱导NF-kB，导致促炎细胞因子的释放。基于TLR的佐剂复制了感染期间产生的PAMPs，因此可以非常有效地对抗通常诱导PRRs的病原体或疾病。尽管PRR激动剂具有出色的免疫刺激性效果，但它们作为疫苗佐剂的使用受到高制造成本的限制，这代表了未来临床应用的限制。APCs，如树突细胞（DCs），表达各种PRRs，使它们能够识别多种病原体成分。当PRRs被PAMPs激活时，它们启动复杂的信号级联反应，导致细胞因子和趋化因子的产生，包括干扰素（IFNs），增强抗原呈递能力，以及DCs向淋巴组织的迁移，在那里它们与T细胞和B淋巴细胞相互作用，启动和塑造适应性免疫反应。成熟的DCs也可以刺激naive CD4+ T细胞分化为不同的T辅助（Th）亚群（例如，Th1和Th2细胞），帮助B细胞产生抗体。几种细胞因子调节Th细胞分化；例如，如IL-12、IL-15和IL-27等细胞因子调节naive CD4+ T淋巴细胞向Th1细胞的发展。总之，Th1细胞主要响应于细胞内病原体，如病毒和一些细菌，而Th2细胞主要响应于大型细胞外寄生虫。DCs还能够刺激naive细胞毒性CD8+ T细胞成为活化的CD8+ T细胞。这种现象称为“交叉呈递”，对于诱导针对外源性抗原的强大和持久的细胞免疫，以及有效预防病毒疾病和癌症是必要的。目前尚不清楚外源性抗原是如何在DCs中处理并呈现给MHCI上的CD8+ T淋巴细胞的；然而，已经提出了两种不同的机制。在细胞质途径中，抗原通过内体囊泡进入细胞质，并被蛋白酶体降解。在囊泡途径中，抗原在溶酶体隔室中被降解，独立于蛋白酶体活性。铝、皂素和TLR佐剂可以利用这种机制。 图2. (a) 表面和内体 TLR 激活。(b) 增强抗原呈递。由主要组织相容性复合物（MHC）在抗原呈递细胞（APCs）上呈递的抗原，是激活适应性免疫的关键步骤。许多佐剂，如明矾、乳液和纳米颗粒（NPs），被认为通过"靶向"抗原到APCs，增强MHC的抗原呈递功能。迄今为止，尚不清楚佐剂增加抗原呈递的机制是否有助于适应性免疫系统的发展。例如，明矾已被证明可以增强树突细胞对抗原的摄取，以及延长抗原呈递的持续时间。抗原大小似乎在调节抗原呈递效率方面很重要。在早期内体/吞噬体中发现了大的脂质囊泡，它们增加了抗原呈递，而在晚期溶酶体中发现了较小的囊泡，它们减少了抗原呈递。 3.佐剂类型  3.1.铝盐  基于铝的佐剂（ABA）最早发现于1926年，目前是全球疫苗中最常用的佐剂。最初使用的铝佐剂是硫酸铝钾，通常称为"明矾"，通过将抗原溶液和佐剂与碱直接沉淀制备而成（明矾沉淀疫苗）。今天，抗原被吸附到预先形成的铝盐凝胶上（直接吸附），在商业制剂的标准化和可重复性方面提供了更多的优势。目前，传统使用的明矾几乎完全被类氢氧化铝（Alhydrogel?，Croda，丹麦Frederikssund）和非晶磷酸铝（AdjuPhos?，Croda，丹麦Frederikssund）所取代。两种新型佐剂是硫酸铝羟磷酸盐（AAHS），目前用于某些人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗的配方和Imject? Alum（Pierce，Rockford，美国），由非晶碳酸铝和结晶氧化镁组成。在人类疫苗接种中，ABA主要用于针对破伤风、白喉、百日咳、脊髓灰质炎、甲型和乙型肝炎以及人类乳头瘤病毒（HPV）的疫苗。FDA批准的含有ABA的人类疫苗列表见表2。ABA也在兽医疫苗中广泛应用，用于预防细菌、病毒和寄生虫感染。 尽管使用历史悠久，但关于ABA（铝盐佐剂）免疫刺激特性背后的机制仍需进一步阐明。最初，ABA的佐剂特性首先归因于"贮存效应"。根据这一假设，抗原颗粒从不溶性盐颗粒中缓慢释放到体内，随着时间的推移，允许抗原对免疫系统的长期暴露和强化的免疫刺激，从而产生更高的抗体滴度。然而，最近的发现挑战了这一理论，证明抗原在接种部位的保留并不是免疫反应所必需的，而是接种部位炎症的程度才是佐剂效应的解释。因此，除了作为缓释系统外，ABA对免疫刺激还有其他主要影响，如先天免疫细胞的募集和激活、炎症介质的释放以及通过诱导Th2细胞激活适应性免疫。 给药后，先天炎症细胞，如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞（DC）和单核细胞，被招募到注射部位。尽管许多免疫佐剂的活性基于Toll样受体（TLR）信号，但铝盐显然不引起基于TLR的反应。与在细胞损伤后释放到细胞质中的不溶性单体尿酸钠（MSU）晶体的尿酸类似，已经显示ABA的颗粒性质促进了巨噬细胞的吞噬作用和APCs中抗原的摄取。此外，ABA的细胞毒性诱导了热休克蛋白（如hsp70）和其他DAMPs（如MSU形式的尿酸）的分泌。NLR家族含吡啉结构域3（NLRP3）是核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体家族（NLR）的成员，是一种细胞质模式识别受体（PRR），在调节先天免疫信号中起着至关重要的作用。NLRP3通过钾离子外流激活，作为膜完整性的感应器。当被ATP、石棉、硅石、铝佐剂或MSU等刺激触发时，NLRP3与适配蛋白凋亡相关斑点蛋白含有CARD（ASC）和非活性前caspase-1结合形成NLRP3炎症体多聚体复合物。前caspase-1的自蛋白解剪切为活性caspase-1，将促炎细胞因子前体pro-IL-1β、pro-IL-18和pro-IL-33裂解为它们的活性和分泌形式。有假设认为，铝盐可能通过直接方式激活NLRP3炎症体，通过吞噬溶酶体损伤和随后的cathepsin B释放，或者通过MSU的间接释放。除了NLRP3介导的炎症外，哨兵细胞极化为活跃的巨噬细胞和APCs，增加了吞噬体活性氧物种（ROS）的产生，吞噬体酸化干扰和通过低氧诱导转录因子-1α（HIF-1α）的细胞代谢重编程，是最近揭示的对ABA免疫刺激特性有贡献的其他机制（图3）。 图 3. 基于铝的佐剂（ABA）的效果。 哨兵细胞激活为抗原呈递细胞（APCs）对适应性反应至关重要，从而将先天免疫与适应性免疫联系起来。ABA通过主要组织相容性复合体II类（MHCII）分子增加活化树突细胞上的抗原呈递。MHCII抗原呈递位点激活CD4+ T细胞，这些细胞分化并激活B细胞，进而主要产生IgG，推动体液免疫。铝盐优先增强抗体介导的免疫反应，通过TFH细胞和IL-4信号，结果产生IgG1并诱导Th2细胞分化，这些细胞通过IgE推动嗜酸性粒细胞炎症反应。与强烈的Th2反应相比，明矾对需要Th1细胞介导保护的感染效果较差。在小鼠研究中，已证明明矾间接抑制Th1反应，原因是IL-4激活。通过Th1反应产生的淋巴因子是补体固定IgG2a抗体的基本诱导因子，因此是巨噬细胞的刺激因子。此外，先天免疫系统的细胞可以发展适应性特性（“训练免疫”），并且铝佐剂可能涉及训练免疫的诱导。然而，NLRP3炎症体和caspase-1在抗体反应诱导中的作用仍然存在争议。经过近一个世纪的使用，铝盐仍然是疫苗佐剂的里程碑，因为它们具有确立的安全性和有效性记录。ABA非常耐受，并且仅报告了一些轻微的局部反应，如注射部位疼痛、肿胀、红斑，以及罕见的肉芽肿和过敏反应，这些反映了它们通过炎症体激活、促炎介质、吞噬细胞积累和抗体产生的作用模式。在一些免疫接种对象中还描述了接触性皮炎的罕见病例，注射后头痛、关节痛和肌痛以及持续性肿胀。有关铝佐剂长期毒性的辩论引起了广泛关注，包括如阿尔茨海默病（AD）、慢性自身免疫和多发性硬化症等影响。由佐剂引起的自身免疫综合征（ASIA）指的是一组不良效应，包括海湾战争综合征、巨噬细胞性肌筋膜炎、硅肺症和与佐剂暴露相关的接种后现象。此外，由于铝离子在AD的发病机制中被牵连，人们对ABA的生物持久性和潜在神经毒性提出了担忧，但这种相关性从未被证明。尽管需要进一步的知识来更新和确认ABA的安全概况，但作为佐剂的铝盐的风险-效益概况仍然极其积极，并确认它们作为疫苗佐剂的黄金标准。 3.2.STING激动剂佐剂 环状GMP-AMP合酶/干扰素基因刺激因子（cGAS/STING）途径是先天免疫系统胞质模式识别受体（PRRs）网络的一部分，监测细胞质以感知危险刺激。途径的刺激激活下游的核因子-κB（NF-κB）和干扰素调节因子3（IRF3），增加I型干扰素（IFN-1）和其他促炎细胞因子的转录，从而增强抗原呈递和免疫反应。cGAS/STING在免疫调节中的关键作用使其成为免疫疗法的重要靶点，特别是与癌症相关的，并且是使用STING激动剂作为有前途的疫苗佐剂的理由。STING激动剂（图4）主要在肿瘤学和病毒学中应用，包括环状二核苷酸（CDNs）、非核苷小分子（NCDNs）、胞质双链DNA（dsDNA）、锰离子、可电离脂质和聚合物。如20,3-环状鸟苷酸-腺苷酸（cGAMP）、环状二聚鸟苷酸（c-di-GMP）或环状二聚腺苷酸（c-di-AMP）等环状二核苷酸是途径的天然激动剂，但它们由于高极性和由于外切核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶（ENPP1）酶降解导致的短半衰期，其药代动力学（PK）特性较差，大大限制了它们的使用。为了改善环状二核苷酸的PK特性，已经测试了如ADU-S100的磷酸衍生物，ENPP1抑制剂也是一个有前途的新策略。为了选择活性更好的候选物，寻找模仿CDNs和STING结合构象的刚性类似物的研究导致了一类新的激动剂，即大环桥接刺激剂（MBS），如E7766。为了克服环状二核苷酸的PK限制，研究还集中在NCDNs上，如黄酮类5,6-二甲基黄酮-4-乙酸（DMXAA）和α-芒果苷，以及二聚酰胺苯并咪唑（diABZI）衍生物，这些在肿瘤免疫疗法和针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）方面取得了有希望的结果。 图 4. 小分子STING激动剂的二维结构 作为触发STING途径的一种方式，诱导细胞质双链DNA (dsDNA) 释放的策略也被采用，例如使用放疗、基于明矾的佐剂，以及化疗药物，如顺铂或多柔比星。无机锰被发现能激活cGAS，并通过增强第二信使cGAMP的产生，充当STING的间接激动剂。在其他激动剂类别中，我们列举了聚合物，如壳聚糖或PC7A，以及基于纳米粒子的可电离脂质。目前在临床试验中的STING激动剂总结在表3中。 cGAS/STING信号的触发因素是细胞质dsDNA，这是细胞损伤的重要标志。因此，cGAS作为直接的DNA受体，催化dsDNA转化为第二信使cGAMP，这诱导了STING的激活和寡聚化。STING寡聚体激活TANK结合激酶1 (TBK1)，它招募IRF3并通过NF-κB诱导I型干扰素刺激基因的转录。下游自噬的诱导和NLRP3炎症体的激活增加了病原体清除，并在自身免疫和炎症性疾病、衰老以及与肿瘤相关的炎症中具有重要意义。STING激动剂通常与环状二核苷酸有关，如cGAMP、c-di-GMP和c-di-AMP，它们作为各种微生物的代谢产物被发现。 STING途径的激动剂能直接诱导树突细胞的成熟和MHCII分子的上调，增加抗原呈递、T细胞的启动，并通过炎症细胞因子间接促进前述效应。STING激动剂还增强适应性免疫反应，通过IgG1和IgG2的产生、脾脏生发中心的诱导以及记忆B细胞的刺激来增强体液免疫。此外，I型干扰素诱导CD4 T细胞分化为Th1和TFH细胞，显著帮助B细胞的启动，也促进CD8 T细胞的激活和增殖，这对抗击耐药肿瘤细胞很重要。通过STING刺激协调的多种免疫反应使得这一途径成为免疫疗法的一个有吸引力的靶点。尽管cGAS/STING的急性激活无疑对病原体和癌细胞有益处，但慢性激活可能导致由IFN驱动的系统性炎症，引发细胞因子风暴（细胞因子释放综合征），类似于败血症。除了可能诱发系统性炎症反应外，STING过度刺激引起的其他主要问题包括缺乏细胞和组织特异性以及淋巴细胞毒性。这些前提，加上具有挑战性的药代动力学特性，使得STING激动剂的全身给药情况复杂化，它们通常在肿瘤内给药。使用药物载体技术，如纳米粒子、基于脂质的载体和抗体至关重要，以实现更选择性的靶向，结合改善的传递和功效。尽管它们的药代动力学具有挑战性，且全身使用的疗效指数较窄，STING激动剂代表了一个非常有前途的佐剂类别，需要优化它们的制剂以进一步提高其佐剂性。 3.3.TLR配体 3.3.1.Toll样受体 市场上的大多数疫苗主要由单一佐剂组成，但通常保护性免疫反应并未达到有效使用疫苗的标准。因此，显著的Toll样受体（TLR）是先天免疫的关键组成部分，提供防御性炎症反应以抵御入侵的病原体。人类TLR包括10个成员（TLR1-10），可以跨越细胞表面（TLR1、2、4、5、6、10）或定位在内质网膜（TLR3、7、8、9）上，并参与不同PAMPs（表4）的识别。PAMPs的结合诱导TLR同二聚体（TLR3、4、5、7、8、9）或异二聚体（TLR1/2或TLR2/6）的形成，将两个toll/IL-1受体（TIR）结构域聚集在一起，允许适配蛋白MyD88（髓样分化初级反应-88）与复合物结合。TLR3是唯一结合不同适配蛋白的受体，即含有TIR结构域的适配蛋白-诱导干扰素-β（TRIF）蛋白。与其他TLR不同，TLR4信号可以通过涉及MyD88信号适配蛋白或TRIF的两条独立途径进行。一旦激活，TLR将增加免疫细胞的迁移并引发适应性免疫反应。 由于TLRs作为免疫增强剂，它们的激动剂可以用作疫苗佐剂。疫苗产生的免疫反应类型取决于由特定TLR及其适配蛋白激活的信号通路。虽然大多数TLR途径导致Th1免疫反应，TLR2诱导Th0、Th1或Th2反应，TLR3激活NF-κB途径。表1总结了疫苗配方中使用的几种TLR激动剂，TLR激动剂的结构报告在图5中，临床试验中的TLR激动剂在表5中。 3.3.2.TLR2激动剂 TLR2可以识别许多PAMPs，因为它们可以与TLR1和TLR6形成异二聚体。L-pampo是由PAM3CSK4（PAM3）、TLR1/2、聚(I:C)和TLR3构成的复杂系统，是一种有效的佐剂。它在乙型肝炎病毒（HBV）疫苗中使用，诱导细胞介导的免疫反应，增加CD4+ T细胞水平。目前，它正在作为使用RBD（受体结合域）、S1抗原和RBD-Fc作为病毒抗原的SARS-CoV-2疫苗的佐剂进行研究，已被证明能引发强烈的体液和细胞免疫反应。 TLR2识别细菌脂蛋白，因此，由细菌LPS衍生的合成脂肽作为疫苗佐剂被开发出来。MALP2（巨噬细胞激活脂肽2，图5）来源于支原体发酵，利用TLR2-MyD88信号通路激活免疫细胞。PAM2CSK4和PAM3CSK4是两种作为疫苗佐剂评估的TLR2激动剂，用于对抗利什曼病、疟疾和流感。由于它们的尺寸、化学复杂性和疏水性，TLR2激动剂通常不用于疫苗开发，即使在固相自动肽合成研究可以帮助发现新的更简单的衍生物。 图5.小分子Toll样受体激动剂的2D结构。TLR2激动剂（紫罗兰色上部） 面板）、TLR4 激动剂（青色，中间面板）、TLR 7/8 激动剂（绿色，下面板）。 3.3.3.TLR3激动剂 TLR3是内体受体，能够检测病毒dsRNA。聚(I:C)是一种结构类似于病毒RNA的佐剂。它能够诱导IFN-I和IFN-III的产生，并刺激Th1细胞因子反应。MVS途径（RIG-1和/或MDA5）的激活会导致人类毒性，因此开发了新的聚(I:C)衍生物，聚(ICLC)和聚(IC12U)。 聚(ICLC)是一种聚-L-赖氨酸羧甲基纤维素，能刺激干扰素的产生。它诱导炎症体和补体系统的表达，并在针对恶性疟原虫、HIV和癌症的疫苗候选中使用，显示出引发Th1反应的强能力。由于这种佐剂的高度免疫刺激性和对血清核酸酶的高抗性，设计了聚(IC12U)。这种新物质显示了尿嘧啶和鸟嘌呤残基的错配，导致毒性较低（不与MDA5结合），以及IFN-I的产生减少。 3.3.4. TLR4激动剂 TLR4通过MD-2（髓样分化因子-2）和CD14识别细菌脂多糖。LPS的免疫刺激性活性是由于脂质A区域，并且脂肪酸链的变化反映了不同的生物活性。Eritoran是一种TLR4-MD2激动剂。它是一种由脂质A衍生的合成物，其特点是含有四个脂质链，其中一个含有顺式双键。3-O-去酰基-40'-单磷酸脂质A（MPLA，图5）和葡萄糖基脂质A（GLA）表现出低致热性和强免疫增强特性。LeIF（利什曼原虫真核起始因子）和neoseptins（合成肽模拟化合物，图5）是两种非糖脂配体，它们不像LPS，但能够像天然配体一样激活TLR4。在THP-1细胞中筛选激活NF-κB途径的小分子化合物，发现了一种属于吡啶并吲哚类的特定TLR4激动剂（1Z105，图5）。1Z105被确定为安全的TLR4激动剂，其他研究目前正在进行中。TLR4可以激活一个强大的TRIF介导的细胞反应，其特征是多能CD8+/CD4+ T细胞的存在和对癌症和传染病的CTL活性增强。 3.3.5.TLR5激动剂 TLR5由多种免疫细胞表达，参与细菌鞭毛蛋白的识别。配体与TLR5的结合诱导炎症途径的激活，释放包括TNFα、IL-1β、IL-6和一氧化氮在内的炎症介质，引发Th1和Th2反应。当与抗原一起给予时，鞭毛蛋白诱导粘膜免疫反应，这对于保护免受呼吸和胃肠道感染至关重要。鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白已与PR8流感病毒（IPR8）、HA（H5N1）或禽流感病毒（AIV）H5N1抗原配方，证明它能引发强烈的免疫反应，包括IgA的产生。对鞭毛蛋白的修改导致了嵌合鞭毛蛋白或活细菌中的鞭毛蛋白抗原复合物，如结核分枝杆菌、霍乱弧菌、化脓性链球菌、单核细胞增生李斯特菌、肠毒素大肠杆菌（ETEC）等，并在动物模型中使用。三种使用鞭毛蛋白作为佐剂的疫苗正在进行临床试验阶段，其中两种针对流感病毒，一种针对鼠疫耶尔森菌。 3.3.6.TLR7/8激动剂 TLR7/8能够诱导Th1免疫反应，并产生高水平的I型干扰素、IL-12、TNF-α和IL-1β。TLR7/8和TLR9激动剂能够激活并促进cDCs（常规树突细胞）和浆细胞样树突细胞（pDCs）的克隆扩展，动员CD14+ CD16+炎症单核细胞和CD14dimCD16+巡逻单核细胞。Imiquimod（R837，图5）目前已获批准并用于治疗生殖器疣、表浅基底细胞癌和日光角化病。另一种异喹啉衍生物resiquimod（R848）具有抗病毒和抗癌治疗用途，正在评估用于黑色素瘤治疗。已经开发了不同的结构相关的oxoadenine化合物，尽管需要其他临床前研究来证明它们的疗效。CL075是一种结构相关的杂环化合物，具有融合的喹啉-噻唑环。 3.3.7.TLR9激动剂 TLR9识别细菌DNA基序胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）二核苷酸，通过MyD88途径激活免疫系统。CpG是已被修改以防止蛋白酶降解并用作佐剂的分子基序。CpG-CDNs能在自然杀伤细胞、B细胞和pCCS中引起强烈的趋化因子、细胞因子和抗体产生，并引发强烈的Th1型免疫反应。CpG1018是一种能够引发Th1型免疫反应的寡核苷酸。CpG1018是过去20年中批准的四种新型佐剂之一。即使它的使用最初在Hepliisav-B疫苗中受到限制，但目前正在评估用于对抗黑色素瘤和SARS-CoV-2的疫苗。MGN1703属于TLR9激动剂，是一种包含CG基序并呈现线性结构的小DNA分子。它由中间的双链DNA部分构成，两侧是单链结构。它作为疫苗的佐剂在癌症疫苗中进行了测试，在那里它激活了先天和适应性免疫反应，仅有轻微或暂时的副作用。它目前正在作为免疫调节剂单独或联合用于治疗恶性肿瘤，如黑色素瘤、小细胞肺癌和结直肠癌的I/II期研究中进行评估。 3.4.CLR配体 C型凝集素受体（CLRs）是病原体和受损组织来源脂质的免疫传感器，参与激活先天和获得性免疫。免疫反应可以通过CLRs细胞信号通路和其他PRRs（如TLR）的串扰来引发，导致不同信号通路的激活和特定细胞因子的表达。CLR触发的佐剂包括Curdlan、PGA-45、海藻糖二硬脂酸酯（TDB）和海藻糖二肉豆蔻酸酯（TDM），它们诱导强烈的Th17和Th1反应。 Curdlan在铜绿假单胞菌疫苗中使用，并诱导高水平的IL-17A和CD44+ CD62L-CD69+ CD4+ TRM细胞产生。Curdlan还能够激活树突细胞（DCs）并增强基于DC的抗肿瘤免疫，因此正在评估用于抗肿瘤免疫疗法。由于Curdlan的高度疏水性，开发了部分氧化的Curdlan衍生物β-1,3-聚葡萄糖醛酸，PGA-45聚合物，它能够刺激IKK-β的磷酸化并降低磷酸化Akt的表达，表明PGA-45可以激活多种细胞表面受体，包括TLR4和dectin-1。 海藻糖-6,60-二肉豆蔻酸酯（TDM）及其合成类似物海藻糖-6,60-二硬脂酸酯（TDB），能够通过与C型凝集素受体Mincle结合来激活巨噬细胞和树突细胞。TDB在结核病亚单位疫苗的临床研究中。TDB还可以独立于Mincle发挥作用，通过PLC-γ1/钙/CaMKKβ/AMPK途径诱导小胶质细胞极化为M2表型，使这种佐剂成为治疗神经炎症性疾病的治疗剂。 3.5.RLR配体 视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体（RLRs）是病毒感染的传感器，诱导产生I型和III型干扰素和炎症细胞因子，激活参与先天和获得性免疫反应的信号通路。RLRs可以检测病毒和宿主RNA，导致抗病毒反应，但如果RLR途径被无控制地激活，也会导致免疫病理。聚(I:C)激活RLRs途径，因为它模仿细胞中的病毒入侵，导致MAVS-IRF3/7级联的激活和IFN-β和ISGs的产生。IFN-β的表达取决于聚(I:C)的长度；短序列在髓样细胞中诱导IFN-β表达，而长序列在成纤维细胞中诱导IFN-β表达。这意味着使用特定激动剂刺激RLR途径将导致细胞特异性IFN-β表达的诱导，特别是在成纤维细胞中，与单核细胞和巨噬细胞相比，可以赋予更强的抗病毒状态。 4.辅助佐剂和佐剂配方  市场上的大多数疫苗只包含一种佐剂，然而，保护性免疫反应通常不足以实现疫苗的有效性。为了增强疫苗的效果，开发了许多佐剂配方。佐剂和抗原可以一起传递，使用两种流行的方法之一，共价偶联或将抗原和佐剂包装在传递机制中。适当的佐剂组合选择可以导致对疫苗免疫反应的补充或协同改善。例如，AS04中的明矾和MPL的联合使用在乙型肝炎病毒（HBV）和人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗中显示出比仅使用明矾盐的相同疫苗更好的免疫反应。 4.1.脂质体 脂质体是球形颗粒，可以包裹抗原和免疫刺激性分子，保护它们免受降解并将其传递给APCs。脂质体由可生物降解、生物相容、无毒的磷脂组成，允许灵活的结构修改，以实现可调节的特性，如大小、表面电荷、膜柔韧性和药物装载模式。作为疫苗佐剂传递系统（VADS）的脂质体使用带来了许多优点，如高安全性和强烈的免疫反应。市场上的脂质体配方包括Epaxal和inflixal，分别用于对抗甲型肝炎和季节性流感病毒。另一种基于脂质体的疫苗是GSK（GlaxoSmithKline）开发的Shingrix，已获得FDA批准，用于带状疱疹病毒的老年人预防。 4.2.乳液 作为疫苗佐剂开发的乳液可以分为两种主要形式，完全弗氏佐剂（CFA）和不完全弗氏佐剂（IFA）。这两种佐剂都是油包水乳液，具有运输抗原和激活先天免疫系统的能力。CFA由矿物油、乳化剂和热杀死的结核分枝杆菌组成，促进免疫反应的刺激。然而，CFA可能会引起强烈、持久的局部炎症，并有在注射部位形成溃疡的潜力。IFA与CFA的成分相同，但不含有杀死的细菌M. tuberculosis。这种佐剂可以产生比没有它的相同疫苗更强大和持久的抗体反应。然而，IFA在疫苗配方中的使用受到其强烈副作用和毒性的限制，这是由高水平的非生物降解油和质量差引起的。 4.2.1.Montanide Montanide 是一个包括油包水和水包油乳液在内的大型家族，它已被用于兽医和人类疫苗中。MontanideTM 的生物可降解性质减少了与 IFA 类似物理结构的许多细胞毒性特征。在注射部位形成储存库，有助于抗原的逐渐释放，这是这种基于油的佐剂的作用机制的一部分。产生集中并防止恶化的抗原，并促进吞噬作用 。Montanide ISA 51 和 ISA 720 已在涉及癌症、艾滋病、疟疾或自身免疫疾病的疫苗的多项临床试验中使用。Montanide ISA 201 和 ISA 206 则被用于口蹄疫疫苗。 4.2.2.MF59 MF59 是一种水-油乳液佐剂，由角鲨烯组成，角鲨烯是一种生物可降解且与人体兼容的油，是人体的正常成分，在 pH 6.5 的 10 mM 柠檬酸钠缓冲液中通过表面活性剂 Tween 80 和 Span 85 稳定，平均粒径小于 200 纳米。它首次在 1997 年在欧洲被批准用于人类疫苗（Fluad），现在已在超过 30 个国家的超过 1 亿人中使用。其作用机制类似于明矾盐，具有在注射部位的储存活性，刺激局部先天免疫反应。肌肉中 MF59 的给药激活了强大的细胞和体液免疫反应，释放 ATP 并上调细胞因子和趋化因子，这反过来促进了白细胞的募集、抗原摄取和迁移到淋巴结以激活 B 细胞和 T 细胞，结果比明矾盐更有效。MF59 具有可接受的安全性和良好的耐受性，自 1997 年以来已施用了数百万剂。 4.3.AS0佐剂系统 AS0 佐剂系统基于经典佐剂分子的组合，如明矾、乳液和脂质体。它们由葛兰素史克公司开发，以实现最大的佐剂效果和可接受的耐受性，结合免疫刺激分子，如 TLR 配体等。这些经典佐剂和免疫刺激剂的各种组合旨在针对目标人群（包括儿童、老年人和免疫功能低下的个体）的病原体个性化适应性免疫反应。 4.3.1.AS04 AS04 由 3-O-去酰基-40'-单磷酸脂 A（MPL）组成，这是从革兰氏阴性细菌 Salmonella minnesota 分离出的脂多糖（LPS）的去毒形式，吸附在明矾盐上 。MPL 在保持较低毒性的同时，通过 TLR4 激活保留了 LPS 的免疫刺激性，当吸附在明矾上时。TLR4 在先天细胞上的信号传导介导了 AS04 的佐剂作用，与明矾的内在免疫调节特性相结合。我们可以在乙型肝炎病毒（HBV）Fendrix  和人乳头瘤病毒（HPV）Cervarix  疫苗中找到 AS04，与仅用明矾盐佐剂的相同疫苗相比，显示出更好的免疫反应。 4.3.2.AS03 AS03 是一种角鲨烯油包水乳液佐剂，与 MF59 类似，结合了表面活性剂聚山梨醇酯 80 和 α-生育酚（维生素 E），结果具有较低的反应原性并具有更好的安全性。2009 年，欧洲委员会批准了 AS03 佐剂疫苗 Pandemrix 的商业化，2013 年食品药品监督管理局授权了 AS03 佐剂流感 A（H5N1）单价疫苗 。它也用于 SARS-CoV-2 重组蛋白疫苗（CoV2 preS dTM）。α-生育酚的抗氧化和免疫刺激性特性与 MF59 相比，促进了免疫增强反应，调节了某些细胞因子和趋化因子的表达，如 CCL2、CCL3、IL-6 和 GM-CSF。此外，AS03 通过刺激 NF-κB 激活免疫系统，这导致肌肉和引流淋巴结中细胞因子和趋化因子的释放，并促进先天免疫细胞的迁移。此外，AS03 可以促进 CD4+ T 细胞特异性免疫反应，这可能导致持久的中和抗体产生和更高水平的记忆 B 细胞 。为了增加其免疫原性，使用两种强效免疫刺激剂，QS-21（来自 Quillaja saponaria 的皂苷）和 3-O-去酰基-40'-单磷酸脂 A（MPL），产生了 AS02。 4.3.3.AS01 AS01 佐剂是两种强效免疫刺激组分的组合，TLR4 配体也在 AS04 中使用（MPL）和分离纯化的皂苷部分（QS-21），在脂质体中配制。它用于带状疱疹疫苗 Shingrix 和疟疾疫苗 Masquirix 。临床前研究表明，QS-21 作为佐剂增强了抗体以及细胞介导的免疫反应 ，但作为疫苗中的单一组分佐剂，它的耐受性较差。在 AS01 中，脂质体中的胆固醇允许它结合 QS-21 并抑制其反应原性。MPL 通过 TLR4 激活先天免疫系统，而 QS-21 激活引流淋巴结中副皮质窦巨噬细胞（SSMs）中的 caspase 1。两种已建立的佐剂分子的结合引发了先天免疫的协同激活，结果大于独立组分的总和，激活了不是由任一组分单独触发的新途径，增加了表达 IL-2、IFNγ 和 TNF 的多能 CD4+ T 细胞。AS01 作为佐剂在带状疱疹疫苗中的使用已获批准，该疫苗用于老年人，具有高疗效，并在非洲有限的运动中实施的疟疾疫苗。 4.4.免疫刺激复合物 免疫刺激复合物是另一种具有强大佐剂活性的疫苗传递载体。它们是球形的，笼子状的自组装颗粒，大小约为 40 毫米。ISCOMs 由 Quillaja 皂苷、胆固醇、磷脂和抗原组成。没有抗原的颗粒被称为 ISCOM 基质。ISCOM 抗原可以是原生病毒的包膜蛋白、细胞膜蛋白或通过极性相互作用含有疏水域的肽 。ISCOMATRIX® 是使用与 ISCOMs 相同的材料开发出来的，但没有抗原，可以在疫苗配方中添加，使得使用更加多样化，并消除了疏水抗原的限制。树突状细胞（DCs）和 ISCOM 相互作用可以改善结合抗原的交叉呈递 。因此，有效地诱导了 CD4+ 和 CD8+ 抗原特异性 T 细胞反应。诱导细胞毒性 T 细胞、平衡的 Th1/Th2 反应和持久的抗体反应都是 ISCOM 疫苗的记录效果 。其他 ISCOM/ISCOMATRIX 疫苗已针对 HIV、HPV 和癌症利用抗原 NY-ESO-1 进行了临床试验。在所有情况下，研究都显示出良好的安全性和耐受性，以及诱导体液和细胞免疫反应。尽管具有这些特点，但由于一些皂苷在高浓度下具有毒性，因此对人类疫苗中使用 ISCOMs 的安全性问题已经阻止了其使用 。 4.5.类病毒颗粒 类病毒颗粒（VLPs）是与病毒大小相似的二十面体纳米颗粒（范围在20至800纳米之间），它们具有自我组装衣壳蛋白的能力。它们是非感染性颗粒，因为它们没有遗传物质。VLPs由具有重复表位的外部病毒壳组成，这些表位被免疫系统识别为非自身，并产生快速且持久的免疫反应，即使没有佐剂。它们可以通过使用不同的技术和细胞系统，如大肠杆菌、酵母（酿酒酵母和毕赤酵母）、杆状病毒、哺乳动物细胞、植物细胞或无细胞系统，由各种病毒类型生产。 历史上的VLPs制造方法包括一个称为“先组装后纯化”的多步骤方法。第一步包括衣壳蛋白在表达细胞载体内的自发组装。第二步则提供新形成颗粒的纯化。有时需要将VLPs拆解后再重新组装，以获得纯化的颗粒并提高质量。另一种VLPs的制造方法提供了使用无细胞体外组装，颠覆了传统的自我组装方法。特别是，体外系统被用作一个平台，在衣壳蛋白表达和纯化后诱导其自发组装，无需拆解新形成的VLPs。在市场上，两种重要的佐剂疫苗使用这种类型的纳米颗粒，即乙型肝炎（HBV）和人乳头瘤病毒（HPV）疫苗。当前的乙型肝炎疫苗是一种利用酿酒酵母作为表达载体的重组DNA疫苗，包括用于预防乙型肝炎感染的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）。这种疫苗已被证明至少可以提供10年的免疫力。 在HPV疫苗中，非包膜HPV病毒颗粒包含双链DNA（dsDNA）。L1和L2蛋白组成衣壳的主要和次要结构蛋白，具有二十面体对称性。酿酒酵母是目前用于表达L1蛋白的载体。VLPs和佐剂（AlP）的结合导致强烈的免疫反应和90%的宫颈癌保护。 4.6.病毒体 病毒体是一种药物传递系统，由病毒包膜和病毒或其他病原体的成分组成。它们由重组流感病毒包膜形成，包含血凝素（HA）、神经酰胺酶（NA）和磷脂，并且像VLPs一样缺乏病毒遗传物质。第一个基于病毒体的疫苗是在1975年开发的，这允许研究这种类型疫苗的有效性。自那以后，有两种疫苗已经上市，用于预防甲型肝炎（Epaxal）和流感（Inflexal）。 病毒体结构中HA的存在允许保持受体结合能力，增加免疫原性和膜融合活性，但由于缺乏病毒RNA，病毒体在结合后不能在细胞中诱导感染。病毒体可以将抗原输送到抗原呈递细胞（APCs）的细胞质中，并诱导细胞毒性T淋巴细胞反应，使它们成为完美的传递系统。然而，由于佐剂质量较差，病毒体在激活APCs和鼓励交叉呈递方面效果不佳。使用更强的佐剂可以克服这种固有限制。最近开发了一种基于病毒体的创新流感疫苗，结合了TLR4配体单磷酸脂A（MPLA）和金属离子螯合脂质DOGS-NTA。病毒体可以诱导强烈的体液和细胞免疫，与自然感染和其他强效佐剂相当。由于其极高的耐受性和安全性，这种传递系统已获得FDA批准用于人类。除了针对流感和甲型肝炎的两种基于病毒体的疫苗外，还有几种疫苗正在进行临床试验，包括针对HIV、HPV、RSV和疟疾的疫苗。 5.佐剂设计和开发的新见解 如前所述，在过去20年中，发现了新的免疫激活佐剂类别，能够增强免疫功能低下和老年人等脆弱人群的免疫反应。有几种佐剂类别可用，每种都有其自身的优势和劣势。油包水乳液等传递系统是有效且安全的系统，尽管有可能产生局部或系统性不良效应。最近的研究表明，PRR信号在几个人群中可以改变，降低了疫苗配方的保护效果。例如，防止胎儿排斥的免疫机制以及老年人中TLR途径的失调或遗传多态性的存在。出于所有这些原因，选择适当的佐剂配方对于提高效果而不降低风险-效益比至关重要。从化学角度来看，蛋白质数据银行存储库上有几种与特定配体共晶的蛋白质晶体结构，有助于通过计算机辅助药物设计寻找新化合物。报道的STING和TLR小分子激动剂的大多数结构是杂环化合物，模仿核苷酸。即使在这种情况下，也已经开发了许多具有不同应用的结构相关化合物，包括在癌症疾病中广泛应用的激酶抑制剂和作用机制不太明确的配体或人类辅因子的配体。另一个需要考虑的方面是存在用于合成肽的高通量全自动仪器。最近已经做出了努力来合成复杂的高分子量肽和糖蛋白。此外，已经开发了使用天然成分的新型复杂纳米配方，如来自昆虫的功能化聚合物。所有这些方面都非常有前景，并为佐剂发现的发展开辟了新的场景。 6.结论 佐剂是疫苗配方的关键组成部分的大家族。它们的使用在历史上最重要的疫苗接种活动中至关重要，包括脊髓灰质炎、猪流感和最近的COVID-19大流行。即使已经取得了良好的结果，但还需要更多的努力来增加疫苗对耐药病毒的保护，并减少额外加强针的需要。重组技术、DNA筛选和生物信息学研究已经阐明了新的机制和免疫信号通路的关键参与者。还需要更多的努力来识别更有效的佐剂，以对抗未来的大流行并增加对抗癌症的成功率。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

学术前沿 单细胞结合空间转录组的研究思路和案例分享 ——肿瘤免疫研究领域（下） 01 引言 单细胞转录组测序是在单个细胞水平进行高通量转录组测序的一项技术，其能有效解决细胞异质性以及之前bulk RNA-seq被掩盖的种种问题。随着该技术在分辨率和通量方面的不断优化，研究者从异质性样本中分析细胞类型特异性基因调控网络的能力也相对提高，但是在细胞的空间位置水平尚有欠缺。空间转录组技术于2020年被《自然》杂志评为年度技术，可以解析时间和空间维度上单个细胞的基因表达模式，以及细胞类群的空间位置关系及生物学特征。其原理是将空间条形码寡核苷酸引物固定在载玻片上，然后将组织贴于载玻片实现组织内转录组序列的捕获与检测。随着10x Genomics的空间Visium技术的登场和不断更新加强，单细胞联合空间转录组的研究如火如荼的开展，遍布了遗传、发育、肿瘤、免疫等多个生物科研和医学热门领域。 一、研究目的 1.某肿瘤中，整体的细胞图谱、空间图谱及细胞间机制探索。 2.某肿瘤中，不同进展期（病变期）、不同亚型、特殊基因表达或原发灶与转移灶样本之间差异机制探索。 3.某肿瘤中，肿瘤对治疗方案的疗效应答中的差异机制探索。 二、样本选择 1. 某癌种中，根据其样本类型的特殊性，选择一定数量的样本，包括新鲜组织、冰冻组织或石蜡样本。 2. 某癌种中，根据原发灶和转移灶、免疫类型（浸润型、沙漠型、排斥型）、基因表达（阴/阳）或不同病理亚型的分组取样。 3. 某癌种中，根据PD1免疫药物治疗/靶向药物治疗/常规放化疗等治疗药物，新辅助、转化治疗等方案，选取应答/无应答、治疗前/治疗后的样本分组取样检测。 三、研究方法 1.主要研究方法：主要应用在发现探索阶段的方法,一般包括流式细胞技术(Facs)、单细胞组学（scRNA-seq）、空间转录组(visium HD)、多重免疫荧光染色(mIF)、探针原位杂交（Xenium）等； 2.其他辅助方法：辅助研究方法应用在机制验证方面，会根据验证模型的不同水平，比如细胞水平、动物模型、人源组织、类器官、网络数据库等等，对应各种生物检测分析方法并没有固定的思路。 四、分析思路 1.单细胞图谱：细胞类型的空间分布特征，亚群的图谱分类； 2.空间图谱绘制：细胞类型的空间分布特征，亚群的定位； 3.各个亚群细胞中的特征，寻找对比差异显著的细胞亚群，从剖析细胞/基因功能空间动态变化、空间细胞分化规律（拟时序）去分析细胞发生的机制和可能作用； 4.各类细胞亚群的相关性，通过细胞通讯、ST定位以及IHC或mIF等图像直观证明细胞亚群间特异的互动关系； 5.实验验证靶点和机制：细胞水平、类器官水平、动物模型水平做敲除干预治疗等验证。 五、文献分享 案例1 《单细胞和空间转录组分析揭示了肝转移性结直肠癌的细胞异质性》 发表期刊：Cell，影响因子：11.5 研究背景：结直肠癌(CRC)是世界上第三大最常见的恶性肿瘤，而转移性 CRC 的生存率很低。CRC转移过程是一个多步骤的过程，包含了癌细胞和基质细胞之间的交流通过分泌细胞因子、生长因子和蛋白酶来促进转移性扩散，从而重塑肿瘤微环境。TME 的细胞组成非常复杂，包括多种成纤维细胞和免疫细胞，它们在癌症逃避、转移和治疗反应中发挥着重要作用。癌症相关成纤维细胞（CAF）是许多类型恶性肿瘤（包括 CRC、乳腺癌和胰腺癌）的主要基质细胞成分。为了全面绘制结直肠癌和匹配的肝转移的细胞景观，研究人员使用scRNA-seq结合空间转录组(ST)和免疫组织化学(IHC)染色以及流式细胞术生成了高分辨率的细胞图谱。 检测技术组合：流式细胞术、单细胞转录组、空间转录组 样本类型：1. 6例CRC患者的27份样本，包括原发性结直肠癌(CC)、邻近正常结直肠粘膜(CN)、肝转移(LM)、邻近正常肝组织(LN)和外周血(PB)五种组织类型用于单细胞转录组检测。 2. 6例CRC患者，包含4例CRC原发性肿瘤（C1至C4）和2例肝转移性肿瘤（L1和L2）采用空间转录组。 主要结果： 1.根据免疫和非免疫细胞群，分别展示了CRC原发肿瘤和CRC肝转移性肿瘤的单细胞转录组图基本分类，以及原发和转移的差异。 Fig.1.CRC原发及肝转移中的全球细胞景观 2.CRC原发性肿瘤和CRC源性肝转移性肿瘤的空间分布 在ST组织中鉴定出B细胞、 T细胞、 NK细胞、浆细胞、髓样细胞、肿瘤细胞、成纤维细胞和内皮细胞。这些细胞簇的比例和分数在每个地区都不同。与C1、C3和C4的肿瘤旁组织相比，肿瘤组织中浆细胞的比率降低。 Fig.2.空间转录组样本的细胞鉴定 3.原发性肿瘤和肝转移性肿瘤之间肿瘤细胞的转录组异质性 亚聚类分析揭示了肿瘤细胞的不同分化谱系。在各群中鉴定出簇状细胞的分化标志基因。肿瘤细胞群的异质性表明肿瘤细胞的分化潜力。 为了进一步研究不同肿瘤细胞簇的功能通路和转录程序，进行了基因集变异分析（GSVA）和转录因子（TF）分析。结果显示，表明CA2可能是TME中的干细胞亚群。 Fig.3.原发性和转移性肿瘤细胞的转录组特征和异质性 4.TME重塑髓系细胞的组成 鉴定出三种髓系细胞：单核细胞/巨噬细胞、树突状细胞和肥大细胞。使用亚聚类分析确定了8个单核细胞/巨噬细胞簇和3个常规DC（cDC）簇，GSVA分析显示，Mac_SPP1亚群参与了与炎症反应相关的通路。拟时序显示Mac_CXCL9 和 Mac_SPP1 亚群均发生终末分化，表明它们是肿瘤激活的Mac亚群。cDC_LAMP3 亚群还表现出高水平的成本刺激分子CD40CD80和CD86 表达，它们是DC成熟的标志物。在LM中，cDC_LAMP3亚群的比例显著增加表明肿瘤细胞对TIME的重塑作用。 Fig.4.骨髓细胞的免疫景观 5.CXCL13T 细胞在肝转移性肿瘤中富集 在 T 细胞中，7个CD8 T细胞簇、5个常规CD4 T（cCD4）细胞簇和2个调节T细胞簇被识别。从细胞比例显示，无论是CD8还是CD4的T细胞，LM的CXCL13T细胞子集比例都很高。GSVA分析显示，CD8_CXCL13亚群富含T细胞增殖通路，CD4_CXCL13 亚群富含G细胞+2-M检查点通路。用流式细胞术鉴定了CD69+CD103+CD8+T细胞。CC和LM的CD69+CD103+CD8+T细胞的Ki67表达水平均高于其他CD8+T细胞。然而，来自CN和LN的不同CD8+T细胞亚群的增殖特性几乎相同。 Fig.5.CXCL13+T细胞在肝转移瘤中富集 6.CXCL13 T细胞与CRC患者的良好预后相关 在上图验证CD8_CXCL13细胞可能是肿瘤激活的亚群。进一步对CD8_CXCL13子集的特征做深入研究。与其他亚群相比，在CD8_CXCL13亚群中观察到高水平的耗竭标志物，且耗竭表型表明它们的肿瘤反应性。IHC难以检测组织中的CXCL13，因此选用CD69和CD103标记CXCL13细胞，结果显示该群T细胞比肿瘤组织中的其他CD8 T细胞更接近CK19肿瘤细胞。将基因表达综合（GEO）队列中的CRC患者分为CXCL13+高和CXCL13低组，发现CC中 CXCL13 的较高表达预示着更好的总生存期。 Fig.6. CXCL13+ T细胞的特性及预后影响 7.成纤维细胞的不同亚群存在于 CRC 的原发性和肝脏转移性肿瘤中 在CRC的TME中鉴定出8个具有不同基因表达模式的成纤维细胞簇，然后研究人员对各类成纤维细胞分别做了转录组数据比较、IHC组化、拟时序分析、以及ST分析，在CRC原发性和肝转移性肿瘤之间观察到不同的表型谱和成纤维细胞的高度可变频率，这表明在不同癌症环境中TME内的细胞异质性。 Fig.7. 原发性和转移性肿瘤中成纤维细胞的转录组特征和异质性 8.在原发性肿瘤中富集的 F3 表达成纤维细胞亚群分泌促肿瘤因子，并与 CRC 患者的不良预后相关 为了研究富含CC和LM的不同成纤维细胞对TME 的重塑，研究人员分析了F2_MCAM和F4_F3的特征。通过差异基因富集以及F4_F3细胞与肿瘤细胞之间揭示了通过NRG1和Erb-B2受体酪氨酸激酶3 （ERBB3）通路进行串扰。在ST中发现了两类细胞 F3与NRG1的共定位并通过transwell细胞实验迁移证明。最后在预后数据中发现F3和NRG1 高表达水平的CRC患者总生存期较差。 Fig.8. F3+成纤维细胞的特性及预后影响 9. LM的TME中表达MCAM的成纤维细胞通过Notch 信号通路调节CD8_CXCL13细胞的产生 之前发现RBPJ在LM中的表达与CXCL13和ITGAE呈正相关。为了进一步了解两个亚群受到什么类型的细胞调节Notch信号，采用cellphoneDB分析，在内皮细胞中E2_DLL4亚群与CXCL13+ T细胞的相互作用最强，在成纤维细胞中F2_MCAM簇通JAG1-NOTCH1与CD8_CXCL13和CD4_CXCL13亚群相互作用。由于TME中成纤维细胞的分散分布模式，推测F2_MCAM亚群有助于CXCL13+ T细胞中Notch信号的激活。此外根据LM中F2_MCAM的比例高低，发现F2_MCAM高组患者LM中CD8_CXCL13亚群的浸润评分更高，并在ST中得到了验证，使用JASPAR预测表明RBPJ可能作TF影响CXCL13的表达。 Fig.9. TME中的NOTCH信号调节CD8_CXCL13细胞的生成 10.ST组织中的细胞间相互作用网络 原发性肿瘤和肝转移性肿瘤ST中不同簇之间的细胞相互作用，表明ERBB3-NRG1相互作用在原发性肿瘤发生和转移中的潜在作用，发现在CRC原发肿瘤中富集的F3成纤维细胞可以通过产生各种促肿瘤因子（包括 NRG1）来调节发展和/或迁移，这些因子与肿瘤细胞上表达的ERBB3相互作用以发挥其促肿瘤功能。 Fig.10. ST组织中的细胞配体和受体相互作用 案例2 《空间和单细胞转录组学揭示了HNSCC中与癌症相关的成纤维细胞亚群限制了CD8+ T细胞的浸润和抗肿瘤活性》 发表期刊：Cancer Research，影响因子：12.5 样本类型：5例头颈部鳞状细胞癌HNSCC癌和癌旁组织； 技术组合：单细胞RNA转录组、空间转录组、免疫组化、免疫荧光、其他等等； 研究背景：免疫治疗可以延长一些HNSCC患者的生存期，但应答率仍然很低。阐明肿瘤微环境中cd8+t细胞浸润和功能障碍的关键机制有助于最大限度地发挥免疫治疗HNSCC的益处。CD8+T细胞与包括CAFs在内的其他类型细胞之间的相互作用决定了CD8+T细胞如何在这一动态TME中发挥作用，本研究对五对肿瘤和邻近组织的不同免疫浸润和单细胞RNA测序的HNSCC标本进行了空间转录组学分析，揭示了与cd8 + t细胞浸润限制和功能障碍相关的特定癌症相关成纤维细胞(CAF)亚群。 技术路线： 主要结果： 1. HNSCC肿瘤组织对CD8+T细胞具有招募趋化作用，CD8+T细胞存在于肿瘤基质中，且免疫排斥型的HNSCC中CD8a+被受限无法浸润到肿瘤巢中； Fig 1.CD8+T细胞在不同HNSCC肿瘤亚型中的分布 2.MHC-IhiCAFs（5亚群）是肿瘤组织中区别于癌旁组织的最主要的CAFs亚群，高表达CXCLs和MHC-I增强了CAFs与CD8+T的结合，且可通过限制CD8+T细胞的抗肿瘤能力造成预后不良； Fig 2.HNSCC肿瘤及邻近组织成纤维细胞的整体分析 3. MHC-IhiCAFs中存在LGALS9（编码galectin-9蛋白）的富集，大部分HNSCC肿瘤基质中均存在galectin-9蛋白的表达；MHC-IhiCAFs中galectin-9蛋白的表达依赖于干扰素信号； Fig3. TCF1 ~ GZMK ~ CD8 + T细胞与galectin-9的CAF细胞呈负相关 4.在CAFs中敲减LGALS9表达会降低CD8+T表达免疫检查点分子，同时促进干性和细胞毒性分子的表达，且动物实验证明Gal-9+CAFs促进干细胞样CD8+T细胞耗竭转化。 图4. 动物实验验证MHC I类的高表达限制了cd8+T细胞的抗肿瘤功能 案例3 《上皮细胞激活成纤维细胞促进食管癌的发展》 发表期刊：Cancer cell，影响因子：48.8 样本类型：29例ESCC患者79个多期食管病变的正常上皮、癌前病变和癌组织； 技术组合：单细胞RNA转录组、空间转录组、免疫组化、免疫荧光、其他等等； 研究背景：食管鳞状细胞癌(ESCC)的发展经历了多阶段上皮癌的形成，即从正常上皮、低级别和高级别上皮内瘤变到浸润性癌。然而，癌前病变如何发展为癌机制尚未可知。 主要结果： 1.ESCC多阶段肿瘤发生过程各种细胞类型图谱分析 Fig 1.单细胞转录组学分析揭示了ESCC多阶段肿瘤发生过程中的各种细胞类型 2.上皮细胞中ANXA1的功能失调可能是ESCC肿瘤发生中至关重要的事件； Fig 2.上皮细胞在ESCC肿瘤发生过程中逐渐抑制ANXA1表达 3.ESCC肿瘤发生过程中上皮细胞与成纤维细胞的相互作用，食管上皮细胞产生的ANXA1功能的丧失可能导致NF-CAF转化； Fig 3.上皮细胞抑制ANXA1可促进NF向CAFs转化 4.KLF4、KLF5、CEBPB和FOXA1与ANXA1的RNA水平呈正相关，细胞实验发现只有靶向KFL4的SiRNA可显著抑制ANXA1表达，KLF4调节ANXA1转录，促进NFs向myCAF的转化。 图4.在体外和体内，抑制上皮细胞ANXA1可促进myCAF的激活 参考文献： [1]Wang F, Long J, Li L, Wu ZX, Da TT, Wang XQ, Huang C, Jiang YH, Yao XQ, Ma HQ, Lian ZX, Zhao ZB, Cao J. Single-cell and spatial transcriptome analysis reveals the cellular heterogeneity of liver metastatic colorectal cancer. Sci Adv. 2023 Jun 16;9(24):eadf5464. doi: 10.1126/sciadv.adf5464. Epub 2023 Jun 16. PMID: 37327339; PMCID: PMC10275599. [2]Li C, Guo H, Zhai P, Yan M, Liu C, Wang X, Shi C, Li J, Tong T, Zhang Z, Ma H, Zhang J. Spatial and Single-Cell Transcriptomics Reveal a Cancer-Associated Fibroblast Subset in HNSCC That Restricts Infiltration and Antitumor Activity of CD8+ T Cells. Cancer Res. 2024 Jan 16;84(2):258-275. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-23-1448. PMID: 37930937; PMCID: PMC10790129. [3]Chen Y, Zhu S, Liu T, Zhang S, Lu J, Fan W, Lin L, Xiang T, Yang J, Zhao X, Xi Y, Ma Y, Cheng G, Lin D, Wu C. Epithelial cells activate fibroblasts to promote esophageal cancer development. Cancer Cell. 2023 May 8;41(5):903-918.e8. doi: 10.1016/j.ccell.2023.03.001. Epub 2023 Mar 23. PMID: 36963399. 本文由 科研学术部 何鼎 提供