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侃言 勃林格殷格翰在癌症领域有重大布局，其中针对KRAS靶向抑制剂的研究投入了不小的精力，其针对KRASG12D激活态非共价抑制剂BI-2852已经处在临床前的研究阶段。 本周，勃林格殷格翰在医药顶刊杂志J Med Chem上刊载了其在KRASG12D激活态PPI抑制剂的研发过程中针对金属离子（尤其是钯金属盐残留）干扰对生物试验的影响进行了报道，同时也报道了其高通量筛选发现靶标苗头化合物的研发流程，以及后续的生化验证。 01 高通量筛选发现苗头化合物      针对化合物库进行无偏筛选，鉴定苗头化合物作为后续开发的起点，仍然是小分子药物研发的主流。 勃林格殷格翰与FORMA制药合作，对10个高价值药物靶标的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）抑制剂进行高通量筛选（HTS）其流程如下图所示。 其中针对热门靶点KRASG12D参与的PPI抑制剂发现，经过层层筛选、去除，初步产生了6,917个确定的KRAS激活态活性的化合物。 再通过排除非特异性感染、剂量依赖性筛查等，进一步获得87个簇群代表化合物，并通过适应饱和转移差核磁共振（STD-NMR)和热移试验（TSA）测定CRAF结合，共获得7苗头化合物。 研究人员在这个过程中敏锐的发现，可能有假阳性的存在。 首先，针对泛分析干扰化合物（PAINS），以及其它的已知的干扰分析技术的化合物（CIAT）基序，进行了检查、活性匹配。 然而，7个最终获得的苗头化合物尽管具有STD-NMR活性，但却没有一个可以通过SPR、或者X单晶衍射晶体学验证。这无疑给这项靶点筛选带来了无比的错乱！ 02 基于片段的筛选发现苗头化合物    在进行高通量筛选的同时，研究人员也平行进行了基于片段的筛选，并从结合比较微弱的片段分子中开发出了具有nM抑制活性的KRASG12D抑制剂，BI-2852。 在此基础上，研究人员使用基于核磁共振的片段筛选(FBS)，针对GDP和非水解GCP负载的KRASG12V/G12D进行筛选。这种方法曾产生了核磁共振和X射线验证的苗头化合物，具有毫摩尔KRAS激活态亲和力。 然而，现在这些苗头化合物在基于AlphaScreen的KRASG12D(GTP)::CRAF 生化筛选中，失去了活性，如下图。 研究人员利用从FBS筛选中确定的结构相似的苗头化合物，设置对照试验，进行补充研究。 FBS Hit 1在X单晶衍射研究中获得确认，然而FBS Hit 2的结合模式仍很模糊（上图C和下表)，可能是结合比较微弱。 利用FBS Hit 2的羰基结构进行亚结构搜索，研究人员有鉴定出了两个羰基化合物Comp 3、Comp 4，在AlphaScreen中具有微摩尔级的PPI抑制活性。 03 重合成确定活性消失的原因      尽管有大量的实验证据、结构相似性、晶体结构等，仍然无法在AlphaScreen方法中重复Comp.3、Comp.4及其邻近类似物的抑制效力，从上表Table 1中可以看出，很不稳定。 经验这东西，真的很难得! 在对构效关系研究中，不稳定的陡峭变化引起了团队的注意，即未知的混合杂质因素可能会显示IC50值，进而影响配体的IC50值的测定。 这种情况，团队曾经在先前的磷酸甘油酸脱氢酶的项目中遇到过，其明显的酶抑制活性是由酮和汞杂质的存在导致的。 因此，研究人员检测了第一批Cmpd 3、Cmpd4的过渡金属含量，分别发现24,000 ppm和29,000 ppm的Pd污染！ 继续追溯片段化合物的合成，这些Pd污染来自于Suzuki偶联过程。 同时研究发现，PdCl2单独抑制KRASG12D(GTP）::CEAF AlphaScreen和对照试验的IC50值分别为0.7 μM、5.8 μM。 04 过渡金属催化的必要性及对下游的影响      碳-碳键的形成是现代有机合成的一个重要方法，通常由过渡金属催化剂的使用介导。在这种特殊情况下，Pd经常被用来催化两种化合物的化学合成。 从粗反应产物中消除过渡金属污染物可能会带来重大挑战，因为金属杂质和所需产物之间形成的配合物可能在各种纯化条件下（例如，沉淀、结晶、反相或正相色谱）表现出稳定的形式。 因此，即使在使用最先进的反相色谱技术进行纯化时，来自常用合成有机化学催化剂的金属杂质往往也是不可避免的，并且可能带来重大的去除挑战，工业规模的制药生产工作流程也是如此。 勃林格殷格翰确定了解决方案和实用除钯指南，如下图。 然而，这些解决方案只能是在重合成和重纯化的过程种应用。对于从供应商获得的庞大化合物库（成千上万甚至百万），无法预先处理。 因此，开发对重金属杂志敏感度低的筛选分析方法，再辅助开发强大的金属敏感性测试工具，以分析当前和未来的分析组合，反而更为实际一些。 05 金属离子干扰装置（MIIS)开发     研究发现，基于荧光的AlphaScreen的Pd干扰就有一般的敏感性，有标记的重组蛋白存在时，这种敏感性明显变差。 将相同的标记蛋白质转换为基于荧光的时间分辨荧光共振能量转移试验（TR-FRET）形式，导致灵敏度显著降低了近2个数量级，同时保持了原始AlphaScreen中观察到的相当阳性对照灵敏度。 这表明，可以通过不同的筛选方式，在一定程度上避免金属残留的影响。 研究团队总结了不同类型的反应引入的金属残留，如下表。 并总结了不同检测方法和筛选技术对应内部的靶点研究。 研究发现，一些过渡金属，如Pd2+，Au3+和Ag1+在大约16%的测试分析/靶组合中具有高抑制作用(IC50 <1 μM)。 但其他金属，例如Mn2+， Zn2 +，Co2+和Mg2+ 对分析读数的明显影响较低。 每一种金属盐的检测都会对至少两种中等效价(IC50 <10 μM）的检测产生干扰，这突出了这一问题的普遍性，特别是在低效价的配体发现中。 由于钯催化剂最常用于大化合物集合的高通量交叉偶联反应，是最值得关注的金属。与KRASG12D(GTP): CRAF示例一致，金属离子干扰并不仅仅与分析技术相关：基于发光和基于荧光的分析都同样受到金属离子的影响。 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

*仅供医学专业人士阅读参考 表皮生长因子受体（EGFR）突变是非小细胞肺癌（NSCLC）中最常见的驱动突变之一，特别是在亚洲人群中。尽管EGFR-酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的靶向治疗已显示出良好的疗效，但许多患者最终会发展出耐药性。此外，多项II期研究表明，EGFR-TKIs可能也不是新辅助治疗的有效策略，主要病理反应（MPR）率范围仅为10%-15%。 因此，免疫检查点抑制剂与化疗相结合的新辅助治疗策略，提供了新的希望。 近日，广东省人民医院钟文昭教授团队发起的II期临床研究NEOTIDE/CTONG2104的中期结果，发表在Cell Reports Medicine期刊上[1]。 结果显示，PD-1抑制剂信迪利单抗和化疗的新辅助治疗方案在EGFR突变的局部晚期NSCLC患者中具有可接受的安全性和初步的临床有效性，44%的患者达到了MPR，大多数不良事件为轻至中度。 他们发现，利用循环肿瘤DNA（ctDNA）检测可以帮助识别对这种疗法不响应的患者，并根据肿瘤微环境的组成定义了一种对免疫治疗高度耐药的EGFR突变NSCLC亚型，或可作为预测免疫治疗效果的潜在标志物。 论文首页截图 论文主要结果 Checkmate-816研究已经开创性地证明，新辅助免疫治疗联合化疗在局部晚期NSCLC中能够显著提高病理缓解率，与传统的新辅助化疗相比表现出更佳的效果。然而，鉴于通常认为携带致癌突变的患者很难从免疫疗法中获益，许多相关试验通常会排除携带EGFR或间变性淋巴瘤激酶（ALK）突变的患者。 钟文昭教授团队发起的名为NEOTIDE/CTONG2104的II期临床试验，采用了Simon两阶段设计，旨在评估PD-1抑制剂信迪利单抗和化疗的新辅助治疗方案在局部晚期EGFR突变NSCLC患者中的临床疗效和安全性。 试验共招募18名局部晚期的EGFR突变NSCLC患者。所有患者在广东省肺癌研究所接受为期3个周期的信迪利单抗联合卡铂+白蛋白紫杉醇的新辅助治疗后，均接受根治性切除手术。 从临床反应来看，术前56%的患者在接受新辅助治疗后实现病理降期。44%的患者实现了主要病理反应（MPR），但没有患者实现病理完全缓解（pCR）。其中，携带不同类型EGFR突变的患者，MPR率有显著差异：携带EGFR敏感性突变、20号外显子插入以及其他非常见EGFR突变的患者，MPR率分别为30%、75%和50%。 临床反应 所有患者均经历了与治疗相关的不良事件（TRAEs），其中39%的患者出现了3/4级不良事件。虽然所有18名患者均进行了手术，但有3名患者由于术中发现隐匿的胸膜转移而未能实现R0切除。 通过对手术前后的肿瘤样本进行基因组学分析，研究团队发现最常见的与EGFR突变伴随的基因变异是TP53（83.3%）和TTN（41.7%）。相比于未实现MPR，携带TP53/RB1/RBM10基因突变、染色体拷贝数扩增变异或无吸烟史，在达到MPR的患者中更常见。 获取患者的血液和组织样本，检测循环肿瘤DNA（ctDNA）的结果显示，新辅助治疗期间几乎所有患者的ctDNA水平都有所下降。尤其是达到MPR的患者，其ctDNA水平的降幅比未达到MPR的患者高出671倍。此外，在治疗的各个阶段，ctDNA的阳性预测值（PPV）普遍高于阴性预测值（NPV）。这些结果突显了ctDNA的动态监测有助于识别潜在治疗受益者。 检测ctDNA水平 研究团队还结合来自真实世界队列的34个肿瘤样本等数据，分析了治疗前后肿瘤微环境的变化。结果提示，CCR8+调节性T细胞（Treg）和CXCL13+耗竭型T细胞（Tex）的浸润模式可以预测EGFR突变的NSCLC免疫治疗效果。治疗前具有CCR8+Treg hi/CXCL13+Texhi相关表型的患者与更高的反应率和长期益处相关，无论PD-L1状态如何；治疗中肿瘤表现为CCR8+Treghi/CXCL13+Texlo表型，与疗效和生存期较差相关。 找到两种细胞可以作为免疫治疗的潜在预测生物标志物 最后，研究团队对残余肿瘤进行了表征。他们发现，HLA杂合性缺失水平较高，是疗效不完全、残余肿瘤发生免疫逃逸的机制。同时，他们指出，TACSTD2（Trop2）和CEACAM5/6是在残留肿瘤中表达相对较高的分子，这暗示可以使用抗体偶联药物（ADC）进行联合治疗。 总之，该研究结果支持了在EGFR突变NSCLC患者中使用信迪利单抗+化疗的新辅助治疗策略的可行性。未来研究需关注长期生存数据，并探索不同生物标志物在预测疗效和监测疾病进展中的作用，以优化治疗方案和提高患者生活质量。 参考文献： [1]Zhang, C., Sun, Y. X., Yi, D. C., Jiang, B. Y., Yan, L. X., Liu, Z. D., Peng, L. S., Zhang, W. J., Sun, H., Chen, Z. Y., Wang, D. H., Peng, D., Chen, S. A., Li, S. Q., Zhang, Z., Tan, X. Y., Yang, J., Zhao, Z. Y., Zhang, W. T., Su, J., … Zhong, W. Z. (2024). Neoadjuvant sintilimab plus chemotherapy in EGFR-mutant NSCLC: Phase 2 trial interim results (NEOTIDE/CTONG2104). Cell reports. Medicine, 101615. Advance online publication. https://doi.org/10.1016/j.xcrm.2024.101615 本文作者丨张艾迪

THURSDAY, June 27, 2024 -- Rare predicted loss-of-function (pLOF) variants and a polygenic risk score (PRS) are associated with increased atrial fibrillation (AF) risk, according to a study published online June 26 in JAMA Cardiology . Oliver B. Vad, M.D., from Copenhagen University Hospital–Rigshospitalet in Denmark, and colleagues examined rare pLOF variants associated with AF and elucidated their role in risk of AF, cardiomyopathy, and heart failure in combination with a PRS in a genetic association and nested case-control study. Data were included for 403,990 individuals from the U.K. Biobank (median age, 58 years). Over a median follow-up of 13.3 years, 24,447 participants were diagnosed with incident AF. The researchers identified associations for rare pLOF variants in six genes ( TTN , RPL3L , PKP2 , CTNNA3 , KDM5B , and C10orf71 ) with AF. In an external cohort, TTN , RPL3L , PKP2 , CTNNA3 , and KDM5B were replicated. Rare pLOF variants combined with high PRS conferred an odds ratio of 7.08 for AF. PRS carriers also had a considerable 10-year risk of AF (16 and 24 percent in women and men older than 60 years, respectively). There was an association seen for rare pLOF variants with increased risk of cardiomyopathy before and subsequent to AF (hazard ratios, 3.13 and 2.98, respectively). "These findings may contribute to possible future genetic risk stratification and improved clinical practice," the authors write. Several authors disclosed ties to the biopharmaceutical and medical device industries. Abstract/Full Text Whatever your topic of interest, subscribe to our newsletters to get the best of Drugs.com in your inbox.