HDACs x HSP90

摘要：尽管基于干细胞的治疗方法在管理某些疾病方面显示出比传统手术更大的潜力，但它也不可避免地存在一些缺点，这些缺点可能会限制其临床转化。与干细胞相比，干细胞衍生的外泌体拥有许多优势，例如无免疫原性、无输注毒性、易于获取、保存方便，且没有致瘤潜力和伦理问题。外泌体可以通过垂直传递其多能性或多向分化能力，从其亲本细胞（如胚胎干细胞和成体干细胞）继承相似的治疗效果。在对过去五年的相关文献进行彻底搜索和细致剖析后，我们呈现了这篇全面、最新、专业特定和疾病导向的综述，以突出干细胞衍生外泌体在外科应用和潜力。来自干细胞（例如胚胎干细胞、诱导多能干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞和内皮干细胞）的外泌体能够治疗骨科手术、神经外科、整形外科、普通外科、心胸外科、泌尿科、头颈外科、眼科和妇产科中遇到的众多疾病。干细胞衍生外泌体的多样化治疗效果是通过组织特异性反应和细胞特异性分子信号通路的层级转化实现的。在这篇综述中，我们强调干细胞衍生外泌体作为管理各种外科状况的干细胞疗法的可行且强大的替代方案。我们建议未来的研究结合外科医生、纳米医学从业者和干细胞研究者的智慧，在这一相关且引人入胜的研究领域进行探索。 1.引言 干细胞是一群未分化的细胞，具有自我更新和重建功能性组织的独特能力。它们主要根据分化潜能、来源和谱系进展进行分类。根据它们的潜能，干细胞可以是全能的、多能的、多向的、寡能的和单能的。干细胞存在于胚胎和成体细胞中。胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）是多能干细胞的最佳例子，而成体多能干细胞则以造血干细胞（HSCs）、间充质干细胞（MSCs）、神经干细胞（NSCs）和内皮干细胞/祖细胞（EPCs）为代表。所有这些亚型的干细胞都已广泛用于人类疾病的治疗。 作为再生医学的一种方式，干细胞疗法引起了巨大关注，因为它为以前无法治愈的疾病患者提供了新的选择。随后，成千上万的相关临床试验被注册，涵盖了广泛的医学问题，如肌肉骨骼和神经系统疾病、免疫疾病、血液学功能障碍和退行性状况。然而，一些试验未能在临床上显示出任何益处。这可能是由于干细胞疗法不可避免的限制，如输注毒性、免疫原性、致瘤潜力和伦理问题。 外泌体，由几乎所有细胞类型包括干细胞分泌，被认为是比干细胞疗法更安全、更通用的替代品。外泌体是纳米级、球形、脂质双层单膜细胞外囊泡，充当细胞间信使。外泌体被视为其亲本细胞的缩小版，部分原因是某种细胞类型的外泌体提供细胞特异性或独特的生物分子集合。此外，已发现干细胞通过其可溶性分泌物包括外泌体以旁分泌方式发挥作用。换句话说，干细胞衍生的外泌体（SC-Exo）继承了其亲本细胞相似的治疗效果，例如抗炎、免疫调节和组织再生。总的来说，干细胞衍生的外泌体是干细胞疗法的强大替代品，没有表现出其细胞对应物所呈现的缺点。（表1） 在临床应用之前，外泌体必须在生产、纯化和修饰方面进行准备和优化。近年来，已发表了许多医学综述，分析了外泌体疗法的这些上游措施。然而，一些研究途径仍然未被充分调查：特别是，缺乏系统调查下游临床应用的研究，尤其是从外科角度来看。无论是由疾病还是外科医生的手术刀造成的组织损伤，都会通过炎症和再生动态作出反应，这使得外科成为干细胞衍生外泌体疗法的完美场所。干细胞衍生的外泌体继承了其亲本细胞相似的治疗效果，例如组织再生、抗炎和免疫调节。 在这项工作中，我们将剖析过去五年的相关出版物，以呈现一个全面、最新、专业特定和疾病导向的综述。我们的目标是弥合目前外科医生、纳米医学从业者和干细胞研究者之间存在的差距。 2.外泌体和外泌体疗法的一般背景 2.1.外泌体的生物发生、组成和摄取 外泌体在大小、内容和生产机制方面与其他类型的原发性细胞外囊泡（例如凋亡体和小囊泡）不同。外泌体形成的最广泛接受的机制，即内体途径，如下。最初的内体是通过细胞膜内陷产生的，在这个过程中生物活性物质开始在早期排序内体中积累。晚期排序内体随后形成多泡体（MVBs），在第二次内陷后。最后，MVBs与细胞膜融合，将携带的外泌体释放到外部。也有报道称非内体途径的外泌体生物发生，例如血浆膜出芽。 正如三大外泌体数据库（即ExoCarta、VesiclePedia和EVpedia）总结的，外泌体包含众多分子，包括蛋白质、糖复合物、脂质、核酸、代谢物和其他生物活性物质。每个类别的例子及其相应功能已在其他地方进行了全面审查。一方面，外泌体包括一个复杂的蛋白质网络，包括外部蛋白质（例如四跨膜蛋白、抗原呈递复合物和粘附分子）和内部蛋白质（例如热休克蛋白、ESCRT机制、细胞因子和趋化因子以及膜转运蛋白）。另一方面，作为人类外泌体核酸中最丰富的，微小RNA（mRNA）可以通过外泌体介导的细胞间通信参与造血、外泌体和神经及血管再生。 外泌体一旦到达受体细胞，就有多种摄取机制，这些机制可以归类为膜融合、受体相互作用和内吞作用（图1b）。最终，外泌体的货物被释放到细胞质中，这一过程取决于外泌体的来源、货物的性质以及受体细胞的代谢状态。从外泌体生物合成到摄取和细胞内信号传导的整个生命周期可以使用荧光、发光和放射性技术进行追踪。 图1 外泌体治疗的上游措施说明（使用Autodesk 3ds Max 2023生成的图表）。a 外泌体的生产和纯化（以MSCs和NSCs为例，展示多能干细胞）。b 天然外泌体的内容。c 外泌体的修饰。（BM 骨髓，DC 树突细胞，IAC 免疫亲和色谱，iPSC 诱导多能干细胞，MHC 主要组织相容性复合体，miRNA 微小RNA，MSC 间充质干细胞，MVB 多泡体，NSC 神经干细胞，SEC 尺寸排阻色谱，UC 脐带） 2.2.外泌体的来源和分类 根据外泌体是否经过人工修饰，它们大致被分类为天然外泌体和工程化外泌体（第2.4节）。根据物种来源，外泌体被分为动物源性和植物源性外泌体。目前，外泌体主要根据其亲本细胞的类型进行分类。几乎所有类型的人类细胞都能产生外泌体。这些包括但不限于巨噬细胞、树突状细胞（DCs）、血小板、干细胞，甚至是肿瘤细胞（图1a）。 例如，巨噬细胞源性外泌体有助于疾病进展（例如糖尿病、动脉粥样硬化和心力衰竭）和疾病治疗（例如皮肤创伤、炎症性肠病和真菌及病毒感染）。然而，它们在抑制和促进肿瘤方面似乎扮演着矛盾的角色。与DCs类似，DC源性外泌体（Dex）也可以通过其表面蛋白如主要组织相容性复合体（MHCs）与免疫细胞（例如T细胞、B细胞和NK细胞）相互作用。一些临床前和临床试验已经证明了基于Dex的免疫疗法对癌症的有效性和安全性。此外，肿瘤源性外泌体（Tex）不仅参与肿瘤增殖、侵袭、转移和免疫，而且可以作为癌症诊断和治疗的生物标志物。最近，Tex被用作抗肿瘤药物和DC疫苗的抗原呈递者，作为一种有前景的无细胞癌症免疫疗法。最后，干细胞源性外泌体的临床应用将在以下部分详细讨论。 外泌体可以在所有体液中找到，如血液、唾液、尿液、血浆、眼泪、精液、羊水甚至母乳。体液衍生的外泌体是疾病生物标志物的高稳定储库，协助液体活检在各种临床环境中进行，如癌症、心血管疾病和围产期疾病。然而，每种体液中共同存在的内容和可用性可能会给外泌体分离带来挑战。 2.3.外泌体的生产、分离和纯化 阻止基于外泌体的治疗进入临床实践的主要障碍之一是外泌体的产量和效率低。例如，在实验室环境中，从1毫升培养基中只能收获不到1微克的外泌体蛋白。有各种扩大外泌体生产的方法，这些方法被归类为生化策略（例如LPS、BMP-2、HIF-1α和IFN-γ及TNF-α）、物理策略（缺氧、热应激和饥饿）、机械策略（剪切应力和3D培养）和仪器策略（中空纤维生物反应器和搅拌罐生物反应器）。 外泌体在大小、内容、表面标记和来源方面是异质的，这使得它们的分离变得困难。目前可用的外泌体分离和纯化技术是基于它们的大小、表面电荷或免疫亲和性（图1a）。然而，没有一种“一刀切”的方法，因为这些技术都有优点和缺点。 例如，超速离心被认为是外泌体提取的金标准。尽管它需要最少的试剂和专业知识，但时间消耗、高成本、低效率和脂蛋白共分离限制了它的大规模使用。免疫亲和色谱是一种基于抗体和配体特异性结合的分离技术。它快速且提供高纯度、特异性和产量。然而，使用的抗原/蛋白偶联需要表达在外泌体表面。基于大小的分离技术主要是指超滤和尺寸排阻色谱，这两种方法都快速且适合大规模应用。但是孔堵塞、外泌体丢失和纯度低使得这种方法难以普及。尽管没有单一的技术是完美的，将上述技术与其他技术（例如基于沉淀和基于微流体的）结合起来可能是一种解决方案，以同时满足外泌体分离和纯化的多重要求。 2.4.外泌体的修饰 外泌体可以生化修饰以扩大、改变或改善它们的治疗效果。外泌体的修饰分为内部策略（例如药物装载）和外部策略（例如表面修饰）。一方面，外泌体可能是一个理想的治疗载体，用于输送药物、核酸和疫苗，因为它们在稳定性、非免疫原性和靶向受体细胞方面的优势。有各种货物装载技术，包括生产前装载方法（例如转染、共培养和电穿孔）和生产后装载方法（例如冻融循环、孵化、超声、挤出和低渗透析），这取决于它们是在外泌体生物合成之前还是之后应用（图1c）。例如，Tian等人使用电穿孔将阿霉素装载到Dex中以治疗乳腺癌。Kim等人使用孵化和超声将紫杉醇装载到RAW 264.7衍生的外泌体中以克服癌细胞的多药耐药性。Ohno等人使用转染将抗肿瘤let-7a miRNA装载到HEK293衍生的外泌体中以管理乳腺癌。 另一方面，外泌体的表面修饰以遗传工程外泌体膜或亲本细胞、化学连接靶向配体、静电相互作用和磁性纳米颗粒技术为例。表面修饰的主要目的是选择性地将外泌体输送到目标细胞以进行精确治疗。例如，Alvarez-Erviti等人通过遗传工程修改DC以表达Lamp2b和RVG肽，从而靶向中枢神经系统（CNS）。Zhu等人使用化学反应将肿瘤靶向肽c(RGDyK)插入外泌体表面以靶向胶质母细胞瘤。Nakase等人使用静电相互作用将外泌体与由pH敏感融合肽和阳离子脂质形成的复合物结合，从而实现增强的细胞质递送。 2.5.外泌体的特性和验证 外泌体在治疗应用前需要进行特性和验证。当前用于外泌体特性的方法主要集中在外泌体的大小、形态和货物剖面上。基于大小的验证包括纳米颗粒跟踪分析（NTA）、动态光散射（DLS）和可调电阻脉冲传感（TRPS），而基于形态的分析包括扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）。此外，货物剖面进一步细分为蛋白质组学、脂质组学和基因组学分析，包括西方印迹、ELISA、流式细胞术、质谱和PCR。由于上述每种特性方法都有优点和缺点，将三个方面的分析结合起来是一种普遍做法，例如一组TEM、NTA和西方印迹，以识别分离的外泌体。 例如，基于显微镜的方法，如SEM和TEM，可以分别直接可视化表面形貌和内部结构。然而，由于操作复杂和样品制备繁琐，TEM不适合快速测量大量样品。NTA有助于快速检测和实时外泌体观察，同时比流式细胞术具有更高的分辨率。NTA的主要缺点是难以区分外泌体和污染蛋白。作为一种成熟的技术，西方印迹可以定性和定量地检测外泌体蛋白生物标志物的表达，特别是来自细胞培养介质的外泌体。然而，它耗时且不适合检测来自生物流体的外泌体。 2.6.外泌体的储存 目前用于外泌体长期保存的方法主要包括冷冻保存、冻干和喷雾干燥。温度和防冻液是冷冻保存中最重要的两个成分。4°C的储存可能会削弱外泌体的生物活性并减少蛋白含量，而-80°C被认为是对外泌体形态和内容影响最小的最佳温度。不可渗透的二糖防冻液，特别是海藻糖，是最佳选择，因为它可以防止外泌体聚集和冷冻损伤。对于热敏感材料，例如外泌体和疫苗，通过冷冻干燥的冻干处理可以轻易储存，并且通过简单地加水重新配制。最近的一项研究表明，即使在室温下储存，带有冷冻保护剂的冻干可以保持外泌体蛋白和RNA的活性大约4周。最后，与冷冻干燥相比，喷雾干燥是一个单步过程，从而减少了对昂贵设备和漫长多步骤研磨的需求。然而，喷雾干燥的核心参数，如外泌体给药速率、雾化压力和出口温度，都会影响外泌体的稳定性和货物完整性。 图2 外泌体治疗在外科应用的下游说明（使用Adobe Photoshop 2023和Adobe Illustrator 2023生成的图表）。外泌体的治疗效果是通过疾病特异性组织反应、组织特异性细胞变化和细胞特异性分子信号通路的层次转化实现的。 3.骨科和创伤手术以及SC-EXO治疗 3.1.骨折 骨折是最常见创伤性大型器官损伤，大约有10%无法正常愈合。骨折愈合涉及一个合成组织体积增加阶段和一个分解组织重塑阶段，这两个阶段受到各种因素的控制，如干细胞、先天和适应性免疫功能以及稳定性。骨折的生物药理治疗可以局部给药（例如骨形态发生蛋白，BMP）或系统给药（例如甲状旁腺激素，PTH）。作为一种有前景的替代方案，外泌体治疗骨折愈合主要利用骨髓源性MSCs作为细胞供应者（表2）。 推测MSC源性外泌体促进骨折愈合的机制如下。首先，骨修复的进展需要多种细胞，例如炎症阶段的炎症细胞、纤维血管阶段的内皮和间充质祖细胞、骨形成过程中的成骨细胞和软骨细胞以及骨痂重塑过程中的破骨细胞。其次，这些细胞中的大多数可以吸收外泌体，特别是成骨细胞和血管内皮细胞，它们与骨折愈合最为相关。最后，在吸收外泌体后，受体细胞的基因表达被修改，从而激活各种信号通路（图3a），引起各种细胞和组织反应（图3b），最终导致改善骨折愈合。 图3 干细胞衍生外泌体治疗的机制（使用Adobe Photoshop 2023和Adobe Illustrator 2023生成的图表）。a 激活和调节各种信号通路。b 疾病特异性的细胞和组织反应。 早期研究使用了各种动物模型来研究骨折愈合。在横向股骨干骨折模型中，发现外泌体不仅促进了野生型小鼠的成骨作用，还挽救了CD9−/−小鼠骨折愈合的迟缓，这是一种已知具有较低骨结合率的品系。在股骨不连模型中，外泌体通过可能的BMP-2/Smad1/RUNX2途径促进成骨和血管生成，从而增强骨折愈合。在胫骨牵张成骨模型中，年轻MSC分泌的外泌体促进了老年MSC的成骨能力，并在老年大鼠中增强了新骨形成。此外，EPC源性外泌体通过刺激血管生成加速牵张成骨过程中的骨再生。作为外泌体的主要货物（第2.1节），RNA可以改变受体细胞的基因表达和表型功能，其中微小RNA（miRNA）和长非编码RNA（lncRNA）被最广泛研究。从外泌体miRNA的角度来看，一个小组发现，骨髓MSC源性外泌体中的miR-136-5p促进了体外成骨细胞的增殖和分化，从而促进了体内的骨折愈合。这是通过抑制miR-163-5p的下游靶基因，低密度脂蛋白受体相关蛋白4（LRP4），通过Wnt/β-catenin途径实现的。另一个小组发现，MSC源性外泌体miR-25可以通过Smad泛素化调节因子1（SMURF1）调节Runt相关转录因子2（Runx2）的泛素化和降解，以促进小鼠骨折愈合。从lncRNA的角度来看，特别是骨特异性lncRNA H19，一个中国小组揭示了尽管高脂饮食减少了成骨分化并削弱了骨折愈合，但这可以通过MSC源性外泌体lncRNA H19通过miR-467/HoxA10轴在肥胖诱导的骨折模型中逆转。此外，一个美国小组证明了外泌体lncRNA H19不仅改善了成骨作用，还通过血管生成素1/Tie2-NO信号途径改善了血管生成。 与其使用MSC自然衍生的外泌体，一些研究人员对分离前的外泌体进行了预处理以获得更好的结果。梁等人用小剂量的二甲基草酰甘氨酸（DMOG），一种小的血管生成分子，预处理MSCs，以准备外泌体，通过靶向蛋白激酶B/mechanistic target of rapamycin（Akt/mTOR）途径，在临界尺寸颅骨缺损模型中增强血管生成和骨再生。另一种方法，陆等人将miR-29a装载到MSC源性外泌体中，通过靶向vasohibin 1，显示出强大的促进血管生成和成骨作用的能力。此外，脐带MSC源性外泌体在骨折愈合中显示出与骨髓MSC相当的成果。此外，低氧条件下的MSC源性外泌体对骨折愈合的效果比正常氧条件下的更好。从机制上讲，低氧预处理通过激活低氧诱导因子1（HIF-1α）增强了外泌体miR-126的产生。各种研究表明，低氧预处理是MSC源性外泌体治疗骨折愈合效果的有效和有前景的优化方法。 3.2.骨关节炎 骨关节炎（OA）是最常见的关节疾病，也是成人活动限制的最常见原因，全球约有2.4亿患者受到影响。OA的病理学已经从被视为仅软骨发展到影响整个关节的所有组成部分的多组织疾病，包括骨骼、滑膜、肌肉、韧带和周围脂肪。临床试验成功揭示了阻止结构进展（例如，组织蛋白酶K和Wnt抑制剂）或减少OA疼痛（例如，神经生长因子抑制剂）的系统化合物。作为一种潜在的OA治疗选择，大多数MSC源性外泌体治疗在体外模型中以软骨细胞为目标。这些MSCs可以来自各种组织，如骨髓、滑膜、牙龈和髌下脂肪垫（IPFPs）。 一些关注软骨生成的研究特别关注miRNA的作用。吴等人发现IPFP MSC源性外泌体通过miR100-5p调节的mTOR-自噬途径抑制来保护关节软骨免受损害，并改善OA小鼠的步态异常。由于在临床上通过关节镜手术容易从OA患者中检索到人类IPFP，这种类型的外泌体治疗可能会简化和加速从实验室到床边的过程。刘等人发现MSC源性外泌体可以通过lncRNA-KLF3-AS1/miR-206/GIT1轴促进软骨细胞的增殖并抑制其凋亡。孔等人进行的细胞工作表明，滑膜MSC源性外泌体miR-320c可以通过靶向ADAM19增强软骨生成。此外，毛等人建议，来自软骨生成MSCs的外泌体miR-92a-3p可以通过靶向Wnt5a增强软骨生成并抑制软骨降解。82 与这些使用原始外泌体的研究相比，很少有小组在系统给药前对外泌体进行了修改。陶等人通过转染滑膜MSCs与miR-140-5p修改外泌体，发现外泌体miR-140-5p过表达可以增强软骨组织再生并防止大鼠模型中的膝关节OA。同时，王等人使用TGF-β1刺激MSCs，由此产生的外泌体miR-135b通过调节特异性蛋白-1增加了软骨细胞的增殖。在一项比较研究中，朱等人证明了来自iPSC衍生的MSCs的外泌体比滑膜MSC衍生的外泌体对OA的治疗效果更强。 其他研究不仅关注软骨形成，还关注在骨关节炎(OA)治疗中的抗炎和免疫调节作用。例如，间充质干细胞(MSC)衍生的外泌体在体外抑制了炎症因子、与谷氨酰胺代谢活性相关的蛋白、谷氨酰胺以及GSH/GSSG比例，同时在体内改善了小鼠的软骨细胞功能、组织炎症和运动能力，从而缓解了OA的进展。使用整体方法，近期研究已将注意力从软骨转移到其他组织（例如，骨骼）在关节中。首先，骨髓MSC衍生的外泌体miR-206促进了OA中成骨细胞的增殖和成骨分化，通过减少E74样因子3(Elf 3)，改善了炎症，并增加了小鼠股骨组织中骨钙素和BMP2的表达。其次，MSC外泌体处理的骨软骨缺陷表现出再生免疫表型，特征是CD163+ M2型巨噬细胞的浸润高于CD86+ M1型巨噬细胞，并伴随着促炎滑膜细胞因子IL-1β和TNF-α的减少。最后，牙龈MSC衍生的外泌体在预防胶原诱导的关节炎方面被证明具有免疫抑制作用。与亲代细胞相比，这些外泌体在抑制IL-17A和促进IL-10、降低关节炎的发病率和骨侵蚀方面具有相同或更强的效果，通过抑制IL-17RA-Act1-TRAF6-NF-κB信号通路。 目前，没有单一的“一刀切”药物可能适合所有OA患者。改变疾病的OA药物(DMOADs)可能成为下一代OA治疗。MSC衍生的外泌体治疗OA与DMOADs相吻合非常有价值和相关：两者都能靶向炎症细胞因子、基质降解酶和Wnt通路。因此，DMOADs开发中的新兴方法，如基于miRNA的模式和靶向细胞衰老，也可能被用来完善基于MSC的外泌体治疗OA。 3.3.脊髓损伤 创伤性脊髓损伤(SCI)是一个毁灭性的全球健康问题，对患者和社会都造成了重大的功能和经济负担。SCI的病理生理学包括由机械创伤引起的原发性损伤和以凋亡、水肿、缺血、炎症细胞浸润和兴奋毒性为特征的继发性损伤级联。尽管进行了外科干预，涉及药物治疗的临床研究可以被广泛分类为神经保护性或神经再生性。针对上述机制链的每个事件，MSC和NSC衍生的外泌体治疗都能对脊髓保护和再生产生有益影响。 一些研究小组已经针对神经细胞死亡。Ma等人。揭示了胰岛素样生长因子1(IGF-1)刺激的NSC衍生的外泌体可以通过miR-219a-2-3p/YY1途径抑制神经细胞凋亡，同时促进SCI后的功能恢复。另外，Zhang等人。发现蛛网膜下腔注射NSC衍生的外泌体可以通过激活自噬来抑制神经细胞凋亡，通过miR-374-5p/STK-4轴增强SCI后的功能恢复。Shao等人。使用MSC衍生的外泌体探索了其他形式的细胞死亡（例如，铁死亡），发现外泌体lncGm36569可以通过miR-5627-5p/FSP1轴抑制神经细胞铁死亡，从而减少神经功能障碍。 一些研究小组已经针对抗炎和免疫调节。Nakazaki等人。发现分数静脉注射MSC衍生的外泌体可以靶向M2型巨噬细胞并上调TGF-β，从而稳定微血管并改善功能恢复。类似地，Liu等人。证明除了缺氧增加骨髓MSCs中外泌体的产生外，预处理的外泌体miR-216a-5p也可以通过TLR4/NF-κB/PI3K/Akt途径调节小胶质细胞M1/M2极化，修复创伤性SCI。Huang等人。有价值地证明了硬膜外脂肪MSC衍生的外泌体可以减轻NLRP3炎症体并改善SCI后的功能恢复。与MSC衍生的外泌体相比，内皮祖细胞(EPC)衍生的外泌体可以提供相当的抗炎效果。Yuan等人。显示EPCs的外泌体miR-222-3p可以通过SOC3/JAK2/STAT3途径促进抗炎巨噬细胞，并改善SCI后小鼠的功能修复。 一些研究小组已经针对血管生成和血-脊髓屏障(BSCB)完整性。例如，Zhong等人。使用未修饰的NSC衍生的外泌体，发现它们富含VEGF-A，因此可以增强脊髓微血管内皮细胞(SCMECs)的血管生成活性。相比之下，Chen等人。用FTY720修饰NSC衍生的外泌体，FTY720是一种免疫调节剂和微血管调节剂，通过PTEN/Akt途径保护SCMECs的屏障功能，从而改善后肢功能。众所周知，脊髓微血管内皮与周细胞之间的连接对于维持BSCB的结构完整性至关重要。因此，Zhou的团队试图验证外泌体治疗在周细胞稳态中的作用。他们证明骨髓MSC衍生的外泌体可以减少体外周细胞焦亡并增加周细胞存活率，同时改善BSCB完整性和运动功能恢复。 最后，一些研究小组在神经保护和神经再生期间针对其他方面，如神经毒性星形胶质细胞和内源性NSC的可持续性。Lai等人。证明人脐带MSC衍生的外泌体可以通过靶向神经毒性星形胶质细胞来促进脊髓功能的恢复。此外，miR-146a-5p修饰的外泌体比未修饰的外泌体具有更强的效果。Li等人。发现从神经生长因子(NGF)过表达的骨髓MSCs衍生的外泌体可以增强NSCs的神经元分化和轴突再生。Zhou等人。证明胎盘MSC衍生的外泌体可以促进增殖内源性NSCs的激活，从而改善运动活性和膀胱功能障碍，这是一个可能进一步恶化SCI患者生活质量的常见后遗症。 3.4.肌肉和肌腱撕裂 肌肉和肌腱撕裂可能是由急性创伤（例如，骨折，第3.1节）或慢性过度使用（例如，运动损伤）引起的。肌肉拉伤和肌腱撕裂的愈合遵循典型的伤口愈合过程，涉及炎症、增殖和重塑阶段。包括基于细胞和基于生长因子的治疗在内的多种非外科策略已被试验以改善愈合。以下概念验证研究表明，MSC衍生的外泌体可能成为下一代肌肉骨骼治疗。 一方面，一些研究小组专注于肌肉-肌腱-骨单元的各个组成部分。Nakamura等人。声称MSC衍生的外泌体可以改善C2C12肌细胞的体外肌生成和HUVECs中的血管生成，同时加速体内骨骼肌再生在心脏毒素诱导的肌肉损伤模型中。这些好处至少部分是通过miRNAs如miR-494介导的。Chen等人。发现脂肪MSCs的外泌体可以增强原代腱细胞的增殖和迁移，同时通过上调装饰蛋白和小胶原在兔子跟腱断裂模型中改善修复肌腱的机械强度。 另一方面，一些研究小组将肌肉-肌腱-骨单元视为一个单一的功能系统，并使用肩袖撕裂作为疾病模型，这是患者寻求治疗的最常见肩部疾病。一组研究人员发表了两项连续的研究，使用脂肪MSC衍生的外泌体。在大鼠大量肩袖撕裂模型中，外泌体治疗可以防止肌肉的萎缩、炎症和血管化。在兔子慢性肩袖撕裂模型中，外泌体治疗可以防止脂肪浸润并改善生物力学特性。另一组报告说，骨髓MSC衍生的外泌体可以增加肩袖重建后的断裂负荷和刚度，诱导肩袖端点周围的血管生成，并促进腱-骨界面的生长。 3.5.其他骨科疾病 骨质疏松症是一种代谢性骨病，其特征是骨密度低和骨结构弱化，增加了骨折的风险。它是由破骨细胞骨吸收过度补偿成骨细胞骨形成引起的。在一项细胞研究中，脂肪MSC衍生的外泌体可以拮抗缺氧/血清剥夺诱导的骨细胞凋亡和骨细胞介导的成骨细胞生成。进一步的动物研究揭示了脐带MSC衍生的外泌体可以通过miR-1263/Mob1/Hippo途径抑制骨髓MSC凋亡并预防废用性骨质疏松症，并通过miR-2110和miR-328-3p改善胫骨密度和逆转雌激素缺乏性骨质疏松症。 与脊髓损伤(SCI)相比，周围神经损伤（例如坐骨神经损伤）更为常见。随后的神经再生受到神经元和施万细胞之间相互作用的控制，并因炎症细胞浸润而变得更加复杂。研究表明，脂肪MSC衍生的外泌体可以通过增加体外神经突起生长和体内轴突再生以及步行行为来靶向神经元。脂肪MSC衍生的外泌体可以通过促进施万细胞的增殖、迁移和神经营养因子的分泌来靶向施万细胞，在体外促进神经营养因子的分泌，并在体内恢复去神经肌肉萎缩。LPS预处理的MSC衍生外泌体可以通过增强体外M2型巨噬细胞极化来靶向炎症细胞，并加速体内周围神经再生。 腰椎间盘退变(IVD)是导致下背痛的主要原因，这是导致全球残疾寿命年数最多的伤害。其分子过程包括细胞外基质(ECM)退化、炎症、氧化应激、凋亡、衰老和自噬减少。外泌体治疗的新途径试图解决这些问题。Cheng等人证明，骨髓MSC衍生的外泌体通过外泌体miR-21抑制髓核细胞(NPC)凋亡，缓解IVD退变。另一方面，Chen等人发现，人类ESC衍生的外泌体可以通过传递miR-302c抑制NLRP3炎症体，从而减轻髓核细胞的焦亡。除了细胞死亡和线粒体损伤外，NPC中的氧化应激也被MSC衍生的外泌体抑制。由于IVD退变和OA共享常见的分子疾病谱，使用MSC衍生外泌体治疗OA（第3.2节）的积极结果可以作为IVD退变研究的参考。 股骨头坏死（ONFH），也称为缺血性坏死，是一种影响年轻人群的致残性疾病，通常导致全髋关节置换。糖皮质激素(GC)诱导的骨坏死是ONFH最常见的原因之一，其发病机制表现在两个方面：股骨头的血液供应受损和成骨活性减弱。刘等人表明，iPSC衍生的MSCs的外泌体可以通过PI3K/Akt途径促进血管生成和成骨来预防GC诱导的ONFH。Zuo等人证明，过表达miR-26a的外泌体衍生自HSCs，可以提供类似的治疗效果。 4.神经外科和SC-EXO治疗 4.1.缺血性中风 中风是全球死亡第二大原因，也是导致残疾的第三大原因，其中缺血性中风是最常见的亚型。缺血性级联反应中的关键事件包括神经元功能障碍、兴奋毒性、神经化学损伤和神经炎症。在治疗方面，新一代的临床试验正在进行中，使用细胞保护药物，如免疫调节剂、IL-6受体拮抗剂、Rho激酶抑制剂和自由基清除剂。针对上述病理生理学的每个事件，几乎所有亚型的SC-exo都显示出对中风恢复的强效治疗效果（表3）。 一些研究小组已经针对神经保护和神经发生。首先，SC-exo治疗可以抑制神经细胞死亡。Luo等人发现，NSC衍生的外泌体可以抑制凋亡，同时在正常和缺氧糖剥夺（OGD）条件下促进SH-SY5Y细胞的增殖。这在大脑中动脉闭塞（MCAO）模型中也得到了测试，表现为减少的梗死面积和神经细胞凋亡，通过外泌体miR-150-3p。其他体外和体内研究表明，使用EPC衍生的外泌体具有类似的抗凋亡效应。Zhang等人发现，通过用干扰素γ（IFN-γ）预处理亲代NSCs，可以提高外泌体的抗凋亡效应。其次，SC-exo治疗可以保护中枢神经系统的细胞。Kang等人揭示，来自骨髓MSCs的外泌体可以通过抑制NLRP3炎症体介导的焦亡来挽救OGD诱导的神经细胞损伤。来自缺氧培养的外泌体比正常培养的外泌体具有更显著的神经保护效应。同样，Li等人发现，来自人类iPSC衍生的神经祖细胞的外泌体对OGD神经元和神经突起生长具有神经保护作用。在缺血条件下保护神经功能是通过PTEN/Akt途径调节的。此外，Sun等人证明，NSC衍生的外泌体也可以保护星形胶质细胞，这些细胞在中风后变成支持反应性星形胶质细胞（RAs）。第三，SC-exo治疗可以改善中风后的神经发生。Wei等人表明，来自骨髓MSCs的外泌体中的Zeb2/Axin2可以改善中风后的神经发生、神经可塑性和空间记忆以及神经功能，可能通过SOX10、Wnt/β-catenin和内皮素-3/EDNRB途径。Wang等人说明，修饰miR-126的EPC衍生的外泌体可以通过增强神经发生来缓解急性脑损伤并促进中风后的功能恢复。 一些研究小组已经针对抑制神经炎症。首先，未修饰的SC-exo治疗通过外泌体miRNAs显示出抗炎效应。Dong等人表明，骨髓MSC衍生的外泌体可以在体外诱导BV2小胶质细胞失活和M2极化，同时通过传递miR-23a-3p减少体内梗死大小并改善神经功能。类似地，Zhang等人揭示，脐带MSC衍生的外泌体miR-146a-5p可以减轻体外OGD后小胶质细胞介导的神经炎症，同时通过IRAK1/TRAF6信号通路改善体内行为缺陷和小胶质细胞激活。其次，通过修饰外泌体可以增强SC-exo治疗的抗炎效应。Yoon和同事建立了过表达肿瘤易感性基因（TSG）101的人类NSCs，从而增加外泌体分泌。工程化外泌体不仅在体外减轻了LDH释放和促炎因子，而且在体内减少了梗死体积，抑制了DNA损伤途径，并上调了神经营养因子。此外，Tian的团队通过巧妙地将RGD肽附着在NSC衍生的外泌体膜上，开辟了新的领域，该外泌体在静脉给药后靶向缺血性大脑的损伤区域，从而通过抑制MAPK途径抑制脑缺血后的炎症反应。有趣的是，Gao等人使用从小鼠成纤维细胞重编程的诱导NSCs（iNSCs）进行中风治疗。他们表明，iNSC衍生的外泌体与NSC衍生的外泌体具有相似的治疗效应，不仅可以促进神经发生，还可以抑制神经炎症。 最后，一些研究小组在中风恢复期间针对其他方面，如神经化学损伤和氧化应激。Zhu等人将脑源性神经营养因子（BDNF）装载到NSC衍生的外泌体中，构建工程化外泌体。在H2O2诱导的氧化应激模型中，外泌体治疗显著增强了NSC的存活。在大鼠MCAO模型中，外泌体治疗不仅抑制了小胶质细胞激活，还促进了内源性NSCs向神经元的分化。总的来说，基于BDNF的NSC衍生外泌体的修饰在治疗缺血性中风中提高了效果。另一方面，修饰miR-210的EPC衍生外泌体可以保护神经元免受缺氧和再氧化（H/R）诱导的凋亡、氧化应激和活力下降，从而支持缺血性中风的治疗。来自富含ACE2的EPC衍生外泌体的miR-17-5p可以改善老年小鼠的脑缺血损伤。在Xu和同事进行的一项有趣的研究中，NSC-exo和EPC-exo的组合，通过BDNF-TrkB和Nox2/ROS途径保护H/R损伤的神经元，通过miR-210和miR-123过表达对缺血性中风发挥更好的治疗效果。 与缺血性中风相比，出血性中风对大多数幸存者构成了更致命的威胁和更严重的残疾。miR-137过表达被发现可以增强EPC衍生外泌体对氧血红蛋白处理的SH-SY5Y细胞（一种体外出血性中风模型）中凋亡、铁死亡和线粒体功能障碍的神经保护效应，部分通过COX2/PGE2途径实现。 4.2.创伤性脑损伤 全球每年大约有7000万患者遭受创伤性脑损伤（TBI），这构成了严重的身体、心理社会和经济威胁。TBI可以分为原发性损伤（例如，轴突死亡、神经炎症、神经化学变化和代谢功能障碍）和继发性损伤（例如，缺血和缺氧损伤、脑水肿、颅内压增高、脑积水和感染）。每位TBI患者都有一套独特的情况，这取决于伤害的位置和严重程度等变量，使得医疗和外科治疗相当具有挑战性。因此，使用SC-exo的系统疗法可能成为管理TBI的“一刀切”选项。 一系列最初关注MSC衍生外泌体疗法功能恢复和宏观方面的动物研究发表。在大鼠TBI模型中，接受外泌体治疗的动物在空间学习和感觉运动功能方面显示出显著改善。此外，外泌体治疗显著增加了病变边界区域新生内皮细胞的数量，以及齿状回中的新生未成熟和成熟神经元。在另一个具有类似发现的大鼠TBI模型中，从3D系统中培养的MSC衍生的外泌体比传统2D条件下的外泌体提供了更好的结果。在对主要运动皮层进行TBI的猴子模型中，接受外泌体治疗的动物在恢复的前3-5周内恢复到术前的抓握模式和获取食物奖励的潜伏期。在一个更复杂且临床上更现实的大动物模型中，研究了TBI和出血性休克，外泌体疗法减轻了神经损伤的严重程度并加快了神经恢复。 相比之下，近年来完成的研究为SC-exo疗法对TBI的分子机制提供了新的见解。Chen等人报告称，脂肪MSC衍生的外泌体可以通过特别被微胶质细胞摄取并抑制它们的激活来促进功能恢复、抑制神经炎症、减少神经元凋亡和增加神经发生，通过抑制NF-κB & MAPK途径实现。Wen等人表明，骨髓MSC衍生的外泌体可以减少TBI小鼠模型的皮层组织中细胞凋亡，抑制神经炎症，并促进微胶质细胞向抗炎表型的转变。这是通过miR-181b对IL-10/STAT3途径的作用实现的。Abedi等人证明，NSC衍生的外泌体可以改善神经行为表现，抑制星形胶质细胞神经炎症，增强神经发生，同时保持NSC干性。一个有价值的额外发现是，与亲本NSC相比，外泌体在感觉运动功能恢复方面似乎更优越。最后，剂量反应和治疗窗口表明，MSC衍生的外泌体可以改善血管生成和神经发生，以及感觉运动和认知功能，同时减少神经炎症和海马神经元细胞丢失。尽管100 µg和1天可能是最佳剂量和治疗窗口，但外泌体在至少7天伤后的治疗窗口内对TBI治疗显示出广泛的有效剂量范围。 TBI和SCI是两种最严重的CNS创伤，日益被认为是全球健康优先事项。第3.3节和4.2节中提出的新兴证据对这两个密切相关的研究子专业是相互有益的。因此，未来对TBI和SCI的SC-exo疗法的研究可以是机制基础的（例如，脑肠轴转录因子炎症体和补体系统的作用）或基于修饰的（用药物装载外泌体，例如，免疫调节剂抗氧化剂循环RNA和microRNAs）。 4.3.阿尔茨海默病 与TBI和SCI不同，阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）是最常见的神经退行性疾病（NDD）。NDD的标志包括但不限于，病理性蛋白聚集，突触和神经网络功能障碍，异常蛋白质稳态，细胞骨架异常，能量稳态改变，DNA和RNA缺陷，炎症和神经元细胞死亡。AD是全球最常见的痴呆形式，占2500万例。目前，只有两类药物被批准用于症状性AD治疗，包括胆碱酯酶抑制剂和NMDA拮抗剂。尽管有几种疗法正在积极进行临床试验，但它们都远未治愈AD。大脑-药物输送的挑战，例如，血脑屏障（BBB）和药代动力学缺点，很可能被纳米大小的外泌体解决，这些外泌体还包装有强大的生物分子。大多数SC-exo疗法涉及淀粉样β（Aβ），它位于AD病理生理学的中心。 最初的工作集中在清除病理性蛋白Aβ肽的聚集。Elia及其同事通过脑内注射MSC衍生的外泌体，在AD的临床前模型的早期阶段减少了皮质和海马中的Aβ斑块负担和营养不良的神经突起。此外，作者使用免疫印迹确认了Neprilysin的存在，Neprilysin是一种能够降解Aβ的中性内肽酶，存在于外泌体的裂解物中及其mRNA中。 一些团队专注于缓解突触功能障碍和氧化应激。Wang等人发现，MSC衍生的外泌体可以挽救突触损伤并改善APP/PS1小鼠的认知行为，同时减轻外源性Aβ诱导的诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达。与使用MSC衍生的外泌体不同，Li等人给予NSC衍生的外泌体并增强线粒体功能，激活sirtuin 1，突触活动，并挽救认知缺陷。Huber等人注意到，热休克诱导的NSC衍生的外泌体表现出更大的神经保护作用，对抗氧化应激以及Aβ诱导的神经毒性。 一些团队将研究重点放在能量稳态上。Chen等人发现，MSC衍生的外泌体可以改善AD转基因小鼠的大脑葡萄糖代谢和认知功能，分别使用18F-FDG PET/CT成像和NOR测试。 一些团队专注于小胶质细胞神经炎症。在Zavatti的细胞研究中，发现羊水MSC衍生的外泌体可以减轻神经炎症小胶质细胞表型并从Aβ中恢复神经毒性，使用LPS刺激的BV2小胶质细胞和SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞作为模型。Ding等人表明，脐带MSC衍生的外泌体可以通过调节小胶质细胞激活来减轻神经炎症和减少Aβ沉积，从而增加AD小鼠的空间学习和记忆功能。 一些团队专注于神经元细胞死亡和神经发生，希望抵消AD的进展。Reza-Zaldivar及其同事给予AD小鼠MSC衍生的外泌体，SC-exo疗法刺激了侧脑室区的神经发生并减轻了Aβ诱导的认知障碍。这些效果与MSC中显示的效果相当。 一些团队专注于血脑屏障（BBB），其功能障碍导致通透性增加、微出血、葡萄糖运输受损以及周细胞和内皮细胞退化。刘等人指出，5xFAD（家族性阿尔茨海默病）小鼠在4个月大时BBB破裂，更重要的是，用NSC衍生的外泌体治疗逆转了AD引起的BBB缺陷。 最后，一些团队专注于提高AD的SC-exo疗法的技术性。当外泌体被静脉注射时，它们可以在大脑以外的其他器官中被追踪，而不是目标区域。崔等人将MSC衍生的外泌体与CNS特异性狂犬病病毒糖蛋白（RVG）结合，以靶向转基因AD小鼠的大脑。修改后的外泌体不仅显示出增加的皮层和海马体输送，而且还显著改善了学习能力和记忆能力，同时减少了Aβ沉积。另一方面，高等人通过体细胞重编程获得了iNSC，为治疗性外泌体的来源开辟了新窗口。他们证明，与NSC衍生的外泌体具有相似治疗效果的iNSC衍生外泌体，可以减轻各种AD表型，例如，认知功能、Aβ沉积、神经炎症和神经再生，在临床前小鼠模型中。 4.4.帕金森病 帕金森病是老年人中第二常见的神经退行性疾病，全球影响超过600万患者。PD是由黑质多巴胺能神经元坏死和名为Lewy体的蛋白质包涵体存在引起的。分子病理生理学包括α-突触核蛋白蛋白质稳态、线粒体功能障碍、氧化应激、钙失衡和神经炎症。 在一项使用骨髓MSC衍生外泌体的研究中，黄等人发现，外泌体衍生的肿瘤坏死因子刺激基因-6（TSG-6）可以减轻1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+，神经毒素MPTP的代谢产物）诱导的神经毒性。在这个使用SH-SY5Y和SK-N-SH细胞的体外PD模型中，外泌体抗PD进展效应被发现是通过STAT3/miR-7/NEDD4轴介导的。 在一项使用NSC衍生外泌体的研究中，李等人揭示了SC-exo疗法可以帮助预防PD的神经病理学和进展。在体外对SH-SY5Y和BV2细胞工作时，NSC衍生的外泌体可以减少细胞内活性氧（ROS）和相关的凋亡途径。在体内对6-羟多巴胺诱导的PD小鼠工作时，NSC衍生的外泌体可以下调促炎因子并显著减少多巴胺能神经元丢失。确认了NSC特异性microRNAs的存在，如miR-182-5p、miR-183-5p、miR-9和let-7，并发现它们参与细胞分化、神经营养功能和免疫调节。 4.5.多发性硬化症 多发性硬化症（MS）是最常见的非创伤性、神经退行性和致残性CNS疾病，影响年轻成人。MS的病理标志是大脑和脊髓中脱髓鞘病变的形成，伴有炎症和自身免疫参与。目前批准的疾病修饰疗法包括基于干扰素的、免疫调节的、免疫抑制的和免疫重建药物。一些初步研究强调了MSC衍生外泌体对MS治疗的潜力。 在一项使用实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）大鼠的动物实验中，李等人表明SC-exo疗法显著降低了神经行为评分，减少了炎症细胞渗入CNS，并减少了脱髓鞘。此外，外泌体治疗通过调节小胶质细胞的极化，上调M2相关细胞因子，同时下调M1相关细胞因子。 在一项使用两种脱髓鞘小鼠模型（EAE模型和铜饮食模型）的动物研究中，张等人发现SC-exo疗法可以通过直接作用于少突胶质细胞（OL）前体和间接作用于小胶质细胞来促进再髓鞘化。MSC衍生的外泌体可以改善神经系统结果，增加新生成和成熟的OL数量，减少Aβ前体蛋白密度，通过从M1转变为M2表型减少神经炎症，并抑制TLR2/IRAK1/NF-κB途径。 4.6.其他神经外科和相关疾病 上述已经详细讨论了MSC和NSC衍生外泌体疗法在四种主要类型的神经外科或神经系统疾病中的外科潜力。除了血管破裂、创伤、神经退行性和自身免疫相关疾病外，最近证明其他疾病也适合SC-exo疗法（表3）。这些包括但不限于：1，痴呆症，如血管性痴呆。HIV相关的神经认知障碍和辐射诱导的认知功能障碍；2，功能障碍，如癫痫和机械性痛觉过敏；3，先天性异常，如开放性脊柱裂；4，神经心理状况，如抑郁和压力；5，大脑衰老；6，医源性大脑问题，如深度低温循环停止。 5.整形外科和SC-EXO疗法 人体所有部位都发生伤口愈合，其中皮肤伤口最为常见。伤口相关费用最高的是外科伤口，其次是糖尿病溃疡。伤口愈合的总体但重叠阶段包括止血、炎症、血管生成、增殖和重塑，每个阶段由不同的细胞类型控制，并由各种信号通路调节。超过一半的相关使用SC-exo疗法促进皮肤伤口愈合的工作是基于MSC的（表4）。 在炎症阶段，外泌体能够抑制外周血单个核细胞的增殖，并在体外促进调节性T细胞的转化，减少皮肤中淋巴细胞的浸润。此外，外泌体能够减少IgE、嗜酸性粒细胞和肥大细胞的数量，并下调炎症细胞因子。在血管生成阶段，受过教育的外泌体（例如，阿托伐他汀和去铁酮）能够通过Akt/eNOS和PTEN/PI3K/Akt途径促进糖尿病伤口的血管生成。内皮祖细胞衍生的外泌体能够通过Erk1/2途径和p53途径加速皮肤伤口愈合。在增殖阶段，干细胞衍生的外泌体能够促进成纤维细胞和角质形成细胞的增殖和迁移。一些是通过PI3K/Akt、Akt/HIF-1α、ERK1/2和Wnt/β-catenin途径实现的，而另一些则是通过抑制LATS2、PPARγ和AIF核转位实现的。在伤口愈合的最后重塑阶段，肉芽组织被永久性瘢痕所取代，异常的伤口愈合可能会发生（例如，瘢痕疙瘩和肥厚性瘢痕）。间充质干细胞衍生的外泌体能够通过TGF-β/Smad2途径抑制成纤维细胞-肌成纤维细胞的转化，并在早期增加胶原蛋白合成，在晚期减少，从而减少瘢痕形成。此外，胚胎干细胞衍生的外泌体被发现对伤口愈合具有与间充质干细胞衍生的外泌体相似的治疗作用。陈等人使用人类胚胎干细胞衍生的外泌体帮助治疗压力性溃疡。他们注意到外泌体能够通过激活Nrf2改善内皮细胞衰老，并恢复与衰老相关的血管生成功能障碍，从而加速伤口愈合。此外，Bae等人揭示了来自胚胎干细胞的外泌体mmu-miR-291a-3p能够通过TGF-β受体2途径抑制人皮肤成纤维细胞的细胞衰老，从而加速切除性皮肤伤口愈合过程。除了伤口愈合，其他与整形外科相关的疾病已被证明适合SC-exo治疗（表4）。这些包括但不限于：1，皮肤移植，如皮瓣；2，组织丢失，如颅面缺陷；3，自身免疫性皮肤病，如硬皮病；4，皮肤感染，如利什曼病；5，毛发移植，如治疗脱发；6，皮肤老化。 6.普通外科和SC-exo治疗 作为普通外科的一个主要亚专业，肝胆外科对SC-exo治疗引起了极大的关注。首先，急性肝损伤（ALI）/急性肝衰竭（ALF）是一种罕见但具有挑战性的综合征，表现为肝功能障碍、凝血病、脑病和多器官衰竭。大约60%的ALF病例需要并接受原位肝移植或导致死亡。在一项研究中，林的团队关注了ALI的细胞死亡方面，并发现间充质干细胞衍生的外泌体能够通过稳定SLC7A11对抗四氯化碳诱导的ALI中的铁死亡。或者，邵的团队关注了外泌体的预分离修饰，并揭示了来自脐带间充质干细胞的外泌体能够通过外泌体miR-455-3p改善IL-6诱导的ALI。其次，与ALI相比，肝纤维化发生在肝脏持续慢性损伤时，可能会发展成肝硬化、肝衰竭、肝细胞癌甚至死亡。马等人发现间充质干细胞起源的外泌体circDIDO1能够通过miR-141-3p/PTEN/Akt途径在人肝纤维化中抑制肝星状细胞的激活。此外，王等人发现来自3D人类胚胎干细胞球体的外泌体能够通过外泌体miR-6766-3p的失活Smad途径减轻肝星状细胞的激活并抑制肝纤维化。对于那些需要肝移植的晚期肝纤维化患者，肝脏缺血再灌注损伤（IRI）是移植物功能障碍和器官排斥的严重并发症。杨等人证明骨髓间充质干细胞衍生的外泌体能够缓解肝IRI，减少肝细胞凋亡，并降低肝脏酶水平，通过增强自噬。杜等人表明，来自iPSC衍生的间充质干细胞的外泌体能够通过激活鞘氨醇激酶和鞘氨醇-1-磷酸途径保护肝脏免受肝IRI。第三，非酒精性脂肪肝病（NAFLD）被知道对中风恢复产生不利影响。使用2型糖尿病小鼠模型，Venkat等人证明HSC衍生的外泌体能够同时减少肝功能障碍并改善神经和认知功能。最后，急性胰腺炎是一种不可预测且可能致命的疾病，其预后主要取决于是否发展成多器官功能障碍综合征。陈等人揭示了来自iPSC衍生的间充质干细胞的外泌体能够通过Akt/Nrf2/HO-1途径改善严重急性胰腺炎引起的心肌损伤。外周动脉疾病影响全球2亿患者，在最严重的阶段，可能导致严重肢体缺血，使患者面临增加的心血管事件、截肢和死亡风险。作为一种无细胞治疗，胎盘间充质干细胞衍生的外泌体输注能够在小鼠耳缺血损伤模型中增强血管生成，使用激光多普勒血流分析。从机制上讲，间充质干细胞衍生的外泌体不仅促进体外管状结构的形成，而且动员内皮细胞进入皮下Matrigel栓塞体内，主要通过外泌体促血管生成的微小RNA，如miR-30b。此外，HSC衍生的外泌体能够通过改善肢体灌注、毛细血管密度、运动功能及其截肢来修复小鼠的缺血后肢。这很可能是由于内皮细胞相对于平滑肌细胞和成纤维细胞的外泌体miR-126-3p的内化。人类iPSC衍生的外泌体通过外泌体miR-199b-5p展示了类似的新生血管生成效应。另一方面，腔内再通越来越多地被用来重建血流到缺血区域，并恢复外周动脉疾病患者的组织丢失或坏疽。三个独立的团队都证明了EPC衍生的外泌体能够通过增强内皮细胞功能促进血管修复并加速大鼠球囊诱导的血管损伤模型中的再内皮化。此外，Kong等人通过抑制新内膜增生展示了EPC衍生的外泌体对球囊损伤的类似保护效果。这是通过促进再内皮化和抑制再狭窄而不是通过直接抑制平滑肌细胞的增殖和迁移来实现的。 McCulloh及其同事发表了一项关于坏死性小肠结肠炎（NEC）的SC-exo治疗的有趣研究，该研究对需要手术的早产儿的总体死亡率超过30%。作者比较了四种不同类型的干细胞衍生的外泌体的治疗效应，即羊水间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、羊水神经干细胞和新生儿肠神经干细胞。当以至少4×10^8的浓度注射时，所有类型的SC-exo都被证明能够像它们的亲本干细胞一样有效地减少实验性NEC的发生率和严重程度。 败血症是普通外科中致命且可能可以预防的并发症，其中微血管功能障碍导致多器官衰竭和死亡。使用通过盲肠结扎和穿刺（CLP）的小鼠败血症模型，周等人证明EPC衍生的外泌体能够改善败血症结果。这表现为减少肺和肾脏血管渗漏，改善器官功能，并增加通过外泌体miR-126-5p和miR-126-3p的生存率。同样，刘等人通过外泌体miR-382-3p通过IκBα/NF-κB途径展示了EPC衍生的外泌体对败血症诱导的器官损伤和免疫抑制的保护作用。 7.心脏外科和SC-EXO治疗 全球主要死因是缺血性心脏病（IHD），主要由阻塞性冠状动脉粥样硬化引起。动脉粥样硬化斑块的破裂是急性动脉血栓形成导致心肌梗死（MI）最常见的触发因素。心肌长期缺氧可导致心肌细胞死亡。尽管及时的再灌注至关重要，但可能发生心肌IRI，从而减轻再灌注的有益效果。尽管现代冠状动脉再灌注，与急性MI导致的心力衰竭发展相关的死亡率和发病率仍然很高，这突出了下一代心脏保护治疗的重要性，如SC-exo。 邢等人进行的工作关注动脉粥样硬化。脂肪来源的间充质干细胞衍生的外泌体miR-342-5p被证明可以通过靶向H2O2挑战的HUVEC模型中的PPP1R12B来保护内皮细胞免受动脉粥样硬化的影响。彭等人和高等人进行的工作关注MI。来自间充质干细胞的外泌体miR-25-3p能够通过靶向促凋亡蛋白和EZH2来缓解MI，在OGD心肌细胞模型和左前降支结扎动物模型中。类似地，人类iPSC衍生的外泌体可以在不增加心律失常并发症的频率的情况下改善MI的恢复，在猪模型中。温等人和桑索等人进行的工作关注心肌细胞的死亡。间充质干细胞衍生的外泌体可以通过miR-144靶向PTEN/Akt途径在缺氧条件下改善心肌细胞凋亡，而iPSC衍生的外泌体可以调节缺氧心肌细胞中的自噬。卡苏尔等人和陈等人关注心肌IRI。前者发现来自非心肌细胞相关细胞的外泌体，即CTX0E03 NSCs，可以通过JAK/STAT途径减少梗死面积，同时延迟心肌细胞线粒体通透性转换孔的开启。后者发现间充质干细胞衍生的外泌体miR-143-3p可以通过CHK2-Beclin2途径调节自噬来抑制心肌IRI。最后，陈等人证明骨髓间充质干细胞衍生的外泌体可以减轻压力过载诱导的重构中的心肌肥大和纤维化，从而为心力衰竭提供了有希望的潜在治疗。 与间充质干细胞衍生的外泌体相比，来自胚胎干细胞的外泌体对心脏状况显示出相似的治疗效果。在保护心肌细胞方面，Khan等人发现胚胎干细胞衍生的外泌体miR-294可以改善心肌细胞存活，促进新生血管形成并抑制MI后的纤维化，从而增强MI后心脏功能。此外，Tavakoli Dargagni等人证明胚胎干细胞衍生的外泌体可以通过抑制TLR4-NLRP3介导的焦亡细胞死亡来减轻阿霉素诱导的心脏毒性。类似地，Singla团队表明胚胎干细胞衍生的外泌体可以通过增强抗炎M2型巨噬细胞和减少炎症诱导的焦亡来改善心脏重构。在管理心力衰竭方面，Pang等人展示胚胎干细胞衍生的外泌体可以通过FGF2信号在主动脉缩窄诱导的心力衰竭模型中减轻心力衰竭，改善心脏功能，并促进心肌血管生成。使用冠状动脉闭塞诱导的心力衰竭模型，Kervadec等人表明胚胎干细胞衍生的心血管前体分泌的外泌体可以恢复心脏功能，如减少左心室收缩末期和舒张末期容积。最后，同一研究小组后来证明，来自更易获得的细胞来源的外泌体，例如iPSCs，能够提供与胚胎干细胞衍生的外泌体相似的心脏保护效果。 其他重要的SC-Exo亚型，如iPSC-exo、HSC-exo和EPC-exo，也显示出心脏保护效果。例如，iPSC分泌的外泌体可以发挥细胞保护作用，维持细胞内Ca2+稳态并促进心肌细胞存活，从而改善MI的恢复。HSC-exo可以减少心脏损伤相关指标和心脏纤维化程度，同时提高心力衰竭动物模型的射血分数。此外，HSC衍生的外泌体的全身输注可以改善急性MI大鼠模型中的缺血性心肌病，同时在治疗副作用如肾脏损伤方面也有额外的好处。使用声波刺猬蛋白（Shh），一种血管生成因子，通过将外泌体Shh传递到缺血心肌，可以保持急性MI后的心脏功能。Ke等人证明EPC衍生的外泌体可以通过激活间充质-内皮转化和降低HMGB1的表达来增强心脏成纤维细胞的增殖和血管生成，后来发现EPC衍生的外泌体中的外泌体miR-218-5p和miR-363-3p可以通过靶向p53/JMY途径改善MI。在Yue等人的一项有趣的研究中，发现IL-10缺乏引起的全身炎症会通过在受体细胞中外泌体富集整合素相关激酶（ILK）和ILK介导的NF-κB途径的激活来损害EPC衍生的外泌体对心肌修复的修复特性。 在治疗胸部疾病方面，刘等人证明人类胚胎干细胞衍生的外泌体可以减轻炎症，防止过量胶原沉积，并保持博来霉素诱导的肺纤维化小鼠肺部的肺泡结构。这是通过外泌体mi-17-5p靶向血栓蛋白-2实现的。同样，周等人证明iPSC衍生的外泌体中的外泌体miR-302a-3p可以通过TET1抑制M2型巨噬细胞，从而减轻肺纤维化。刘等人表明EPC衍生的外泌体可以通过调节Mitofusion-2和Ras-Raf-ERK1/2途径抑制肺动脉平滑肌细胞增殖及其对凋亡的抵抗力，从而作为治疗肺动脉高压的潜在治疗候选药物。两个独立团队都揭示了人类EPC衍生的外泌体可以通过将miR-126传递到受损肺泡来改善LPS诱导的急性肺损伤的结果。张等人发现EPC衍生的外泌体可以改善肺微血管内皮细胞的生物活性，并保护它们免受过氧化损伤，在发育中的肺血管中，从而有助于治疗支气管肺发育不良。此外，Montay-Gruel等人证明人类胚胎干细胞衍生的外泌体可以改善与暴露于肺部电离辐射相关的晚期正常组织并发症，如在肺癌术后治疗中遇到的。 8.泌尿科和SC-EXO治疗 慢性肾脏病（CKD）是一种以肾脏结构、功能或两者持续变化为特征的综合征，影响全球10-14%的人口。CKD最常见的病理特征和最终表现是某种形式的肾纤维化。当伤口愈合失调时会发生肾纤维化，导致过多的细胞外基质蛋白，如胶原和纤维连接蛋白的积累。在他们的研究中，刘等人发现骨髓间充质干细胞衍生的外泌体可以通过靶向NFAT5的外泌体miR381-3p来减轻血管钙化，这是CKD中发病率和死亡率的一个不利指标。这在透析患者的严重动脉钙化中得到了进一步验证。在替代研究中，几个小组证明了骨髓间充质干细胞衍生的外泌体在治疗肾纤维化方面的能力，每个都有不同的作用机制解释。在细胞研究中，尹等人发现外泌体可以通过运输Nedd4L来防止TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的上皮-间充质转化，Nedd4L激活自噬。在5/6亚全肾切除大鼠模型中，刘等人揭示外泌体可以通过调节Smurf2/Smad7轴来改善肾功能并减少纤维化大小。在单侧输尿管梗阻诱导的间质纤维化小鼠模型中，陆等人证明外泌体可以通过激活EP2受体减少M1和M2型巨噬细胞的极化来改善肾纤维化。 急性肾损伤（AKI）和CKD紧密相连，每个都是发展为另一个的风险因素。肾脏IRI是AKI和急性肾衰竭的主要原因。Lim等人证明来自iPSC衍生的间充质干细胞的外泌体可以通过激活ERK1/2信号通路纠正AKI小鼠的血清肌酐水平、小管坏死、凋亡、炎症细胞因子产生和氧化应激。在张等人的类似工作中，发现EPCs的外泌体miR-21-5p可以通过抑制CLP大鼠中RUNX1的表达来减轻败血症诱导的AKI。 9.耳鼻喉头颈外科和SC-EXO治疗 听力损失是全球最常见的感觉缺陷，影响着近20%的全球人口。感音神经性听力损失（SNHL）的原因非常多样，如老年性耳聋、耳毒性药物诱导、噪声诱导和特发性突发性SNHL。Tsai团队证明，脐带间充质干细胞（MSC）衍生的外泌体能够挽救顺铂诱导的听力损失中外毛细胞的丢失，并修复耳蜗损伤。耳蜗保护效应的潜在机制是通过miRNAs（例如miR-125a-5p和miR-125b-5p）和重塑因子（例如纤维连接蛋白和半乳糖结合蛋白-3）介导的。耳蜗缺血再灌注损伤（IRI）是特发性突发性和噪声诱导性SNHL的主要原因之一，可能导致感觉毛细胞和双极耳蜗螺旋神经节不可逆损伤。其病理生理学包括氧化应激、细胞过度死亡和炎症调节失调。Hao等人发现，过表达miR-21的神经干细胞（NSC）衍生的外泌体可以通过抑制小鼠耳蜗中的炎症过程来预防IRI引起的听力损失。这通过降低听觉脑干反应阈值、上调IL-10和下调TNF-α和IL-1β得到证实。甲状腺功能减退症是一种非常常见的疾病，可能由于甲状腺切除术或放射性消融治疗甲状腺功能亢进或甲状腺癌而发生。干细胞治疗和干细胞衍生的外泌体治疗已成为通过甲状腺再生治疗甲状腺功能减退症的有希望的管理方法。Degoserie等人使用体外甲状腺叶培养系统表明，EPC衍生的外泌体可以促进甲状腺细胞组织成甲状腺滤泡和腔扩张（即滤泡形成），这由层粘连蛋白-α1促进。颞下颌关节（TMJ）紊乱是影响31%成人和11%儿童的第二常见肌肉骨骼疾病。与其他滑膜关节一样，TMJ也容易受到骨关节炎（OA）的影响，共享常见的病理生理过程（第3.2节）。Zhang及其同事证明，MSC衍生的外泌体可以通过减轻免疫能力兔模型中的炎症和恢复基质稳态来缓解TMJ OA。外泌体介导的关节修复归因于腺苷激活Akt、ERK和AMPK信号传导，以及增强s-GAG合成。 10.眼科学和SC-EXO治疗 获得性视神经病变是成人失明的主要原因之一，有多种病因，如血管性、炎症性、创伤性、毒性、压迫性和营养性病因。视网膜神经节细胞（RGC）丢失是视神经病变的标志，通过多种细胞死亡途径发生。Mead和Tomarev发现，骨髓MSC衍生的外泌体可以在大鼠视神经压碎模型中促进RGC的生存和轴突再生。外泌体的神经保护和神经营养效应是通过外泌体miRNAs实现的，展示了无细胞潜力用于创伤性和退行性眼病。视网膜退行性疾病（例如，年龄相关性黄斑变性和视网膜色素变性）是全球导致双侧不可逆视力丧失的主要原因。其特征是光感受器、RGC或视网膜色素上皮（RPE）细胞的逐渐退化。Bian团队发现，NSC衍生的外泌体可以在RCS视网膜退化大鼠模型中保护光感受器、视觉功能和防止外核层变薄。这是通过外泌体靶向TNF-α、IL-1β和COX-2显著灭活小胶质细胞炎症实现的。在两项连续研究中，Gao团队表明，ESC衍生的外泌体可以通过增强视网膜Müller细胞的增殖和逆转分化来缓解视网膜退化，作为替代视网膜神经元前体。一方面，这是通过调节Müller细胞中外泌体HSP90的Oct4表达实现的。另一方面，通过向Müller细胞传递BDNF蛋白激活Wnt信号通路也发挥了重要作用。此外，使用遗传性视网膜退化大鼠模型，Park等人证明，无论是视网膜下还是玻璃体内注射人类HSC衍生的外泌体都可以提供退化视网膜的功能挽救。角膜缺陷愈合失败常常导致角膜盲，据报道是仅次于白内障的导致失明的主要原因。最严重和难以治疗的病例需要角膜移植。Wang等人比较了iPSC和MSC衍生的外泌体作为角膜上皮缺陷治疗的治疗提供者。发现这两种类型的外泌体都可以促进体外增殖、细胞周期进展和迁移，同时抑制凋亡，并加速体内角膜上皮缺陷愈合。更重要的是，iPSC衍生的外泌体比MSC衍生的外泌体具有更强的治疗效果。角膜移植是固体器官移植最成功的形式之一。然而，高达90%的高风险受者可能会发生移植物排斥。先天和适应性免疫是移植物失败的主要原因。免疫抑制药物仅显示出部分效果。Jia等人表明，MSC衍生的外泌体可以跨越生物屏障，并在角膜同种异体移植排斥的大鼠模型中延长移植物存活时间。这可能是通过抑制CD4+和CD25+ T细胞的浸润以及通过Th1信号通路减少IFN-γ和CXCL11实现的。 11.妇产科和SC-EXO治疗 原发性卵巢功能不全（POI）或早发性卵巢衰竭（POF）定义为40岁之前卵巢功能丧失。POI的非遗传因素包括自身免疫性疾病、代谢状况、感染和医源性程序（例如，化疗、放疗和手术）。POI女性遭受各种并发症，如骨质疏松症、不孕、心血管疾病和抑郁。尽管及时启动激素替代疗法对于控制这些症状和并发症至关重要，但它无法恢复卵巢功能。目前正在测试的实验性治疗方法包括线粒体激活、体外激活、干细胞治疗和外泌体治疗。Li等人进行的工作表明，脐带MSC衍生的外泌体可以在环磷酰胺（CTX）诱导的POI小鼠模型中改善卵巢功能。SC-exo治疗不仅恢复了与卵巢功能相关的激素水平和卵巢滤泡数量，还改善了POI小鼠的生殖能力。此外，外泌体通过调节Hippo途径促进卵巢颗粒细胞（GCs）的增殖，这种效应被YAP抑制剂中和。使用iPSC衍生的MSCs的外泌体也获得了类似的结果。Ding等人进行的工作表明，脐带MSC衍生的外泌体可以在POI小鼠模型中恢复卵巢表型和功能，促进CTX损伤的人类GCs和卵母细胞的增殖，并通过传递外泌体miR-17-5p和靶向其下游mRNA SIRT7来减轻ROS积累。进一步阐明miR-17-5p通过抑制SIRT7下调PARP1、γH2AX和XRCC6的表达。最后，Yang等人完成的工作揭示，骨髓MSC衍生的外泌体可以在化疗诱导的POF大鼠模型中恢复发情周期，增加基底和窦卵泡的数量，增加雌二醇E2和抗苗勒管激素水平，并降低卵泡刺激激素和黄体生成激素水平。从机制上讲，这是通过靶向PTEN的外泌体miR-114-5p实现的。 12.从外泌体治疗的临床前研究到临床试验 如第3至11节所讨论的许多临床前研究已证实，MSC衍生和NSC衍生的外泌体治疗许多疾病的优势，涵盖外科实践的亚专业。不仅限于干细胞衍生的外泌体，许多临床试验已证明外泌体的作用是双重的：生物标志物和治疗剂。在ClinicalTrials.gov上使用“外泌体治疗”、“外泌体治疗”和“外泌体”作为关键词进行搜索，产生了188条记录。然而，其中只有60（32%）直接涉及使用外泌体作为治疗剂的干预性研究（表5）。其余的，特别是与肿瘤学相关的试验，大多使用外泌体作为生物标志物，例如疾病发病机制中的关键角色（例如NCT04288141，NCT04154332），诊断标志物和治疗前的指导（例如NCT04629079，NCT03791073，NCT05451342，NCT03432806），监测指数和治疗效果的预测工具（例如NCT05427227，NCT04499794，NCT04852653，NCT05370105，NCT03800121，NCT05370105，NCT05328089），以及治疗后的预后指标（例如NCT06026735，NCT05705583，NCT05411445，NCT04167722，NCT05575622）。外泌体作为生物标志物的临床应用已在其他综述中广泛探讨328-332，因此不在本综述中讨论。就60项外泌体治疗临床试验的临床特征而言（表5），有几个亮点值得一提。 首先，所涵盖的疾病范围非常广泛，包括外科和内科疾病。这些包括第3至11节中讨论的许多外科疾病，如骨科疾病（NCT05060107中的膝关节骨关节炎、NCT04998058中的骨丢失和NCT04849429中的椎间盘退变）、神经外科疾病（NCT03384433中的缺血性中风和NCT04388982中的阿尔茨海默病）、整形外科疾病（NCT02565264和NCT05475418中的皮肤伤口愈合）、普通外科疾病（NCT05871463中的肝硬化）、心胸外科疾病（NCT05669144中的心肌梗死）和眼科疾病（NCT05413148中的视网膜色素变性）。换句话说，一些临床前研究尚未发展成为临床试验。这些包括但不限于，针对骨折、脊髓损伤、创伤性脑损伤、急性肝损伤和听力损失的外泌体治疗，这些可能成为未来外泌体治疗相关临床试验的方向。 其次，越来越多的临床试验关注两种医疗状况，即COVID-19（16项试验，占27%）和癌症（5项试验，占8%）。MSC衍生的外泌体可以通过修复作用和再生效应管理COVID-19中的病毒感染和肺损伤。前者表现为阻断病毒进入和复制，抑制细胞因子风暴，后者表现为预防炎症、液体清除和恢复肺通透性。此外，外泌体可以被设计成药物（例如，CD24，一种强大的免疫调节剂）传递平台，甚至疫苗来对抗COVID-19。与用于COVID-19管理的MSC衍生外泌体相比，用于癌症治疗的外泌体主要依赖非干细胞和货物工程。部分原因是MSC衍生的外泌体对肿瘤发生和转移表现出有争议的效应。尽管MSC衍生的外泌体与肿瘤细胞之间的确切相互作用仍有待讨论，但科学家们通过修改外泌体货物来传递抗癌核酸和抗癌药物，以及外泌体膜用于特定肿瘤靶向，克服了几个障碍。 最后，在用于疾病治疗的40项临床试验中，有38项（95%）使用MSC，2项（5%）使用iPSC作为外泌体的细胞来源。然而，这与第3至11节中讨论的临床前研究显著不同。NSC衍生外泌体在临床试验中使用不足，可能部分是因为其母细胞的供应限制。目前，NSC可以从三个来源获得：1、从初级CNS组织（例如成人和胎儿大脑）中分离；2、从多能干细胞（例如iPSC和ESC）分化而来；3、从体细胞（例如成纤维细胞和血细胞）重编程为iNSC。最近的研究开发了成纤维细胞衍生的iNSC，为从NSC样细胞中获得外泌体开辟了新窗口。这些iNSC-exo不仅在体外促进细胞生存和增殖不亚于NSC-exo，而且在缺血性中风后恢复和减轻AD样表型方面也有所增强。因此，iNSC可能是产生临床级外泌体的优秀细胞来源，用于临床试验。 总之，从临床前研究到外泌体治疗的临床试验的进展已经加快。然而，外泌体治疗的临床指示不足和亲本干细胞来源有限等问题仍有待解决。此外，一旦克服了在放大制造、遵守良好生产规范和监管框架方面的限制，干细胞衍生的外泌体治疗将很快被纳入临床实践，并服务于患者床边。 13.结论和未来展望 外泌体最近被追求作为一种无细胞的干细胞治疗替代品。ESC、iPSC、HSC、MSC、NSC和EPC衍生的外泌体特别引人注目，部分原因是其亲本细胞的多能性或多向分化能力。在经过有或没有修改的生产和纯化后，干细胞衍生的外泌体在治疗外科实践中遇到的许多疾病方面展现出巨大的潜力。这些疾病包括骨科疾病（例如骨折、骨关节炎和脊髓损伤）；神经外科（例如缺血性中风、创伤性脑损伤和阿尔茨海默病）；整形外科（例如伤口愈合）；普通外科（例如急性肝损伤）；心胸外科（例如心肌梗死）；泌尿外科（例如慢性肾病）；头颈外科（例如感音神经性听力损失）；眼科（例如获得性视神经病变）和妇科（例如原发性卵巢功能不全）。从机制上讲，干细胞衍生的外泌体通过疾病特异性的细胞和组织反应（例如组织再生、抗炎、抗细胞死亡、免疫调节和抗氧化应激）以及组织特异性的分子信号通路（例如Wnt/β-catenin、PTEN/PI3K/Akt/HIF-1α、MAPK和JAK/STAT通路）实现多种治疗效果。总的来说，干细胞衍生的外泌体治疗已被证明是外科领域干细胞治疗的强大且多功能的替代品。 干细胞衍生的外泌体的临床应用的未来重点应该放在这种治疗管道的各个节点上。首先，针对外泌体治疗前的大规模生产，需要一个高通量细胞来源以及一个可重复和可扩展的生产和分离协议。与静态系统培养单层细胞相比，生物反应器形式的动态系统，例如中空纤维生物反应器和搅拌罐生物反应器，可以通过在短期内产生大量细胞和外泌体来提高效率。然而，由于在反应器中遇到的物理和剪切应力，亲本细胞和衍生外泌体的表型可能会发生变化。因此，必须优化生物反应器的工作参数，以促进干细胞衍生外泌体的大规模生产。其次，针对外泌体的治疗方式，需要探索除全身给药之外的传递方法。当通过静脉系统传递时，外泌体会迅速从血液循环中清除，并在肝脏、脾脏和肺部积累，这可以通过局部给药来克服。最近，各种生物材料被用来保护、协助和增强局部传递的外泌体，以最大化它们的治疗效果。这些生物材料可以根据它们的来源（例如天然、合成和混合聚合物）、格式（例如支架、补片、喷雾和微针）和响应性（例如温度、pH和蛋白质）来设计，从而允许疾病特异性定制。最后，针对外泌体治疗的治疗指示，应该在未来的临床前研究和临床试验中包括比本综述中讨论的更多的疾病。例如，考虑到MSC衍生外泌体的免疫调节效应，气道炎症状况（例如过敏性鼻炎和哮喘）可能是外泌体治疗的合适候选者。最适合使用外科植入物治疗的疾病（例如人工耳蜗植入物、人工晶状体和避孕宫内节育器）可以以植入物为基础的局部释放外泌体的形式进行管理。除了主要疾病外，次要疾病，包括外科手术和全身麻醉相关的并发症（例如认知障碍、伤口麻木和恶性高热）可能成为外泌体治疗的治疗目标。总的来说，扩大外泌体生产的努力与多模式外泌体传递相结合，将加速干细胞衍生外泌体在迅速扩大的疾病谱中的临床应用。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：抗体-药物偶联物（ADCs）是一种快速发展的靶向生物治疗药物类别，目前结合了单克隆抗体的选择性和由细胞毒素组成的有效载荷的效力。多年来，微管靶向和DNA嵌入剂一直是ADC开发的核心。最近，两种基于拓扑异构酶1抑制剂的ADC——曲妥珠单抗德鲁替康（Enhertu®）和萨奎图珠单抗戈维替康（Trodelvy®）的批准和临床成功，展示了将非传统有效载荷与差异化作用机制结合的潜力。在未来ADC领域的发展中，有效载荷多样化预计将发挥关键作用，这一点从越来越多的临床前和临床阶段非传统有效载荷偶联ADC的数量中可以看出。本综述提供了一个全面的概述，涵盖了不同作用机制的经过验证的、被遗忘的和新开发的载荷。 1.引言 使用单克隆抗体作为治疗载体是Paul Ehrlich在“神奇子弹”概念中提出的假设。生物学和化学方面的显著进步导致了抗体-药物偶联物（ADCs）的开发，这是新一代的生物治疗药物，结合了抗体的高度特异性和小分子细胞毒素的效力，目的是在目标细胞内传递高度有效的有效载荷。这些武装化的抗体在某些情况下可以显著提高细胞毒素分子的治疗指数，并减少它们的非靶向毒性，这是传统细胞毒素化疗的主要问题。 抗癌ADCs由三部分组成：一种特异性识别目标细胞上抗原的单克隆抗体（mAb）、一种在释放时触发细胞死亡的有效小分子，以及连接这两个元素的链接器。 这些药物的复杂性解释了它们艰难的开发过程，最好的例子是gemtuzumab ozogamicin的混乱历史，它最初在2000年获得批准，在2010年从大多数市场撤出，然后在2017年被FDA重新批准。在mAb设计、目标选择、偶联技术、有效载荷选择和质量控制标准化方面的主要进步，使这个家族演变成了抗癌药物的成熟组成部分，目前有13种药物获得批准用于治疗癌症，其中7种是在过去三年中获得批准的。 鉴于有效载荷的效力，抗体必须对其目标高度选择性，并在偶联后保持其半衰期和生物学特性。抗体工程，如Fc（可结晶片段）沉默或Fc容量增强，是一种强大的工具，分别用于平衡由T细胞靶向引起的抗体非靶向毒性或增加抗体功能，如ADCC和ADCP，两种方法都已在治疗性mAbs的背景下证明其临床益处。在ADCs的背景下，假设Fc沉默将显著减少非靶向毒性。血小板减少症和中性粒细胞减少症是接受ADCs治疗的患者常见的不良反应，可能与血小板表面FcγRIIa受体的表达有关。MEDI4276，一种减少了FcγR结合的曲妥珠单抗艾美坦辛（T-DM1，Kadcyla®）的类似物，已在临床试验中进行了研究，旨在减少与T-DM1观察到的血小板减少症（NCT02576548）。令人惊讶的是，这种ADC在首次人体试验中显示出显著的毒性。相比之下，Fc容量增强已通过brentuximab vedotin（Blenrep®）的批准证明了其益处，其mAb是岩藻糖基化的。最近mAb衍生物的开发扩大了载体的可能性，同时旨在改善ADC载体的基本特性。较小的格式，如mAb片段（scFv、单链可变片段和Fabs、抗原结合片段），在这种情况下进行了探索（小格式药物偶联物），目的是增强实体肿瘤的穿透和细胞内化。然而，到目前为止，这些候选药物没有进入临床试验，因为它们被发现面临快速消除，可能因此无法提供比传统mAb格式的好处。相比之下，另一类基于自行车肽的小格式药物偶联物似乎满足了与mAb格式偶联物竞争的挑战，具有竞争性的摄取效率，正如目前正在进行的三个自行车肽偶联物的临床试验所说明的（NCT04561362、NCT04180371和NCT03486730）。 除了大小之外，其他重要参数影响这些大分子的药代动力学（PK）和循环半衰期，包括化学修饰，影响它们通过肾小管上皮细胞的保留，以及它们通过新生儿Fc受体（FcRn）的回收率。小格式偶联物可能受益于这些参数的调节。多价结合实体，如二价抗体或双特异性抗体，正在开发中，以提高抗原亲和力、选择性或内化，并可能构成有前途的载体。 最广泛应用的生物偶联方法使用赖氨酸侧链胺和半胱氨酸链间硫醇。然而，所得混合物的异质性一直是ADC失败的主要问题。其他偶联策略已经开发出来，包括通过特定或工程化氨基酸的位点特异性偶联，但迄今为止未能在临床试验中证明改善结果。Iladatuzumab vedotin（DCDS0780A），一种FDA批准的polatuzumab vedotin（Polivy®）的THIOMAB™版本，在临床试验中进行了探索，但由于在测试剂量下的过度眼部毒性而未能进入II期。这种THIOMAB™药物偶联技术展示了巨大的潜力，但两个mAbs之间的区别和/或在临床设计上，包括选定的剂量、适应症和患者群体，可能导致一个获得批准而另一个没有。在这种情况下，重要的是要强调不仅技术很重要。正在探索新的偶联策略，如糖链和短肽标签（酶辅助连接）或最近通过ADP-核糖环化酶，目的是生成均匀且物理稳定的ADCs。 连接子在抗体药物偶联物（ADC）设计中扮演着重要角色，因为它强烈影响着ADC的安全性、效力和活性。最重要的是，连接子需要在循环中保持稳定，以避免药物过早脱落，同时允许其在目标细胞内释放。根据其可切割性，已经开发并区分出两类连接子。可切割连接子要么对pH敏感，如腙连接子，要么对谷胱甘肽或二硫化物异构酶敏感，如二硫键连接子，要么对蛋白酶敏感，如二肽键对卡他普辛B。不可切割连接子依赖于抗体部分的溶酶体降解，从而至少保留一个氨基酸，通常是赖氨酸或半胱氨酸，连接到载荷-连接子复合物。这种方法提高了连接的稳定性，因为需要抗体消化才能释放载荷。虽然强调连接子越稳定，引起的非靶向毒性就越少，但这些技术通常发现过于严格，无法支持抗肿瘤活性。ADC的安全性仍然是其设计中的主要挑战，靶向和非靶向毒性不仅由连接子-载荷的不稳定性驱动。实际上，靶向毒性总是由单抗及其对目标的亲和力/亲和力驱动，以及载荷的作用机制，这再次说明了肿瘤类型、目标抗原和ADC结构匹配的重要性。最近对连接子设计改进的兴趣导致了亲水性连接子的开发，以平衡载荷的疏水性。硫酸盐、聚乙二醇（PEG）、多唾液酸（PSAR）或最近基于DNA的连接子显著提高了ADC的稳定性和药代动力学，导致毒性更低、活性更高的ADC。 药物-抗体比率（DAR）直到现在一直保持在四个以下，以避免单抗聚集并限制ADC的整体疏水性，这与毒性、缩短的半衰期和狭窄的治疗指数相关。因此，增加DAR更适合于疏水性较低或得到良好补偿的疏水载荷，如新型连接子技术所示，包括掩蔽实体或连接子亲水插入物，其效率直接决定了DAR增加的能力。恢复亲水性和裸mAb药代动力学特性以及高DAR显著增加了载荷对肿瘤的暴露。这些新的连接子技术使得开发比DNA插入或微管干扰剂更少效力的载荷成为可能，如两个基于拓扑异构酶1的ADC在DAR8处的结合所示，曲妥珠单抗deruxtecan（Enhertu®）和sacituzumab govitecan（Trodelvy®）。这些高度装载的ADC与非传统载荷也可能潜在地扩大ADC的治疗适应症，通过解决高或低目标表达水平的肿瘤，如基于DESTINY-Breast04结果最近批准的Enhertu®在HER2低表达肿瘤中所示。相反，在高效力载荷的背景下，到目前为止，较低的DAR更受欢迎，如最近批准的loncastuximab tesirine（Zynlonta®），一个DAR2的极强吡咯苯并二氮杂卓（PBDs）载荷。值得注意的是，与在临床试验中评估的曲妥珠单抗deruxtecan和类似物在DAR8处结合不同，datopotamab deruxtecan的DAR降低到4，以减少其目标驱动的毒性，这表明了ADC设计的多维性。 载荷（也称为弹头）发挥了ADC的细胞内细胞毒性活性。通过连接子部分共价结合到抗体的细胞毒素的性质非常重要，因为它的作用机制将决定ADC作为抗癌化合物的效力及其可能的适应症。第一代ADC结合了传统化疗药物（紫杉醇、蒽环类），因为载荷不够有效，只有一小部分总偶联物成功地在目标细胞内传递了它们的载荷。肿瘤穿透、细胞表面的靶标拷贝数以及ADC的内化和降解强烈影响细胞内游离载荷的浓度。因此，载荷必须在低浓度下具有高度效力，其50%抑制浓度（IC50s）在低至亚纳摩尔范围内。其他因素，如分子在血浆中的稳定性和在酸性条件下的稳定性、结合位点的可及性或溶解度至关重要。多年来，载荷基本上由两类组成：微管抑制剂，包括美登素和auristatins，以及DNA烷基化剂，如calicheamicins。这些载荷导致了八个ADC的批准（图1）。 图1 FDA对抗癌ADCs的批准。根据其有效载荷的性质对ADCs进行识别：微管破坏剂；DNA靶向剂：卡利奇霉素，吡咯并苯并二氮杂环（PBD），拓扑异构酶1（TOPO 1）抑制剂。 新型且更有效的DNA烷基化剂，如PBD单体和二聚体、indolino-benzodiazepines（IGNs）或cyclopropabenzindolone（CBI）单体和二聚体，IC50值在皮摩尔范围内，一直处于ADC设计的前沿。这些分子是有史以来合成的最强大的抗肿瘤化学物质之一，它们通过ADC结构特异性靶向肿瘤细胞以产生高度有效的“魔法子弹”进行了研究。然而，强烈的剂量限制毒性限制了它们的临床发展，目前只有loncastuximab tesirine在2021年获得了FDA批准（图1）。已经做出了努力，使载荷家族多样化，以获得具有原始作用机制的分子，包括几个不直接针对DNA或微管的分子。效力较低的分子从ADC结构的重大突破中受益，通过改进的连接子设计允许更高的DAR值、更稳定的载荷附着或增强的旁观者杀伤活性。最近和引人注目的成功是拓扑异构酶1（topo-1）抑制剂的开发，这代表了载荷选择的转折点，自2019年以来批准了两个基于topo-1抑制剂的ADC（图1），曲妥珠单抗deruxtecan（Enhertu®，DS-8201a）和sacituzumab govitecan（Trodelvy®）。最近的综述已经描述了ADC的验证和探索性治疗靶标的格局。这篇综述旨在描述ADC背景下验证的、被遗忘的和新开发的载荷的格局，具有多种作用机制，不包括微管抑制剂和DNA烷基化剂。 2.成功的载荷家族：拓扑异构酶1抑制剂 拓扑异构酶1抑制剂是FDA最近批准的抗体-药物偶联物载荷家族，最初由曲妥珠单抗deruxtecan推动，随后是sacituzumab govitecan（表1，图2A）。这些基于中等效力载荷的偶联物的最近发展得益于生产了DAR值为8的高负载ADC。 图2 拓扑异构酶I抑制剂基础的ADCs结构图。A FDA批准的ADCs和有效载荷（紫色）以及正在临床评估中的ADCs和有效载荷（蓝色）。B 用于临床前开发的拓扑异构酶1抑制剂（绿色）。C 作为ADCs潜在有效载荷的下一代拓扑异构酶I抑制剂。图中注释：[ADC名称]，抗体，有效载荷。 拓扑异构酶酶位于细胞核内。它们的作用是控制和修复在DNA开放、上游转录和复制过程中发生的DNA超螺旋和纠缠。这些催化酶切割、修复超螺旋并重新连接DNA链。拓扑异构酶根据它们的切割活性分为两个家族：拓扑异构酶I切割单链DNA，而拓扑异构酶II切割双链DNA。拓扑异构酶抑制剂特异性结合到DNA-拓扑异构酶复合物的界面，从而抑制拓扑异构酶修复机制，导致DNA损伤和随后的细胞凋亡。然而，最有效的拓扑异构酶抑制剂的效力比美登素或calicheamicin低100到1000倍，这解释了在最初的ADC设计中对这种载荷类别最初缺乏兴趣。 这种载荷类别包括基于喜树碱和非喜树碱的化合物。喜树碱（CPT）是一种由五个化学环组成的天然植物生物碱，其水溶性差（图2B）。几种衍生物已经获得监管机构的批准，具有改善的生物利用度，即拓扑替康、伊立替康和贝洛替康。这些药物已获得批准用于多种适应症，包括卵巢癌、肺癌、宫颈癌和结直肠癌。伊立替康的脂质体制剂也已获得批准用于治疗晚期胰腺癌。还合成了几种其他CPT衍生物，如gimatecan，目前正在II期评估中，用于治疗卵巢癌、输卵管癌或腹膜癌（NCT04846842）。基于CPT的分子最严重的不良事件（SAEs）包括严重水样腹泻、中性粒细胞减少和血小板减少。 由于其中等细胞毒性效力，CPT衍生物最近被用作ADC载荷，其IC50值在低纳摩尔范围内。它们的效力介于非常有效的（皮摩尔IC50s）抗微管/DNA靶向剂和最初用于最初的ADC项目的传统（微摩尔IC50s）化疗药物之间，后者因缺乏效力而失败（甲氨蝶呤和多柔比星）。到目前为止，有两种CPT衍生物已成功结合到抗体上并获得批准：DXd和伊立替康的活性代谢物SN-38（表1）。 2.1.Exatecan及其衍生物 DXd是exatecan（也称为DX8951f）的衍生物，与CPT相比，该化合物具有增强的活性和改善的溶解性，并且被描述为不是ABCC2或ABCG1的底物。未偶联的exatecan在几项临床试验中进行了评估，但由于其狭窄的治疗窗口，剂量限制性中性粒细胞减少和血小板减少以及强烈的胃肠道毒性，没有提高生存率。最初尝试将exatecan生物偶联到抗体上取得了部分成功，但偶联物出现显著聚集。这个问题通过第一三共制药科学家使用稍微修改的exatecan衍生物，名为DXd，得到了解决。发现这种新化合物保留了exatecan的效力，同时能够成功生物偶联多达8个DXd分子每个抗体，而没有显著的聚集。这种deruxtecan药物连接子在几个专有ADC项目中使用，例如DS-8201a（Enhertu®）、U3-1402和DS-6157a，以DAR8偶联，DS-1062a和DS-7300a以较低的DAR（4）偶联以限制它们的毒性[39]，它们要么已经获得FDA批准（DS-8201a），要么目前正在临床评估中（表1，图2A）。尽管DXd载荷展示了比exatecan甲磺酸盐更低的被动膜渗透性，但发现它较少骨髓毒性，因此也被选择用于其改善的安全概况。 曲妥珠单抗deruxtecan（DS-8201a或Enhertu®）由已获批准的靶向HER2的抗体曲妥珠单抗组成，通过一个基于马来酰亚胺的mc-GGFG-am蛋白酶可切割连接子连接到8个DXd载荷（图2A）。这种创新的DAR8 ADC在优化的连接子和载荷方面，与第一代ADC相比，在临床前展现了改善的治疗窗口。在两项大型3期研究（DESTINY-Breast03, NCT03529110, DESTINY-Gastric01, NCT03329690）之后，曲妥珠单抗deruxtecan已于2019年获得FDA批准用于治疗不可切除或转移性HER2+乳腺癌（BC），并于2021年获得批准用于治疗晚期或转移性HER2+胃癌或胃食管癌，2022年稍后用于治疗不可切除或转移性HER2+非小细胞肺癌（DESTINY-Lung02）。值得注意的是，曲妥珠单抗deruxtecan在曲妥珠单抗emtansine治疗后复发的乳腺癌患者中展现了强大的抗肿瘤活性，并在胃癌患者中显示出比伊立替康更强的活性，在非小细胞肺癌（NSCLC）和结直肠癌中显示出持久的抗癌活性。另一个ADC批准的突破是由其在DESTINY-Breast04试验中的临床评估所展示，该试验导致其在2022年获得批准用于治疗不可切除或转移性HER2低表达乳腺癌。目前还有几项其他临床试验正在进行中，包括DESTINY-breast05和DESTINY-breast09，分别评估Enhertu在新辅助疗法后残留疾病HER2+BC患者中的使用或与当前一线标准护理方案在HER2+BC中的对比，再次展示了其成功。其他四个含有这种有前景的连接子-载荷的ADC目前正在进行临床评估，用于治疗实体瘤，分别靶向NSCLC中的HER3、转移性结直肠癌和乳腺癌、TROP2在NSCLC和三阴性乳腺癌（TNBC）、B7-H3在晚期实体瘤或GPR20在胃肠道间质瘤（GIST）中（表1）。 最近，由于开发了能够绕过化合物的疏水性和促聚集特性的亲水性可切割连接子结构，exatecan（图2B）已经在临床前作为潜在的ADC载荷进行了探索。这允许在不干扰ADC药代动力学特性的情况下以高DAR值偶联exatecan（表1）。这些ADC在肿瘤异种移植物中展现了强大的抗肿瘤活性，并由于与DXd相比exatecan改善的被动细胞渗透性，与基于deruxtecan的ADC相比显示出更强的旁观者杀伤效应。目前正在开发两种使用这种药物连接子策略的ADC：PRO1184和PRO1160，分别含有亲水性exatecan基连接子，以DAR8偶联到抗FRa和抗CD70抗体，并预计将于2023年进入临床试验。最近的体内研究还表明，exatecan不需要呋喃环功能就能发挥其抗肿瘤活性，从而扩大了该分子的功能化可能性，以生成可连接的衍生物（表1）。使用这种策略开发的最有前途的ADC（mAbE-21a，衍生物11，DAR7.5）在EGFR+模型中以0.25 mg/kg剂量展现了显著的抗肿瘤活性，完全缓解。 今年披露了一种新型专有exatecan衍生物AZ’0132，正在作为ADC AZD8205的载荷进行研究，靶向B7-H4（表1，图2A）。AZD8205目前正在进行I/II期研究，用于治疗乳腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌以及胆管癌（NCT05123482）。 2.2.伊立替康 伊立替康已获得FDA批准用于治疗各种实体瘤，如胃肠道恶性肿瘤、胶质母细胞瘤和宫颈癌，是拓扑异构酶1抑制剂SN-38的前药。SN-38水溶性差，会引起严重的毒性，包括强烈的骨髓抑制和高级别腹泻。因此，开发了伊立替康以改善生物利用度并获得可接受的治疗指数。IMMU-132（Trodelvy®）是一种抗TROP2抗体，与基于SN-38的药物连接子偶联（表1，图2A）。这种ADC已于2020年获得FDA批准用于治疗三阴性转移性乳腺癌和转移性尿路上皮癌，目前正在进行临床试验，用于治疗HR+/HER2-、前列腺和子宫内膜癌（NCT03725761和NCT04251416）。其他ADC也已开发出这种基于SN-38的连接子，包括IMMU-130（labetuzumab govitecan）[84–86]和IMMU-140，分别靶向CEACAM5和HLA-DR（表1）。Labetuzumab govitecan在I期（NCT01270698）中展现了可接受的毒性和活性，然而，II期评估在2020年因未公开原因终止（NCT01915472）。IMMU-140针对HLA-DR，在血液病和黑色素瘤中展现了有希望的临床前活性。SN-38载荷也在临床前评估中针对各种液体肿瘤（表1）。据我们所知，尽管临床前结果有希望，但这些ADC中没有一个进入临床试验，最近的相关出版物超过七年前。最近，为了治疗自身免疫疾病，绕过激素抵抗，开发了一种A7R-SN-38 ADC（表1）。 2.3.Belotecan衍生物 另一种拓扑异构酶1抑制剂KL610023，是FDA批准的分子belotecan的衍生物，正在作为ADC载荷进行研究。这种拓扑异构酶I抑制剂被开发用于生成抗TROP2 ADC（SKB-264），目前正在进行I/II期临床试验（NCT04152499）治疗各种实体瘤的患者（表1，图2A）。 2.4.其他拓扑异构酶1抑制剂 作为ADC载荷的喜树碱衍生物的一个限制是分子内缺乏可连接的化学胺基团。为了在不改变其抗肿瘤性质的情况下在载荷内插入可连接的功能，已经合成了其他CPT衍生物（表1）。在这些衍生物中，cAC10的临床前研究，一种抗CD30抗体偶联到8个AMDCPT分子，显示出非常有希望的结果（图2B）。最近开发了几种非喜树碱衍生物，包括吲哚异喹啉、二苯萘吡啶酮和氟吲哚异喹啉（图2C）。这些分子显示出与CPT衍生物相比具有几个优点，包括更高的细胞毒性、改善的稳定性或延长的活性，并且目前正在作为小分子进行早期临床试验。LMP-517，与氟吲哚异喹啉偶联，正在被研究；然而，据我们所知，还没有数据被披露。 3.已经进入临床试验的载荷：承诺和失败 虽然拓扑异构酶1抑制剂深刻地改变了ADC载荷格局，但其他几个药物已经在临床试验中进行了评估。表2总结了在患者中评估的原始载荷。主要类别包括拓扑异构酶2抑制剂、RNA聚合酶抑制剂、Bcl-xL抑制剂和免疫刺激剂。此外，糖皮质激素现在作为超出肿瘤学适应症的ADC载荷出现了。 3.1.拓扑异构酶2抑制剂 拓扑异构酶2抑制剂在血液病恶性肿瘤和实体瘤的抗癌治疗中广泛使用。它们的机制复杂，可能不仅涉及直接抑制拓扑异构酶2活性，还包括DNA插入、ROS诱导和线粒体破坏。它们的毒性谱包括骨髓抑制、胃肠道毒性，在某些情况下还有高级别心脏毒性。多柔比星作为治疗乳腺癌、膀胱癌和甲状腺癌以及淋巴瘤和多发性骨髓瘤的一线治疗已经使用了几十年。多柔比星也是ADC开发中使用的第一批载荷之一，当时常规化疗小分子首次被偶联。第一个含有拓扑异构酶2抑制剂的ADC（SGN-15, BMS-182248）由多柔比星偶联到靶向Le-Y抗原的小鼠BR-96抗体（表2，图3）。SGN-15是在ADC发现的最初阶段与KS1/4-甲氨蝶呤（表2）一起在20世纪80年代开发的，用于治疗前列腺癌、乳腺癌和NSCLC。它的I期临床试验显示了可接受的耐受性，然而II期由于连接子不稳定和Le-Y靶标在正常组织中的表达导致了非靶向毒性。因此，ADC在可接受的剂量下缺乏效力。已经批准的化疗药物偶联观察到的令人失望的结果形成了共识，即ADC载荷应该比常规化疗药物更强效。这导致了第二代ADC的开发，它们被偶联到更强效的载荷上，如微管抑制剂和DNA损伤剂。 图3 展示了已经进入临床试验的抗体-药物偶联物的结构以及它们有效载荷（蓝色）的分类，这些有效载荷根据它们的作用机制进行了分类。图中注释：[ADC名称]，抗体，有效载荷。 尽管早期开发不尽人意，多柔比星后来被偶联到靶向CD74的抗体milatuzumab（IMMU-110）用于治疗多发性骨髓瘤（表2，图3）。这种ADC被带到临床试验中，但显示出令人失望的效力，其开发在2013年被终止（NCT01101594）。此外，多柔比星还被用作ADC载荷在临床前连接子概念验证研究中（表3），它被偶联到一个新的可切割连接子（NEBI）或一个不可切割连接子（SMAC）。SMAC研究的结果表明，不可切割连接子对于基于多柔比星的ADC开发可能过于严格，因为没有观察到细胞毒性。 鉴于多柔比星作为ADC载荷的效力不足，另一种蒽环类药物PNU-159682，其细胞毒性是多柔比星的100倍，后来被探索。除了比其他拓扑异构酶2抑制剂更强效外，PNU-159682不是efux泵的底物。被发现是efux泵底物的载荷是ADC开发中的限制因素。2020年，一种基于PNU-159682的新型ADC，NBE-002（表2，图3），针对ROR1，进入I/II期临床试验（NCT04441099）。有趣的是，NBE-002诱导了长期免疫保护，这表明它可以成功地与免疫检查点抑制剂（ICIs）结合。SOT102（前称SO-N102）是另一种有前景的基于PNU-159682的ADC，靶向CLDN18.2（表2，图3）。SOT102在低表达肿瘤中展示了大的治疗窗口，并已于2022年4月进入I期临床试验（EudraCT编号2021-005,873-25）。PNU-159682的许多临床前用途也被报道，结果证明了它能够绕过常用载荷如MMAE或DM1的抗性机制（表3）[110, 111, 114–118]。PNU-159682载荷还与MMAE一起偶联形成双药ADC（表3）。然而，尽管体外同时观察到了两种作用机制，但没有观察到协同作用。 在20世纪90年代的临床前阶段也开发了柔红霉素和伊达比星的偶联物（表3，图4），但显示出降低的效力。一种抗HER2 afbody-idarubicin偶联物最近在体外进行了评估，具有特异性针对HER2阳性头颈鳞状细胞癌（HNSCC）细胞而不是HER2阳性BC细胞（表3）。 图4 非传统ADC有效载荷的化学结构图，这些有效载荷处于临床前阶段。 3.2.转录抑制剂 转录在细胞发展、活动和增殖中具有基本作用，因此可以构成ADC载荷的一个创新和原始靶标。转录由RNA聚合酶II（RNApolII）调节，它直接与DNA结合，并涉及转录因子，这些因子与RNApolII形成复合体以启动转录（如TFIIH）和共同调节因子（如组蛋白去乙酰化酶，HDAC），这些因子介导染色质结构和可及性。尽管一些HDAC抑制剂已经获得批准，但由于耐受性差，目前还没有批准的RNApolII抑制剂。 毒蝇伞素是从毒蝇伞蘑菇中提取的天然且高效的RNApolII抑制剂。α-毒蝇伞肽和β-毒蝇伞肽连同其他七种大环衍生物构成了毒蝇伞素家族。尽管它们作为实验室试剂广泛用于探索转录机制，但α-毒蝇伞肽被证明毒性太大，特别是对肝脏，以至于不能作为抗癌药物进一步开发。然而，这种分子作为潜在ADC载荷具有许多优点，包括其原始的细胞内靶标、其有利的物理化学性质（包括亲水性）、其对efux泵的不敏感性，以及其在静止癌细胞中产生细胞毒性的能力。相比之下，毒蝇伞肽的亲水性预计将阻止通过旁观者效应杀死邻近细胞，这可能限制其在均匀分布的靶标中的使用。即使在这些情况下，完全缺乏旁观者效应可能导致由于患者之间的靶标分布不同而导致效力不足。 毒蝇伞肽衍生物β-毒蝇伞肽最早在1973年与白蛋白偶联，这种ADC前体证明了选择性杀死巨噬细胞（表3）。后来，这个衍生物被偶联到抗MUC1和抗PSMA抗体上，在临床前模型中展示了强大的选择性细胞毒性（表3）。它的类似物α-毒蝇伞肽及其衍生物偶氮-毒蝇伞肽也很早就被用作ADC载荷（表3）。偶氮-毒蝇伞肽-ADC比未偶联的分子显示出大约500倍的细胞毒性。这可以通过分子的亲水性来解释，这种亲水性降低了细胞膜的渗透性，同时作为ADC结构被有效内化。截至2021年5月，第一个毒蝇伞肽-抗体偶联物（ATAC®）候选药物HDP-101已经进入早期临床试验（表2，图3）。HDP-101是一个针对BCMA的ADC，目前正在评估用于治疗多发性骨髓瘤和浆细胞疾病的患者（NCT04879043）。ATAC最近被描述为免疫激活药物。它们被发现可以诱导免疫原性细胞死亡（ICD），并与ICI表现出协同作用，这为临床环境中的组合可能性开辟了新的视野。值得注意的是，针对其他靶标的一些α-毒蝇伞肽ADC（EpCam、HER2、PSMA、CD19）在体外和体内都显示出强大的抗肿瘤活性（表3）。α-毒蝇伞肽还作为双弹头与MMAE偶联（表3）。这种DAR 1+1 ADC靶向FGFR1，在体外显示出强大的细胞毒性。其他高效的RNApolII抑制剂在20世纪90年代被偶联，如鬼笔环肽，以及霉菌毒素三烯醇、疣状菌素A和roridin A（表3，图4）。考虑到自90年代以来ADC设计的进步，以及这些化合物在各种细胞系中的纳摩尔细胞毒性，这些分子可能在未来几年成为进一步探索的对象。 另一种阻止DNA转录的策略是抑制转录因子（TFs）。TFs对RNApolII附着在DNA上的启动步骤至关重要。TF抑制剂（TFi）已经证明它们在临床试验中具有抗肿瘤活性，其中水溶性前药minnelide目前正在II期评估中（NCT04896073）。雷公藤内酯，一种来自被称为“雷公藤”的中草药的天然化合物，具有高度的细胞毒性，但也具有疏水性，具有较差的生物利用度和高毒性（图4）。因此，正在努力开发具有更好药物化学特性的类似物。另一种策略是将这种分子偶联到靶向实体上，从而绕过这些问题。雷公藤内酯最近首次被偶联到抗CD26抗体上，以靶向间皮瘤和淋巴瘤（表3）。这种不可切割的ADC在目标细胞中有效地停止了mRNA合成，并在体外和体内展示了有希望的抗肿瘤活性。还开发了一种针对EGFR阳性肺癌的cetuximab-triptolide ADC（表3）。这种ADC对EGFR过表达模型具有选择性，并比未偶联的雷公藤内酯具有更低的毒性。Cetuximab-triptolide有效地诱导了转录抑制，在体外和体内都具有强大的抗肿瘤活性。还评估了针对HER2的雷公藤内酯ADC，并取得了类似的结果。然而，对于每种基于雷公藤内酯的ADC，都需要高剂量才能在异种移植模型中观察到抗肿瘤活性，这些论文中没有报告最大耐受剂量，从而质疑了治疗指数的宽度。 组蛋白去乙酰化酶（HDACs）影响转录因子，因此参与包括转录在内的各种细胞过程。它们被发现在癌细胞中过度表达或过度激活，并被认为参与增加增殖、迁移和侵袭。Vorinostat和dacinostat是FDA批准的两个HDAC抑制剂（HDACi）的例子。然而，这些分子呈现出强烈的系统性副作用风险，如血小板减少和胃肠道毒性，以及较差的药代动力学（PK）特性。自2018年以来，它们已经在ADC设计中进行了研究：ST74612AA1是第一个生物偶联的HDAC抑制剂（表3，图4）。这种相对无毒的分子是第二代泛HDACi。这种分子被偶联到cetuximab和trastuzumab上，两种ADC都比未偶联的HDACi具有更安全的特性，同时在细胞系衍生的异种移植（CDX）和患者衍生的异种移植（PDX）模型中都具有活性。然而，正如观察到的基于TFi的ADC一样，异种移植模型接受了30 mg/kg的高剂量治疗。2020年，vorinostat和dacinostat也被偶联到cetuximab和trastuzumab上，在体外具有有趣的抗增殖活性（表3，图4）。 3.3.Bcl-xL抑制剂 Bcl-2家族成员可能是促凋亡蛋白（Bad、Bim、PUMA、Bik、Bak等）或抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1等）。在癌细胞中，这些蛋白之间的平衡通常倾向于生存，使得抗凋亡蛋白成为创新ADC载荷的有趣和原始靶标。 根据它们的化学功能骨架，Bcl-xL和Bcl-2抑制剂被分类为4大家族：N-酰磺胺类（navitoclax、venetoclax）、吲哚类（obatoclax）、棉酚乙酸（AT-101、sabutoclax）和苯并噻唑腙类（如WEHI-539）。Bcl-xL的抑制与严重的血小板减少有关，这证明了寻找高度特异性Bcl-2抑制剂的合理性，如venetoclax。目前venetoclax已获批准用于慢性淋巴细胞白血病的一个亚组患者和急性髓系白血病。 ABBV-155（mirzotamab clezutoclax）是一种抗B7-H3抗体，与Bcl-xL抑制剂clezutoclax偶联（表2，图3）。这种创新ADC于2018年进入正在进行的I/II期临床试验，作为单一药物用于晚期实体瘤的治疗，以及与紫杉醇联合用于晚期非小细胞肺癌和乳腺癌患者（NCT03595059）。在单一药物I期队列中包含的前31名患者中没有报告剂量限制毒性，SAEs包括贫血、淋巴细胞计数下降、疲劳和腹泻。在紫杉醇组合臂中观察到21%的患者部分缓解。 3.4.酪氨酸激酶抑制剂 人类激酶组包含超过500个激酶，其中150多个与各种疾病相关，包括癌症。蛋白激酶是催化磷酸化的酶，分为3类：丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸激酶。目前正在临床试验中研究的小分子中超过四分之一是蛋白激酶抑制剂，超过30个FDA批准的癌症治疗分子是激酶抑制剂。在癌症中，各种激酶家族参与细胞周期进展、细胞增殖、运动和血管生成。自2001年首个激酶抑制剂伊马替尼获批以来，激酶抑制剂被分为5类：I型和II型是ATP竞争性，分别针对激酶的活性或非活性形式；III型结合ATP的变构口袋；IV型结合激酶的变构口袋，V型结合多种结合模式。 虽然在癌症治疗中被广泛探索，但蛋白激酶抑制剂作为ADC载荷并未被广泛探索，可能是因为它们的效力较低。抗CD19抗体B43已与染料木素（一种含有大豆异黄酮的植物雌激素）偶联，发现它通过抑制表皮生长因子受体（EGFR），一种酪氨酸激酶受体，诱导凋亡和细胞增殖抑制（表2，图3）。体外和体内的临床前研究（小鼠、大鼠、非人灵长类：NHP）表明在100 mg/kg的累积剂量下没有毒性，并且在小鼠模型中比标准化疗具有更强的抗肿瘤效果。这些有希望的结果导致了它在1999年首次用于治疗ALL和NHL的人体研究。除了在人类中呈现有利的药代动力学特性外，没有报告毒性和有希望的抗肿瘤活性。不幸的是，这种化合物的状态此后没有进一步报告（NCT00004858）。另外两项研究调查了染料木素偶联到抗EGFR或17.1A mAb的抗肿瘤活性，后者针对上皮膜抗原（表3）。抗EGFR-染料木素ADC在高达140 mg/kg的剂量下显示出良好的耐受性，在临床前模型中1 mg/kg时显著的抗肿瘤活性。17.1A-染料木素被发现比未偶联的染料木素在结肠癌模型中更活跃。 最近，另外三种激酶抑制剂被评估为ADC载荷。这些分子包括neolymphostin（一种PIKK抑制剂），dasatinib和staurosporine，两种多激酶抑制剂（表3，图4）。Trastuzumab neolymphostin展示了选择性和体外细胞毒性，尽管比其他常用的基于trastuzumab的ADC效力较低。一种与dasatinib偶联的抗CXCR4 mAb选择性地将dasatinib输送到目标T细胞，并展示了强大的免疫抑制效果。最后，广泛使用的实验室试剂和多激酶抑制剂staurosporine被偶联到cetuximab，用于治疗KRAS/BRAS突变的结肠癌细胞。总的来说，酪氨酸激酶抑制剂在ADC格式中的效力有限，这个家族可能不会在更高级的设置中成功。 3.5.免疫刺激抗体偶联物 免疫刺激抗体偶联物是一类新的抗体-药物偶联物，目前有2个ADC正在进行临床试验（表2，图3）（NJH395，BDC-1001），另一个SBT6050，由于赞助商的战略决策，其临床评估已被终止（NCT05091528）。STING激动剂和TLR激动剂构成了两类主要的偶联免疫刺激剂。 针对适应性免疫系统的免疫检查点抑制剂的成功极大地增强了利用先天免疫系统刺激的努力。然而，最有力的剂如STING和TLR激动剂的系统性给药与严重的系统毒性相关，由细胞因子释放综合征引起，从而将当前研究限制在肿瘤内注射。它们与蛋白质或mAbs的偶联因此是利用它们强大的抗肿瘤潜力同时改善耐受性配置文件的有希望的手段。 几种含有TLR激动剂的免疫刺激ADC目前正在临床环境中进行评估。NJH395，结合了一个小分子TLR7/8激动剂和抗HER2 mAb，是第一个达到临床评估的（表2，图3）。在18名非乳腺癌HER2+恶性肿瘤患者的I期临床试验（NCT03696771）中，发现严重的毒性，包括细胞因子释放综合征和淋巴细胞耗竭，没有显著的抗肿瘤活性。同样，BDC-1001，一种由抗HER2抗体与TLR7/8激动剂偶联的免疫刺激偶联物，目前正在进行I/II期评估，作为单一药物或与nivolumab联合用于治疗实体HER2+肿瘤的患者（NCT04278144，表2，图3）。它的临床前评估显示了强大和持久的免疫介导的抗肿瘤效力，并且临床评估显示出有希望的结果，包括在测试剂量下没有毒性和临床活性的证据。上述TLR7/8类似物也被偶联到抗PD-L1抗体，旨在结合免疫检查点抑制、抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）和肿瘤内髓系重编程。这种免疫刺激ADC在临床前模型中优于抗PD-L1的抗肿瘤活性。SBT6050是一种pertuzumab-TLR8激动剂偶联物，目前正在作为单一药物以及与抗PD1抑制剂（NCT04460456）和与trastuzumab deruxtecan联合用于治疗HER2阳性实体癌（NCT05091528）进行评估。Pertuzumab不与trastuzumab结合相同的HER2表位，研究表明trastuzumab和SBT6050之间存在协同潜力。 已经报告了其他免疫刺激ADC的有希望的临床前结果，它们分别与UC-1V150、CL264或T785 TLR 7/8激动剂偶联（表3，图4）。最近披露了一种与TLR7/8激动剂D18偶联的抗PD-L1，其中包括在B16黑色素瘤模型中具有强大的抗肿瘤活性，该模型对PD1有抗性（表3，图4）。最近，作为一种免疫刺激ADC载荷，研究了一种更具选择性的激动剂，即TLR7激动剂。另一类新兴的免疫刺激剂载荷是STING激动剂。TAK-500是第一个进入临床试验的STING激动剂免疫激活ADC，目前正在招募患者（NCT05070247）。这种针对CCR2的ADC（TAK-676）正在评估用于治疗实体瘤（表2，图3）。此外，还有三种STING偶联的ADC正在进行临床前阶段的开发：CDR-550、XMT-2056和最近一种针对FcγR的免疫刺激ADC，与STING激动剂XMT-1621偶联（表3）。最先进的XMT-2056（STING激动剂：XMT-1621，图4）在小鼠异种移植中以1 mg/kg剂量导致肿瘤完全缓解，并在非人灵长类中耐受，没有临床迹象或不良组织病理学发现，并且与ICI显示出协同活性。这种有希望的ADC应该在2022年进入首次人体研究的临床试验。 4.在临床前阶段的非传统载荷 由于肿瘤细胞具有增加的合成活性，几种载荷候选物已经针对蛋白质合成的各个步骤进行了靶向，包括转录、剪接和翻译抑制剂以及蛋白质分解。另一种方法是针对在肿瘤细胞中过度活跃的其他普遍存在的细胞过程。然而，只有经过精心设计的ADC才能支持这类载荷，因为即使肿瘤中的ADC浓度高于周围组织，大多数静脉注射的化合物并没有定位到肿瘤。 4.1.HSP90抑制剂 HSP90（热休克蛋白90）是一种主要的分子伴侣蛋白，已被证明在多种肿瘤中异常表达。已经开发并测试了几种源自格尔德霉素（GA，图4）骨架的HSP90抑制剂在临床环境中。抑制剂与HSP90结合后，阻止其保护其客户蛋白免受蛋白酶体降解的能力。迄今为止发现的主要限制是显著的剂量限制毒性和不良的药代动力学特性。在21世纪初，人们努力化学修饰GA，合成了一种适合生物偶联的马来酰亚胺可切割药物连接子（表3）。结果产生的trastuzumab-GA ADC与用trastuzumab治疗的小鼠相比，提高了荷瘤小鼠的整体生存率。Streptonigrin和17-aminogeldanamycin被用于在DAR4处产生抗CD70和抗CD30可切割ADC，并在临床前模型中被发现活性（表3）。GA在载荷领域中的最近复苏重新定位了这种分子，通过生成一种HER2 scFv HBD/GA ADC，在HER2阳性肺癌临床前模型中展示了抗肿瘤活性（表3）。 4.2.剪接抑制剂 转录后，前mRNA通过剪接体去除内含子，加工成成熟的mRNA。snRNPs（小核糖核蛋白）U1、2、4、5和6构成了剪接体的主要snRNPs。这些复合体对成熟mRNA的生成至关重要，并且在癌细胞中通常被调节异常。靶向U2的SF3B1亚基已被证明可以有效地抑制剪接。已经发现几种药物是有效的剪接抑制剂，包括pladienolides、spliceostatins和thailanstatins。然而，这些高度细胞毒性分子的IC50s在纳摩尔范围内，由于化学不稳定性而没有进一步开发。E7107，一种pladienolide类似物，在临床试验中进行了评估（NCT00499499），但由于安全问题，特别是严重的眼部毒性，已停止使用。Tailanstatin A-trastuzumab偶联物在临床前模型中显示出高度活性，某些体内模型中的效力大于T-DM1（表3，图4）。 4.3.翻译抑制剂 开发可耐受的翻译抑制剂已被证明是具有挑战性的，因为翻译在健康组织中的普遍重要性。Omacetaxine（之前指定为homo-harringtonine）是第一个获得FDA批准的翻译抑制剂，它干扰蛋白质合成的初始延伸步骤。已经开发了其他几种翻译抑制剂用于治疗各种癌症，靶向核糖体、EIFs（真核生物翻译启动因子）或mTOR。迄今为止，只有pymberin被用作潜在的ADC载荷（表3，图4）。Pymberin，也称为irciniastatin A，是一种从海绵中分离出的天然碳水化合物。它通过β-葡萄糖醛酸苷连接子与抗CD30和抗CD70抗体偶联，在体外展示了选择性和抗增殖活性，IC50s在亚纳摩尔范围内。 4.4.蛋白酶体抑制剂 蛋白酶体抑制剂是一种极其有效的抗癌剂。Bortezomib在2003年被批准用于治疗多发性骨髓瘤患者，从那时起显著改善了患者的预后。已经开发出几种其他抑制剂，具有减少神经毒性和/或允许口服给药的特点。环氧酮衍生物，如卡马霉素B类似物，强烈抑制20S蛋白酶体，已被结合到曲妥珠单抗上（表3，图4）。尽管未结合的有效载荷在体外细胞毒性方面令人满意，但相应的ADC（抗体药物偶联物）证明比基于MMAE的ADC效力要低。 4.5.PROTACS 靶向蛋白降解的嵌合分子（PROTACs）是双功能分子，它们将E3连接酶与目标蛋白结合在一起，从而允许其泛素化并通过蛋白酶体降解。PROTACs不是直接抑制其目标蛋白，而是触发其降解，具有几个潜在的临床优势，如延长效果、催化活性，因此具有非常强的细胞毒性。降解剂-抗体偶联物（DACs）构成了ADC领域中一个令人兴奋的新兴家族。在DAC设计中，PROTACs可以从被mAb（单克隆抗体）内部运输到细胞中获益，以克服它们有限的细胞渗透性。当前DACs的构建、生物活性和挑战已在最近的综述中报道。BRD4/BET降解剂GNE-987被结合到抗CLL1抗体上，导致恢复了药代动力学特性，并在小鼠异种移植中显示出强大的体内活性（表3，图4）。MZI类似物结合到曲妥珠单抗或抗STEAP1抗体也被评估了体外，证明了选择性BRD4降解和细胞毒性（表3，图4）。其他包含VHL或CRBN配体的BRD4降解剂-抗体偶联物最近也被生成了（表3，图4）。同样，雌激素受体（ER）、TGFbR2和BRM降解剂正在作为DAC有效载荷进行研究，通过结合到抗HER2、抗B7-H4和/或抗CD22抗体（表3，图4）。ORM-5029，最新披露的DAC或抗体新降解剂偶联物（AnDC™），旨在通过Pertuzumab将GSPT1降解剂（Smol006）输送到HER2表达细胞。这种AnDC™显示出比其他GSPT1降解剂更强的细胞毒性和与DS-8201a相当的抗肿瘤活性。ORM-5029的毒性目前正在研究中，结果将构成关于DACs治疗窗口的首次报告。 4.6.其他分子 有效载荷多样化的努力导致了最近非传统抗体-药物偶联物的临床前开发，这些偶联物提供具有独特作用机制的有效载荷。通过靶向烟酰胺磷酸核糖基转移酶抑制剂（NAMPTs）改变细胞代谢构成了一种新颖而原创的ADC技术。FK-866类似物被结合到抗CD30抗体上，随后的ADC在体外和体内选择性地耗尽了NAD（表3，图4）。CD30-NAMPTi在L540cy模型中以3 mg/kg剂量显示了有希望的体内抗肿瘤活性，实现了完全缓解。在大鼠中，以100 mg/kg以上的MTD（最大耐受剂量）勾勒出了有利的治疗指数。其他NAMPTis也被合成并结合到针对c-Kit的mAb。尽管在体外具有选择性和强大的细胞毒性（亚纳摩尔IC50s），这些不可切割的ADC在体内活性中等，仅在20 mg/kg剂量下实现了部分反应。 KSP（动力蛋白纺锤体蛋白）抑制剂，也称为Eg5抑制剂，构成了一个新兴的ADC有效载荷家族。Eg5是抗肿瘤治疗的一个有希望的靶点，因为它的表达仅限于增殖细胞，并且不在神经系统细胞中表达。因此，这些有效载荷不应该呈现与微管靶向剂相关的经典神经系统副作用。KSP抑制防止了细胞分裂期间的中心体分离，从而导致有丝分裂停滞。KSP抑制剂衍生物，具有亚纳摩尔效力，被结合到HER2和TWEAKR/Fn14靶向抗体（表3，图4）。TWEAKR-KSPi ADC在尿路上皮PDX中实现了完全缓解，而小分子KSP抑制剂ispinesib仅在这个模型中延缓了肿瘤生长。通过与flanesib结合，也生产了ADC，具有可接受的PK特性和良好的体内效力。 5.结论 抗体-药物偶联物已成为治疗日益增多的癌症指征的重要组分，并且正在进行数百项临床试验以探索新的靶点和指征。ADC领域取得的惊人进展主要得益于将它们的设计量身定制到特定靶点上。这得益于几项成就，包括（1）对越来越多靶点的探索和验证，（2）专为ADC设计而进行的mAbs（单克隆抗体）的适当筛选，重点关注交叉反应性、pH变化帮助下的优先肿瘤结合、降低到低纳摩尔范围的亲和力以避免粘性并促进内化和FcRn循环，（3）结合技术的进步，使药物-抗体比率更高，和/或恢复裸mAb样的药代动力学特性，以及（4）有效载荷的多样化（如图5所示），正如最近通过拓扑异构酶1抑制剂取得的突破所例证。 图5 展示了ADC有效载荷的靶标景观图，这些靶标超出了微管和DNA插入剂的范围。注释：FDA批准的ADCs，正在进行临床试验的ADCs。 在未来的发展中，具有原创作用机制的有效载荷的持续多样化预计将发挥关键作用。在晚期疾病中，通常通过结合具有互补作用机制的药剂来实现治愈，并且尽可能地结合非冗余的毒性。虽然目前批准的ADC拥有与传统化疗药剂相似的作用机制，但未来的有效载荷可能会针对迄今为止因毒性过大而难以处理的关键细胞现象。正如以前观察到的，与可切割链接物结合的auristatins和maytansinoids，topo-1 ADCs的旁观者效应已经证明了其对低或异质性肿瘤治疗的有效性，并且应该在后续开发中越来越受到关注。这些新型有效载荷的另一个主要优势可能在于它们能够针对静止的肿瘤细胞，这些细胞构成了患者肿瘤储备的大部分。此外，在新兴的有效载荷家族中，目前与严重副作用相关的几种激酶抑制剂将从更大的治疗指数中受益。就PROTACs而言，它们受益于亚化学计量活性，理论上可以降低细胞毒性的有效载荷阈值。 有效载荷的多样化也预示着ADC治疗武器库向尚未从靶向治疗中受益的其他癌症的开放。Sacituzumab govitecan导致TROP2在TNBC中的验证，而正在进行临床评估的基于SN-38的ADC突出了在ADC领域中代表性不足的癌症类型中的新靶点的潜力（HER3、CEACAM5、B7-H3和GPR20）。有趣的是，针对TNBC的临床试验展示了越来越多的包含原创有效载荷的抗体-药物偶联物，包括Dxd、PNU-159682和SN-38。 正如我们在这篇综述中所描述的，已经确定了几个潜在的有效载荷，并且许多已经显示出有希望的临床前结果。其中一些化合物已经进入临床试验，但由于毒性特征不满意而没有继续进行。在这方面，应该强调的是，主要的技术进步，特别是安全获取高药物-抗体比率的ADC的可能性，支持这样一个事实，即许多在ADC生产和表征不够理想的时候探索的有效载荷应该用目前可用的技术重新考虑。 整合原创有效载荷的新ADC格式，如双重有效载荷（表3）、治疗诊断和非内化偶联物，在最近的临床前研究中显示出巨大潜力，可能构成ADC研究中不断增长的领域。非内化ADC将特别受益于具有强烈旁观者杀伤效应或针对细胞外或基质靶点的新型有效载荷，正如基于PNU-159682的ADC针对tenascin-C、基质金属蛋白酶细胞外蛋白的抑制或最近的碳酸酐酶抑制（表3）。有趣的是，ADC技术也在非肿瘤学指征中被探索。两种原创ADC（ABBV-3373和ABBV-154），含有糖皮质激素受体调节剂（GRM），正在临床评估用于治疗类风湿性关节炎和克罗恩病（表2, NCT03823391, NCT04888585, NCT05068284和NCT04972968）。其他免疫学ADC有效载荷正在临床前环境中进行研究，并可能构成ADC设计中的新兴类别。此外，一种在临床前评估中显示出有希望结果的A-利福霉素衍生物，已经在患有金黄色葡萄球菌菌血症的患者中进行了1期临床试验（NCT03162250）。非细胞毒性有效载荷也进入了有效载荷领域，例如通过将肝X受体（LXR）激动剂结合到抗CD11b抗体来针对脂质代谢的细胞内靶向，用于治疗动脉粥样硬化（表3）。 尽管符合条件的疾病范围扩大了，但开发这些新型有效载荷的一个关键问题将是减轻它们的副作用。目前批准的ADC已经显示出它们与预期的（骨髓抑制、神经毒性）或意外的（如眼部或肺部）毒性相关。因此，获得令人满意的治疗指数将是未来创新ADC有效载荷发展的基本属性。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

——诺华“合成致死”新靶点创新产品进展——2024年1月26日，CDE官网公示，诺华在研创新产品HRO761获得临床试验默示许可，拟开发治疗晚期不可切除或转移性MSI-H/dMMR型实体瘤。截图来源：CDE官网HRO761为WRN抑制剂。Werner综合征RecQ解旋酶（WRN）是近年来发现的“合成致死”新靶点，对MSI-H肿瘤具有“合成致死”作用，是该赛道的潜力创新产品。但纵观诺华近年来在创新药品领域，进展多遭受坎坷。布局风险性极大的“合成致死”赛道，又是新靶点，着实风险和机遇并存。我们来回顾下该赛道目前的研究进展情况。——合成致死里程碑产品PARPi适应证撤销——PARP抑制剂（PARPi）是首款根据合成致死原理研发的抗癌药，自2014年奥拉帕利问世以来，全球已上市六款PARP抑制剂，分别是奥拉帕利、鲁卡帕尼、尼拉帕利、他拉唑帕利、氟唑帕利和帕米帕利。深刻改变了卵巢癌治疗格局，同时，也先后获得乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌的适应症。逐步引起国际制药巨头纷纷押注合成致死赛道。但随着FDA近期对PARPi适应症的撤销，又为合成致死赛道蒙上了阴影。PARP抑制剂（PARPi）的问世，深刻改变了既往治疗手段有限的卵巢癌的治疗格局，但是，随着相应临床试验随访时间的延长，临床数据显示卵巢癌患者使用鲁卡帕尼、奥拉帕利和尼拉帕利的死亡风险有所增加，所以在2022年FDA接连撤回奥拉帕利和鲁卡帕尼末线治疗卵巢癌的适应症以及尼拉帕利末线治疗卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌的适应症。让外界对于以PARPi为代表的合成致死赛道前景充满担忧。既往时刻，诸多国际制药巨头已经纷纷押注合成致死赛道，未来是否真的如预期中的一路坦途呢？——合成致死赛道频繁BD——2022年3月22日，Volastra Therapeutics宣布，与百时美施贵宝达成研发合作，利用Volastra基于探索染色体不稳定性（chromosomal instability, CIN）的药物发现平台，发现与染色体不稳定性相关的合成致死药物靶点。合成致死是一种已经得到验证的靶点发现策略， 它通过探索肿瘤细胞的弱点，在杀死肿瘤细胞的同时避免伤害健康细胞。根据合作协议，Volastra将负责针对未公开的靶点进行一系列研发活动，直至选定开发候选疗法。百时美施贵宝将负责后续开发、监管和商业化活动。Volastra将获得3000万美元的前期付款，并有资格获得高达11亿美元的里程碑付款。2022年6月1日，RepareTherapeutics宣布，与罗氏制药集团就拆monsertib（RP-3500）的开发和商业化达成全球许可和合作协议。Repare将收到1.25亿美元的预付款，并有资格获得高达12亿美元的潜在开发、监管、商业和销售里程碑，以及全球净产品销售的特许权使用费。Camonsertib是一种选择性ATR（共济失调毛细血管扩张突变基因Rad3相关激酶）口服小分子抑制剂，用于治疗具有特定合成致死基因组改变的肿瘤，包括 ATM（共济失调-毛细血管扩张突变）基因。让大众的视线再次聚焦到合成致死赛道上。在具体回顾基本概念前，我们先讲解下ATR抑制剂的作用机制。——ATR抑制剂作用机制——内源性（DNA双链断裂）和外源性（紫外线辐射和化学毒性等）的因素，引起细胞DNA的损伤，为了维持基因组的完整性，细胞进化出DNA损伤应答机制DDR（DNAdamageresponse）可以检测DNA损伤并修复，与细胞周期的检查点相互作用以控制细胞增殖。DDR的核心激酶是3种结构独特的丝氨酸/苏氨酸激酶成分的中枢调控因子：共济失调性毛细血管扩张突变蛋白（ATM）、Rad3相关蛋白ATR、DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)。ATM和DNA-PK主要在双链断裂修复中被激活；而ATR主要在单链断裂修复中被激活。DNA损伤累积并阻碍DNA复制的过程就会发生RS，在RS下，DNA链的损伤可导致复制减慢或停止，如果损坏未修复可能会崩溃，导致细胞死亡，ATR在协调RS中起着至关重要的作用。复制蛋白A（RPA）在损伤位点与单链DNA结合，所得复合物结合可引发ATR募集到DNA损伤位点。当ATR被复制蛋白A（RPA）激活后，会磷酸化CHK1，后者又磷酸化CDC25A，最终通过抑制周期蛋白依赖性激酶（CDK）的活性介导G2～M期和S期检测点的活化，来减少RS并触发适当的DNA修复途径。而ATR抑制剂可以干扰DNA修复，这样癌细胞的DNA就有可能产生一堆错误而且得不到修复，然后凋亡。正常细胞有很多蛋白质负责DNA修复（比如MMR相关的就有4个，MSH2、MSH6、MLH1、PMS2；此外，BRCA以及POLE等蛋白），单独阻断ATR，并不会对DNA修复有影响。综上可知，ATR抑制剂也属于合成致死理论的明日之星。——合成致死理论——合成致死（Synthetic lethality）理论由来已久，通俗来讲，指两个非致死基因同时失活将导致细胞死亡的现象。概念最早可以追溯到1992年，美国科学家卡尔文在果蝇的研究中发现，具有pd和 Pdr双基因突变的果蝇不能存活，而这其中任何一个基因单独突变都不会导致果蝇死亡。1946年，西奥多·多布赞斯基正式提出“合成致死“概念，用来描述这种不同基因之间的互补性致死作用。科学家们很容易将果蝇中发现的这种现像与肿瘤治疗理论相结合，如果发现肿瘤细胞中存在特定基因A失活，那么用药物抑制它的合成致死搭档基因B，使两者都失活，而健康的体细胞因为有正常的基因A，能够保证正常的生理功能的表达，不会受到药物的伤害，从而只特异性的杀死该类肿瘤细胞。基于合成致死原理的肿瘤治疗原理很简单，但难点相信大家也能想得到。没有技术的突破，你很难找到合适的成对存在的合成致死基因。犹如好的逗哏必须得有好的捧哏才能合演一场成功的相声。突破在于PARP与BRCA这对黄金搭档的世纪相遇，促进了PARP抑制剂的成功商业化上市，并在卵巢癌领域获得巨大成功，由此开启了基于“合成致死”理论进行药物开发的热潮。最成功的产品当然是PARP抑制剂。——PARP抑制剂——PARP（聚腺苷二磷酸核糖聚合酶）在DNA单链碱基切除、修复过程中发挥着关键作用。BRCA是重要的抑癌基因与肿瘤易感基因，包括BRCA1及BRCA2。BRCA基因突变会导致基因组不稳定性显著增加，从而显著提高女性罹患乳腺癌、卵巢癌以及其他癌症（胰腺癌、子宫内膜癌、腹膜癌及宫颈癌等）的风险。在人体内，BRCA可与PARP共同作用于同源重组（HR）修复通路，这种双保险组合，可以有效保证体内DNA复制的正确性。但部分癌细胞，BRCA基因会突变，此时，人类如若开发出能够抑制PARP的药物，通过抑制肿瘤细胞DNA损伤修复、促进肿瘤细胞发生凋亡，从而可增强放疗以及烷化剂和铂类药物化疗的疗效。特别是对于携带BRCA突变的肿瘤细胞，理论上对PARP抑制剂的敏感度会更高。 BRCA和PARP的合成致死示意图 目前，已经有四种PARP抑制剂在中国获批上市，分别是奥拉帕利、尼拉帕利、氟唑帕利以及帕米帕利，将这几款PARPi在卵巢癌领域获得FDA和NMPA批准的适应症总结如下：来源：NMPA、FDA、各公司官网（未更新最新追踪结果）——开发PARP抑制剂新策略——随着临床上PARPi不断涌现，耐药现象同样限制了PARPi的进一步运用。PARPi的耐药性的主要原因是BRCA1/2突变癌细胞HR修复活性的恢复。详细地说，BRCA1/2中的继发突变与原始突变导致的链终止子/移码的废除有关，导致全长 BRCA1/2 开放阅读框的恢复。因此，活性BRCA1/BRCA2蛋白表达被恢复，从而重新启动功能齐全的HR途径。除了BRCA1/2中其他突变介导的耐药性外，还提出了BRCA1启动子甲基化的减少/丧失，从而恢复了BRCA1的表达而导致对PARPi的耐药性。为了克服耐药性，一方面进一步对PARP抑制剂进行修饰开发以发现下一代PARP抑制剂，另一方面采取联合用药，如2023年3月，强生旗下杨森（Janssen）公司则宣布向FDA递交了将PARP抑制剂尼拉帕利和醋酸阿比特龙（abiraterone acetate）以双效片剂（DAT）形式的新药申请（NDA），联合强的松（prednisone）共同用于治疗BRCA阳性的转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）患者，或者双靶点抑制剂，如进入临床II期的Stenoparib，同时抑制PARP1/2和TNKS1/2，还有很多临床前在研的靶向PARP和其它靶点如HDAC、TOPO、BRD4、PI3K、HSP90、AChE和PD-L1等的抑制剂。与此同时也在开展其它靶向PARP新策略，如PARP的PROTAC和PARP抑制剂的前药。除了在PARPi升级改造下苦功夫以外，也期望能够在其他的靶点上，如WEE1和TP53，重塑PARPi的辉煌。——WEE1与TP53——PRMT5/MAT2A抑制剂、WEE1抑制剂，都是潜在的合成致死赛道的黑马，本文主要介绍尚在临床早期的WEE1抑制剂的相关知识。与 WEE1 形成合成致死基因搭档的，则是大名鼎鼎的抑癌基因 TP53。 TP53 与 WEE1合成致死效应 TP53 是人类非常重要的抑癌基因，在正常细胞中低表达，在恶性肿瘤中高表达。TP53 基因翻译的 P53 蛋白是细胞生长、增殖和损伤修复的重要调节因子。细胞的 DNA 受损时，P53 蛋白阻止细胞增殖而停止于 G1/S 期，把损伤修复好后才能进入 G2 期，如不能修复则促进细胞凋亡。在所有恶性肿瘤中，50% 以上会出现该基因的突变，从而导致大多数恶性肿瘤细胞于 G1/S 期检查点存在修复缺陷，复制出错的细胞就会轻松通过 G1 关卡，进入到 G2 期。 WEE1在 G2/M 检查点中作用的示意图  目前，直接针对抑癌基因 TP53 的药物研发，比直接针对原癌基因，如 EGFR、ALK 的靶向药物研发要艰难的多。现在针对抑癌基因的药物研发，更多的是在信号通路的上下游想办法，找相应的药物靶点，进行抑制。而 WEE1 就是合理的与 TP53 相搭配的合成致死靶点。WEE1 是 DNA 损伤修复（DDR）通路相关的一个重要激酶。WEE1 激酶能磷酸化细胞分裂周期基因 (cell division cycle，CDC2)，下调其活性，进而可以调控细胞 G 2 到 M 期的转变并调节细胞有丝分裂。它在染色体浓缩延迟和组蛋白合成中也起到关键作用，与 TP53基因突变存在一定的合成致死效应。 ——WEE1抑制剂在研项目汇总—— PARPi和WEE1抑制剂与化疗的增敏探索目前，临床有多款 WEE1 抑制剂在研，且各种 WEE1 抑制剂与 DNA 损伤 (化疗或放射治疗) 相结合的联合治疗方式已取得了很多进展，如进展最快的 Adavosertib（AZD1775），已在全球布局50余项临床试验，多为联合用药方案。基于此，WEE1 逐渐成为肿瘤治疗中的一个重要靶点。来源：医药魔方巧合的是，与 PARPi 在卵巢癌领域所获得的巨大成就相比，作为临床进展最快的 WEE1抑制剂—Adavosertib，在妇瘤领域中的浆液性子宫癌（USC）中也有着不俗的表现。                           USC非化疗药物数据对比  普通化疗对USC疗效较差，近年来，Her-2靶向治疗，抗血管生成药，酪氨酸激酶抑制剂与免疫检查点抑制剂的结合，以及我们今天所介绍的WEE1细胞周期调节剂，在USC领域取得了不错的ORR和PFS数据 。然而 Adavosertib 单药或联合用药均出现频率较高的不良事件，主要为腹泻、呕吐等胃肠道相关及贫血等血液方面不良事件, 对于Adavosertib 进一步的拓展蒙上了阴影。                           国内一众企业，在“合成致死“肿瘤治疗领域，多聚焦于已经商业化运作成功的PARPi的研发，鲜有突破创新者。不过值得一提的是，专注于”合成致死“作用机制药物研发的英派药业，是国内该领域鲜有的突破创新者，利用自主研发的 DNA损伤修复通路平台，开始探索PARP、WEE1等合成致死靶点的药物研发。在研产品包括PARP抑制剂（IMP4297）、WEE1抑制剂（IMP7068）、Hedgehog通路抑制剂（IMP5471）等。此次施贵宝重金布局合成致死领域，会更加吸引大众视野。——PRMT5与MTAP的初识探索——有企业全力押注PARPi的研发，自然也有企业想弯道超车，基于PARPi的成功，能否寻找到堪比PARP/BRCA的下一对“合成致死“黄金搭档呢？答案是有的， PRMT5/MTAP正是这种潜在的组合。PRMT5在基因表达、剪接和DDR中的作用模型PRMT（蛋白质精氨酸甲基转移酶）能够使多种蛋白甲基化，并在基因表达、剪接和DNA损伤修复等生物学过程中发挥重要作用。目前，已发现了11种PRMT家族的成员，主要的研究热点集中在PEMT5上。 MTAP（methylthioadenosine phosphorylase，甲硫腺苷磷酸化酶）常与体内常见的抑癌基因CDKN2A发生共缺失现象，这种共缺失现象在肿瘤中的比例可达9%~15%。 PRMT5和MTAP是合成致死组合2016年的两篇背靠背《Science》文章首次报道了抑制PRMT5在MTAP缺失肿瘤中的合成致死效应。另外，有研究证明，MTAP缺失的癌细胞对蛋氨酸腺苷转移酶2A（MAT2A）也敏感。因此，PRMT5抑制剂和MAT2A抑制剂有望成为治疗MTAP缺失肿瘤的新一代靶向药物。  在研PRMT5/MAT2A抑制剂项目汇总目前，有多款PRMT5/MAT2A抑制剂正在临床试验中，其中不乏GSK、辉瑞等大药企的身影，也有Agios这类新兴生物制药公司。让我们期待在肿瘤靶向药物治疗领域，“合成致死“理论能够再下一城。声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓