caspase 7

摘要：癌细胞对化疗药物的耐药性大大降低了癌症患者的治疗效果，化疗引起的毒副作用也严重影响了患者的生活质量。茶中主要活性成分表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）与顺铂、5-FU、多柔比星和紫杉醇的联合使用，增强了它们对肿瘤的增敏效果，并对抗了癌细胞的耐药性。这些效应似乎通过多种机制介导，包括对抗癌症干细胞介导的药物耐药性、增强药物敏感性、诱导细胞周期停滞和凋亡，以及阻断血管生成。此外，EGCG可以通过其抗炎和抗氧化作用，抑制化疗引起的一系列不良反应，如胃肠功能紊乱、肾毒性和心脏毒性，从而改善患者的生活质量。然而，EGCG的生物利用度低、脱靶效应以及与某些化疗药物的反应性限制了其临床应用。EGCG和化疗药物的纳米改性不仅增强了抗肿瘤活性，还延长了荷瘤小鼠的生存时间，并具有低毒性的优势。因此，本综述旨在讨论EGCG与化疗药物联合治疗癌症的现状和挑战。总体而言，EGCG是一个有前景的化疗辅助剂。 1.引言 恶性肿瘤的发病率和死亡率持续上升，已成为对人类生命健康的主要威胁。恶性肿瘤的治疗方法主要包括手术、放疗和化疗，其中化疗在恶性肿瘤治疗中发挥着关键作用。然而，肿瘤细胞常常产生耐药性，使得通过化疗彻底杀死所有肿瘤细胞变得困难，限制了治愈率。目前，现有的癌症化疗药物不仅价格昂贵，还会改变多个信号通路组分的表达水平，从而不可避免地带来不同程度的副作用。这些副作用的产生与化疗药物的剂量和个体对药物的敏感性有关。化疗药物在抑制或杀死肿瘤细胞的同时，也对其正常组织造成一定的损伤。化疗的常见副作用包括胃肠功能紊乱、心脏毒性、神经病变、血管毒性等。这些副作用严重影响了肿瘤治疗效果和患者的生活质量。一些植物化学物质被报道具有化疗增敏作用，并能减少化疗引起的毒性副作用的发展。表儿茶素没食子酸酯（EGCG）就是其中之一。 EGCG是绿茶中最重要的活性成分之一，约占儿茶素化合物的50-60%。EGCG清除自由基，减少氧化损伤，对正常细胞和组织无毒性，但对肿瘤预防和治疗有积极作用。此外，EGCG还被报道能够对抗癌细胞干细胞的耐药性，增强化疗药物的敏感性，从而减少药物用量，缓解胃肠道功能紊乱和肾毒性等副作用，并降低肿瘤引起的恶病质发生率和发展。 尽管EGCG在癌症预防和治疗方面显示出了强大的优势，但其疗效与一线化疗药物相比仍有一定差距，作为单一抗癌药物开发的可能性有限。然而，当EGCG作为辅助化疗药物用于治疗肿瘤时，它们表现出强烈的化疗增敏作用，并减轻化疗副作用（图1），因此有望作为化疗辅助药物使用。本文综述了EGCG与化疗药物联合增强抗癌效果的现状和挑战，并为包含EGCG的组合策略在肿瘤治疗中的发展提供了参考。 图1. EGCG 在辅助化疗中的优势 2.增强化疗效果  单独的EGCG具有强大的抗癌活性，当与化疗药物（5-氟尿嘧啶、塞来昔布、顺铂、多柔比星、他莫昔芬）联合使用时，其协同治疗效果得到放大。这些作用机制包括减少癌细胞干细胞的药物抗性、增强化疗药物敏感性、诱导细胞周期停滞和凋亡、抑制血管生成，以及诱导抗炎和促氧化效应（图2）。我们将在下面简要阐述这些机制。 图2. EGCG与化疗药物联合作用增强抗肿瘤效果的机制 2.1. 减少癌细胞干细胞的药物抗性 在肿瘤组织的细胞群中，癌细胞干细胞（CSCs）数量较少，但在肿瘤抗性和复发过程中起着重要作用。CSCs通过不对称分裂维持自我更新和多向分化潜能，导致肿瘤细胞继续增殖，并促进肿瘤异质性和多样性的形成。因此，靶向CSCs是预防癌症和克服药物抗性的重要策略。在针对CSCs的研究中，发现EGCG对CSCs药物抗性有积极影响。EGCG单独使用时已显示出对CSCs生长和干性的强烈抑制作用。当EGCG与其他化疗药物联合对抗CSCs时，联合的肿瘤抑制效果比单一作用效果更显著（图2）。这些效应主要是EGCG通过减少CSCs的干性和降低细胞内流出泵活性来降低CSCs对化疗药物的抗性。 集落和球状体形成能力被用作实验指标，以测试CSCs的干性能力。低浓度的EGCG（5μM）未能抑制胰腺导管腺癌的集落和球状体形成，但当与PDE3A抑制剂曲前列醇联合使用时，它降低了FOXO3和CD44蛋白水平，并上调了cGMP表达，导致CSCs形成集落和球状体的能力显著降低。肿瘤抗性通常由增加的细胞内药物流出介导，由膜转运蛋白介导。作为最大的细胞内转运蛋白基因家族，ABC超家族已被报道参与肿瘤的多药耐药性。EGCG可以通过抑制CSC膜上的转运蛋白（ABCC2和ABCG2等）的活性和表达，增加CSCs中的药物浓度，减少药物从细胞中泵出的量，并增强抗癌药物对CSCs的杀伤效果（图2）。在头颈癌、胆管癌和鼻咽癌等癌症的CSCs中发现了这一点。在胶质瘤CSCs中，尽管EGCG对ABCG2表达没有影响，但EGCG下调了另一种膜转运蛋白P-糖蛋白（P-gp），减少了肿瘤细胞的球状体形成和迁移能力，最终增强了化疗药物替莫唑胺对CSCs的杀伤。 除了影响膜转运蛋白的表达外，EGCG还可以通过调节miRNAs的表达来保护CSCs。5-氟尿嘧啶（5-FU）处理的药物耐药性结直肠癌细胞比亲本细胞具有更强的球状体形成能力。低剂量EGCG与5-FU联合使用抑制了多个自我更新驱动途径，包括Notch和Bmi1、Ezh2和Suz12，通过上调关键肿瘤抑制miRNAs（miR-34a、miR-145和miR-200c）的表达，从而增强了耐药性结直肠癌细胞的凋亡并抑制了球状体形成。在动物实验中，EGCG与5-FU或顺铂的联合使用也可以减少小鼠中各种CSCs的肿瘤体积和重量，如结直肠癌、头颈癌和鼻咽癌。 2.2. 提高药物敏感性 EGCG与化疗药物的结合可以显著降低化疗药物的IC50值（表1），同时减少药物剂量也能显著增强效果。三氧化二砷（ATO）是治疗急性早幼粒细胞白血病（APL）的有效化疗药物，长期使用可能导致严重的副作用和癌细胞耐药性。EGCG与ATO的结合有效降低了抑制APL HL-60细胞和U937细胞所需的ATO浓度。EGCG增强了三苯氧胺和顺铂在胶质瘤细胞中的增敏效果，并抑制了端粒酶的表达。它还可以通过抑制核酸修复酶ERCC1/XPF的活性，增强各种癌细胞对顺铂的敏感性。EGCG和吉西他滨的结合增强了胆管癌细胞对吉西他滨的敏感性，促进了凋亡，并显著抑制了移植肿瘤的生长。 EGCG可以通过多种途径增强化疗药物的增敏效果，包括促进药物摄取相关蛋白的表达和抑制药物在细胞内的翻译或流出（图2）。铜转运蛋白1（CTR1）是一种跨膜溶质载体转运蛋白，之前已被证明可以增加顺铂的细胞摄取和敏感性。EGCG在卵巢和肺癌细胞中上调了CTR1的转录和翻译水平，并抑制了癌细胞中顺铂介导的CTR1降解。羰基还原酶1（CBR1）将抗肿瘤药物柔红霉素和阿霉素转化为柔红霉素醇（DNROL）和阿霉素醇（DOXOL），这些新产生的醇代谢产物不仅具有低抗肿瘤活性，还会引起心脏毒性和心肌细胞损伤。EGCG还直接结合肝脏中的CBR1，增加癌细胞中柔红霉素的积累，增强抗肿瘤活性，同时减少DNROL诱导的心脏毒性（图3）。EGCG和萝卜硫素的联合治疗通过时间和剂量依赖性地降低细胞活性并增强顺铂诱导的凋亡和G2/M期阻滞，增强了顺铂在顺铂敏感和顺铂耐药卵巢癌细胞中的疗效。 图3. EGCG 提高癌细胞对多柔比星的化疗敏感性。EGCG 通过抑制 CBR1 和 P-gp 的活性，减少柔红霉素和多柔比星的转化和外排，从而增强抗肿瘤活性并降低心脏毒性。 EGCG可以抑制结直肠癌和肺癌中多药耐药蛋白1（MRP1/MDR1）的活性，并抑制化疗药物从癌细胞中的流出，从而促进细胞内积累。EGCG下调MDR1及其蛋白产物P-gp，减少肝癌细胞中多柔比星（DOX）的流出泵活性（图3）。DOX和EGCG的结合使口腔癌细胞中的DOX浓度增加了51%，并与单独使用DOX相比，增加了肿瘤细胞的凋亡率。进一步研究表明，EGCG通过协同抑制MEK/ERK和PI3K/Akt信号通路，抑制DOX诱导的P-gp过度表达。在EGCG-三苯氧胺联合测定中，P-gp和乳腺癌耐药蛋白显著受到抑制，增强了乳腺癌细胞对三苯氧胺的敏感性。 2.3. 诱导细胞周期停滞 EGCG和顺铂的联合治疗通过降低多种细胞周期相关基因（cyclin A2、cyclin B1、cyclin D1和cyclin E1）的mRNA表达水平，并增加细胞周期抑制因子p21和DR5的表达（图2），诱导细胞在G1期停滞，并增强胆道癌和非小细胞肺癌（NSCLC）中的凋亡。EGCG衍生物不仅可以增强EGCG的稳定性和生物利用度，还可以促进NSCLC细胞的凋亡，并在与顺铂联合使用时抑制小鼠肿瘤的生长。 EGCG和DOX的结合抑制了肿瘤中磷酸化NF-κB和MDM2的表达，并上调了p53，从而显著抑制了膀胱癌细胞（T24和SW780）的增殖，增强了DOX对癌细胞的凋亡诱导效果，并降低了膀胱癌细胞的迁移能力。EGCG和曲司他丁A的结合通过上调p16表达促进淋巴瘤细胞在G1期停滞，从而减少细胞增殖。与vorinostat单独使用相比，EGCG的联合治疗上调了p21、p27、caspases（3、7和9）和Bax，并抑制了cdk2、cdk4、cyclin A、NF-κB和Bcl2的活性，从而显著降低了黑色素瘤细胞的增殖并促进了它们的凋亡。 2.4. 诱导凋亡 EGCG和顺铂的结合抑制了头颈鳞状细胞癌的形成并增强了细胞凋亡。EGCG减轻了化疗药物吉非替尼诱导的CYP1A1/CYB1B1、EGFR、cyclin D1、p-Akt（Ser473）和survivin在转录和翻译水平上的表达增加，并增强了p-p53（Ser15）的表达（图2），从而增强了吉非替尼对苯并[a]芘诱导肺癌的治疗效果。EGCG还降低了EGFR的磷酸化水平，抑制了乳腺癌细胞中的AKT信号，并增强了雷洛昔芬诱导的癌细胞凋亡。此外，EGCG与三苯氧胺在小鼠中的结合通过抑制mTOR和EGFR的表达，减少了肿瘤体积71%和肿瘤重量80%。EGCG和博来霉素的结合显著促进了Mia Paca-2胰腺癌细胞的凋亡。EGCG和丁酸钠的结合也在结肠癌细胞中诱导了细胞周期停滞、凋亡和DNA损伤。 EGCG与紫杉醇（例如，紫杉醇和多西他赛）的结合上调了p53和caspase-3，增加了前列腺癌细胞的凋亡率，并使肿瘤携带小鼠的无病生存率提高到90%。EGCG与5-FU的结合可以通过抑制葡萄糖调节蛋白78（GRP78）的表达来阻断5-FU的流出，激活NF-κB信号，增强miR-155-5p的表达水平，并进一步抑制靶基因MRP1的表达。5-FU的积累导致caspase-3和PARP激活，Bcl-2降低和Bad增加，最终导致结肠癌细胞的凋亡。EGCG和阿霉素的结合也下调了bcl-2并增加了bax和caspase-3的表达，从而促进了食管癌细胞的凋亡。EGCG结合GRP78并将其从活性单体转化为非活性二聚体和寡聚体，干扰了抗凋亡GRP78-caspase-7复合体的形成，导致依托泊苷、紫杉醇和长春新碱诱导的癌细胞凋亡增加。EGCG和ATO的结合显著诱导了HL-60细胞的线粒体依赖性凋亡，凋亡细胞占总死亡细胞的70%以上。 NS-398和化疗药物塞来昔布都是环氧化酶-2（COX-2）抑制剂，EGCG和NS-398的联合治疗促进了前列腺癌细胞（LNCaP、PC-3和CWR22Rnu1）中Bax、pro-caspase-6和pro-caspase-9以及裂解的PARP的表达，并降低了前列腺特异性抗原和IGF-I水平，从而诱导凋亡并抑制小鼠肿瘤的生长。单独的EGCG或塞来昔布都没有诱导PC-9肺癌细胞中DNA损伤基因GADD153的表达，而联合治疗通过ERK信号通路上调了GADD153，从而促进了肺癌细胞的凋亡。 肝源性生长因子（HDGF）是一种分泌的肝素结合生长因子，调节肿瘤侵袭和转移，并促进血管生成。EGCG和顺铂的结合可以破坏线粒体膜电位，并通过下调HDGF上调caspase-3和caspase-9，从而诱导NSCLC细胞凋亡（图2）。EGCG还通过下调Axl和Tyro 3的表达抑制顺铂耐药肺癌细胞的增殖。此外，EGCG可以通过抑制hsa-miR-98-5p的表达并进一步上调p53，增强顺铂对NSCLC细胞的治疗效果。 2.5. 抑制血管生成 EGCG显著抑制了semaxanib诱导的内皮素过度表达，并抑制了肿瘤血管生成，为解决对抗VEGF疗法的抗性提供了新策略。EGCG治疗导致微血管密度、微血管周细胞覆盖指数和胶原IV表达降低；血管灌注和通透性的短暂增加；间质液压力和缺氧降低。在顺铂诱导的血管正常化期间共同给予顺铂，显著降低了在肿瘤组织中诱导效果所需的顺铂药物浓度（1.8 μg/g组织对比0.8 μg/g组织，P < 0.01），并抑制了移植肺肿瘤的生长。使用聚乙二醇（PEG）偶联的EGCG（PEG-EGCG）作为载体制备的载药胶束纳米复合物（SU-MNC），也能特异性地抑制VEGF诱导的内皮细胞增殖。 2.6. 抗炎和促氧化效应 EGCG与塞来昔布联合使用，降低了胰岛癌细胞（Colo357）中IL-6、IL-8、VEGF和MMP-2的表达，并减弱了塞来昔布诱导的COX-2表达增加，减少了细胞炎症水平。这种组合在偶氮甲烷加硫酸葡聚糖钠诱导的结肠癌发生模型中也显示出类似的抗炎效应。核因子E2相关因子2（Nrf2）是一个重要的细胞保护性转录因子，在抗氧化和解毒过程中发挥关键作用。激活Nrf2-Keap1通路诱导相II酶的表达，并通过ARE信号通路阻止癌症发展。EGCG和顺铂的组合通过上调Nrf2/HO-1表达增强了凋亡，从而抑制了宫颈癌和乳腺癌的发展。此外，EGCG和顺铂的组合可以促进各种卵巢癌细胞系中H2O2的表达，加剧氧化应激以放大顺铂的毒性，从而抑制卵巢癌细胞的生长。 3.减少化疗副作用  长期化疗药物的使用除了药物抗性外，还可能导致某些有毒副作用（如胃肠疾病、心脏毒性、肾毒性、耳毒性、神经毒性等），从而限制了药物的有效性和治疗效果。EGCG不仅作为出色的辅助化疗增强剂，而且在减少化疗药物用量和增强抗肿瘤治疗效果的同时，减轻了化疗药物引起的有毒副作用。 3.1. 胃肠疾病 化疗引起恶心、呕吐、食欲减退等副作用，主要是由于药物或辐射对胃肠道细胞的损伤，导致胃肠道粘膜炎症。EGCG通过减少氧化损伤，改善了小鼠中伊立替康引起的胃肠副作用。接受同期放疗的不可切除III期NSCLC患者经常发生食管炎，这可能导致治疗中断并影响肿瘤治疗。在一项包括24名AJCC IIIA（6名）和IIIB（18名）期患者的研究中，化疗（顺铂和依托泊苷）与放疗（中位剂量64 Gy）同时进行。经过EGCG治疗（平均治疗持续时间34.8天，建议EGCG浓度440 μmol/L），在24名患者中有22名观察到食管炎显著回归至0/1级。 3.2.心脏毒性 阿霉素诱导的活性氧物种产生是心肌病的主要原因，也是限制其临床使用的主要副作用[68,69]。EGCG可以通过靶向结合抑制CBR1活性，进一步减少DOX的乙醇代谢产物DOXOL的产生，并减少DOXOL在心肌细胞中的损伤。EGCG还通过清除活性氧（ROS）和增强心肌细胞中Ca2+瞬态的幅度来减轻DOX诱导的心脏毒性。EGCG和DOX的联合给药显著抑制了肿瘤生长，同时减少了心肌Ca2+超载和乳酸脱氢酶释放，减轻了心肌细胞凋亡，从而降低了DOX的心脏毒性。与DOX和EGCG共载的多离子复合胶束增强了联合药物的稳定性，胶束核心中的EGCG除了抑制P-gp表达和逆转癌细胞的多药耐药性外，还保护心肌细胞免受DOX介导的心脏毒性。 3.3.肾毒性 顺铂诱导的肾毒性与肾脏中氧化应激和炎症细胞因子的增加有关。Nrf2和HO-1表达水平降低，顺铂处理的大鼠中NF-κB和4-羟基壬醛水平显著增加。EGCG逆转了这些顺铂介导的变化，并增强了肾脏抗氧化酶（过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶）和谷胱甘肽的活性，从而减少肾脏氧化应激和炎症反应，并改善顺铂诱导的肾毒性。另一方面，EGCG减轻了顺铂诱导的线粒体氧化/硝化应激、线粒体电子传递链活性和线粒体抗氧化防御酶活性的线粒体损伤，并减少了肾小管细胞中线粒体ROS的产生，而PAS染色显示EGCG改善了顺铂诱导的肾脏结构损伤，如小管扩张、小管形成、颗粒空泡变性和小管细胞坏死。EGCG和CoQ10的多剂量组合也通过改善肾脏氧化/硝化状态、炎症和凋亡减轻了顺铂介导的肾毒性的发展。 3.4.耳毒性 除了肾毒性外，耳毒性是限制顺铂在临床实践中进一步使用的另一种有毒副作用。顺铂的耳毒性基于对耳蜗外毛细胞、螺旋神经节和血管纹的损害，包括不仅由药物本身引起的内外部环境的变化，还包括其激活caspase途径引起的凋亡。在大鼠中口服EGCG减轻了顺铂诱导的听力损失，减少了耳蜗基底区外毛细胞的丢失，并减少了氧化应激和凋亡标志物。它还保护了与内毛细胞相关的血管纹和螺旋韧带中的Na+/K+腺苷三磷酸酶（ATPase）α1的丢失以及与丝带突触相关的。体外研究发现，顺铂通过ROS/MAPK途径激活STAT1，降低磷酸化STAT3水平并减少p-STAT3/p-STAT1水平，从而诱导耳蜗炎症和凋亡。相比之下，EGCG通过抑制STAT1表达和保护p-STAT3，增加p-STAT3/p-STAT1比例，并调节bcl-2等促生存因子的表达，促进耳蜗细胞存活。 3.5.神经毒性 神经毒性通常与使用基于铂的药物、长春碱和紫杉醇类药物有关。EGCG对大鼠顺铂诱导的神经毒性的保护机制包括下调炎症因子TNF-α和IL-6的表达以减少大脑皮层的炎症负荷；激活抗氧化Nrf2/HO-1通路以减少NF-κB表达；下调与凋亡相关的蛋白Bax和caspase-3并增加抗凋亡因子Bcl-2的表达以减少大脑皮层的凋亡；最后，上调脑源性神经营养因子和乙酰胆碱酯酶并抑制乙酰胆碱表达以保护大脑皮层免受顺铂诱导的神经化学紊乱。 3.6.肺纤维化 博来霉素是一种诱导DNA损伤的化疗药物，长期使用可能导致肺纤维化的发展。EGCG显著下调了博来霉素诱导的炎症因子NF-κB、TNF-α和IL-1β的表达水平，增加了抗氧化调节因子Nrf2的表达，并促进了体内氧化还原动态平衡，同时减少羟脯氨酸和胶原蛋白的合成和积累，从而改善了博来霉素诱导的肺纤维化。另一方面，EGCG还促进了博来霉素诱导的糖结合物恢复正常水平，并增加了基质降解溶酶体酶的活性。电子显微镜的超微结构观察还发现EGCG促进了肺泡II型细胞的空泡化和核收缩，并减少了胶原蛋白沉积。 4.辅助化疗的限制  尽管EGCG已经显示出与化疗药物的强烈辅助作用，增强了化疗效果，但EGCG和某些化疗药物也存在一定的拮抗作用，降低了化疗效果。硼替佐米是一种用于治疗多发性骨髓瘤的临床蛋白酶体抑制剂。由于硼替佐米的硼酸成分可以与EGCG的儿茶酚反应形成环状硼酸酯（图4），EGCG与硼酸基抗癌药物如硼替佐米的组合可能导致药物失活。由于它们的共同特征，任何含有儿茶酚或间苯二酚结构的化合物都不应与硼酸基药物同时服用。在EGCG与舒尼替尼联合使用的研究中，口服EGCG也被发现降低了舒尼替尼的生物利用度。EGCG还被报道通过减少丁酸诱导的癌细胞分化，降低了丁酸对结肠癌细胞的治疗效果。因此，需要进一步研究EGCG与不同化疗药物之间的相互作用，并确定临床上合适的组合治疗策略。 图4. 硼替佐米与 EGCG 的相互作用。A). 硼替佐米和 EGCG 的化学结构。B). 硼替佐米与 EGCG 的结合模式。C). 在酸性条件下，硼替佐米、EGCG 和 Fe3+ 纳米材料可以重新释放。 EGCG的口服生物利用度低也是限制其进一步应用的原因之一。大多数细胞实验中使用的EGCG浓度为10-100 μM，而口服3克脱咖啡因绿茶后的最大血药浓度(Cmax)为0.7 μM，增加剂量至4.5克并未显著增加Cmax值，表明存在饱和现象。在大多数研究中，EGCG只有在动物或人类胃消化后达到20-100 μM或更高浓度时才有效。例如，在前列腺癌患者的临床试验中，患者在手术前3-6周服用EGCG（800毫克/天），结果显示组织中无法检测到EGCG的存在。因此，如果要在临床试验中观察到体外实验的结果，就需要考虑儿茶素的生物利用度。这是因为EGCG在口服给药能达到的低生理浓度下的生理效应将非常有限。特别重要的是提高EGCG的稳定性和生物利用度。 5.纳米改性增强化疗效果  近年来，微囊化和纳米囊化技术作为提高EGCG稳定性和生物利用度的技术手段受到了广泛关注[87]。EGCG与化疗药物结合，通过纳米材料包封的组合药物的缓慢释放和靶向研究已经相当深入（表2）。EGCG与化疗药物的纳米改性不仅发挥其自身的抗肿瘤效应，减轻化疗的有毒副作用，还通过引入纳米材料增强了组合物的稳定性，减缓释放，并增强了药物动力学参数。它还具有低毒性、肿瘤靶向和定位成像能力的优势（图5）。其中，EGCG与DOX的组合是研究最深入的儿茶素相关二元组合策略。 图5. 包裹化疗药物和 EGCG 的纳米材料的多重有益效应 5.1.聚合物纳米粒子 通过抗乳腺癌药物赫赛汀与EGCG和PEG的自组装形成的胶束纳米复合物Herceptin-MNC，在肿瘤中的积累比游离赫赛汀多2.3倍，赫赛汀-MNC的血液半衰期比后者高29倍，而赫赛汀-MNC在肝脏、肾脏和肺部的积累速率比游离赫赛汀低1倍，表明基于EGCG的组合疗法比单一化疗药物具有更好的抗癌效果。使用PEG偶联的EGCG（PEG-EGCG）作为载体形成SU-MNCs，与口服/静脉注射舒尼替尼相比，在人类肾细胞癌异种移植小鼠中产生了更强的抗癌效果（更强的抗血管生成、诱导凋亡和抑制肿瘤增殖效果）和更低的毒性（图5）。DOX和EGCG之间的高效相互作用在PEG-EGCG胶束纳米复合物中实现了DOX的88%药物载荷，提高了DOX的循环稳定性和肿瘤靶向性，同时减少了DOX剂量依赖性副作用。 海藻酸具有对P选择素的强亲和力，诱导凋亡并抑制癌细胞增殖；透明质酸（HA）通过范德华力和氢键与癌细胞膜表面糖蛋白CD44结合。d-α-生育酚PEG琥珀酸酯（TPGS）通过阻断ATP结合位点并防止P-gp ATPase水解ATP来抑制ATPase活性。使用上述三种组分装载EGCG和DOX的纳米药物靶向胃癌治疗，比EGCG/DOX组合疗法显示出更好的抗肿瘤效果。装载EGCG/DOX的NPs的IC50为200/4 mg/L，是EGCG/DOX组合溶液（400/8 mg/L）的一半，纳米药物中DOX的细胞摄取率为60.42% ± 1.56%，远大于裸药中Dox的摄取率（28.62% ± 0.97%）。然而，将EGCG和多西他赛封装在TPGS偶联的透明质酸和海藻酸基纳米粒子中，纳米粒子通过靶向识别CD44和P选择素配体内化进入前列腺癌细胞，诱导G2/M期细胞周期停滞。进一步研究表明，纳米粒子比EGCG和多西他赛的组合显著更多地抑制肿瘤生长（53%对比31%），并且对非靶向器官无毒性。由HA-EGCG/顺铂偶联制成的胶束纳米复合物，其中HA暴露在表面，有效地传递到过度表达CD44的癌细胞，增加了纳米复合物在卵巢癌中的积累并延长了血液循环时间。通过铂纳米粒子和EGCG的pH可逆硼酸酯反应制备的基于酚的肿瘤渗透纳米框架（EGPt-NF），不仅诱导肿瘤细胞的免疫原性死亡和缓解肿瘤缺氧，还有效促进了树突细胞的成熟并下调癌细胞中的PD-L1，从而显著抑制了小鼠肿瘤的生长和转移。 光热疗法在控制药物释放、减少多药耐药和提高疗效方面具有很高的应用潜力，是抗癌治疗的有希望的策略。由叶酸（FA）、多巴胺（DPA）、DOX和EGCG开发的双重药物输送系统DOX-EGCG/DPA-FA NPs，在近红外光（NIR）组中DOX的细胞摄取率是游离DOX组和无NIR照射的对照组的三到六倍。DOX-EGCG/DPA-FA NPs通过抑制肿瘤生长和血管生成，增强乳腺癌细胞中的凋亡和坏死，提高了60%的乳腺癌小鼠存活70天以上，从而提高了治疗效果。由氧化铁、靛青绿和葡萄糖氧化酶合成的磁性光热剂（ICGOx@IO）装载了DOX和EGCG，最终开发了纳米药物ICGOx@IO-Dox-EGCG-PPP，结合化学-光热-饥饿疗法几乎消除了小鼠的肿瘤，并显著减少了Dox诱导的心脏毒性。 5.2.金属纳米粒子 甲氨蝶呤（MTX）和DOX与含有EGCG的花状金纳米簇通过半胱氨酸桥结合，形成了有效的药物输送系统（Au-Cys-MTX/DOX NCs），纳米复合物在体外和体内都显示出良好的抗肿瘤活性，因为MTX的引入为纳米药物提供了良好的靶向。由EGCG、铁离子和DOX自组装而成的纳米粒子与单独的DOX相比，肿瘤体积减少了66%，转移结节减少了73.7%，表明药物输送系统显著抑制了肿瘤的生长和转移，而铁离子作为磁共振成像（MRI）的优秀对比剂，为药物输送系统的准确定位提供了潜力。 使用Fe3+与多酚的配位将DOX和EGCG自组装成FDEP NPs，增加了药物在血液中的循环时间和其在肿瘤内的积累。FDEP NPs的循环半衰期是单独DOX的36倍以上。FDEP30 NPs对小鼠肿瘤形成的肿瘤生长抑制率为74.38%，显著高于DOX + EGCG（44.13%）。末端脱氧核糖核酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）对肿瘤切片的染色显示，FDEP30 NPs和DOX + EGCG的凋亡/坏死率分别为45.06%和27.9%。有趣的是，FDEP NPs在显著降低CBR1活性、减轻DOXOL产生和随后的心脏毒性的同时，抑制了肿瘤生长并促进了凋亡。 包括DOX、EGCG、Fe3+和HA的自组装纳米反应器，可以穿透血脑屏障靶向胶质母细胞瘤并抑制肿瘤生长，从而延长了携带肿瘤的小鼠的生存时间。尽管以前的研究报告称EGCG可以与硼替佐米复合以抵消后者的抗肿瘤效应，但最近的研究显示这种拮抗效应可以通过纳米技术逆转。由EGCG、硼替佐米和Fe3+组成的纳米药物可以促进纳米粒子在肿瘤部位的释放，由于肿瘤微环境的弱酸性，具有低毒性和肿瘤定位功能，并最终显著抑制了MDA-MB-231细胞携带肿瘤的小鼠的肿瘤生长（图4）。 由EGCG与5-羟基多巴胺修饰的顺铂(IV)前药(Pt–OH)、含多酚链段的嵌段共聚物(PEG-b-PPOH)复合制备的有机纳米治疗药物(PTCG NPs)，设计用于使纳米粒子聚乙二醇化，从而延长纳米粒子的循环时间，抑制蛋白吸附，并增强所获纳米药物在肿瘤中的积累（图5）。由于Fe3+与多酚基团之间的强配位作用，PTCG NPs中Pt–OH和EGCG的载药比例可以精确调节至治疗水平，从而实现协同效应。此外，纳米粒子可以掺杂钆离子(Gd3+)，借助MRI功能监测纳米药物的递送和释放行为，赋予纳米药物诊断能力。在低pH环境下，活性药物通过亚胺连接键的断裂和Pt–OH激活为顺铂，在HepG2细胞内化后有效释放。生成的顺铂通过级联反应提高细胞内H2O2水平，由Fe3+催化产生有毒的活性氧(ROS)，从而通过化学动力疗法增强疗效。 5.3.其他类型的纳米粒子 通过将生物相容性的介孔硅纳米粒子与天然多酚涂层结合，并装载抗肿瘤药物DOX，开发的给药系统MSN-Dox@EGCg-Apt，旨在在酸性环境或细胞内GSH的刺激下向肿瘤病灶释放药物；该系统允许实时荧光追踪，对正常细胞无毒，即使在500 μg/mL的高浓度下也不影响CEM、Ramos和K562细胞的活性。在PLGA-酪蛋白核壳中包裹紫杉醇与EGCG的纳米药物表现出比游离紫杉醇更长的循环时间、更好的可用性，并且没有器官毒性。该纳米药物降低了紫杉醇诱导的P-gp表达，增加了对紫杉醇耐药的MDA-MB-231细胞的紫杉醇敏感性，诱导凋亡，抑制NF-κB激活，并下调与血管生成、肿瘤转移和存活相关的关键基因。多酚胶体球(CSs)是由EGCG在水溶液中分子凝聚自组装而成，但在有机溶剂中分解并在水溶液中重新组装。重新组装的CSs/DOX的最大包封率和载药率达到90%和44%，该纳米药物可以逆转肿瘤细胞的耐药性，增强对乳腺癌的治疗效果。重要的是，单次生产运行产生了37.3克多酚CSs，为重组纳米药物的规模化应用奠定了基础。基于EGCG和熊果酸的纳米载体系统可以靶向EpCAM释放至肝细胞癌，可以增加CD4+和CD8+ T细胞的激活及其在肿瘤组织中的免疫浸润，从而产生显著的协同抗肿瘤治疗效果。 总之，EGCG和化疗药物的纳米化可以显著增强抗肿瘤治疗的效果，但在考虑EGCG和化疗药物的纳米组装时，需要精心设计纳米药物的形状、大小和靶向策略。形状和大小是纳米粒子的重要参数，球形颗粒最为常见。直径大于5 μm的颗粒在静脉注射后会引起肺部毛细血管栓塞。直径大于0.2 μm的颗粒不能通过过滤方法进行灭菌。网状内皮系统更快地清除大颗粒，并且不能通过血管外渗逃离血管系统。直径小于5 nm的颗粒可以被肾脏过滤迅速清除。纳米药物的靶向策略包括主动靶向和被动靶向。被动靶向在很大程度上依赖于肿瘤生物学(血管和渗漏性)和药物载体属性(循环时间、孔隙性和大小)。而主动靶向依赖于配体-受体结合，这提高了对目标部位的选择性积累。例如，可以向纳米粒子中添加HA或FA，以增强纳米药物的靶向，利用肿瘤细胞中CD44和叶酸受体的高表达。此外，向纳米粒子中添加金属离子(Fe3+, Gd3+)可以使纳米药物的递送和释放通过MRI检测。尽管基于EGCG和化疗药物的纳米药物很有前景，但目前还缺乏体内安全性研究，大多数现有研究集中在细胞和小鼠实验上。这些实验结果是否能够在临床环境中复制还有待进一步探索。纳米材料的质量稳定性和储存条件也需要进一步研究。 6.结论和未来展望  体外和体内实验表明，EGCG可以与多种化疗药物（如5-FU、顺铂、多柔比星、紫杉醇和他莫昔芬）联合使用，增强抗肿瘤治疗效果。这些作用机制包括减少CSCs的药物抗性、增强药物敏感性、诱导细胞周期停滞和凋亡、减少细胞自噬调节、阻断血管生成以抑制癌细胞侵袭和转移、抑制炎症和调节氧化应激。此外，EGCG可以减少化疗药物引起的胃肠疾病、心脏毒性、肾毒性、耳毒性、神经毒性和肺纤维化的发生率。但需要注意的是，EGCG可以与某些化疗药物（硼替佐米和舒尼替尼）结合，降低化疗效果。尽管EGCG可以通过多种方式增强化疗药物的治疗效应，但目前对EGCG的作用机制和进一步的药物学优化研究还不足。此外，由于基本上没有研究报告EGCG和化疗药物在临床治疗中一起使用，EGCG辅助化疗的概念应该在可能性/展望和临床验证方面得到更多关注。同时，考虑到EGCG的生物利用度低，我们探索了将纳米技术应用于EGCG化疗药物策略以增强化疗效果的可能性。共载EGCG和化疗药物的纳米粒子增强了药物的药代动力学和循环时间，增加了肿瘤细胞中药物的浓度，显著抑制了肿瘤的生长和转移，对非靶向器官表现出低毒性，并最终显著延长了小鼠的生存时间。总之，EGCG是化疗的良好辅助剂；利用纳米技术双重载药EGCG和化疗药物进行靶向肿瘤治疗，提高了EGCG的临床应用价值，突出了EGCG治疗策略作为有前景的研究方向。

导读：相比优化CD8+细胞毒性T淋巴细胞的抗肿瘤功能，激活自然杀伤细胞（NK 细胞）是另外一种新兴的肿瘤免疫治疗手段。迄今为止，工程化NK细胞主要是通过慢病毒载体和电穿孔进行制备。尽管它们效率高，但由于使用病毒成分、生产成本高以及电穿孔毒性高等限制因素，急需开发新的递送工具。采用mRNA-LNP技术在NK细胞表达任何感兴趣的靶蛋白是一种极具吸引力的非病毒递送方式。其中IL2是一种关键靶点，在激活、扩增NK细胞，增强NK细胞杀伤活性方面发挥非常关键的作用。 2024年6月24号，法国国家科学研究中心（CNRS）与赛诺菲公司团队合作在Molecular Therapy Nucleic Acids发表文章：Enhancing Natural killer cells proliferation and cytotoxicity using Imidazole-based lipid nanoparticles encapsulating interleukin-2 mRNA。他们开发了一种基于咪唑脂质的递送平台（ iCD-Lx和iD-LNP），可高效转染NK-92 细胞、KHYG-1 细胞和原代 NK 细胞，而不会产生细胞毒性。有趣的是，这种基于咪唑的脂质递送平台转染未修饰mRNA的翻译速率反而高于修饰mRNA。利用基于咪唑的脂质递送平台向NK细胞系和原代NK细胞递送IL2 mRNA，可延长存活期、维系激活标志物表达水平、增强细胞毒性。这项工作为构建工程化NK细胞提供了一种高效的非病毒载体方式。 01  研究背景：IL-2的免疫作用 IL2在激活、扩增NK细胞，增强NK细胞杀伤活性方面发挥非常关键的作用。IL2 主要由 T 细胞产生，与NK细胞表面存在由 IL2Rα和 IL2Rβ链组成的受体复合物结合，导致各种细胞内信号传导途径的激活，包括JAK-STAT途径，从而导致 NK 细胞的增殖和激活。通过增加激活受体的表达、释放细胞毒颗粒以及增强其他细胞因子的产生，IL2 能增强 NK 细胞对癌细胞和病毒感染细胞的细胞毒性。 IL2注射液是30 年前首次获批准的免疫疗法 。高剂量注射IL2会过度激活抑制性调节 T 细胞（Treg），展示出明显的毒性。在细胞移植治疗（ACT）中，低剂量IL-2与Treg耗竭策略结合使用，可降低毒性并维持转移细胞的活力。对于NK细胞疗法来说，寻找更加安全有效的IL2使用策略成为当务之急。 02  咪唑脂质递送平台的开发和优化 研究人员通过微流控设备制备了2种基于咪唑功能化脂质的递送系统：第一种称为iCD-Lx，由一种可电离咪唑脂质（IL）、携带咪唑鎓的阳离子脂质（CL）及不同的辅助脂质构成；第二种称为iD-LNP，由相同的可电离咪唑脂质和辅助脂质组成。 2.1 优化iCD-Lx递送系统 制备ARCA eGFP mRNA（无修饰） iCD-Lx制剂，转染NK-92细胞。当制剂配方中CL摩尔百分比从10%增加至20%时，转染细胞数量从20%增加到75%，荧光信号强度从400增加至800。一旦CL摩尔百分比超过20%，转染细胞数量会骤降。CL摩尔百分为10%时，对细胞毒性最强。随着制剂CL摩尔百分比增加超过10%，对细胞的毒性反而呈现下降趋势。 在ARCA eGFP mRNA（无修饰） iCD-Lx制剂配方中使用20%CL，用DMG-PEG替代DMPE-PEG后，转染细胞数量降低至50%，细胞毒性从5%上升至10%，荧光强度MFI无显著变化。 将iCD-Lx制剂配方中的胆固醇替换为β-谷甾醇后，细胞转染效率未发生改变，然而，如果iCD-Lx制剂配方采用β-谷甾醇和DMPE-PEG的组合，转染细胞数量会发生显著下降。 由20%CL，40%IL，胆固醇，DMPE-PEG制备的iCD-Lx制剂，其转染效率（75%）和mRNA翻译强度（MFE为800）是最佳的。 此外，当N/P比例为1时，iCD-Lx转染效率最高，而当N/P比例达到3:1时，不仅iCD-Lx转染效率发生骤降，细胞毒性也出现明显增加（20%）。 脂质体（iCD-Lip）与脂质体复合物（iCD-Lx）在PBS缓冲液中4℃条件下可稳定存放8周，脂质体尺寸大小和分散系数（PDI）均不会发生显著变化。4℃存放的iCD-Lx的转染效率与即时制备的iCD-Lx无显著差异。此外，iCD-Lx无论是否在血清中，在37℃条件均可稳定存放10h。 2.2 优化iD-LNP递送系统 根据不同比例的可电离咪唑脂质（IL）或者Dlin-MC3-DMA制备一系列LNP，包封0.2ug eGFP mRNA (5-MoU)，转染NK-92细胞。与IL-LNP相比，MC3-LNP转染NK-92细胞的效率极低。转染效率最佳（60%）的iD-LNP19制剂配方为：50% IL、39% β-谷甾醇、10% DOPE 和 1% DMG-PEG 以及 N/P 20。iD-LNP19制剂可在4℃条件下稳定存放8周。无论是否存在血清，在37℃条件可稳定存在10h。 03  mRNA修饰对咪唑脂质递送效率的影响 研究人员合成4种eGFP mRNA：ARCA UNR(未修饰)；UNR cap1（未修饰）；MNR 5-MoU cap1（5‘moU修饰核苷酸）；MNR PsiU Cap1(甲基甲尿嘧啶修饰核苷酸)，采用iCD-Lx或者 iD-LNP作为递送载体，转染NK-92或者KHYG-1细胞。对于未修饰的eGFP mRNA来说，携带Cap1结构要比ARCA表现出更高的转染效率和翻译效率。令人感到惊奇的是，与未修饰mRNA相比，修饰mRNA居然会表现出更低的转染效率和翻译效率。值得注意的是，iCD-Lx的翻译效率要高于iD-LNP，这与mRNA类型无关。在荧光显微镜下观察到，采用 iD-LNP或者iCD-Lx递送不同类型的mRNA均不会影响转染NK-92细胞的形态。 对于 iD-LNP或者iCD-Lx递送系统来说，转染效率均在3-4天达到平台期，但是，eGFP mRNA的翻译效率自转染后第一天开始后持续下降。与修饰eGFP mRNA相比，携带Cap1的无修饰eGFP mRNA（UNR）的转染效率和翻译效率均是最高的。 04  咪唑脂质与其他转染试剂或递送系统的比较 对于NK-92细胞来说。市售商业化转染试剂（ScreenFect,mRNA-Fect,Lipofectamine）的转染效率和翻译效率均明显低于 iD-LNP或者iCD-Lx。与SM102、ALC0315、MC3可电离脂质制备的LNP相比， iD-LNP转染NK-92细胞的翻译效率和转染效率明显处于最佳，相比之下， iD-LNP转染Jurkat细胞的效率与其他LNP类似，但翻译效率是最高。上述数据说明，可电离咪唑脂质（IL）非常有希望成为一种通用型的可电离脂质。 05  NK细胞靶向的IL2 mRNA咪唑脂质递送平台 NK-92细胞是一种IL-2依赖性的细胞系，培养基中需要添加IL-2以维持NK-92细胞的存活和增殖。当培养基中缺乏IL-2，培养3天后，NK-92细胞全数死亡。在培养基中加入IL-2重组蛋白后，NK-92细胞可存活6天。洗涤细胞，并且耗尽培养基中的IL-2，采用iD-LNP或者iCD-Lx向NK-92细胞中递送cap1 UNR IL-2 mRNA，NK-92细胞同样也可存活6天。有意思的是，iCD-Lx作为递送载体，可使得转染cap1 UNR IL-2 mRNA的NK-92细胞存活时间延伸至8天。此外，iCD-Lx共递送等量的UNR eGFP mRNA与IL-2 mRNA，可在NK-92细胞中实现IL-2与 eGFP的正常表达。 K562是一种人类慢性髓系白血病细胞系，对NK细胞杀伤极其敏感，激活Caspase-3/7可诱导K562细胞凋亡。与IL-2饥饿NK-92细胞相比，添加重组蛋白IL-2，IL-2 mRNA iCD-Lx，IL-2 mRNA iD-LNP均会增强K562癌细胞中Caspase3/7表达，同时，维持CD69、NKG2D或者NKP30、TNF-α水平不会发生下降。总的来说，在NK-92细胞中转染IL-2 mRNA可达到补充IL-2重组蛋白同样的效果。 06  咪唑脂质递送系统在原代NK细胞中的转染效率 对于eGFP mRNA转染原代NK细胞来说，iCD-Lx转染效率可达到80%，而iD-LNP转染效率大致在50%左右。同时，这两种咪唑脂质递送系统均不会对原代NK细胞的存活率造成不利影响。与NK-92细胞类似，缺乏IL-2会导致原代NK细胞相比转染IL-2 mRNA或者补充重组蛋白IL-2的细胞中的CD69、NKG2D、NKP30表达水平减少。转染IL-2 mRNA或者补充重组蛋白IL-2的原代NK细胞增殖能力类似，均高于缺乏IL-2的饥饿原代NK细胞。无论是添加重组蛋白IL-2还是转染IL-2 mRNA均会导致原代NK细胞中的TNF-α表达水平相比于饥饿细胞有所升高，这导致与原代NK细胞共同孵育的K562细胞中的caspase3/7表达显著提升，引发非常显著的细胞毒性反应。 07  总结 NK细胞免疫疗法的一般流程为：分离NK细胞，并在体外合适的条件下扩增NK细胞，然后，输送会患者体内，以此抑制或者杀死肿瘤细胞。工程化NK细胞表达靶向特定肿瘤抗原的嵌合抗原受体制备的CAR-NK细胞具有更低的潜在毒性和更广泛的抗肿瘤效果，近年来备受关注。随着CAR结构的不断升级，引入细胞因子或趋化因子受体结构的第四代CAR结构能够改善免疫细胞一些固有缺陷并赋予其额外的特定功能，从而促进肿瘤免疫治疗效果。 但是，要实现NK细胞的工程化改造，必须借助于递送载体。由于电穿孔和病毒递送载体的局限性，科学家希望借助正处于风口之上的mRNA-LNP技术，更加高效地对NK细胞实现基因改造。这项工作最为重要的贡献在于优化了基于咪唑脂质的递送系统：iCD-Lx和iD-LNP，使其高效转染NK细胞系和原代NK细胞。令人感到欣喜的是，咪唑脂质递送系统的在细胞水平的转染效率和翻译效率明显优于市售的转染试剂和已知的可电离脂质制备的LNP（SM102、ALC0315、MC3）。同时，利用iCD-Lx和iD-LNP向NK细胞系和原代NK细胞递送IL2 mRNA，可明显提升NK细胞的增殖能力和细胞毒性。未来，还需要再体内进一步验证咪唑脂质递送系统的效率和毒性。 参考文献  [1] Christophe Delehedde, Ivan Ciganek, et al. Enhancing natural killer cells proliferation and cytotoxicity using imidazole-based lipid nanoparticles encapsulating interleukin-2 mRNA. 2024, 35(3): 102263 DOI: 10.1016/j.omtn.2024.102263. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

病理学（Pathology）是从疾病的发病原因、病理变化的过程、病变部位及病理形态等方面进行研究，是了解疾病发生的本质及其变化规律的重要手段，是医学科学的重要组成部分。长期以来，病理学被形象地比喻为“桥梁学科”和“权威诊断”，这充分表明了它在医学中，特别是在临床医学中占有不可替代的重要地位。病理学可以回答疾病状态下的形态结构、机能代谢的改变，这些改变与临床上出现的症状、体征之间的关系、疾病的诊断、转归和结局等临床医学中的种种问题。病理诊断（Pathological Diagnosis）在医学诊断中具有权威性，病理诊断在明确疾病性质，解释临床症状、决定治疗原则、评估预后以及明确死亡原因等方面起至关重要的作用，是疾病诊断的金标准。病理诊断是在对器官的进行大体观察、镜下观察组织结构和细胞病变特征而做出的疾病诊断，因此它比临床上根据病史、症状和体征等做出的分析性诊断（常有多个诊断或可能性诊断）以及利用各种影像（如超声波、X射线、CT、核磁共振等）所做出的诊断更具有客观性和准确性。尽管现代分子生物学的诊断方法（如PCR、原位杂交等）已逐步应用于医学诊断，但到目前为止，病理诊断仍被视为带有宣判性质的、权威性的诊断。在现代科技的支撑下，创新药物的研发的效率已取得了明显的进步，但仍然面临巨大挑战。病理学在创新药物研发领域逐渐发挥了举足轻重的作用。它可以通过对疾病组织进行病理解剖、免疫组化及分子生物学研究，探讨组织、细胞和分子水平疾病发生机制，从而为寻找新的治疗靶点、提出新的治疗策略，为创新药物的安全性评价、药效评估、剂量选择、作用机制等提供有力的科学依据。越来越多的研究表明，分子病理涉及肿瘤的早期诊断、预后判断及个体化分子靶点检测等多个方面，在肿瘤分子靶向创新药物研发中发挥重要作用。病理学是一门古老的学科，但是随着科技不断进步，病理诊断技术也在不断追求基础理论的探索和应用实践的创新。已发展为传统的解剖、组织形态学和免疫组织化学及原位杂交等分子技术相互补充、综合应用的新阶段。当代的病理诊断建立在细胞、组织结构和蛋白质、核酸分子改变共同构成的组织病变基础之上，从而为疾病的预防、早期诊断、精准治疗提供重要的理论和技术支撑。本文将从病理诊断技术的分类、技术流程、在创新药研发中的应用、在临床试验中的合规性要求以及在创新药物研发中的应用案例分享等方面进行阐述，以期帮助大家全面了解病理诊断技术及其在创新药物研发中的应用。同时也热切地期待这门古老的学科的不断进步能够推动实现创新药精准治疗的研发进程，为人类健康事业做出更大的贡献。病理诊断技术分类肉眼的大体观察和光学显微镜水平的形态学研究方法，是病理学诊断和研究中最经典、最基本的方法。随着生物医学新技术的快速发展与广泛应用，一些新的先进技术手段也逐渐应用在疾病的研究和病理学诊断中。病理诊断通过分别与免疫诊断、分子诊断结合，形成了免疫病理和分子病理，将病理诊断从组织、细胞水平的形态学观察深入到蛋白与分子水平。下面介绍几种常用的病理诊断技术。图1 病理诊断分类1、常规病理（1）组织病理是病理学最重要、最基础、应用最广泛的技术。通过将病变组织制成切片，经不同的方法染色后用显微镜观察，分析和综合病变特点，做出疾病的病理诊断。组织病理的样本一般通过开放手术、内镜检查或经皮穿刺活检获取。常用的制片方式有常规石蜡切片、快速冰冻切片等。常用的染色方法是苏木素-伊红（Hematoxylin and eosin，HE）染色。（2）细胞病理是研究组织碎片、细胞群团、单个细胞形态和结构以及细胞间比邻关系。采集病变处的细胞或自然分泌物、体液、排泄物等，涂片染色后进行细胞学诊断。细胞病理的样本一般通过体液、拉网、细针穿刺、脱落细胞等途径获取。细胞病理常用制片技术分为巴氏涂片及液基薄层细胞学制片技术。2、免疫病理免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）和免疫细胞化学（Immunocytochemistry，ICC）是临床病理诊断中常用的技术和手段，是应用免疫学基本原理抗原抗体反应，即抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原。然后通过免疫动物后获得特异性的抗体，再用此抗体去探测组织或细胞中的同类抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法（荧光素、酶、金属离子、同位素）将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性、定位或定量的研究。图2使用Leica BOND III全自动免疫组化仪进行免疫组化染色的流程图由于具有特异性强、敏感性高、定位准确、形态与功能及代谢相结合等特点，免疫组化已经成为医学基础研究和临床病理诊断中不可或缺的技术手段之一，广泛应用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测、细胞属性的判定、淋巴细胞免疫表型分析、激素受体和耐药基因蛋白表达的检测、细胞增殖和凋亡、细胞周期及信号传导的研究等。图3免疫组化染色的代表性图像:a鸟氨酸转氨基甲酰基酶（高表达）；B精氨酸琥珀酸合成酶（低表达）[1]3、分子病理分子病理是应用分子生物学方法，以组织学/细胞学标本为载体，从基因水平上检测受检个体或其携带病毒、病原体的遗传物质的结构或含量的变化而做出诊断的技术，被广泛应用于传染性疾病、血液筛查、遗传性疾病、肿瘤伴随诊断等领域，以协助病理诊断和分型、指导靶向治疗、预测治疗反应及判断预后。目前分子病理技术主要包括原位杂交、荧光原位杂交（FISH）、基因重排、实时定量PCR、DNA测序、基因芯片技术等。不同技术路线各有优劣，其中PCR与FISH技术平台发展相对较为成熟。分子病理技术也可应用于肿瘤标志物的检测，在肿瘤微环境研究、肿瘤细胞克隆演化进程追踪等方面有着不可替代的作用。图4 病理诊断技术特点病理诊断技术流程病理诊断技术流程主要包含取材、制片、诊断和报告四个步骤。制片是病理诊断过程中相当重要且最复杂的阶段，包括组织脱水、包埋、切片、染色、封片。图5 病理诊断流程对免疫组化染色组织进行评分并不是一项简单的任务，因为在不同的细胞和组织类型中可能观察到不同的模式。需要仔细观察染色模式、强度和面积，并将其纳入评分方案。在肿瘤药物研发中，多使用免疫组化评价蛋白表达，将细胞的染色特征，如细胞质、细胞核或膜染色，根据染色强度级别（0-3分）、着色细胞占比或合并评分并建立阈值（cutoff value) 的方法进行免疫组化表达的评价[2, 3]。免疫组化结果解读时需要考虑假阴性和假阳性。如果抗体已失活或浓度不合适；或由于组织自溶或操作步骤不当导致的抗原丢失等，都有可能产生假阴性结果。如果抗体与组织非特异性结合（所用抗体浓度过高或染色过程中切片干燥导致抗体与组织产生非特异性结合或在应用多克隆抗血清时抗体特异性较差），或组织或细胞中有内源性过氧化物酶、碱性磷酸酶及生物素等产生非特异性显色则可能得到假阳性结果。为了避免假阴性和假阳性结果，免疫组化的各个步骤须保持一致，包括样本固定，脱蜡（会对FFPE组织），抗原修复，尽量减少背景结合HRP或ALP，选择适当抗体（种类和交叉活性）等。其次，可以通过图像分析工具对IHC图像采集进行量化，使样本之间判断标准统一。病理诊断技术在创新药研究中的应用病理诊断在药物研发的各个阶段均有使用。无论是在药物发现早期的靶标筛选和靶标验证，还是临床前药效和药理毒理研究，以及临床试验过程中的病理检测和诊断，生物标志物的组织学检测和判读等，均需要使用病理诊断技术。表1 免疫组化在药物研发各阶段的应用（1）  在早期研发及动物实验中应用安全、有效、质量可控是药物的三大属性，也是新药能否成功上市的标准。病理学诊断在药物非临床研究中发挥着重要的作用。在毒理学研究中，病理诊断是评价新药潜在毒性的重要手段，不仅可以提供药物剂量与毒性反应的关系，还可以确定药物毒性作用的靶器官。在药理学研究中，免疫组化试验可以用于阐明药物的药效作用及机制，对试验结果进行科学的解读。在抗肿瘤药物评价中，我们可以通过免疫组化技术检测肿瘤核增值抗原ki67的表达情况并评估药效，通过Caspase3/7等蛋白的表达，来判断药物治疗是否引起了肿瘤细胞凋亡。在干细胞产品评价中，成瘤性是评价干细胞治疗产品安全性的一个重要指标。因为实验使用免疫缺陷动物，个别动物可自发形成肿瘤，干扰结果判定。因此，试验过程中，对接种干细胞的动物形成的肿瘤，可通过免疫组化技术检测肿瘤是否表达人的抗原，来判断肿瘤是否来源于干细胞，从而排除自发肿瘤对结果判定的影响。免疫组化的结果不仅可以用于辅助诊断，还用于选择合适的体内肿瘤模型进行药物疗效研究。与其它生物标志物检测平台一起评估，也有助于理解药物的药代动力学-药效学（PK-PD）关系，为临床试验入组患者的选择及确定临床实验首次给药剂量的确定提供参考。（2）  在临床用药及创新药临床试验中的应用免疫组化可为临床用药提供治疗方案。随着越来越多的肿瘤药物相关基因和蛋白的发现，可以通过免疫组化的方法来检测相关基因和蛋白的表达水平。免疫组化不仅提供了蛋白质丰度的半定量评估，而且还对表达的细胞进行定位[5]。一方面，在免疫抑制剂PD-1/PD-L1的用药上，免疫组化是目前临床诊断级别评估肿瘤组织PD-L1表达水平的唯一方法学，另一方面可以初步判断患者化疗和分子靶向药的适用范围，为下一步更精确的检测提供筛检依据。目前应用最多的是乳腺癌中ER、PR、HER-2检测，另外包括ALK阳性的肺腺癌可以使用靶向药克唑替尼、胃肠道间质瘤CD117阳性可以使用格列卫治疗等。免疫组化可以通过分析肿瘤标志物，从而辅助诊断和鉴别诊断。仅需特异性抗体即可在常规实验室内完成，准确度高且方便快捷。肿瘤标志物是指由肿瘤组织或其与宿主相互作用所产生的一类活性物质，特征性存在于肿瘤细胞，多存在于体液及组织中，对肿瘤早期诊断、治疗与预后分析等有重要临床意义。目前常见的肿瘤标志物有癌胚抗原类、酶类、激素、糖类抗原、癌基因及抑癌基因、细胞表面肿瘤抗原、miRNA、lncRNA、ctDNA、外泌体、循环肿瘤细胞等[6]。许多肿瘤标志物的伴随诊断产品可以采用免疫组化平台、PCR或原位杂交等分子病理平台进行检测，最终指导患者对药物的治疗。由于个体差异，癌症患者要找到适用的药物，就必须得到自己独特的基因或表达，这种检测常常与精准治疗药物绑定使用，称为伴随诊断（CDx，companion diagnosis）。体外诊断在医疗领域被誉为“医生的眼睛”，伴随诊断正是体外诊断技术的一种。所谓“精准治疗、检测先行”，伴随诊断可以辅助判断某一特定治疗产品对患者是否受益，从而调整治疗方案或用药方案，最终达到提高治疗效率并降低无谓治疗开支的目的。肿瘤的精准治疗可以通过激活人体自身免疫系统，让免疫系统重新识别出逃逸的肿瘤细胞，从而抵抗并治愈癌症。实现个体化医疗，首先需要精确检测病理组织或者血液中特定生物标志物的水平，来预测患者对特定药物的敏感性与毒副反应的大小，从而对每个病人选择合适的药物和剂量进行治疗，以求达到最佳的治疗效果。近年来，随着免疫组化技术的发展和各种特异性抗体的出现，许多疑难肿瘤得到了明确诊断，尤其是免疫组化在肿瘤诊断和鉴别诊断中的实用价值受到了普遍的认可，其在低分化或未分化肿瘤时的鉴别诊断准确率可达50%-75%。目前不仅在肿瘤治疗领域，在神经系统、血液疾病以及免疫系统疾病领域，都开始重视通过生物标志物的检出来指导用药。同时，伴随诊断对于新药研发的意义也愈加凸显。随着新药研发难度和成本的不断增长，创新药企开始将伴随诊断引入其研发环节，帮助更好的筛选出有效病人，提高临床试验的成功率。根据ARK研究，伴随诊断的新药研发可将研发成本降低60%左右，同时也有助于提高新药的获批概率。病理诊断技术在临床试验中的合规性要求正如前文所述，病理诊断技术在新药的研发和临床试验过程中扮演着重要的角色，关乎临床试验的进度、药品的疗效和安全等重要指标，故国内外的药政部门对病理检测机构的资质、质量体系、技术体系、生物安全等方面均有较高的要求。1、 资质要求临床试验过程中的病理检测和诊断在实施过程中需要满足《药物临床试验质量管理规范》、《药品注册核查要点与判定原则（药物临床试验）》、《抗肿瘤药物临床试验中心实验室使用专家共识（2019版）》等指导原则的相关要求，如：病理检测实验室或所属组织应具备独立的法人资格、不参与临床的诊断和诊疗、定期参与能力验证活动并获得满意结果等。图6 临床试验过程中的病理检测和诊断相关指导原则2、质量体系作为参与临床试验中的病理检测的中心实验室，其质量体系各个要素应满足ISO15189《医学实验室质量和能力认可准则》及其在病理相关领域的应用说明要求，以及满足CAP认证的标准中相关要求。首先，中心实验室的设施设备、场地环境、通讯、仓储空间和供电等硬件设施应符合相关要求，且应具备质量管理、方法学建立/验证、文件管理、仪器设备管理、数据管理、样本管理和人员管理等完善的管理体系。质量要素通常包含：人员、环境、设备、试剂耗材、生物安全、信息系统到检测服务全过程，通常涉及14个要素；其次，监管机构为了促进病理学科向规范化、精细化和现代化发展，通常要求病理检测机构的质量体系应通过ISO15189的认可或CAP认证。图7 病理学检测良好操作规范核心质量要素3、 生物安全要求病理检测中经常会接触到患者或实验动物病变的器官、组织、细胞、体液及分泌物等，许多标本都是新鲜的病变标本，可能含有传染性的微生物和病原体，在标本处理不当时，容易通过呼吸道或皮肤粘膜进入人体引发生物安全事故。故病理检测实验室还应满足《病原微生物实验室生物安全管理条例》、《病原微生物实验室生物安全环境管理办法》、《人间传染的病原微生物目录》生物安全的管理要求和备案要求。4、技术标准要求由于病理检测采用的技术不同，涉及的层面不同，故病理检测的技术标准需要根据检测手段、应用的范围逐一对应技术类的指导原则或操作规范。按照病理技术分类、以及应用范围去选择和遵循不同的指导原则。图8 病理技术标准要求遵循的指导原则5、AI病理的规范性要求近年来，AI技术以其高效和精准的数据处理能力，在数字病理领域发挥着越来越多的应用价值，但由于AI病理参与临床的检测和诊疗，涉及医学数据准确性、受试者隐私保护、数据安全等各种问题也需要得到解决，AI病理规范性方面也逐步纳入药政部门的监管。2023年7月10日国家药监局发布了关于人工智能病理相关审批要求：《影像超声人工智能软件（流程优化类功能）技术审评要点》、《病理图像人工智能分析软件性能评价审评要点》、《病理图像人工智能分析软件临床评价审评要点》、《血液病流式细胞学人工智能分析软件性能评价审评要点》。参与临床试验的病理检测实验室临床试验中的病理检测通常是在中心实验室或研究机构的病理科(或检验科)来完成的，由于三种类型实验室存在各自的优势和劣势，如何选择合适病理检测实验室是很多申办者或CRO面临的难题。图9 临床试验在中心实验室和病理科或检验科中的流程（1）中心实验室是指在多中心试验中，为避免临床试验机构临床实验室无法检测某个或多个涉及安全性和疗效指标的检验项目，或各个实验室的检查方法、正常值范围不同而对试验数据造成大的检测偏倚而建立的一种实验室，也是一种合同研究组织（Contract Research Organization，CRO）。其目的是为临床试验提供特殊服务，应有严格的质量体系，有良好的质量控制，方法应进行合理验证，确保评价工具的科学性和可靠性并经有关的药政部门定期审查确认，试验过程应满足药物临床试验相关法规的要求。中心实验室采用相同的测试方法和设备，统一测试来自所有研究中心的样本，采用统一严格的质量控制措施，可以有效地避免不同实验室存在的差异，提高临床试验的质量。（2）检验科。《医疗机构临床实验室管理办法》中对临床检验科的定义为对取自人体的各种标本进行生物学、微生物学、免疫学、化学、血液免疫学、血液学、生物物理学、细胞学等检验，并为临床提供医学检验服务的实验室。检验科检测的目的主要有为疾病诊断提供依据；为疗效观察和预后判断提供依据；为预防疾病提供资料；为科学研究提供数据，如新药研发过程中疗效的判断。（3）病理科在医疗过程中主要承担病理诊断工作，通过活体组织检查、细胞学检查等，为临床提供明确的病理诊断，确定疾病的性质。临床科室需要根据病理诊断结果或报告来确定疾病的诊断，以及确定临床治疗方案。图10 中心实验室与病理科或检验科的比较鉴于临床试验机构的临床实验室和中心实验室各自的优缺点，涉及临床试验样本检测是由研究机构还是委托中心实验室进行统一检测，申办者和研究者需根据检测目的、样本特点进行充分评估。对一致性要求高的疗效或预后指标，可以选择在中心实验室检测；对于临床常规检验项目，受试者需承担额外的诊疗风险和经济负担的，不符合质量管理要求的，应该在临床试验机构内检测。随着药物研发的飞速发展，国际和国内多中心临床试验项目日益增多，越来越多的临床试验已在全球范围开展，研究规模越来越大，更多的研究机构分布在更多的国家。全球几乎所有主要地区都已成为临床试验结构的一部分。随着中心实验室在临床研究中的广泛使用，全方位的检测技术平台越来越受到重视。北京阳光德美医药科技有限公司自成立以来，始终坚持高质量的服务，可提供统一的覆盖采集包制作、采集培训、样品物流、样本管理、样品检测、数据传输、检测完毕样品永久保存等一站式的中心实验室的定制化服务。阳光德美中心实验室拥有生化、免疫、血液、流式、病理、质谱、细胞等多个检测平台，可满足客户在安全性分析、生物标志物分析、药代动力学（PK）研究、药效学 （PD）研究等不同研究目的检测需求，确保以国际一流水准助力高质量临床研究。病理诊断技术在创新药物研发中的应用案例北京阳光德美病理学服务平台符合中国CCPI认证、北欧NordiQC、CAP PT、GLP/GCP认证要求。拥有全套先进的病理制片和分析设备，包括全自动组织脱水机、组织包埋机、全自动轮转式石蜡切片机、全自动玻片染色机、全自动封片工作站、全自动免疫组化染色机、正置显微镜、荧光显微镜 、Opal荧光多标技术（AKOYA）等，可提供临床试验样本检测、伴随诊断产品开发、实验动物病理检测和宠物病理检测等服务。图11 阳光德美病理平台仪器具体服务内容包括常规病理和特殊病理。常规病理服务包括：常规及特殊取材组织脱水（实验动物）、组织包埋（石蜡或OCT）、组织切片（单张组织或组织芯片）、苏木素伊红染色（HE）；特殊病理服务包括：特殊染色、免疫组化、多重荧光（mIHC）。可以提供多靶点蛋白的定量、免疫细胞的分型、信号通路研究、小分子与蛋白之间的关系等相关药物研发、个性化医疗以及伴随诊断CDx产品开发等方向的服务。平台还拥有专业的病理学专家，可为临床试验中的病理学诊断、生物标记物检测、受试者筛选、疗效评估提供高质量的病理阅片服务。团队成员在病理学领域拥有雄厚的行业沉淀，尤其在Claudin18.2、PD-L1、Her 2、STING、COX-2、EP4、HPV、TIL（CD4+、CD8+）、CD47、CD3、EGFR（T790M突变）、VEGF等指标的研究上具有丰富的经验。典型案例介绍DLL3是Notch通路配体家族的成员，在小细胞肺癌（SCLC）中，DLL3通常被过度表达，作为治疗小细胞肺癌的“明星”靶点，目前，靶向DLL3的药物有单/双抗、ADC、双特异性T细胞接合剂(BiTE)和CAR-T。根据肿瘤类型和细胞生长环境的不同，DLL3的激活可以发挥促癌或抑癌作用。有报道，DLL3在小细胞肺癌、乳腺癌、垂体瘤、急性髓系白血病中有促癌作用，但在肝癌、神经胶质瘤和恶性胶质瘤中却发挥了抑癌作用。在小细胞肺癌中，DLL3在超过80%患者中高表达，并且在肿瘤的细胞膜和细胞质中都高表达；但是，在正常组织中少量表达或不表达。临床研究表明，SCLC中的DLL3高表达与患者的生存期呈现负相关，即DLL3表达量越高，患者的生存期越低。在原发性肝癌中，有研究提示，DLL3的表达被乙肝病毒诱导的DNA甲基化和组蛋白乙酰化所抑制。抑制组蛋白去乙酰化酶的抑制剂可以使DLL3在HCC中重新表达。重表达的DLL3可以抑制HCC细胞的生长并诱导细胞凋亡。因此，在原发性肝癌中，DLL3可以抑制癌细胞的生长。更多研究显示DLL3在多种癌症中异常表达，发挥不同作用。比如，DLL3在异柠檬酸脱氢酶IDH突变的神经胶质瘤细胞中表达，特别是在1p/19q缺失的神经胶质瘤细胞中高表达；在胰腺癌中，激活的DLL3可以刺激Notch信号从而促进癌细胞的生长；在黑色素瘤中，DLL3/MAPK通路可以促进黑色素瘤细胞的增殖和迁移；在子宫内膜瘤中，高表达的DLL3与较差的生存期和较差的无进展生存期相关。近年来，以DLL3为靶点的治疗方法已在临床试验中得到验证。其中，靶向DLL3进展最快的抗体药为Rova-T（Rovalpituzumab Tesirine），目前正处于临床III期。虽然该抗体药在临床II期治疗中的表现没有达到预期效果，但是艾伯维公司（AbbVie）还在进行III期临床实验。AMG-757（Tarlatamab）是由安进公司（Amgen）研发的靶向DLL3/CD3的双特异性抗体，用于增加免疫细胞，促进肿瘤细胞凋亡。目前AMG757治疗SCLC的I期临床研究正在进行中。同时，处于临床阶段的还有HPN-328和89Zr-DFO-SC16.56。DLL3作为一个重要的Notch配体与多种肿瘤的发生发展密切相关，吸引着药企尝试开发DLL3靶向药。阳光德美已经在小细胞肺癌组织中完成免疫组化检测方法的建立及优化工作，通过免疫组化法检测表达DLL3的肿瘤细胞占比，通过高表达DLL3个体的判定来协助筛选临床试验的目标受试者，大幅提高临床试验达到临床药效终点的成功率。Claudin 18.2是Claudins蛋白质家族中的一个亚型，广泛分布于胃、胰腺和肺组织。在胃癌、胰腺癌、肺癌、食管癌等消化系统恶性肿瘤中高表达，使得Claudin18.2成为恶性肿瘤治疗的一个潜在靶点。目前，针对该靶点开发的药物，包括单克隆抗体（mAb）、双特异性抗体（BsAbs）、嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法和抗体偶联药物（ADCs）等。阳光德美病理平台采取Claudin 18.2高表达的胃腺癌组织，建立了该靶点的免疫组化分析方法，可以支持相关药物的研发和伴随诊断产品的研制。同时，阳光德美还建立了PD-L1的免疫组化方法。通过免疫组化法检测肿瘤细胞或免疫细胞（IC）PD-L1的表达量，进而评估PD-L1抑制剂的疗效。需要注意的是不仅仅肿瘤细胞表达PD-L1，肿瘤浸润的免疫细胞也会表达PD-L1，因此在界定PD-L1阳性率的时候是否需要考虑这些免疫细胞的含量。对于PD-L1免疫组化结果的判读，阳光德美也有丰富经验。此外，阳光德美还利用脾脏组织建立了CD4的免疫组化方法。上述靶点阳光德美均已有完整的免疫组化解决方案，可以支持临床样本分析。结语近年来，病理诊断这个赛道在国内逐渐火热。一方面，随着老龄化持续演进、癌症发病率不断增长，病理诊断的重要性愈发凸显。靶向治疗药物及精准医疗不断地发展及自动化设备也随之不断普及，病理诊断领域增长潜力巨大。随着肿瘤发病人数不断上升，肿瘤大分子创新药物研发在近年呈现爆发的势头，由此促发检测蛋白靶点的免疫组化伴随诊断市场进入爆发前夕。目前，从技术层面伴随诊断市场可细分为免疫组化和分子诊断。依托分子诊断技术的小分子药开发已经成为红海，而依托免疫组化技术的肿瘤大分子药物研发正在被挖掘之中。另一方面，目前国内肿瘤诊断水平相对较低，免疫组化产品市场仍由国外企业主导，其中65%-70%市场份额被罗氏、徕卡等国外企业占据，在主要市场中还处在相对垄断的地位。剩余30%-35%市场份额被国内企业占有。国家也在提倡国产替代进口，这也给国内公司的未来发展提供了一个比较好的机会。虽然与国外相比，中国的病理诊断市场还处于初期阶段，但随着精准医疗的发展，预计很快会迎来高速发展期。- 上下滑动查看参考文献 - 参考文献[1] Chan S L, Cheng P N M, Liu A M, et al. 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