ZC3HAV1

导读：体外转录RNA（IVT RNA）包括mRNA、自复制RNA(saRNA)、反式扩增RNA(taRNA)和环状RNA(circRNA)，近年来在预防和治疗用生物制剂的开发中备受关注。IVT RNA是一种精心设计的序列，以模拟天然RNA转录本发挥翻译蛋白的生物学功能。IVT RNA的开发领域正在从人类拓展至动物，包括畜牧业、水产业和宠物领域。然而RNA结构不稳定，容易发生降解。合理的序列设计是提高mRNA稳定性的一种有效策略，学习商业化产品的开发策略是我们快速上手的有效方法。上篇文章中，菌菌解析了辉瑞/BioNTech开发的BNT162b2：mRNA序列设计案例分享：辉瑞辉瑞/BioNTech BNT162b2序列全解析今天菌菌将以Moderna疫苗mRNA-1273为主题，了解多样化的mRNA疫苗序列设计策略。01 mRNA-1273的编码序列设计mRNA的编码区（CDS），也称为开放阅读框（ORF），在体内翻译产生具有生物活性的目标蛋白，如病原体关键抗原、肿瘤抗原、抗体或其他功能性蛋白，CDS序列的设计和优化至关重要。CDS的设计策略主要为密码子优化，以提升蛋白翻译效率。密码子的优化包括两个水平，分别为复合密码子家族和家族内密码子优化。1.1 复合密码子家族优化对于人体内Arg编码基因来说，使用CGN的频率高于AGR密码子。然而，在病毒基因组内却恰恰相反。为抵御宿主锌指抗病毒蛋白（ZAP，基因名 ZC3HAV1）通过CpG靶点对病毒基因组的降解，病毒基因组中CGN频率较低。例如，NC_045512中的 SARS-2-Spike包含42个Arg残基，其中30个由 AGR 密码子编码，仅12个由 CGN 密码子编码。基于人类基因组和新冠病毒刺突蛋白（S蛋白）编码序列的密码子偏好差异，Moderna 对mRNA-1273进行了密码子优化，将其中28个AGR密码子替换成了CGN。高表达的人类核糖体基因序列中，81%的亮氨酸由CUN编码。类似地，在mRNA-1273中，大多数（107/108）的亮氨酸由CUN编码，仅保留了一个UUR。而Moderna在Ser密码子的优化方面体现了另一种考量。理论上，AGY和UCN亚家族在编码Ser时水平相当，但相比之下，AGY更容易优化（AGC＞ AGU），因此mRNA-1273 中仅保留了3/99个UCN。1.2 家族内密码子优化进一步的家族内密码子优化方面，原则是将家族内密码子替换为高表达基因优选且被最丰富的tRNA解码的最佳同义密码子。例如，在编码Arg的密码子中，CGG被认为是CGN家族中的最优解，mRNA-1273基于此理论进行了密码子优化，仅保留了1个CGU。同样地，在谷氨酸（Glu）密码子优化方面，mRNA-1273中的GAN家族密码子全部替换成了GAG。这一策略与辉瑞/BioNTech的BNT-162b2明显不同。mRNA-1273的翻译终止信号由3种不同的终止密码子串联组成：UGAUAAUAG。当前主要以CAI（密码子适应指数）作为密码子优化的参数。经密码子优化后，mRNA-1273的CAI约为0.98，相比天然新冠病毒S蛋白编码基因（CAI＜0.7）大幅提高。02 mRNA-1273的非编码区序列设计2.1 mRNA-1273 5’ UTR序列设计5’UTR是核糖体起始翻译的结合位点，在mRNA翻译起始方面发挥重要作用，合理的5’UTR序列有助于实现mRNA的高表达。基于目前的mRNA开发产品，有3种5’UTR设计策略最为常用：第一种在mRNA疫苗的设计中最为常用，通常直接选取受用群体内高表达基因的5’UTR，例如人alpha珠蛋白的 5’UTR、鼠源alpha珠蛋白的 5’UTR或猫源DNAH2基因的5’UTR等。第二种是通过指数富集（SELEX）的方式来实现 5’UTR的系统演化，这种方法耗时且筛选难度较大。Moderna基于SELEX方法全新设计了mRNA-1273的5’UTR序列，且包括公认最优的Kozak序列GCCACCAUG。Moderna mRNA-1273的5’UTR序列5’UTR的另一种来源是使用病原体或其他病毒RNA来源的5’UTR。这一策略目前主要用于自复制RNA(saRNA)的序列设计，如日本PMDA获批的ARCT-154：全球首款自复制RNA(saRNA)传染病疫苗ARCT-154的序列解析不同的5’UTR序列可能适用于不同的mRNA编码序列、不同的靶细胞。为此，耀海生物mRNA制备平台建立了丰富的天然UTR库、突变UTR库，为客户CDS序列定制化筛选最适合的UTR序列。如感兴趣可扫描文末二维码联系菌菌~2.2 mRNA-1273 3’UTR序列设计3’UTR的生物学功能与5’UTR类似，促进编码序列的翻译，其序列设计策略也与5’UTR的设计类似。Moderna疫苗mRNA-1273采用了人源alpha珠蛋白的 3’UTR，长度为110 nt。Moderna mRNA-1273的3’UTR序列2.3 mRNA-1273 poly(A)序列设计根据Moderna公开的专利信息，mRNA-1273的poly(A)尾由100 nt的聚腺苷酸组成。03 总结随着mRNA工艺路线的不断升级，无疑推动了各类体外转录RNA（IVT RNA）疫苗/药物的开发进程，深刻地影响生物医药领域的格局。IVT RNA的开发前景广阔，当前正在从人用药领域拓展至畜牧养殖、水产养殖和宠物领域。合理的序列设计是mRNA开发的首要目的。基于多年的技术沉淀，耀海生物开发了自有的mRNA体外转录质粒载体、建立了天然UTR和改造UTR库、自主研发了mRNA纯化工艺和检测方法，全力推动mRNA制品的研发进程。参考文献[1] Xia X. Detailed Dissection and Critical Evaluation of the Pfizer/BioNTech and Moderna mRNA Vaccines. Vaccines (Basel). 2021 Jul 3;9(7):734. doi: 10.3390/vaccines9070734.[2] Jeong D.-E., McCoy M., Artiles K., Ilbay O., Fire A., Nadeau K., Park H., Betts B., Boyd S., Hoh R., et al. Assemblies of Putative SARS-CoV2 Spike Encoding mRNA Sequences for Vaccines BNT-162b2 and mRNA-1273.[3] Moderna. US 2021/0228707 A1.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

导读：体外转录RNA（IVT RNA）包括mRNA、自复制RNA(saRNA)、反式扩增RNA(taRNA)和环状RNA(circRNA)，近年来在预防和治疗用生物制剂的开发中备受关注。IVT RNA是一种精心设计的序列，以模拟天然RNA转录本发挥翻译蛋白的生物学功能。IVT RNA的开发领域正在从人类拓展至动物，包括畜牧业、水产业和宠物领域。在多种类型的IVT RNA中，mRNA最为经典，且在大规模人群中验证了其疗效和安全性。mRNA序列由5个关键结构元件组成：5'帽结构（Cap）、5'非翻译区（UTR）、编码区（CDS）、3'非翻译区（UTR）和poly（A）尾巴。mRNA结构极其不稳定，容易被降解。“万变不离其宗”，合理的序列设计是提高mRNA稳定性的一种有效策略。本期文章，菌菌将以BioNTech和辉瑞联合开发的mRNA疫苗BNT162b2为实例，分享mRNA疫苗的序列设计策略。01 BNT162b2的编码序列设计mRNA的编码区（CDS），也称为开放阅读框（ORF），在体内翻译产生具有生物活性的目标蛋白，如病原体关键抗原、肿瘤抗原、抗体或其他功能性蛋白，CDS序列的设计和优化至关重要。CDS的设计策略主要为密码子优化，以提升蛋白翻译效率。密码子的优化包括两个水平，分别为复合密码子家族和家族内密码子优化。1.1 复合密码子家族优化例如，鉴于宿主锌指抗病毒蛋白（ZAP，基因名 ZC3HAV1）以病毒 RNA 中的 CpG 二核苷酸为靶标，并招募细胞RNA降解复合物来降解病毒RNA基因组，因此避免使用 CGN 密码子在病毒进化上是合理的。与之对应地，NC_045512中的 SARS-2-Spike 包含42个Arg残基，其中30个由 AGR 密码子编码，只有12个由 CGN 密码子编码。然而，人类基因使用CGN的频率高于AGR密码子。辉瑞/BioNTech采用了典型的复合密码子优化策略，在BNT-162b2的CDS区域减少了8个AGR密码子，对应增加了CGN密码子。mRNA疫苗的高CpG同时赋予其较高的稳定性和安全性。Moderna开发的mRNA-1273也使用了这一策略，但在数量上有所差异，菌菌将在下期文章中对mRNA-1273序列进行详细解析，敬请关注。类似地，高表达的人类核糖体蛋白中，81%的亮氨酸通过CUN密码子编码。因此，在mRNA疫苗BNT-162b2中，多数的UUR被替换为CUN。1.2 家族内密码子优化家族内密码子优化的原则是替换为高表达基因优选且被最丰富的tRNA解码的最佳密码子。基于上述原则，在编码Arg的密码子中，CGG被认为是CGN家族中的最优解，BNT-162b2和mRNA-1273也基于此进行了优化。而在Glu编码密码子的优化方面，辉瑞/BioNTech采用了自由优化策略。BNT-162b2保留了14/34个GAA密码子，而没有选择全部替换为tRNA丰度最高的GAG密码子。当前密码子优化主要以CAI（密码子适应指数）为基本的优化参数。BNT-162b2的CAI约为0.95，相比天然新冠病毒S蛋白编码区域（CAI＜0.7）大幅改善。02 BNT162b2的非编码区序列设计2.1 BNT162b2 5’ UTR序列设计5’UTR为非编码区域，位于mRNA编码区（CDS）上游，是核糖体起始翻译的结合位点。5’UTR主要发挥2个重要功能：提升mRNA稳定性和起始翻译。在mRNA疫苗研发过程中，有三种 5’UTR序列优化策略。第一种也是最简单的，直接选取高表达的人类基因 5’UTR，例如人alpha珠蛋白的 5’UTR。这一策略在mRNA序列设计中较为常见，BNT162b2直接选取了人alpha珠蛋白基因的5’UTR，在此基础上针对Kozak序列进行了优化，具体为使用GCCACCAUG替换了ACCAUG。第二种方法是使用病原体mRNA自身的5’UTR，这一策略目前主要用于自复制RNA(saRNA)的序列设计，如日本厚生劳动省（PMDA）获批的ARCT-154。关于ARCT-154的序列解析可戳链接查看：全球首款自复制RNA(saRNA)传染病疫苗ARCT-154的序列解析第三种是通过指数富集（SELEX）的方式来实现 5’UTR的系统演化，这种方法有一定的筛选难度较大。不同的5’UTR序列可能适用于不同的mRNA编码序列、不同的靶细胞。为此，耀海生物mRNA制备平台建立了丰富的天然UTR库、突变UTR库，为客户CDS序列定制化筛选最适合的UTR序列。如感兴趣可扫描文末二维码联系菌菌~2.2 BNT162b2 3’UTR序列设计3’UTR位于mRNA编码区（CDS）下游，与5’UTR的功能和设计原则较为相似。辉瑞/BioNTech融合了天然序列和SELEX筛选序列。BNT162b2 3’UTR的部分片段来自人类线粒体12S rRNA（mtRNR1），其余片段为人AES/TLE5基因。AES/TLE5上存在2个C→U(Ψ)突变以提高结合能量。BNT162b2的CDS与3’UTR中间存在6个碱基），随后是136 nt的AES突变序列片段，再下游是139 nt的mtRNR1序列。2.3 BNT162b2 poly(A)序列设计为维持mRNA疫苗的稳定性，BNT162b2采用了分段式poly(A)序列：长度为110 nt的poly(A)由30个腺苷、10个非纯A序列、以及下游的70个腺苷组成。03 总结随着mRNA工艺路线的不断升级，无疑推动了各类体外转录RNA（IVT RNA）疫苗/药物的开发进程，深刻地影响生物医药领域的格局。IVT RNA的开发前景广阔，当前正在从人用药领域拓展至畜牧养殖、水产养殖和宠物领域。合理的序列设计是mRNA开发的首要目的。基于多年的技术沉淀，耀海生物开发了自有的mRNA体外转录质粒载体、建立了天然UTR和改造UTR库、自主研发了mRNA纯化工艺和检测方法，全力推动mRNA制品的研发进程。参考文献[1] Xia X. Detailed Dissection and Critical Evaluation of the Pfizer/BioNTech and Moderna mRNA Vaccines. Vaccines (Basel). 2021 Jul 3;9(7):734. doi: 10.3390/vaccines9070734. [2] WHO. Messenger RNA vaccines.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

2022年，全球PARP抑制剂市场超过55.1亿美元。对治疗癌症以及其他慢性疾病的先进靶向疗法的需求激增，正在促进市场的增长。根据未来市场洞察(FMI)，PARP抑制剂市场的需求预计将超过84.3亿美元，在2022-2026年预测期内以11.2%的惊人复合年增长率增长。奥拉帕尼仍将是全球市场上最受欢迎的药物，到2022年占PARP抑制剂销售额的62.9%以上。FMI指出，PARP抑制剂估计占全球细胞毒性药物市场收入份额的28.5%以上。 PARP7继续内卷 阿斯利康作为PARP赛道的老大哥，自然不会错过这一巨大市场，根据智慧芽新药情报库，奥拉帕利的化合物专利在2024年3月到期，用途专利在2024年11月到期。阿斯利康为构筑护城河，开发了高选择性的PARP1抑制剂AZD5305和AZD9574（入脑）。PARP酶家族亚型众多，下一代抑制剂主要针对其家族的各个亚型，同时开发新适应症（脑转移癌症、自免疾病等）。 PARP7是一种聚腺苷二磷酸核糖聚合酶，它催化adp-核糖的单个单位转移到底物上以改变其功能。PARP7是肿瘤细胞核酸感知的负调控因子。抑制PARP7在肿瘤模型中可恢复I型干扰素(IFN)信号通路对核酸的响应。恢复信号可以直接抑制细胞增殖和激活免疫系统，这两者都有助于肿瘤的消退。 临床前成功的POC，以及通路已经验证过了成药性，让PARP7成为一个颇具吸引力的靶点。AZ最早关注到PARP7抑制剂的成药潜力。在智慧芽专利数据库搜索到的最早一篇PARP7抑制剂的专利来自AZ的WO2016116602 (A1)，优先权日为2015年1月，但PCT并未进入具体国家。 RBN2397结构公布加剧国内公司内卷 如图2，Ribon Therapeutics以AZ的化合物为先导，设计的分子基于吡啶嗪酮核，之前通过片段筛选被确定为主要抑制monoARTs的优势结构，并用于获得PARP酶的NAD+竞争性探针，保留了哌啶酰胺的linker，继续结构优化得到RBN2397。来看一下时间线，2019.9.4，Ribon Therapeutics启动RBN-2397的一期临床研究；2019.11.7，Ribon Therapeutics的PARP7抑制剂专利公开（WO2019212937）；2020.4.28，Ribon Therapeutics在AACR会议上披露RBN-2397临床前数据，并在poster中公布其结构；国内公司也同时开启了fast follow。在智慧芽新药情报数据库搜索PARP7，可以看到众多国内公司已经纷纷参与到PARP7抑制剂的开发中。如成都百裕、南京明德、诺沃斯达、加科思、海思科、杭州英创、齐鲁、英硒智能、轩竹、誉祥、上海优理惠生、武汉人福、重庆财富生物等十几家公司，成都百裕follow的最快，其PARP7专利的最早优先权日为2020.11.27。令人奇怪的是，并未看到国外公司follow的专利公开。至于AZ为何没有推进PARP7项目，可能和市场前景关系较大，奥拉帕尼仍是全球市场上最受欢迎的PARP抑制剂药物，到2022年占PARP抑制剂销售额的62.9%以上，AZ也有奥拉帕利的迭代产品在开发中。 RBN2397的临床前景如何？ RBN-2397先进行了单药临床研究，爬坡阶段中，纳入50例患者；通过剂量方案和相对生物利用度评估测试了25毫克至500毫克的BID给药，最常见的肿瘤类型为乳腺(n=8)、肺部(n=7)和结肠(n=5)。二期推荐（RP2D）的剂量为200 mg BID，与微粉片剂一起连续给药。剂量扩大阶段中，入组患者53例；SCCL(22例)、HNSCC(17例)、HR+乳腺(14例)；RBN-2397在RP2D具有良好的耐受性，在观察到的暴露下具有生物和抗肿瘤活性。 单药RBN-2397具有良好的安全性和耐受性，具体表现在以下几点。只有5例(4.9%)发生了与治疗相关的急性肺泡损伤；28例(27.2%)发生了不良事件导致的治疗中断；12例(11.7%)患者因不良事件中断治疗。与已批准的PARP1/2抑制剂相比，血液学毒性发生率较低。 总体看来，RBN-2397耐受性良好，大多数AE为轻度至中度，并且在剂量递增和扩大队列研究中，初步观察到抗肿瘤活性，剂量递增:HR+乳腺癌患者1例PR，13例SD且临床获益> 4个月；扩大剂量:1例HNSCC病人缓解, 4例SD，且临床获益> 4个月。在所有评估的基线活检中均可见PARP7表达，与基质细胞相比，肿瘤细胞中PARP7表达更高。 在大多数肿瘤类型的扩展队列患者中，CD8+T细胞和/或颗粒酶B表达增加，表明RBN-2397治疗后存在适应性免疫诱导，RBN-2397诱导肿瘤特异性IFN通路激活并增加免疫细胞浸润到患者肿瘤，为诱导适应性免疫反应提供了证据。这些数据证实了PARP7作为一种新的抗癌治疗靶点，并证实了RBN-2397的机制。支持了正在进行的RBN-2397联合派姆单抗(NCT05127590)和纳武利尤单抗(jRCT2031210373)的临床试验。 PARP其他亚型仍具有巨大的潜力 已有17个PARP成员被报道，其中16个具有PARP催化活性。如图4所示，根据催化功能的不同，PARPs又分为多聚PARPs (PARP1、PARP2、PARP5a、PARP5b)、单ADP-核糖转移酶(PARP3、PARP4、PARP6−PARP12、PARP14−PARP16)和无催化活性的PARPs (PARP13)。其中，ADP-核糖转移酶在细胞增殖、代谢与凋亡、细胞周期调控、免疫应答等方面发挥重要作用。 除了PARP1的作用外，TNKS1−2目前正在作为癌症的潜在治疗靶点进行研究，这主要是因为它们在控制Wnt/β- catenin信号通路方面的作用。TNKS1−2通过PARylation和靶向蛋白进行蛋白酶体降解来控制蛋白质复合物和蛋白质稳定性。在Wnt/β-catenin信号通路中，它们控制所谓的“β-catenin破坏复合体”，由轴蛋白、酪蛋白激酶1、腺瘤性大肠息肉病(APC)、糖原合成酶激酶3 GSK3和蛋白磷酸酶2A组成。TNKS抑制剂可用于治疗一系列癌症，包括结肠癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、脑癌。 如图5，已经开发了几种TNKS抑制剂，如化合物E744969和STP100270(结构未公开)，这些化合物已在临床研究中取得进展，即使化合物E7449表现为TNKS1−2和PARP1−2的双重抑制剂。其他TNKS抑制剂，如RK287107和OM-153正在临床前研究中进行评估。此外，PARP10抑制剂、PARP14抑制剂、PARP11抑制剂、PARP15抑制剂、PARP6抑制剂、PARP12抑制剂都在进行广泛的研究。 总结 PARP抑制剂市场前景广阔，上市的第一代PARP抑制剂都是针对PARP1和PARP2的双重抑制剂，因为对PARP2的抑制会带来血液学相关毒性。AZ等公司率先开发了高选择性的PARP1抑制剂如AZD5305、AZD9574等。 PARP蛋白家族亚型众多，其他亚型的成药性也在逐步验证中。Ribon Therapeutics走在最前列，开发的PARP7和PARP14选择性抑制剂都已进入临床。其中PARP7选择性抑制剂RBN-2397目前处于临床一期，从公布的部分临床数据看，与已批准的PARP1/2抑制剂相比，血液学毒性发生率较低，且机制上支持与免疫检查点抑制剂PD1抗体的联用。 然而，PARP7赛道却极其拥挤，国内多达十几家药企follow这个靶点，不乏第一梯队的biotech如加科思，传统药企齐鲁药业、CRO龙头药明康德，以及AI公司英硒智能。足以可见国内药企对这个靶点的重视，但是，根据专利所披露的结构来看，同质化极其严重，未来哪家公司能够脱颖而出仍不明朗。 参考资料： 1.https://www.futuremarketinsights.com/reports/parp-inhibitors-market. 2.Gru.研发前沿|枯燥数据背后的秘密. Minions的新药研发随笔. 3.Heike Keilhack, et al. PARP7 negatively regulates the type I interferon response in cancer cells and its inhibition triggers antitumor immunity. https://doi.org/10.1016/j.ccell.2021.06.018. 4.Melissa Johnson, et al. First-in-Class First-in-Human Phase 1 Trial of RBN-2397 in Patients with Advanced Solid Tumors Validates PARP7 as a Novel Anticancer Therapeutic Target.2023,ESMO,TAT. 5.Yun genxu, et al. Discovery of the Potent and Highly Selective PARP7 Inhibitor as a Novel Immunotherapeutic Agent for Tumors.J. Med. Chem. 2023, 66, 473−490. 6.Oriana Tabarrini, et al. Medicinal Chemistry Perspective on Targeting Mono-ADPRibosylating PARPs with Small Molecules.J. Med. Chem. 2022, 65, 7532−7560. 7.谁能接班奥拉帕利？智慧芽新药科讯. 8.智慧芽新药情报库.