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更新于：2025-05-07

CD69

更新于：2025-05-07

基本信息

别名

Activation inducer molecule、AIM、BL-AC/P26

+ [10]

简介

Transmembrane protein expressed mainly on T-cells resident in mucosa that plays an essential role in immune cell homeostasis. Rapidly expressed on the surface of platelets, T-lymphocytes and NK cells upon activation by various stimuli, such as antigen recognition or cytokine signaling, stimulates different signaling pathways in different cell types (PubMed:24752896, PubMed:26296369, PubMed:35930205). Negatively regulates Th17 cell differentiation through its carbohydrate dependent interaction with galectin-1/LGALS1 present on immature dendritic cells (PubMed:24752896). Association of CD69 cytoplasmic tail with the JAK3/STAT5 signaling pathway regulates the transcription of RORgamma/RORC and, consequently, differentiation toward the Th17 lineage (By similarity). Acts also via the S100A8/S100A9 complex present on peripheral blood mononuclear cells to promote the conversion of naive CD4 T-cells into regulatory T-cells (PubMed:26296369). Acts as an oxidized low-density lipoprotein (oxLDL) receptor in CD4 T-lymphocytes and negatively regulates the inflammatory response by inducing the expression of PDCD1 through the activation of NFAT (PubMed:35930205). Participates in adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (ASCs)-mediated protection against P. aeruginosa infection. Mechanistically, specifically recognizes P. aeruginosa to promote ERK1 activation, followed by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and other inflammatory cytokines secretion (PubMed:34841721). In eosinophils, induces IL-10 production through the ERK1/2 pathway (By similarity). Negatively regulates the chemotactic responses of effector lymphocytes and dendritic cells (DCs) to sphingosine 1 phosphate/S1P by acting as a S1PR1 receptor agonist and facilitating the internalization and degradation of the receptor (PubMed:37039481).

关联

项与 CD69 相关的药物

GFC-101

靶点

CD69

作用机制

CD69 inhibitors

在研机构

GeneFrontier Corp.

原研机构

GeneFrontier Corp.

在研适应症

肠易激综合征 [+2]

非在研适应症-

最高研发阶段临床前

首次获批国家/地区-

首次获批日期1800-01-20

CN116635404

专利挖掘

靶点

CD69

作用机制-

在研机构

Affibody AB

原研机构

Affibody AB

在研适应症

免疫系统疾病

非在研适应症-

最高研发阶段药物发现

首次获批国家/地区-

首次获批日期1800-01-20

100 项与 CD69 相关的临床结果

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100 项与 CD69 相关的转化医学

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0 项与 CD69 相关的专利（医药）

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6,365

项与 CD69 相关的文献（医药）

2025-12-31·OncoImmunology

Liver metastases of colorectal cancer contain different subsets of tissue-resident memory CD8 T cells correlated with a distinct risk of relapse following surgery

Article

作者: Laloy, Emilien ; Vienot, Angélique ; El Kaddissi, Antoine ; Mougey, Virginie ; Chartral, Ugo ; Loyon, Romain ; Spehner, Laurie ; Viot, Julien ; Borg, Christophe ; Doussot, Alexandre ; Monnien, Franck ; Kroemer, Marie ; Abdeljaoued, Syrine ; Bouard, Adeline ; Ben Khelil, Myriam ; Lakkis, Zaher ; Pallandre, Jean René

Tissue-resident memory (T_RM) T cells have emerged as key players in cancer immunosurveillance, and their presence has been linked to a favorable clinical outcome in solid cancer patients. Liver metastases exhibit a highly immunosuppressive tumor microenvironment, however, the role and clinical impact of T_RM cell infiltration in colorectal cancer remain elusive. The expression of several tissue residency and activation biomarkers has been investigated on tumor-infiltrating lymphocytes isolated from 26 patients' colorectal cancer liver metastases (CRC liver metastases) and compared to 16 peripheral blood samples of patients with CRC liver metastases. Cytokine production was also evaluated in in vitro-activated T_RM and non-T_RM cells. The prognostic value of T_RM cells was also assessed in a well-defined cohort of CRC liver metastases. Here we identified two subsets of T_RM cells expressing CD103 and/or CD69 showing significantly higher expression of tissue residency and activation biomarkers. CD103⁺CD69⁺ T_RM cells subset showed almost exclusive expression of tumor reactivity biomarkers PD-1 and CD39. Supporting this observation, CD103⁺CD69⁺ T_RM cells showed a more oligoclonal TCR repertoire. Both T_RM subsets presented higher cytotoxic and functional capacity compared to non-T_RM cells. Our study shows that only the presence of CD103⁺CD69⁺ T_RM cells is associated with longer recurrence-free survival of colorectal cancer patients with liver metastases. Taken together, our work demonstrates the existence of a phenotypic heterogeneity of T_RM cells in colorectal cancer liver metastases. In this study, we identified a population of CD103⁺CD69⁺ T_RM cells exhibiting the characteristics of tumor reactivity and correlated with better patients' prognosis, with potential implications in optimal therapeutic strategies determination.

2025-06-01·Biochemical and Biophysical Research Communications

Intravesical chemotherapy enhances anti-tumor immunity in bladder cancer by modulating CD8+ T cell activation and Treg populations

Article

作者: Ding, Shuangfeng ; Liu, Gang ; Chen, Rui ; Fu, Xiaocong

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urinary system, with standard treatments including surgery, radiotherapy, and chemotherapy. However, these conventional approaches often yield suboptimal outcomes, necessitating exploring alternative therapeutic strategies. This study evaluated the efficacy of intravesical chemotherapy, both alone and in combination with immunotherapy, using an orthotopic mouse model of bladder cancer. To establish the model, luciferase-expressing bladder cancer cells were orthotopically implanted into immunocompetent mice. Treatment efficacy was assessed by monitoring changes in bioluminescence imaging (BLI) signal intensity, indicative of tumor burden, and by measuring tumor weights post-mortem. Mice were divided into four groups: G1: untreated control; G2: intravesical chemotherapy with 40 mph Doxorubicin (0.05 ml per mouse, bladder instillation); G3intraperitoneal (i.p.) chemotherapy with 10 mph Doxorubicin; G4: immune combination therapy with 10 mph Doxorubicin (i.p.) plus 10 mph PD-L1 inhibitor (i.p.). Results demonstrated that intravesical chemotherapy significantly reduced tumor burden compared to both conventional systemic chemotherapy and immune combination therapy (p-value <0.05). Flow cytometry analysis revealed a notable decrease in CD8⁺ T cell expression in both the intravesical and conventional chemotherapy groups (p value < 0.01). Additionally, Treg cell expression was moderately reduced in the conventional and immune combination therapy groups (p value < 0.05). Notably, intravesical chemotherapy led to a significant increase in CD69 activation on CD8⁺ T cells (p value < 0.05), suggesting enhanced T cell activation, while also moderately reducing PD-1 expression, a marker of T cell exhaustion (p value < 0.05).Histological analysis, including hematoxylin and eosin (HE) staining and Ki-67 immunohistochemistry, further confirmed significant differences in tumor morphology and proliferation among the treatment groups (p value < 0.05). These findings suggest that intravesical chemotherapy not only exerts a direct anti-tumor effect but also modulates the immune response by activating CD8⁺ T cells and mitigating T cell exhaustion. To conclusion, this study highlights the potential of intravesical chemotherapy as a promising and clinically feasible approach for bladder cancer treatment, warranting further investigation in translational and clinical practice.

2025-05-01·Molecular Immunology

Dock2 deficiency reveals abnormal activation and differentiation of T cells under the physiological condition

Article

作者: Guo, Tianfu ; He, Tian-Sheng ; He, Wenji ; Liu, Zhiping ; Chen, Jun ; Lv, Huiru ; Shen, Weijie ; Xu, Li

Previous research has demonstrated that Dock2 deficiency results in a reduction in both the quantity and proliferation rate of T cells, thereby heightening the host's vulnerability to various infections. Nevertheless, the impact of DOCK2 on T cell activation remains unexplored. In this study, we employed flow cytometry to assess the activation phenotype of T cells in the peripheral lymphoid tissues of wild-type (Dock2^+/+), DOCK2 heterozygous (Dock2^+/-) and DOCK2 knockout (Dock2^-/-) mice. Our findings revealed that, in comparison to Dock2^+/+ mice, Dock2^-/- mice exhibited increased expression levels of CD44 and CD69 on CD4⁺ and/or CD8⁺ T cells within spleen and mesenteric lymph nodes (MLN). Additionally, there was a significant elevation in the proportions of IFN-γ⁺/CD4⁺, IFN-γ⁺/CD8⁺ and IL-4⁺/CD8⁺ T cells. Furthermore, the percentage of IL-17a⁺/CD4⁺ and IL-17a⁺/CD8⁺ T cells in the MLN of Dock2^-/- mice was higher than that observed in Dock2^+/+ mice. These results suggest that Dock2 deficiency induces aberrant T cell activation in peripheral lymphoid tissues. To further investigate the underlying mechanisms of this phenomenon, we conducted transcriptome sequencing on CD8⁺ T cells collected from all groups of mice. The results indicate that Ccr2 and Ifng are potentially pivotal genes involved in the aberrant activation of T cells in Dock2^-/- mice. These findings contribute to elucidating the host defense mechanisms against foreign pathogens and advance our comprehension of the role of cytoskeleton-related proteins in the regulation of cellular immunity.

项与 CD69 相关的新闻（医药）

2025-04-30

·医药速览

Science子刊：抑制DNMT1，给T细胞（CAR-T）增加NK细胞功能，显著增强抗肿瘤活性

T细胞和NK细胞杀伤肿瘤功能不相同，如果把NK细胞的功能添加到T细胞上，或者CART细胞上，能不能让T杀伤癌细胞能力增强呢？3月21日，《Science Immunology》一篇标题为：DNMT1 inhibition reprograms T cells to NK-like cells with potent antitumor activity 的文章，研究了DNMT1（DNA甲基转移酶1）在维持T细胞特性和抑制其向自然杀伤(NK)样细胞转变中的关键作用。通过抑制DNMT1，研究人员成功将T细胞（包括CAR-T细胞）重编程为具有增强抗肿瘤活性的NK样细胞，体外体内杀伤肿瘤能力显著增强。此前研究表明，转录因子BCL11B的失活可以将T细胞重编程为诱导型T到NK细胞（ITNKs），展现出抗肿瘤活性。然而，BCL11B是如何抑制自然杀伤（NK）细胞转录程序的分子机制尚不清楚。蛋白质组学分析发现，BCL11B在T细胞中与DNMT1和UHRF1形成复合物，共同维持DNA甲基化状态。这一表观遗传机制对抑制NK细胞相关基因的表达至关重要。敲除DNMT1或UHRF1会导致T细胞中NK细胞标志物NKp30和NKp46的显著上调，表明UHRF1-DNMT1轴在维持T细胞特性方面的重要作用。使用非核苷类DNMT1选择性抑制剂GSK3484862（GSK862）处理CD4和CD8 T细胞后，这些细胞表现出NK细胞特征，包括NKp30和NKp46的表达上调。类似地，FDA批准的泛DNMT抑制剂地西他滨（DAC）也能在原代人T细胞中诱导NK细胞标志物的表达。这些结果表明，通过化学手段干预DNMT1/UHRF1轴，可以有效模拟BCL11B缺失的效应，为T细胞重编程提供了一种高效且可控的策略。敲除DNMT1或UHRF1以及使用GSK862处理的T细胞在UMAP空间中形成独特的细胞簇，这些细胞表现出NK细胞标志物（如NKp30、NKp46）的上调和T细胞特异性转录因子TCF7的下调，同时还显著增加了杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIRs）家族成员（如KIR3DL1、KIR2DL2/L3/S2、KIR2DS1）和NKp44的表达。此外，DNMT1抑制上调了CD94和NKG2A，但未诱导NK细胞激活受体NKG2C或ADCC相关受体CD16的表达。部分NK细胞相关基因（如SIGLEC7、TYROBP、KIR家族成员）在DNMT1/UHRF1抑制组中显著上调，而在BCL11B缺失组中无明显变化，而另一些基因（如IL18R1、NCAM1、ZNF683）则更倾向于在BCL11B缺失时上调。这些数据表明，抑制维持性DNA甲基化和敲除BCL11B虽然都能诱导T细胞向NK样细胞转化，但两者调控的基因网络存在显著差异，展现了共享和独特的转录特征。抑制DNMT1生成的NK样细胞展现出比BCL11B缺失ITNKs更强的细胞毒性，可能归因于其分泌更高水平的干扰素-γ（IFN-γ）、颗粒酶A/B、颗粒溶素和穿孔素。抗体阻断实验进一步证实，NKp30和NKp46在NK样细胞对K562细胞的杀伤中起关键作用。这些NK样细胞能够通过NCRs和TCRs识别多种癌细胞系，例如有效裂解表达OKT3的NALM6细胞，而对野生型NALM6无显著作用。这表明，DNMT1抑制重编程的NK样细胞兼具天然免疫和适应性免疫的双重识别能力。NK样细胞在体内展现优异抗肿瘤活性，并可通过CAR工程化增强特异性。在免疫缺陷NSI小鼠模型中评估了NK样细胞对HepG2和K562异种移植瘤的抗肿瘤效果。结果显示，与BCL11B缺失ITNKs相比，由DNMT1抑制或GSK862处理生成的NK样细胞在两种模型中均更显著地抑制肿瘤生长并延长小鼠生存期。肿瘤浸润的NK样细胞高表达活化标志物CD69，而PD1和LAG3的表达水平低于对照组。体外扩增和再刺激后，这些细胞分泌更高水平的颗粒酶B和颗粒溶素。为提高肿瘤识别特异性，研究将抗CD19或抗间皮素（MSLN）CAR转导入GSK862处理的NK样细胞中，结果表明这些CAR-NK样细胞在体内外均展现出优于传统CAR-T细胞的抗肿瘤活性。这些数据证明，DNMT1抑制重编程的NK样细胞不仅具备强效抗肿瘤能力，还可通过CAR工程化实现靶向治疗，进一步增强其临床应用潜力。DNMT1的非酶功能通过稳定BCL11B抑制T细胞向NK样细胞重编程。研究发现，DNMT1与BCL11B相互作用，并通过其非酶功能维持BCL11B的蛋白稳定性，从而支持T细胞特性。DNMT1-BCL11B相互作用在抑制T细胞向NK样细胞重编程中的关键作用。GSK862处理显著上调CD4和CD8 T细胞中NKp30和NKp46的表达，但外源性过表达BCL11B能够部分逆转这一效应。这表明，DNMT1通过与BCL11B的物理相互作用维持其稳定性，从而抑制T细胞向NK样细胞的转化。进一步发现，抑制DNMT1和EZH2可协同重编程T细胞，增强NK样细胞的生成和抗肿瘤活性。DNA甲基化和H3K27me3共同抑制NK细胞相关基因的表达，而联合使用DNMT1抑制剂（如GSK862）和EZH2抑制剂（如EPZ6438）可显著解除这种抑制，促进NK细胞特异性基因的表达和染色质开放性。这种协同作用通过激活NK细胞相关信号通路（如细胞毒性因子和免疫调控基因）实现，从而提升T细胞向NK样细胞的转化效率及其抗肿瘤功能。这些结果表明，DNA甲基化和H3K27me3是防止T细胞转变为NK样细胞的双重保障机制。最后，这项研究揭示了DNMT1在维持T细胞特性和抑制NK细胞程序中的关键分子机制，并提出了通过使用表观遗传抑制剂（特别是DNMT1抑制剂，以及与EZH2抑制剂联合使用）将T细胞转化为具有增强抗肿瘤活性的NK样细胞的新策略，为癌症免疫治疗提供了新的思路和潜在的细胞来源。参考资料：Yao Li et al. ,DNMT1 inhibition reprograms T cells to NK-like cells with potent antitumor activity.Sci. Immunol.10,eadm8251(2025).DOI:10.1126/sciimmunol.adm8251推文用于传递知识，如因版权等有疑问，请于本文刊发30日内联系医药速览。原创内容未经授权，禁止转载至其他平台。有问题可发邮件至yong_wang@pku.edu.cn获取更多信息。©2021 医药速览保留所有权利往期链接“小小疫苗”养成记 | 医药公司管线盘点人人学懂免疫学| 人人学懂免疫学（语音版）综述文章解读 | 文献略读 | 医学科普|医药前沿笔记PROTAC技术| 抗体药物| 抗体药物偶联-ADC核酸疫苗 | CAR技术| 化学生物学温馨提示医药速览公众号目前已经有近12个交流群（好学，有趣且奔波于医药圈人才聚集于此）。进群加作者微信（yiyaoxueshu666）或者扫描公众号二维码添加作者，备注“姓名/昵称-企业/高校-具体研究领域/专业”，此群仅为科研交流群，非诚勿扰。简单操作即可星标⭐️医药速览，第一时间收到我们的推送①点击标题下方“医药速览” ②至右上角“...” ③点击“设为星标

细胞疗法免疫疗法临床研究

2025-04-16

·抗体圈

抗体偶联再添新技术！

近日，Nature Biomedical Engineering期刊发表了一篇名为《Site-directed multivalent conjugation of antibodies to ubiquitinated payloads》的研究论文，主要介绍了一种名为“ubi-tagging”的新型模块化技术，用于通过小蛋白泛素（ubiquitin）实现抗体的定向多价偶联。文章标题抗体偶联物在诊断和治疗应用中具有重要作用，但传统偶联技术常因缺乏对修饰数量和位点的精确控制而导致产品异质性，可能影响抗体功能和药代动力学。该技术能够高效地将抗体、抗体片段、纳米抗体、肽或小分子（如荧光染料）与泛素融合，并在30分钟内完成偶联反应。研究展示了这种技术在生成双特异性T细胞接合剂（BiTE）和靶向树突状细胞的抗原偶联物方面的应用，并证明了其在诱导T细胞反应方面的有效性。主要内容1. 荧光标记的Fab片段：ubi-tagging技术成功实现了Fab片段的荧光标记，且标记后的Fab片段在热稳定性和抗原结合能力上与未标记的Fab片段相当。图1|泛素标记抗体片段的生成及位点特异性标记2. 多价抗体格式：通过ubi-tagging技术，研究者能够快速生成高达11聚体的多价Fab片段，并且展示了通过控制反应条件实现二价和三价Fab片段的合成。图2|使用泛素标记生成多聚体抗体格式及双价和三价Fab片段偶联物3. 双特异性T细胞接合剂（BiTE）：研究者利用ubi-tagging技术开发了四价双特异性抗体复合物，用于T细胞激活和细胞毒性实验。实验结果表明，这种BiTE能够有效地激活T细胞，并在体外实验中显示出对靶细胞的杀伤活性。图3|泛素标记单克隆抗体的偶联及用于T细胞激活的双特异性四价抗体复合物的生成流式细胞术分析显示，泛素标记的TRP1/mCD3 BiTE以剂量依赖性方式激活T细胞，表现为T细胞上Ki67、颗粒酶B、CD69和4-1BB（CD137）表达增加，但仅在与KPC3-TRP1细胞共培养时出现，而与KPC3-WT细胞共培养时则未观察到。在乳酸脱氢酶（LDH）释放实验中，表达TRP1的KPC3细胞显示出泛素标记的TRP1/mCD3 BiTE剂量依赖性的细胞杀伤活性。这些结果共同证明了泛素标记方法的灵活性和高效性，以及泛素标记的四价双特异性抗体复合物的功能性。4. 树突状细胞靶向抗原递送：ubi-tagging技术被用于将抗原肽与靶向树突状细胞的Fab片段偶联。实验表明，与sortagging技术相比，ubi-tagging技术在体内实验中显示出更强的T细胞激活能力，且在细胞摄取实验中表现出更高的靶向性。图4|Fab-Ub2-OVAp偶联物在体外诱导强烈的T细胞反应在Fab-Ub2-OVAp条件下，无论是否存在FR基序，OT-I细胞上激活标记物CD25、4-1BB和CD44的表达水平都很高，并且细胞分泌促炎细胞因子干扰素γ（IFNγ）和白细胞介素-2（IL-2）。对于sortagging标记的偶联物，FR基序对于T细胞激活至关重要，这与早期的研究结果一致。激活标记物的表达水平和细胞因子的分泌表明，与sortagging标记的Fab-Srt-OVAp偶联物相比，Fab-Ub2-OVAp偶联物在体外诱导的T细胞激活更为强烈，无论是否存在FR基序。受这些结果的鼓舞，作者接下来评估了Fab-Ub2-OVAp和Fab-Srt-FR-OVAp偶联物在体内诱导OT-I细胞激活的能力。图5|Fab-Ub2-OVAp偶联物在体内诱导强烈的T细胞反应作者观察到，接受泛素标记偶联物治疗的小鼠表现出强烈的OT-I细胞增殖，而sortagging标记的偶联物在本实验所用剂量下仅诱导了最小程度的OT-I细胞增殖。与给予未偶联的Fab-Ub和Ub-OVAp的条件相比，泛素标记的偶联物也诱导了更强的增殖。这表明了泛素标记靶向部分的优势，以及Fab-Ub2偶联物在体内的稳定性。生物分布数据表明，泛素标记的偶联物（分子量约66 kDa）主要通过肝脏清除，而sortagging标记的偶联物（分子量约52 kDa）则通过肾脏清除。尽管这些偶联物都配备了相同的DEC205靶向Fab'片段，但与sortagging标记的偶联物相比，泛素标记的偶联物被CD11c+“树突状细胞”群体更特异性地摄取。后者则被CD11c−/CD11b+群体以更高的程度摄取。这些数据表明泛素标记的DC靶向疫苗在体内对靶细胞的结合更为优越，这有助于解释这两种偶联物在脾脏中诱导抗原特异性CD8+T细胞激活的能力差异。为了进一步探索泛素标记（ubi-tagging）在树突状细胞（DC）靶向抗原递送中的适用性，作者将研究范围扩展到纳米抗体（VHHs）偶联物。图6|使用泛素标记纳米抗体进行树突状细胞靶向抗原递送结果显示，对DC-SIGN的Rho-Ub2-VHH偶联物的荧光信号显著增强，且呈DC-SIGN表达和剂量依赖性。相比之下，Rho-Ub2-ntVHH未观察到这种增强。所有测试的泛素-肽融合物均能轻松合成，并与VHH-Ub(K48R)don偶联，且未出现溶解性问题。在用抗DC-SIGN VHH-Ub2-gp100p脉冲处理的moDCs条件下，与非靶向偶联物相比，T细胞的增殖、激活和细胞因子分泌表现出更强的剂量依赖性增加。综上所述，结果表明泛素标记在纳米抗体上是可行的，并证明了泛素标记的纳米抗体-肽表位偶联物作为人类树突状细胞靶向疫苗载体具有进一步研究的价值。基础实验小课堂问：为什么要进行竞争性结合实验？答：为了验证双价抗体格式的功能性，并评估其与单价Fab-Ub相比的亲和力增强效应。那么要如何测试呢？让我们一起来看一下吧实验流程竞争性结合实验：以mCD3为靶点的ubi-tagged抗体片段和偶联物1. 每孔加入50,000个EL4细胞（该细胞表达CD3）；2. 将Fab-Ub、Fab-Ub2-Fab或未标记的亲本抗体进行稀释，浓度范围均为0.01到1,000 nM；3. 加入50 µL的mCD3单抗；4. 4°C下孵育15分钟；5. 用含有5%FCS的PBS洗涤细胞；6. 再加入50 µL浓度为1 µg/mL的FITC标记的mCD3单抗；7. 在4°C下孵育30分钟；8. 细胞经过两次洗涤后，使用流式细胞仪测量荧光强度。结果解读：与亲本抗体相比，Fab-Ub的亲和力有所下降，但在泛素标记后部分恢复，且Fab2-Ub2显示出比单价Fab-Ub更低的半数抑制浓度（IC50），这可能是由于双价格式的亲和力增加所致。实验中用到的主要试剂：ThermoScientific，MA1-80783产品相关链接：https://www.thermofisher.cn/order/genome-database/dataSheetPdf?producttype=antibody&productsubtype=antibody_primary&productId=MA1-80783&version=LocalThermoScientific，MA1-80640产品相关链接：https://www.thermofisher.cn/order/genome-database/dataSheetPdf?producttype=antibody&productsubtype=antibody_primary&productId=MA1-80640&version=Local关键结论ubi-tagging技术的优势：该技术能够在短时间内高效生成均质的多价抗体偶联物，具有高度的位点特异性和反应效率。功能验证：ubi-tagging技术生成的抗体偶联物在体外和体内实验中均显示出良好的功能，特别是在树突状细胞靶向抗原递送和T细胞激活方面。与sortagging技术的比较：ubi-tagging技术在体内实验中显示出比sortagging技术更好的T细胞激活效果和靶向性，表明其在疫苗开发和治疗性抗体设计中具有潜在优势。研究意义这项研究提供了一种新的抗体偶联技术，可能对开发新型诊断工具和治疗性抗体药物具有重要意义，尤其是在提高抗体药物的靶向性和治疗效果方面。基础知识点供给站：泛素（Ub）是一种76个氨基酸的小蛋白，通过泛素化过程共价连接到目标蛋白上。泛素化由E1（激活酶）、E2（结合酶）和E3（连接酶）组成的酶级联反应调控，最终将泛素的C末端甘氨酸残基共价连接到靶蛋白的N末端或赖氨酸残基上。泛素分子也可以通过七个内部赖氨酸残基之一或N末端甲硫氨酸残基相互连接，从而形成具有不同连接类型的多泛素链。EL4细胞是一种从小鼠淋巴瘤组织中建立的细胞系，被广泛用于研究肿瘤免疫学、抗肿瘤药物筛选、疫苗研发等领域。EL4细胞系的生长特性是悬浮生长，即细胞在培养液中自由漂浮。这种细胞系的形态学表现为淋巴瘤细胞样，具有圆形或椭圆形细胞核和胞质。识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！请注明：姓名+研究方向！本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

2025-04-16

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Nat. Biomed. Eng. (IF 26.8) | 抗体偶联再添新技术！

近日，Nature Biomedical Engineering期刊发表了一篇名为《Site-directed multivalent conjugation of antibodies to ubiquitinated payloads》的研究论文，主要介绍了一种名为“ubi-tagging”的新型模块化技术，用于通过小蛋白泛素（ubiquitin）实现抗体的定向多价偶联。文章标题抗体偶联物在诊断和治疗应用中具有重要作用，但传统偶联技术常因缺乏对修饰数量和位点的精确控制而导致产品异质性，可能影响抗体功能和药代动力学。该技术能够高效地将抗体、抗体片段、纳米抗体、肽或小分子（如荧光染料）与泛素融合，并在30分钟内完成偶联反应。研究展示了这种技术在生成双特异性T细胞接合剂（BiTE）和靶向树突状细胞的抗原偶联物方面的应用，并证明了其在诱导T细胞反应方面的有效性。主要内容1. 荧光标记的Fab片段：ubi-tagging技术成功实现了Fab片段的荧光标记，且标记后的Fab片段在热稳定性和抗原结合能力上与未标记的Fab片段相当。图1|泛素标记抗体片段的生成及位点特异性标记2. 多价抗体格式：通过ubi-tagging技术，研究者能够快速生成高达11聚体的多价Fab片段，并且展示了通过控制反应条件实现二价和三价Fab片段的合成。图2|使用泛素标记生成多聚体抗体格式及双价和三价Fab片段偶联物3. 双特异性T细胞接合剂（BiTE）：研究者利用ubi-tagging技术开发了四价双特异性抗体复合物，用于T细胞激活和细胞毒性实验。实验结果表明，这种BiTE能够有效地激活T细胞，并在体外实验中显示出对靶细胞的杀伤活性。图3|泛素标记单克隆抗体的偶联及用于T细胞激活的双特异性四价抗体复合物的生成流式细胞术分析显示，泛素标记的TRP1/mCD3 BiTE以剂量依赖性方式激活T细胞，表现为T细胞上Ki67、颗粒酶B、CD69和4-1BB（CD137）表达增加，但仅在与KPC3-TRP1细胞共培养时出现，而与KPC3-WT细胞共培养时则未观察到。在乳酸脱氢酶（LDH）释放实验中，表达TRP1的KPC3细胞显示出泛素标记的TRP1/mCD3 BiTE剂量依赖性的细胞杀伤活性。这些结果共同证明了泛素标记方法的灵活性和高效性，以及泛素标记的四价双特异性抗体复合物的功能性。4. 树突状细胞靶向抗原递送：ubi-tagging技术被用于将抗原肽与靶向树突状细胞的Fab片段偶联。实验表明，与sortagging技术相比，ubi-tagging技术在体内实验中显示出更强的T细胞激活能力，且在细胞摄取实验中表现出更高的靶向性。图4|Fab-Ub2-OVAp偶联物在体外诱导强烈的T细胞反应在Fab-Ub2-OVAp条件下，无论是否存在FR基序，OT-I细胞上激活标记物CD25、4-1BB和CD44的表达水平都很高，并且细胞分泌促炎细胞因子干扰素γ（IFNγ）和白细胞介素-2（IL-2）。对于sortagging标记的偶联物，FR基序对于T细胞激活至关重要，这与早期的研究结果一致。激活标记物的表达水平和细胞因子的分泌表明，与sortagging标记的Fab-Srt-OVAp偶联物相比，Fab-Ub2-OVAp偶联物在体外诱导的T细胞激活更为强烈，无论是否存在FR基序。受这些结果的鼓舞，作者接下来评估了Fab-Ub2-OVAp和Fab-Srt-FR-OVAp偶联物在体内诱导OT-I细胞激活的能力。图5|Fab-Ub2-OVAp偶联物在体内诱导强烈的T细胞反应作者观察到，接受泛素标记偶联物治疗的小鼠表现出强烈的OT-I细胞增殖，而sortagging标记的偶联物在本实验所用剂量下仅诱导了最小程度的OT-I细胞增殖。与给予未偶联的Fab-Ub和Ub-OVAp的条件相比，泛素标记的偶联物也诱导了更强的增殖。这表明了泛素标记靶向部分的优势，以及Fab-Ub2偶联物在体内的稳定性。生物分布数据表明，泛素标记的偶联物（分子量约66 kDa）主要通过肝脏清除，而sortagging标记的偶联物（分子量约52 kDa）则通过肾脏清除。尽管这些偶联物都配备了相同的DEC205靶向Fab'片段，但与sortagging标记的偶联物相比，泛素标记的偶联物被CD11c+“树突状细胞”群体更特异性地摄取。后者则被CD11c−/CD11b+群体以更高的程度摄取。这些数据表明泛素标记的DC靶向疫苗在体内对靶细胞的结合更为优越，这有助于解释这两种偶联物在脾脏中诱导抗原特异性CD8+T细胞激活的能力差异。为了进一步探索泛素标记（ubi-tagging）在树突状细胞（DC）靶向抗原递送中的适用性，作者将研究范围扩展到纳米抗体（VHHs）偶联物。图6|使用泛素标记纳米抗体进行树突状细胞靶向抗原递送结果显示，对DC-SIGN的Rho-Ub2-VHH偶联物的荧光信号显著增强，且呈DC-SIGN表达和剂量依赖性。相比之下，Rho-Ub2-ntVHH未观察到这种增强。所有测试的泛素-肽融合物均能轻松合成，并与VHH-Ub(K48R)don偶联，且未出现溶解性问题。在用抗DC-SIGN VHH-Ub2-gp100p脉冲处理的moDCs条件下，与非靶向偶联物相比，T细胞的增殖、激活和细胞因子分泌表现出更强的剂量依赖性增加。综上所述，结果表明泛素标记在纳米抗体上是可行的，并证明了泛素标记的纳米抗体-肽表位偶联物作为人类树突状细胞靶向疫苗载体具有进一步研究的价值。基础实验小课堂问：为什么要进行竞争性结合实验？答：为了验证双价抗体格式的功能性，并评估其与单价Fab-Ub相比的亲和力增强效应。那么要如何测试呢？让我们一起来看一下吧实验流程竞争性结合实验：以mCD3为靶点的ubi-tagged抗体片段和偶联物1. 每孔加入50,000个EL4细胞（该细胞表达CD3）；2. 将Fab-Ub、Fab-Ub2-Fab或未标记的亲本抗体进行稀释，浓度范围均为0.01到1,000 nM；3. 加入50 µL的mCD3单抗；4. 4°C下孵育15分钟；5. 用含有5%FCS的PBS洗涤细胞；6. 再加入50 µL浓度为1 µg/mL的FITC标记的mCD3单抗；7. 在4°C下孵育30分钟；8. 细胞经过两次洗涤后，使用流式细胞仪测量荧光强度。结果解读：与亲本抗体相比，Fab-Ub的亲和力有所下降，但在泛素标记后部分恢复，且Fab2-Ub2显示出比单价Fab-Ub更低的半数抑制浓度（IC50），这可能是由于双价格式的亲和力增加所致。实验中用到的主要试剂：ThermoScientific，MA1-80783产品相关链接：https://www.thermofisher.cn/order/genome-database/dataSheetPdf?producttype=antibody&productsubtype=antibody_primary&productId=MA1-80783&version=LocalThermoScientific，MA1-80640产品相关链接：https://www.thermofisher.cn/order/genome-database/dataSheetPdf?producttype=antibody&productsubtype=antibody_primary&productId=MA1-80640&version=Local关键结论ubi-tagging技术的优势：该技术能够在短时间内高效生成均质的多价抗体偶联物，具有高度的位点特异性和反应效率。功能验证：ubi-tagging技术生成的抗体偶联物在体外和体内实验中均显示出良好的功能，特别是在树突状细胞靶向抗原递送和T细胞激活方面。与sortagging技术的比较：ubi-tagging技术在体内实验中显示出比sortagging技术更好的T细胞激活效果和靶向性，表明其在疫苗开发和治疗性抗体设计中具有潜在优势。研究意义这项研究提供了一种新的抗体偶联技术，可能对开发新型诊断工具和治疗性抗体药物具有重要意义，尤其是在提高抗体药物的靶向性和治疗效果方面。基础知识点供给站：泛素（Ub）是一种76个氨基酸的小蛋白，通过泛素化过程共价连接到目标蛋白上。泛素化由E1（激活酶）、E2（结合酶）和E3（连接酶）组成的酶级联反应调控，最终将泛素的C末端甘氨酸残基共价连接到靶蛋白的N末端或赖氨酸残基上。泛素分子也可以通过七个内部赖氨酸残基之一或N末端甲硫氨酸残基相互连接，从而形成具有不同连接类型的多泛素链。EL4细胞是一种从小鼠淋巴瘤组织中建立的细胞系，被广泛用于研究肿瘤免疫学、抗肿瘤药物筛选、疫苗研发等领域。EL4细胞系的生长特性是悬浮生长，即细胞在培养液中自由漂浮。这种细胞系的形态学表现为淋巴瘤细胞样，具有圆形或椭圆形细胞核和胞质推文用于传递知识，如因版权等有疑问，请于本文刊发30日内联系医药速览。原创内容未经授权，禁止转载至其他平台。有问题可发邮件至yong_wang@pku.edu.cn获取更多信息。©2021 医药速览保留所有权利往期链接“小小疫苗”养成记 | 医药公司管线盘点人人学懂免疫学| 人人学懂免疫学（语音版）综述文章解读 | 文献略读 | 医学科普|医药前沿笔记PROTAC技术| 抗体药物| 抗体药物偶联-ADC核酸疫苗 | CAR技术| 化学生物学温馨提示医药速览公众号目前已经有近12个交流群（好学，有趣且奔波于医药圈人才聚集于此）。进群请扫描下方二维码，备注“姓名/昵称-企业/高校-具体研究领域/专业”，此群仅为科研交流群，非诚勿扰。简单操作即可星标⭐️医药速览，第一时间收到我们的推送①点击标题下方“医药速览” ②至右上角“...” ③点击“设为星标